一、PCR技术检测结核杆菌的进展（论文文献综述）
路爱丽,廖卫[1]（2021）在《荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色诊断肺结核的效果比较》文中研究指明目的:比较荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测结核杆菌脱氧核糖核酸（DNA）与涂片抗酸染色诊断肺结核的效果。方法:收集2017年1月至2020年12月在新乡市第一人民医院就诊的疑似肺结核患者95例的痰液标本127份,对所有痰液标本均实施荧光定量PCR检测结核杆菌DNA及涂片抗酸染色检测,以痰培养结果为金标准,比较两种检测方法的诊断效能。结果:痰培养结果显示,95例疑似肺结核患者中,61例患者确诊,确诊率为64.21 %。荧光定量PCR检测的准确度、特异度、灵敏度及阳性预测值、阴性预测值均明显高于涂片抗酸染色检测,差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:荧光定量PCR检测结核杆菌DNA对肺结核的诊断效能明显高于涂片抗酸染色检测。
张鹤营[2]（2021）在《具有抗菌活性的新型喹恶啉-N1, N4-二氧化物的设计、合成和作用机制研究》文中提出喹恶啉-N1,N4-二氧化物早期作为抗菌药应用于兽医临床。近些年研究表明,喹恶啉类化合物具有广泛的药理活性,如抗肿瘤、抗病毒、抗结核杆菌、抗虫及抗真菌活性。特别是针对抗结核杆菌和抗原虫活性的新型喹恶啉类化合物的发现及结构改造成为药物化学领域研究的热点之一。研究表明喹恶啉类化合物在生物体内氧化还原酶的作用下产生氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）,ROS进攻细菌DNA双链造成DNA双链发生断裂,最终导致细菌死亡。喹恶啉类化合物具有较强的厌氧选择活性,其在还原性酶的作用下,得到一个单电子被还原,并释放出羟基自由基（OH·）。OH·是生物体内的一种ROS,它能够通过修饰DNA双链进而降解DNA,这也是目前研究所得到的最为认可的喹恶啉类化合物的作用方式。对喹恶啉类化合物抗结核杆菌活性的研究较为广泛,但对其抗结核杆菌的作用机制研究较少。目前基于结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）作用机制的研究主要集中在巨噬细胞内各种通路的调控作用,其中包括ROS和自噬。ROS可以进攻M.tb细胞膜上的电子传递链（Electron transport chain,ETC）,干扰其能量代谢及稳态;高水平的ROS也能诱导细胞自噬,通过自噬可以抑制并清除胞内感染的M.tb。本课题首先运用药效团融合的药物设计策略,保留喹恶啉-N1,N4-二氧化物药效团,分别重点对喹恶啉环C2位和C6位进行结构改造,获得新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物衍生物。对获得的目标化合物进行抗菌活性评价,建立构效关系。然后从ROS、DNA合成与修复以及诱导细胞自噬等方面阐明喹恶啉-N1,N4-二氧化物发挥抗菌作用的作用方式。1.新型噻唑烷酮-喹恶啉-N1,N4-二氧化物的设计、合成与活性研究本课题拟通过结构改造得到新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物,完善该类化合物的构效关系,并筛选出潜在的先导化合物为喹恶啉类化合物研究与发展奠定基础。研究表明喹恶啉环的C2和C7位取代基对该类化合物的抗菌活性影响较大,并且本实验室前期也对该类化合物的构效关系进行了分析,同样发现C2位取代基对其抗菌活性影响较大。近些年来,化合物的结构改造主要借助药效团融合、化合物骨架跃迁和电子等排等方法,从而获得具有潜在活性的先导化合物。噻唑酮环广谱的抗菌活性为本课题化合物的设计改造提供了思路,本课题采用药效团融合的策略设计了C2位含有不同取代噻唑酮环的化合物,在经过氧化反应、Beirut反应、水解反应、醛胺缩合及环化缩合反应后得到26个新型噻唑烷酮-喹恶啉-N1,N4-二氧化物（TZN1～26）。采用微量肉汤稀释法和MABA法分别测定化合物TZN1～26的抗菌、抗真菌和抗结核杆菌活性,结果表明:TZN4、TZN5、TZN10、TZN11、TZN15、TZN16、TZN20、TZN21、TZN25和TZN26对革兰氏阳性菌表现出显着的抗菌活性,较喹乙醇抗菌活性提高2～8倍,如化合物TZN20和TZN21对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC为16μg/m L。化合物TZN19-26对白色念珠菌（C.albicans,ATCC90028）、热带念珠菌（C.tropicalis,ATCC7349）,A.fumigatus（3.5352）和C.neoformans（2.3201）具有一定的抗菌活性（MIC≤8μg/m L）。TZN20、TZN21、TZN25和TZN26对M.tb具有显着的活性（MIC=1.56μg/m L）。分析后发现,在喹恶啉环C7位或苯环C4位引入F原子或Cl原子后能增加化合物活性,当取代甲基或甲氧基后会明显降低化合物活性。通过建立3D-QSAR模型分析化合物的构效关系。结果表明,在喹恶啉环C7位和苯环的C4位取代体积大、电负性强或亲水性基团有利于提高喹恶啉类化合物的抗菌活性;在喹恶啉环C7位引入正电性基团会显着降低化合物的亲和力,导致化合物抗菌活性的降低;在喹恶啉环C2位侧链引入亲水性基团和氢键供体基团同样会提高化合物的抗菌活性。2.新型含氮杂环-喹恶啉-N1,N4-二氧化物的设计、合成与活性研究目前对喹恶啉环C6位的结构改造较少,仅有少量研究表明在C6位引入卤素原子或甲基基团可以提高化合物的抗菌活性,未见更多的结构改造,导致该位置构效关系的空缺。本课题采用药效团融合策略重点针对C6位进行结构改造,引入多种含氮杂环,同时在C2位取代酯基或酰基,C3位引入甲基或三氟甲基,C7位取代氟原子,在经过一系列氧化反应、Beirut反应及亲核取代反应后得到33个新型含氮杂环-喹恶啉-N1,N4-二氧化物（NCH1～33）。采用微量肉汤稀释法和MABA法分别测定化合物NCH1～33的抗菌活性和抗结核杆菌活性,结果显示:化合物NCH1～33对大肠杆菌ATCC25922的抗菌活性较差,仅NCH5、NCH6和NCH25的MIC值为4～8μg/m L;化合物NCH16、NCH20、NCH24、NCH28和NCH29对耐药大肠杆菌的抗菌活性与标准菌相比,并未有明显降低的现象,说明耐药大肠杆菌对这些化合物并未产生明显的耐药性,也间接表明喹恶啉类化合物的抗菌作用方式可能与氟喹诺酮类药物有所差异。NCH1～33对胸膜肺炎放线杆菌ATCC27090的MIC低至0.25μg/m L,对副猪嗜血杆菌HPS0165的MIC低至1μg/m L。对于金黄色葡萄球菌ATCC29213,化合物的MIC低至0.5μg/m L,较乙酰甲喹抗菌活性提高256倍。对于临床分离耐药金葡菌,化合物的MIC低至1μg/m L;化合物对MRSA的MIC值低至4μg/m L。化合物NCH16、NCH20、NCH28和NCH29对M.tb具有显着的抗菌活性,MIC≤0.25μg/m L,与乙酰甲喹相比活性提高了16～32倍。化合物NCH29在不同浓度下与M.tb感染的巨噬细胞孵育不同时间均表现出显着的胞内抗菌活性,在40×MIC浓度时与细胞孵育4 d后可以减少2.73-log数值的胞内M.tb;当不同浓度的NCH29与细胞孵育1 d后,胞内M.tb表现出0.1～1.69-log数值的降低。分析后发现,当喹恶啉环C2位乙酯或苄酯取代时,化合物抗菌活性较高;C3位引入-CF3后发现可以增加化合物的活性;C6位咪唑或1,2,4-三氮唑取代时,化合物抗菌活性较高;C7位引入氟原子显着增加化合物的活性,尤其当C6位引入官能团后,C7位须有氟原子取代才可以起到提升化合物抗菌活性的作用。3D-QSAR结果表明,在喹恶啉环C6位增加取代基的电负性,可以提高化合物的活性;C6位取代亲水性基团、C3位取代疏水性基团能够增加化合物的活性;在C2/C6位置的侧链基团,应该考虑具有更多氢键供体的基团。3.喹恶啉类化合物抗菌作用机制研究对大肠杆菌作用机制研究基于文献调研和前期研究结果,本课题对喹恶啉类化合物的作用机制做出假设:喹恶啉类化合物通过自身产生的ROS对细菌的DNA造成损伤;同时它还能干扰细菌对损伤的DNA修复的过程,从而进一步发挥抗菌作用。选取DNA合成与修复相关的酶,主要包括DNA聚合酶I、DNA连接酶和DNA拓扑异构酶（DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶IV）等,通过对上述蛋白酶进行活性抑制试验阐明喹恶啉类化合物与DNA损伤修复系统之间的联系,结果表明:（1）喹恶啉类化合物对DNA连接酶和DNA拓扑异构酶无明显的抑制作用;（2）对DNA聚合酶I表现出显着的抑制活性,如喹多辛和替拉扎明在128μg/m L时对DNA聚合酶I的抑制率分别为80.2%和78.7%;（3）与底物d NTPs同时竞争酶的活性中心,并且能够抑制酶活性,且N-O键是化合物发挥作用的必要结构。上述结果可以初步确定喹恶啉类化合物通过抑制DNA聚合酶I的活性发挥作用。对结核杆菌作用机制研究首先测定了喹恶啉类化合物对M.tb能量稳态的影响,分别通过膜完整性试验、ATP消耗试验和RT-q PCR评估喹恶啉类化合物对M.tb能量稳态的影响。结果显示:NCH29处理M.tb后,细胞膜完整性受到破坏、菌体内ATP水平显着降低并且II型NADH脱氢酶（Type II NADH-dehydrogenase,NDH-2）相关m RNA（ndh和ndh A）的表达水平显着下调。上述结果表明,NCH29与M.tb作用后,造成细胞膜的损伤和破坏,使菌体无法维持稳态平衡以及自身生存;NCH29能够继续作用于ETC,干扰NDH-2功能的正常发挥,破坏菌体的氧化还原稳态,阻碍电子在ETC的正常传递,造成菌体内ATP水平显着下调,能量稳态受到破坏,导致M.tb的死亡。为研究喹恶啉类化合物作用于巨噬细胞后对M.tb的抗菌作用机制,本课题分别通过多功能酶标仪检测胞内ROS及线粒体超氧自由基的变化,自噬相关蛋白LC3 II的变化则由WB和共聚焦显微镜进行测定。结果表明,NCH29能够刺激M.tb感染的巨噬细胞内ROS水平的增加,并且ROS水平与化合物浓度和孵育时间呈正相关的关系;NCH29处理M.tb感染的细胞后可以诱导细胞自噬的发生,并且可以在胞内观察到大量自噬体标志物的堆积。上述结果表明,当NCH29作用于M.tb感染的巨噬细胞后,一方面可以刺激巨噬细胞产生大量的ROS,ROS进攻胞内的M.tb,起到杀菌作用;另一方面,高水平的ROS也可以诱导巨噬细胞自噬的发生,通过自噬这一生物过程清除胞内的M.tb,进一步发挥抗菌作用。综上所述,本课题设计合成了59个新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物,并对其抗菌活性进行评价。采用3D-QSAR建立了新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物抗菌活性的构效关系。本研究结果表明喹恶啉类化合物不仅可以通过ROS破坏细菌DNA双链,还可以抑制DNA聚合酶I的活性、干扰细菌能量稳态、诱导细胞自噬发挥抗菌作用。本课题深入研究了喹恶啉类化合物的抗菌作用机制并建立了构效关系,为进一步的喹恶啉类药物设计与改造提供了科学依据。
丁涵[3]（2021）在《山羊副结核病的检测和MHC-DRB3基因与副结核病感染相关抗病性的初步研究》文中认为内蒙古地区的生产方式以畜牧业为主,副结核病在内蒙古西部地区广泛流行,大部分患有副结核病的山羊会逐渐消瘦甚至导致死亡,给养殖业带来了极大的经济损失。由于山羊体内MHC基因具有高度的多态性,并且参与机体免疫应答反应。本试验从基因角度出发,为了对比健康山羊与患病山羊MHCⅡ-DRB3基因之间的差异性,初步探究山羊MHCⅡ-DRB3基因的多态性以及与副结核病感染可能存在关联的基因位点。对有疑似副结核分枝杆菌感染的山羊进行病理剖检及病理组织学检查,并提取该病羊粪便中细菌的全序列基因组DNA,通过PCR扩增及测序进行确诊;采集羊群粪便、血液、血清各122份进行检测,用PCR方法检测血液和粪便中的病原体,ELISA方法检测血清中的抗体,将样本分为健康羊和感染病羊两类（病原体检测和抗体检测均为阴性的判定为健康羊）;选择病原体检测和抗体检测均为阳性的样本25份及病原体检测和抗体检测均为阴性的样本25份,共50份样本,提取血液全基因组DNA并通过PCR扩增获得DRB3位点基因全序列,使用MEGA 7.0软件对比健康羊和感染病羊MHCⅡ-DRB3位点基因的差异性,初步筛选出健康羊和感染病羊的差异性位点。结果表明剖检病羊确诊患有副结核病;122只山羊的粪便病原体检测阳性43份,阳性率为35.25%;122份血液病原体检测阳性24份,阳性率为19.67%;经病原体检测结果阳性样本55份,阳性率为45.08%。122份血清中抗体阳性39份,阳性率为31.97%;病原体检测和抗体检测均为阳性的样本有27份,阳性率22.13%。MHCⅡ-DRB3位点经对比统计共发现32个核酸多态位点,突变率为13.22%,其中与疾病不相关多态位点有29个占全部多态位点的90.62%,可能与疾病相关的多态位点有3个占全部多态位点的9.38%。
何如怡[4]（2021）在《基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究》文中提出核酸检测是分子诊断的主要手段之一,在卫生保健、环境监测、生物安全以及食品分析等许多领域发挥了重要的作用,开发操作简单成本低的高灵敏度、高特异性核酸检测技术具有重要意义。近年来,基于CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system）系统发展的一系列高灵敏度和高专一性的核酸检测技术在临床诊断上取得了显着的进展,然而Cas效应蛋白需要使用RNA作为向导,并且依赖特殊序列,比如PAM（Protospacer adjacent motif）或者PFS（Protospacer flanking site）,来识别靶位点,这在一定程度上限制了其应用。与Cas效应蛋白类似,Argonaute（Ago）也是一类以核酸作为向导的核酸内切酶。PfAgo（Pyrococcus furiosus Argonaute）是一种来源于古生菌的原核Ago蛋白质,可以利用具有5’磷酸基团的单链DNA（大于15 nt）作为向导,从向导的5’端开始的第10和11个核苷酸之间的位点切割互补的单链DNA。本研究发现PfAgo切割产生的单链DNA能够作为向导引发新的酶切反应。基于此发现,我们建立了一种具有高灵敏度、高特异性和多重检测能力的核酸检测方法,通过对临床核酸样本的检测证明了该方法的可行性和应用潜力。随后,我们将该方法加以改进并用于SARS-CoV-2的核酸检测。同时,本研究利用向导的长度对PfAgo切割活性的影响,将极短PCR技术与PfAgo结合起来开发了另一种简单快速的核酸检测方法。综上,本研究通过深入探究PfAgo的酶学性质开发了三种高灵敏度、高特异性、高准确性的核酸检测技术,为分子诊断提供了新的方法选择,并为Ago蛋白的应用提供了新的思路。本论文的具体内容如下:1.PfAgo蛋白质的表达纯化及性质研究。根据PfAgo耐高温的性质,利用80°C水浴处理和Ni-NTA亲和纯化获得了高纯度PfAgo蛋白质。对PfAgo性质的进一步研究发现向导DNA（guide DNA,g DNA）与靶DNA（target DNA,t DNA）的单碱基不匹配会显着影响PfAgo对靶的切割效率。此外,g DNA 3’端的突出对PfAgo的切割活性没有影响,5’端突出会影响PfAgo的切割活性和切割位点。本研究发现PfAgo切割单链DNA产生的具有5’磷酸基团的单链DNA可以作为新的g DNA介导PfAgo靶向切割与之互补的单链DNA,表明PfAgo的切割反应可以传递。2.结合PfAgo切割反应可传递的特点和PCR技术开发基于PfAgo的核酸检测方法（PAND）。设计三条分别靶向待检测双链DNA不同位置的g DNAs（输入g DNAs）介导PfAgo切割双链DNA靶,并从中释放出一条单链DNA,作为新的g DNA（生成g DNA）与PfAgo蛋白结合,靶向切割互补的分子信标,从而产生荧光信号,实现检测的目的。该方法检测灵敏度可以达到1.6 a M、能够识别单碱基突变和实现五通道检测。对模拟样本和临床样本的检测结果表明该方法可以应用于16S r DNA、结核杆菌和乙肝病毒耐药性突变、BRAC1基因的单核苷酸位点多态性位点、循环肿瘤DNA以及人乳头瘤病毒（HPV）多亚型分型的检测。3.结合逆转录PCR技术和PfAgo切割反应开发了基于PfAgo的SARS-CoV-2检测（SARS-CoV-2 PAND）。通过筛选最佳的PfAgo/g DNA复合物,仅利用单条输入g DNA建立了高灵敏度、高专一性、高准确度的SARS-CoV-2核酸诊断方法,检测下限可以达到1拷贝每反应。该方法缩短了荧光定量PCR仪的使用时间,能够有效解决大规模检测时荧光定量PCR仪不足的问题。对44例新冠病毒疑似感染者的咽拭子核酸提取物的检测结果与荧光定量逆转录PCR（RT-q PCR）一致,同时对36例阳性样品进行了D614G突变检测,证明SARS-CoV-2 PAND可以用于SARS-CoV-2及其突变体的检测。4.基于PfAgo的切割活性只能由长度大于15 nt的g DNA触发的性质开发了结合极短PCR技术和PfAgo的核酸检测方法（USPCRP）。利用具有5’磷酸基团的短引物启动的极短PCR的扩增产物作为g DNA来介导PfAgo切割分子信标,进行DNA检测,该方法无需额外加入g DNA,具有100 a M的检测灵敏度和序列特异性。利用该方法成功对临床样本的HPV16E6基因和SARS-CoV-2 ORF1ab基因进行了检测,表明该方法能够用于临床诊断。
杨航[5]（2020）在《牛结核病诊断技术的建立与初步应用》文中研究说明牛结核是由牛分枝杆菌引起的人类和动物的人畜共患传染病,OIE将牛结核病分为B类人畜共患疾病在中国为II类人畜共患疾病。牛结核病每年给畜牧业带来的经济损失不可估量,不仅如此,牛结核病给人类的安全带来重大的隐患,因此对于牛结核病的防控至关重要,本研究希望通过探寻作为快速诊断的靶基因以及抗原蛋白,以免疫酶联吸附试验（ELISA）和实时荧光定量PCR技术为基础,建立针对牛结核病的诊断方法,为结核病的防控提供新的技术手段进行以下研究:（1）通过生物信息学分析的手段,对本试验室前期研究的16种结核特异性蛋白进行分析,通过理化特性、不稳定性指数、亲水性、蛋白质二级结构、跨膜域以及B细胞表位的分布预测为后续试验提供理论数据支持;将16株表达菌经表达纯化,经蛋白免疫印迹试验（Western-Blotting）验证均能与牛结核病阳性的牛血清进行反应,具有良好的反应源性;最终用爱德士牛结核病抗体检测试剂盒对本试验涉及的所有蛋白进行初步筛选,结果显示MPT70和MPT83在牛结核病的间接ELISA检测中具备优秀的诊断效能,可以作为诊断抗原进一步研究。（2）以MPT70蛋白、MPT83蛋白、MPT70-83融合蛋白、MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）分别为包被抗原建立间接ELISA检测方法,通过方阵滴定,确定其最佳包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及血清、二抗和显色的最佳反应时间,在各种最佳反应条件下对牛结核阳性的血清和牛结核阴性的血清进行检测,确定其阳性符合率以及阴性符合率。结果显示M1和MPT70的阴阳性符合率以及M2和MPT83的阴阳性符合率相当,可以以抗原多肽代替全蛋白作为诊断抗原。（3）建立一种基于Mpt83基因的实时荧光定量pcr的结核分枝杆菌核酸检测的方法,根据Mpt83基因设计一对特异性引物,以培养的H37RV标准株为模版扩增目的基因并连接T载体,构建标准重组质粒以检测所建方法的有效性。经反应条件的优化建立SYBR Green I实时荧光定量检测方法,结果显示所建立的方法线性关系良好,融解曲线波峰单一,具有很强的特异性与常见致病菌无交叉反应,最低检出下限为10copies/reaction,是常规PCR的100倍,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于病菌的检测及定量分析。本试验通过生物信息学分析以及酶联免疫吸附试验对16种结核特异性蛋白进行初步的筛选,筛选出MPT70、MPT83两种对于牛结核病血清学诊断最具价值的抗原蛋白;分别以MPT70和MPT83两种蛋白和MPT70预测的抗原表位肽（M1）、MPT83预测的抗原表位肽（M2）以及MPT70-83融合蛋白建立间接ELISA检测方法,通过临床样本检测的结果显示两种蛋白的优势抗原表位段均能代替两种蛋白的全蛋白作为诊断抗原;以M PT83为靶基因的建立荧光定量PCR的检测方法,经检测所建立的方法具有良好的特异性,其检出下限可达10copies/reaction,对牛乳模拟标本的检测可达到10 CFU/10m L,可用于定量分析。为牛结核病的快速诊断提供一种新的技术方法。
安婷婷[6]（2020）在《独山瓜馥木茎抗结核杆菌成分及作用机制初探》文中认为结核病（Tuberculosis,TB）是由于结核杆菌（Mycobacterium Tuberculosis,MTB）而引起的慢性致死性传染病,可侵犯全身脏器,严重威胁人类的身体健康。近年来,伴随人口流动的加速,用药不合理以及抗结核药物作用靶点的突变,导致耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）的不断出现,再加上近年来患有艾滋病（AIDS）人口数量的增长,结核病与人类免疫缺陷病毒（HIV）并发发病率急剧上升,给结核的治疗带来了严峻的挑战。因此,研发新型抗结核药物成为控制和治疗结核病的迫切要求。我国中药来源丰富,品种繁多,天然无污染可再生,毒副作用低且不易产生耐药性,这使中药在日益严重的形势下具有一定的优势。本课题利用贵州中草药资源的多样性,以及民族医药文化的独特性,通过前期活性筛选,发现贵州地道药材独山瓜馥木具有抗结核杆菌活性。对独山瓜馥木乙醇提取物（600 g）进行分段萃取,得到石油醚部位（80 g）、乙酸乙酯部位（80 g）、二氯甲烷部位（120 g）以及剩余物（250 g）四个部分。通过活性追踪,结果显示石油醚部位、乙酸乙酯部位以及剩余物的最小抑菌浓度（MIC）值均大于160μg/m L,视为无效,而二氯甲烷部位MIC值为160μg/m L,确定二氯甲烷萃取物为活性部位。将二氯甲烷部位采用硅胶柱色谱继续分离,得到Fr.A～Fr.G共7个组分。其中仅有Fr.C和Fr.D对结核杆菌的MIC范围在100～200μg/m L,但Fr.C比Fr.D活性稍高。随后,通过薄层色谱（TLC）和硅胶柱层析对Fr.C组分进行多次纯化,分离得到具有抑制结核杆菌活性化合物GF-01（16 mg）,对结核杆菌的MIC为80μg/m L。化合物GF-01为白色粉末状,溶于二氯甲烷和甲醇;能使改良碘化铋钾生物碱显色剂呈红色,说明活性单体为生物碱类化合物;能使酸化的氯化铁溶液呈红色,表明活性单体含S元素。综合波谱分析数据并结合参考文献对照,鉴定化合物为3-（6-羟基-9-氧代-9H-芴-1-基）丙硫酰肼。Fr.D组分具有抗结核活性,但由于其极性较大,仅依靠常规的硅胶柱分离技术难以达到理想结果。为了明确其主要化合物种类,故该组分选用分离效能高、灵敏度高的LC-MS手段进行分离,对含量较高的2个化合物进行MS分析,表明Fr.D组分主要由化合物GF-02（2-硫氧-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酰胺）和化合物GF-03（邻苯二甲酐）组成。为初步揭示化合物GF-01的作用靶点,首先运用分子对接技术将该分子与结核杆菌相关靶点进行虚拟对接,结果显示UDP-吡喃半乳糖变位酶为潜在靶点。然后采用荧光定量PCR技术,测定结核杆菌UDP-吡喃半乳糖变位酶基因（glf）转录水平,对靶点进行初步验证。结果显示,与空白对照比较,被单体化合物GF-01干预后的结核杆菌的基因glf表达量出现下调,其2-??值是空白对照的0.36倍,提示活性化合物对UDP-吡喃半乳糖变位酶无抑制作用,而可能是galE1或glfT的抑制剂。
刘发扬[7]（2020）在《Ipr1的转录调控及其通过p53调控Irgm1的机理研究》文中研究说明位于小鼠1号染色体结核超敏感位点的胞内病原体抗性基因1（Ipr1基因）在机体对抗胞内病原体（如结核杆菌）感染的过程中起重要作用。其同源基因位于牛2号染色体以及人2号染色体的SP110（Ipr1）基因,能够抑制结核杆菌在宿主细胞中的增殖。研究发现,SP110的单核苷酸多态性和宿主是否易感结核密切相关。在胞内病原体感染时,Ipr1/SP110被激活并参与细胞免疫的过程中,与Ipr1类似,免疫相关的GTP酶家族M蛋白1（Irgm1）在病原体入侵引起的自噬调控中具有十分重要的作用。Ipr1与Irgm1都属于结核抗性基因,迄今为止,Ipr1以及Irgm1在宿主细胞中的调控方式尚不清楚。因此研究Ipr1以及Irgm1在细胞内的表达调控对理解机体对抗胞内病原体的机理具有重要作用。本研究结合生物信息学分析、分子生物学、生物化学及细胞生物学研究方法与技术,深入探究了Ipr1基因的上游调控机制及其通过p53调控下游靶基因Irgm1的机制。主要研究结果如下:1.通过对NCBI数据库中DNA病毒,RNA病毒以及多种结核杆菌菌株处理的免疫相关细胞（THP-1,RAW264.7等）的转录组数据进行分析,发现诺如病毒,乙型肝炎病毒,仙台病毒,甲型流感病毒,结核杆菌北京株,标准株（H37Rv）能够激活Ipr1或SP110的表达。除此之外,依托泊苷和阿糖胞苷分别在U937,A673细胞中激活SP110的表达。同时,有研究证明,DNA病毒,H37Rv,依托泊苷以及阿糖胞苷都能够激活细胞内c GAS-IRF3通路。2.c GAS-IRF3通路参与调控Ipr1的表达。通过比对多个物种Ipr1启动子上顺式作用元件,发现ISRE位点在Ipr1的转录调控中起到了关键作用。c GAS-IRF3通路激活剂ISD能够激活Ipr1的表达。而Ipr1核心启动子区上的ISRE突变后,Ipr1核心启动子失去对ISD的应答。过表达IRF3能够显着的激活Ipr1的转录。凝胶阻滞实验和染色质免疫共沉淀实验证明了IRF3可以结合到Ipr1的启动子区上,进而发挥调控Ipr1基因表达的功能。3.Ipr1参与ISD诱导的Irgm1表达调控。Irgm1是调控细胞自噬的关键基因。当使用ISD处理RAW264.7细胞时,Irgm1的m RNA和蛋白质水平显着提高。Irgm1基因的转录起始位点上游470bp到下游462bp是其核心启动子区。ISD处理能够显着激活该段启动子的转录活性。当干扰Ipr1后,Irgm1的表达受到了显着的抑制。过表达Ipr1能够提高Irgm1的启动子活性。4.p53参与Irgm1的表达调控。通过Irgm1的启动子区域顺式作用元件预测发现,在Irgm1的启动子上含有p53的识别位点。该位点的突变显着下调Irgm1的启动子活性。当使用Act D,ISD处理细胞或在细胞中过表达p53后,p53位点突变的启动子活性显着低于野生型。使用Act D,ISD处理细胞或在细胞中过表达p53都能够激活Irgm1基因的转录。5.Ipr1通过与Rpl11,Mdm2的互作调控p53的稳定性。在静息状态下,p53与Mdm2结合并通过泛素化而降解。对Ipr1,Mdm2以及p53互作蛋白的聚类分析发现,Rpl11与Ipr1,Mdm2以及p53都存在相互作用。Co-IP证明Ipr1与Rpl11,Mdm2存在蛋白水平上的相互作用。未过表达Rpl11的情况下,Ipr1对Mdm2与p53的相互作用无显着影响。当体系中加入Rpl11后,过表达Ipr1加强了Rpl11与Mdm2的互作,同时Mdm2与p53的互作受到了显着的抑制。过表达Ipr1可以显着减少泛素化p53的含量。这些结果说明Ipr1通过Rpl11调控Mdm2和p53的互作。本研究阐明了胞内病原体抗性基因Ipr1的上游调控机制以及Ipr1通过p53蛋白调节下游靶基因Irgm1的机制。已有报道证明胞内病原体如结核杆菌的入侵能够激活p53通路,但其详细机理仍然没有被解释清楚。c GAS-IRF3通路作为近几年发现的与细胞免疫直接相关的通路,与p53通路也存在密切联系。通过对Ipr1基因上下游调控机制的研究,本研究证明c GAS-IRF3通路调控Ipr1的表达;Ipr1蛋白能够增强Rpl11和Mdm2蛋白的相互结合,从而促进Mdm2-p53蛋白复合体的分离,降低泛素化p53蛋白水平;p53参与自噬相关基因Irgm1的表达调控。本研究通过对Ipr1功能的研究,将参与细胞免疫反应的c GAS-IRF3通路与调控细胞自噬基因Irgm1表达的p53通路联系在一起,丰富了细胞内信号通路交互联系的理论研究。
葛青[8]（2020）在《转录因子NRF2在老龄大鼠巨噬细胞对结核分枝杆菌易感性中的作用研究》文中研究表明研究背景:结核病是严重危害人类健康的疾病之一。根据WHO提供的最新数据,2018年全球人口中约有900-1110万新发结核病患者,结核病目前仍然是全球十大死亡原因之一,是单一传染性病原体的主要死因（Global tuberculosis report 2019,WHO）分枝杆菌是目前全球造成人类死亡三大传染病之一,侵袭自体的固有免疫系统和适应性免疫系统。机体内的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）是结核病病原体,巨噬细胞作为结核分枝杆菌侵入固有免疫系统的主要靶细胞,巨噬细胞和结核杆菌的相互作用与氧化应激、自噬息息相关。转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor,NRF2）及其介导的信号通路在抵抗微生物感染及炎症损伤过程中的作用,正得到越来越多的关注。作为抗氧化系统的中枢调控因子,NRF2与氧化应激相关的老龄化相关。我们在前期研究中发现,结核病患者NRF2表达水平显着高于健康对照组。因而,本研究旨在探讨转录因子NRF2在老龄大鼠巨噬细胞结核分枝杆菌易感性中的作用及其机制。方法:（1）通过RNA-seq技术检测年轻组和老龄组结核病患者和隐性结核感染者外周血PBMC（peripheral blood mononuclear cell）NRF2基因线性RNA表达水平,分析其与年龄的相关性。（2）通过实时荧光定量PCR（real-time quantitive PCR,q-PCR）技术,检测SD大鼠年轻组和老龄组外周血PBMC中NRF2表达水平差异。（3）通过q-PCR技术,检测M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组大鼠肺泡巨噬细胞后,细胞内的NRF2和抗氧化物SOD-1、NOX-1、NOX-2、NOX-4以及IL-12P35、IL-12P40基因转录表达水平。（4）利用蛋白质印迹技术（Western Blot,WB）来检测M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞NRF2、LC3-Ⅱ蛋白表达水平。（5）利用流式细胞术检测SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞对M.tb吞噬率与凋亡率的差异。（6）利用流式细胞术检测M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）变化差异。（7）使用WB技术检测NRF2抑制剂Brusatol预处理后,M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞NRF2、P62蛋白水平的影响。结果:（1）RNA-seq测序结果显示:健康对照组以及各组结核杆菌患者PBMC中NRF2线性RNA基因表达均与年龄之间呈现显着相关性（P<0.05）,但未见年龄与结核病发病之间存在显着相关性。（2）SD大鼠年轻组和老龄组外周血PBMC中NRF2表达水平有统计学差异（P<0.05,n=3）,年轻组SD大鼠NRF2表达量在转录水平和蛋白水平都要低于老龄SD大鼠组。（3）M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞后,NRF2 m RNA水平与对照组相比显着降低（P<0.05,n=3）,且年轻组SD大鼠组要显着高于老龄组（P<0.05,n=3）;M.tb感染后年轻组大鼠NRF2蛋白水平高于老龄组（P<0.05,n=3）。（4）M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞6 h后,老龄组和年轻组SOD-1m RNA、NOX-1 m RNA、NOX-2 m RNA、IL-12P35 m RNA、IL-12P40 m RNA表达水平相对于对照组水平显着升高,NOX-4m RNA表达水平降低（P<0.05,n=3）;老龄组SOD-1 m RNA、NOX-4 m RNA、IL-12P35 m RNA表达水平低于年轻组;老龄组NOX-2 m RNA、IL-12P40 m RNA、NOX-1 m RNA表达水平高于年轻组（P<0.05,n=3）。（5）M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组大鼠肺泡巨噬细胞后,年轻组SD大鼠自噬蛋白LC3-Ⅱ在蛋白水平高于老龄组SD大鼠组（P<0.05,n=3）,且年轻组未感染组高于老龄组未感染组（P<0.05,n=3）。（6）老龄组SD大鼠肺泡巨噬细胞对M.tb-FITC的吞噬率在2 h、4 h、6 h均高于年轻组SD大鼠组,且随时间变化延长吞噬率也不断增高;Brusatol预处理后,会降低肺泡巨噬细胞的吞噬率（P<0.05,n=3）。（7）M.tb感染老龄组SD大鼠肺泡巨噬细胞后2 h、4 h、6 h凋亡率显着高于年轻组SD大鼠,且随时间变化凋亡率也不断增高（P<0.05,n=3）。（8）M.tb感染30 min后,老龄组SD大鼠肺泡巨噬细胞ROS水平显着高于年轻组SD大鼠（P<0.05,n=3）。（9）与对照组比较,Brusatol预处理后,M.tb感染肺泡巨噬细胞P62蛋白表达被完全抑制;M.tb感染后,年轻组SD大鼠P62蛋白水平显着高于老龄组SD大鼠（P<0.05,n=3）;年轻组SD大鼠NRF2蛋白水平显着低于老龄组SD大鼠（P<0.05,n=3）。结论:（1）老龄大鼠肺泡巨噬细胞NRF2水平的降低与其对M.tb的易感性有关（2）NRF2通过调控胞内氧化应激水平和自噬受体P62增强巨噬细胞对M.tb的易感性。
梁书鑫[9]（2019）在《BAG2在巨噬细胞抗结核分支杆菌感染过程中介导免疫调控的机制研究》文中指出结核病是一种人畜共患的慢性传染病,对人类健康和畜牧业的发展均造成重大威胁。结核分支杆菌是结核病的致病菌,它能够成功地寄宿在宿主巨噬细胞中,一方面宿主启动免疫反应抑制病原体的增殖和扩散,另一方面结核分支杆菌进化各种策略逃避宿主免疫系统的清除。为了抵抗这一致病菌的感染,充分了解宿主与病原体相互作用过程的分子机制是至关重要的。感染过程中,细胞凋亡、自噬、炎性反应和内质网应激之间存在内在联系,且均可影响细胞命运和结核分支杆菌在宿主体内的存活。已有研究表明BCL相关抗死亡基因2（BAG2）与细胞在不同病理条件下的命运决定有关,然而,BAG2在结核分支杆菌感染过程中发挥的作用尚不清楚。本研究以小鼠原代巨噬细胞BMDMs、巨噬细胞系RAW264.7和J744A.1为靶细胞,主要探讨结核分支杆菌诱导的内质网应激条件下,BAG2在巨噬细胞中的作用以及其分子机制,主要研究内容和结果如下:1.研究在结核分支杆菌感染诱导的内质网应激中,BAG2表达变化及调控其变化的机制。首先,通过定量PCR和免疫印迹,研究结核分支杆菌感染巨噬细胞后对内质网应激影响以及BAG2表达的动态变化,结果证实结核分支杆菌感染巨噬细胞后,内质网应激标志蛋白HSPA5和CHOP表达增加,激活内质网应激。同时,本研究结果表明巨噬细胞无论在结核分支杆菌强毒株H37Rv还是弱毒株H37Ra刺激下,BAG2均以时间依赖方式表达下调。之后,通过双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀,研究在感染条件下Bag2启动子核心区域及未折叠蛋白反应中ERN1-XBP1信号通路对BAG2转录调节,结果发现,干扰Ern1或Xbp1抑制感染对BAG2表达影响,恢复BAG2的表达,XBP1结合在Bag2启动子上,抑制其转录。2.研究BAG2在结核分支杆菌感染过程中的功能。首先,通过流式细胞术和CFU计数,研究结核分支杆菌感染巨噬细胞后干扰或过表达BAG2对细胞和结核分支杆菌存活的影响。结果显示干扰Bag2增加细胞凋亡率,抑制细胞活性,从而减少细胞内结核分支杆菌的存活。然后,通过免疫印迹、免疫荧光和透射电子显微镜,研究结核分支杆菌感染巨噬细胞后沉默或过表达Bag2对细胞自噬影响以及其是否通过自噬影响细胞存活。结果证明BAG2增加自噬标记蛋白LC3-II表达和LC3自噬体形成,促进自噬流,并且激活内质网自噬,表现为自噬体与内质网定位增加。随后,利用自噬抑制剂抑制自噬早期或晚期,结果表明在感染条件下抑制自噬增加细胞凋亡。加入自噬抑制剂Baf A1阻碍BAG2对细胞保护作用,细胞活性降低。3.研究BAG2激活细胞自噬和内质网自噬的作用机制。通过免疫共沉淀和免疫印迹,研究干扰Bag2对BCL2和BECN1相互作用的影响。结果显示干扰Bag2抑制ERK1/2和BCL2磷酸化,抑制结核杆菌诱导的BCL2和BECN1解离。同样地,加入ERK抑制剂U0126阻断BAG2对自噬的影响,表明BAG2通过ERK信号通路磷酸化BCL2,促进BECN1解离,激活自噬。之后,通过免疫荧光和免疫共沉淀研究BAG2与自噬受体蛋白SQSTM1相互作用对内质网自噬的影响。研究结果证明BAG2与SQSTM1相互作用依赖PB1和UBA结构域。过表达BAG2显着增加SQSTM1在内质网的定位,促进内质网自噬。4.研究miR-27b/BAG2对炎性反应的影响。通过定量PCR和双荧光素酶报告,研究在结核分支杆菌感染过程中miR-27b动态变化及调控其变化的机制。研究证实巨噬细胞无论感染强毒株H37Rv还是弱毒株H37Ra,miR-27b表达均逐渐增加。感染后TLR2/MyD88/NF-κB信号通路被激活,促进miR-27b转录。其后,通过双荧光素酶报告和免疫印迹,结合生物信息学分析预测和验证Bag2是miR-27b功能性靶基因。结果证明miR-27b直接靶向Bag2 3’UTR,抑制内源性BAG2表达。本研究进一步探索miR-27b/BAG2对炎性因子的影响及作用机制。结果发现miR-27b抑制NF-κB p65激活从而抑制炎性因子的产生,而BAG2激活NF-κB活性。功能挽救实验证明BAG2减弱miR-27b对炎性因子的抑制作用,表明miR-27b/BAG2通过调控NF-κB活性影响炎性因子表达。基于以上研究结果,揭示了BAG2在结核分支杆菌感染巨噬细胞中的功能和作用机制,一方面BAG2在内质网应激条件下,通过细胞凋亡和自噬在调控细胞稳态和结核杆菌存活中发挥重要作用,另一方面BAG2参与miR-27b对炎性反应的调控,避免过度炎性反应,以平衡感染和组织损伤。
张梦[10]（2018）在《溧阳市肺结核病流行情况及等温多自配引发扩增技术在检测结核分枝杆菌中的应用分析》文中研究指明目的:1.了解溧阳市肺结核病流行的主要特征及治疗转归情况,为结核病防控措施提供参考意见。2.分析和比较痰涂片抗酸染色法、罗氏细菌培养法和等温多自配引发扩增法（isothermal multiple self-matching initiated amplification,IMSA）在基层医院检测结核分枝杆菌中的应用,为IMSA法的推广提供依据。方法:1.近年来溧阳市肺结核病流行的主要特征及治疗转归情况（1）收集《结核病信息管理系统》中2014-2017年溧阳市1092例肺结核登记患者的数据,采用描述性的流行病学调查方法,结合SPSS 19.0软件进行统计分析。分析肺结核的发病趋势（登记率、涂阳率和涂阳发病率）、时间、地区、患者的性别、年龄和职业分布特征以及初治和复治情况。（2）上述1092例患者中未及时登记治疗转归情况的患者25例,对除此之外的1067例患者分析的其治愈、完成疗程、死亡、失败和转入耐多药治疗等五种转归结果。2.痰涂片抗酸染色法、罗氏细菌培养法和IMSA法检测结核分枝杆菌的比较和分析（1）选取2014年1月-2018年4月在溧阳市人民医院登记的肺结核患者的合格痰液标本1179例,分别进行痰涂片抗酸染色与罗氏细菌培养,分析比较两种方法对结核分枝杆菌的阳性检出率。（2）选取2017年10月-2018年4月于溧阳市人民医院就诊的144例肺结核疑似患者的合格晨痰标本,分别行痰涂片抗酸染色、罗氏细菌培养和IMSA检测,分析比较三种方法的阳性检出率和特异度,以及IMSA法与抗酸染色法和罗氏细菌培养法的检测一致性。结果:1.近年来凓阳市肺结核病流行的主要特征及治疗转归情况（1）近年来溧阳市肺结核病流行的主要特征①发病趋势:2014-2017年溧阳市肺结核患者年均登记率和年均涂阳患病率分别为34.34/10万和12.42/10万,2014年-2016年登记率和涂阳患病率均连续下降,2017年有所上升;涂阳肺结核患者395名,涂阴患者697名,年均涂阳率为36.17%,2014-2017年连续下降。②流行分布:4年登记的肺结核患者总数6、8、9月最多,2月份最少;本地户籍患者占86.08%,外地户籍患者占13.92%;登记较多的前三个镇区为溧城镇（27%）、监区（18%）和社渚镇（10%）;男女性别比3.53:1,男性肺结核患者多于女性;涂阳肺结核病人中65岁以上老年人占比最高为40.51%;患者职业以农民最多占56.96%。③初治与复治情况:初治和复治的登记肺结核患者分别为937例（85.81%）和155例（14.19%）;初治涂阳患者321例（81.27%）,复治涂阳患者74例（18.73%）。（2）治疗转归情况:初治涂阳和复治涂阳患者的治愈率分别是86.12%和66.67%,失败率分别为3.15%和10.14%,转入耐多药治疗比率分别为2.21%和8.70%,差异均有统计学意义（均P<0.05）;初治涂阴和复治涂阴患者的完成疗程率分别为95.57%和94.44%,差异无统计学意义（P>0.05）;初治患者死亡人数占初治患者的2.38%（22/926）,复治患者死亡人数占复治患者的3.55%（5/141）,差异无统计学意义（P>0.05）。2.痰涂片抗酸染色法、罗氏细菌培养法和IMSA法检测结核分枝杆菌的结果:（1）1179例肺结核患者痰涂片中,抗酸染色法和罗氏细菌培养法的阳性率分别是35.88%和36.30%,差异无统计学意义（P>0.05）。（2）①144例肺结核疑似患者的痰标本中,有122例为肺结核确诊病例,22例为非肺结核病例。痰涂片抗酸染色法的阳性检出率为27.87%（34/122）,罗氏细菌培养法的阳性检出率为31.15%（38/122）,IMSA法的阳性检出率为40.98%（50/122）。IMSA法阳性检出率高于抗酸染色法（P<0.05,差异有统计学意义）;IMSA法与罗氏细菌培养法的阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）;抗酸染色法与罗氏细菌培养法的阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。②122例肺结核临床确诊患者的痰标本中,涂阳肺结核组（34例）:罗氏细菌培养法的阳性率为88.24%,IMSA法的阳性率为100%,差异无统计学意义（P>0.05）。涂阴肺结核组（88例）:罗氏细菌培养法的阳性率为9.09%,IMSA的阳性率为18.18%,差异无统计学意义（P>0.05）。③22例非结核病例中,涂片抗酸染色法和罗氏细菌培养法的特异度均为95.45%,IMSA法的特异度为1 00%。④一致性比较:IMSA法与抗酸染色法的一致性良好（Kappa值为0.720）;与罗氏细菌培养法的一致性程度适中（Kappa值为0.596）。结论:1.2014-2017年溧阳市肺结核患者的主要流行特征及治疗转归情况提示,结核病防控工作需加强对夏秋季、本地人、监区、男性、65岁以上老年人和农民等流行特征的重视,还需加强对复治涂阳患者的治疗,开展耐药情况的分析。2.IMSA法检测结核分枝杆菌简便快速,阳性检出率和特异度较高,检测结果一致性较好,适宜在基层医院中推广应用。
二、PCR技术检测结核杆菌的进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR技术检测结核杆菌的进展（论文提纲范文）
（1）荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色诊断肺结核的效果比较（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.1.1 纳入标准 |
| 1.1.2 排除标准 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 痰液标本收集方法 |
| 1.2.2 荧光定量PCR检测法 |
| 1.2.3 涂片抗酸染色法 |
| 1.2.4 痰培养 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结 果 |
| 3 讨 论 |
（2）具有抗菌活性的新型喹恶啉-N1, N4-二氧化物的设计、合成和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.2.1 喹恶啉类化合物生物活性研究进展 |
| 1.2.2 喹恶啉类化合物构效关系研究进展 |
| 1.2.3 喹恶啉类化合物抗菌作用机制研究进展 |
| 1.2.4 细胞自噬和ROS发挥抗结核杆菌活性的研究进展 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计、合成与活性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌种与细胞 |
| 2.1.2 药物与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的合成 |
| 2.1.6 细菌培养 |
| 2.1.7 抗菌活性的测定(MIC) |
| 2.1.8 抗真菌活性的测定 |
| 2.1.9 细胞培养 |
| 2.1.10 细胞毒性 |
| 2.1.11 抗结核杆菌活性的测定 |
| 2.1.12 3D-QSAR |
| 2.1.13 化合物理化性质预测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(TZN1~26)的结构表征 |
| 2.2.2 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(TZN1~26)理化性质 |
| 2.2.3 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(TZN1~26)抗菌活性 |
| 2.2.4 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物细胞毒性结果 |
| 2.2.5 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物3D-QSAR研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计与合成 |
| 2.3.2 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物抗菌活性的分析 |
| 2.3.3 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物构效关系分析 |
| 2.3.4 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的细胞毒性 |
| 2.4 小结 |
| 3 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计、合成与活性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌种与细胞 |
| 3.1.2 药物与试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的合成 |
| 3.1.6 细菌培养 |
| 3.1.7 抗菌活性的测定(MIC) |
| 3.1.8 细胞培养 |
| 3.1.9 细胞毒性 |
| 3.1.10 抗结核杆菌活性的测定 |
| 3.1.11 3D-QSAR |
| 3.1.12 化合物理化性质预测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(NCH1~33)的结构表征 |
| 3.2.2 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(NCH1~33)理化性质 |
| 3.2.3 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(NCH1~33)抗菌活性 |
| 3.2.4 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物细胞毒性结果 |
| 3.2.5 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物3D-QSAR研究 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计与合成 |
| 3.3.2 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物抗菌活性的分析 |
| 3.3.3 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物构效关系分析 |
| 3.3.4 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的细胞毒性 |
| 3.4 小结 |
| 4 喹恶啉类化合物抗菌作用机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 蛋白酶 |
| 4.1.2 菌种与细胞 |
| 4.1.3 药品与试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 主要仪器和设备 |
| 4.1.6 DNA聚合酶Ⅰ活性抑制试验 |
| 4.1.7 酶动力学试验 |
| 4.1.8 DNA连接酶活性抑制试验 |
| 4.1.9 E.coli DNA Topoisomerase Ⅳ活性抑制试验 |
| 4.1.10 细胞复苏、传代和冻存 |
| 4.1.11 细胞毒性 |
| 4.1.12 体外结核杆菌感染巨噬细胞模型 |
| 4.1.13 细胞膜完整性检测 |
| 4.1.14 结核杆菌ATP水平测定 |
| 4.1.15 胞内氧自由基检测(cROS、mROS) |
| 4.1.16 qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达 |
| 4.1.17 Western Blot方法测定蛋白表达水平 |
| 4.1.18 间接免疫荧光试验 |
| 4.1.19 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 DNA聚合酶Ⅰ活性抑制结果 |
| 4.2.2 DNA连接酶活性抑制试验 |
| 4.2.3 DNA拓扑异构酶活性抑制试验 |
| 4.2.4 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的细胞毒性 |
| 4.2.5 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物干扰结核杆菌能量稳态的平衡 |
| 4.2.6 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物诱导结核杆菌感染的巨噬细胞内氧自由基水平增加 |
| 4.2.7 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物诱导结核杆菌感染的巨噬细胞自噬 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 喹恶啉类化合物对大肠杆菌作用机制的研究 |
| 4.3.2 喹恶啉类化合物对结核杆菌作用机制的研究 |
| 4.4 小结 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 研究生简介 |
| 附录Ⅱ 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物核磁图谱 |
| 附录Ⅲ 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物核磁图谱 |
| 附录Ⅳ 菌种PCR鉴定 |
| 附录Ⅴ 文献综述 抗菌药物主要作用靶点的研究进展 |
（3）山羊副结核病的检测和MHC-DRB3基因与副结核病感染相关抗病性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 副结核病 |
| 1.2 副结核分枝杆菌 |
| 1.3 副结核病的致病机理 |
| 1.4 副结核病的流行病学 |
| 1.5 副结核病的临床症状及病理表现 |
| 1.5.1 临床症状 |
| 1.5.2 病理剖检 |
| 1.5.3 病理组织学检查 |
| 1.6 副结核病的诊断方式 |
| 1.6.1 副结核分枝杆菌分离培养 |
| 1.6.2 分子生物学检测 |
| 1.7 主要组织相容性复合体 |
| 1.7.1 主要组织相容性复合体的分类 |
| 1.7.2 山羊的MHC基因研究进展 |
| 1.7.3 羊主要组织相容性复合体与疾病的相关性研究进展 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 试验材料及方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 检测样本的采集 |
| 2.1.2 试剂盒 |
| 2.1.3 试验仪器和设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病理剖检及组织学检查 |
| 2.2.2 剖检羊粪便病原体全序列基因组检测及分析 |
| 2.2.3 巢式PCR法检测副结核分枝杆菌 |
| 2.2.4 引物合成 |
| 2.2.5 PCR扩增目的片段 |
| 2.2.6 电泳试验 |
| 2.2.7 间接ELISA法检测血清中的抗体 |
| 2.2.8 血液MHC-DRB3 全序列基因检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 剖检病羊检查结果 |
| 3.1.1 病理剖检结果 |
| 3.1.2 病理组织学检查结果 |
| 3.1.3 测序结果对比及分析 |
| 3.2 粪便及血液病原体检测结果 |
| 3.2.1 粪便病原体检测结果 |
| 3.2.2 血液病原体检测结果 |
| 3.3 血清中抗体检测结果 |
| 3.4 MHC-DRB3 全序列基因组测序结果对比及分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 核酸检测应用简介 |
| 1.2 核酸扩增技术 |
| 1.2.1 聚合酶链式反应技术 |
| 1.2.2 等温扩增技术 |
| 1.2.3 小结 |
| 1.3 核酸杂交技术 |
| 1.4 高通量测序 |
| 1.5 可编程核酸酶技术 |
| 1.5.1 基于CRISPR/Cas9 的核酸检测方法 |
| 1.5.2 基于CRISPR/Cas13 的核酸检测方法 |
| 1.5.3 基于 CRISPR/Cas12 的核酸检测方法 |
| 1.5.4 基于 CRISPR/Cas14 的核酸检测方法 |
| 1.5.5 小结 |
| 1.6 原核Argonaute |
| 1.6.1 原核Argonaute简介 |
| 1.6.2 原核Argonaute的体外应用 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第2章 Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的表达纯化及性质研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 寡核苷酸 |
| 2.2.4 本实验所用的培养基 |
| 2.2.5 主要缓冲液 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 重组PfAgo蛋白质表达载体的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌常规转化 |
| 2.3.3 重组PfAgo蛋白质的表达与纯化 |
| 2.3.4 考马斯亮蓝G250 法测定蛋白质浓度 |
| 2.3.5 SDS-PAGE电泳实验 |
| 2.3.6 TBE-PAGE电泳实验 |
| 2.3.7 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 2.3.8 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 2.3.9 不同长度的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.10 不同匹配区的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.11 PfAgo单碱基专一性探究的实验 |
| 2.3.12 验证PfAgo切割产生的ss DNA也能介导PfAgo酶切的实验 |
| 2.4 实验结果和分析 |
| 2.4.1 PfAgo基因的优化与合成 |
| 2.4.2 PfAgo的表达与纯化 |
| 2.4.3 PfAgo切割活性验证 |
| 2.4.4 g DNA与靶 DNA 的互补区域对PfAgo切割靶 DNA 的影响 |
| 2.4.5 g DNA与靶DNA的单碱基不匹配对PfAgo切割效率的影响 |
| 2.4.6 PfAgo切割信号传递活性验证实验 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于PfAgo的核酸检测方法 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 双链DNA |
| 3.2.4 寡核苷酸 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 待检测模拟靶DNA的制备 |
| 3.3.2 TBE-PAGE电泳实验 |
| 3.3.3 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 3.3.4 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 3.3.5 DNA扩增反应 |
| 3.3.6 PfAgo介导的核酸检测(PAND)实验 |
| 3.3.7 反应产物的荧光值测定实验 |
| 3.3.8 HEK293T细胞的培养和基因组DNA提取 |
| 3.3.9 PfAgo介导的核酸检测(PAND)的灵敏度验证实验 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.3.11 临床样品来源 |
| 3.4 实验结果和分析 |
| 3.4.1 探究不同商品化的PCR Mix体系对PfAgo切割靶DNA的影响 |
| 3.4.2 PfAgo介导的核酸检测方法的原理验证 |
| 3.4.3 输入gDNAs与PfAgo的摩尔比对 PAND 的影响 |
| 3.4.4 gn的序列对PfAgo介导的核酸检测的影响 |
| 3.4.5 PfAgo介导的核酸检测的灵敏度探究 |
| 3.4.6 PfAgo介导的核酸检测的专一性探究 |
| 3.4.7 PfAgo介导的核酸检测的应用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 PfAgo介导的新型冠状病毒核酸检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 主要缓冲液 |
| 4.2.3 寡核苷酸 |
| 4.2.4 TBE-PAGE电泳实验 |
| 4.2.5 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 4.2.6 最佳输入gDNA的筛选 |
| 4.2.7 构建模拟靶质粒 |
| 4.2.8 筛选检测D614G突变的gDNAs |
| 4.2.9 SARS-CoV-2 PAND检测方法的构建 |
| 4.2.10 RT-qPCR实验 |
| 4.2.11 验证SARS-CoV-2 PAND的检测下限 |
| 4.2.12 临床样品来源 |
| 4.3 实验结果和分析 |
| 4.3.1 输入g DNA的优化和SARS-CoV-2 PAND的建立 |
| 4.3.2 SARS-CoV-2 PAND的优化 |
| 4.3.3 探究SARS-CoV-2 PAND的检测灵敏度 |
| 4.3.4 SARS-CoV-2 PAND对实际样本的检测 |
| 4.3.5 SARS-CoV-2 D614G突变体的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结合极短PCR和 PfAgo的核酸检测技术 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 |
| 5.2.2 主要缓冲液 |
| 5.2.3 TBE-PAGE电泳实验 |
| 5.2.4 寡核苷酸 |
| 5.2.5 构建含有VP72 基因和HPV16E6 基因的质粒 |
| 5.2.6 USPCRP核酸检测方法的初步验证实验 |
| 5.2.7 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.2.8 USPCRP检测灵敏度探究的实验 |
| 5.2.9 USPCRP检测特异性验证实验 |
| 5.2.10 USPCRP检测RNA的实验 |
| 5.2.11 USPCRP临床样品检测实验 |
| 5.3 实验结果和分析 |
| 5.3.1 USPCRP核酸检测方法的初步验证 |
| 5.3.2 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.3.3 USPCRP检测灵敏度探究 |
| 5.3.4 USPCRP检测特异性验证 |
| 5.3.5 USPCRP检测模拟的DNA病毒基因 |
| 5.3.6 USPCRP检测临床样品 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结和展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）牛结核病诊断技术的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文词缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛结核病简介 |
| 2 牛结核病流行病学 |
| 2.1 自然及生态因素的影响 |
| 2.2 牛结核病分子流行病学研究 |
| 3 牛结核病防控措施 |
| 4 结核病的诊断方法 |
| 4.1 结核特异性抗原蛋白研究进展 |
| 4.2 细菌学诊断方法 |
| 4.2.1 改良抗酸染色法 |
| 4.2.2 噬菌体生物扩增技术 |
| 4.2.3 分枝杆菌生长指标管 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 4.3.1 PCR检测方法 |
| 4.3.2 DNA探针检测 |
| 4.4 免疫学诊断方法 |
| 4.4.1 纯化的结核菌素皮内过敏试验 |
| 4.4.2 皮内比较过敏试验 |
| 4.4.3 IFN-测定 |
| 4.4.4 ELISA诊断方法 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 牛结核病血清学特异性诊断抗原的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 结核特异性蛋白基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 1.2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 1.2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 1.2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 1.2.5 结核特异性蛋白B细胞表位预测 |
| 1.2.6 结核特异性蛋白表达菌株的复苏 |
| 1.2.7 结核特异性蛋白的表达及纯化 |
| 1.2.8 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 1.2.9 结核特异性蛋白Western Blot验证 |
| 1.2.10 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核特异性基因在致病性分枝杆菌中的同源性分布 |
| 2.2 结核特异性蛋白理化分析 |
| 2.3 结核特异性蛋白二级结构分析 |
| 2.4 结核特异性蛋白跨膜结构域的预测 |
| 2.5 结核特异性蛋白B细胞表位分析 |
| 2.6 结核特异性蛋白的表达以及纯化 |
| 2.7 结核特异性蛋白浓度的测定 |
| 2.8 结核特异蛋白Western Blot验证 |
| 2.9 结核特异性蛋白酶联免疫吸附试验初步筛选 |
| 3 讨论 |
| 试验二 牛结核病间接ELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 血清来源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计合成 |
| 1.2.2 目的基因的扩增 |
| 1.2.3 PCR产物的鉴定和纯化回收 |
| 1.2.4 目的基因与T载体的连接 |
| 1.2.5 阳性克隆菌落的PCR鉴定 |
| 1.2.6 质粒提取、T载体双酶切与片段回收 |
| 1.2.7 重组原核表达载体的构建 |
| 1.2.8 表达载体阳性克隆的菌液PCR鉴定与测序 |
| 1.2.9 重组蛋白的表达及最佳诱导时间的确定 |
| 1.2.10 蛋白的可溶性鉴定及纯化 |
| 1.2.11 纯化蛋白的浓度测定以及Western Blot验证 |
| 1.2.12 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.2.13 间接ELISA特异性和敏感性试验 |
| 1.2.14 间接 ELISA 检测临床血清样本检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 结核分枝杆菌基因的扩增 |
| 2.2 pMD-19T载体重组质粒构建 |
| 2.3 目的基因与原核表达载体重组构建 |
| 2.4 目的蛋白的表达及纯化 |
| 2.5 蛋白Western Blot分析 |
| 2.6 间接ELISA检测结核病抗体方法的建立 |
| 2.7 间接 ELISA 特异性试验 |
| 2.8 间接 ELISA 敏感性试验 |
| 2.9 间接 ELISA 检测牛结核病血清的阴阳性符合率 |
| 3 讨论 |
| 试验三 结核分枝杆菌实时荧光定量检测方法的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 菌株培养和DNA模版的制备 |
| 1.2.3 标准阳性模版的制备 |
| 1.2.4 建立SYBR Green I法实时荧光定量PCR标准曲线 |
| 1.2.5 特异性检测 |
| 1.2.6 灵敏性检测 |
| 1.2.7 模拟标本的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 引物的设计 |
| 2.2 目的基因的扩增以及重组质粒的构建 |
| 2.3 标准曲线的建立以及融解曲线的分析 |
| 2.4 荧光定量PCR的敏感性 |
| 2.5 荧光定量PCR的特异性检测 |
| 2.6 模拟样本的检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（6）独山瓜馥木茎抗结核杆菌成分及作用机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词列表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 全球及中国结核流行情况及防治措施 |
| 1.2 结核治疗存在的问题 |
| 1.3 独山瓜馥木的研究现状 |
| 1.4 研究内容、研究目标和技术路线 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究目标 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 1.4.4 课题来源 |
| 第二章 独山瓜馥木抗结核杆菌成分的活性跟踪 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 改良罗氏培养基制备 |
| 2.2.2 独山瓜馥木提取分离 |
| 2.2.3 萃取部位抗结核杆菌活性追踪实验 |
| 2.2.4 活性化合物分离 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同萃取部位活性追踪结果 |
| 2.3.2 二氯甲烷组分活性追踪结果 |
| 2.3.3 活性单体化合物GF-01结构鉴定 |
| 2.3.4 利用LC-MS技术推断Fr.D所含成分 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 活性单体与结核杆菌关键酶的虚拟对接 |
| 3.1 程序系统 |
| 3.2 实验步骤 |
| 3.2.1 结核杆菌靶点蛋白的准备 |
| 3.2.2 配体小分子的准备 |
| 3.2.3 分子对接研究 |
| 3.3 分子对接结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 活性单体对结核杆菌UDP-吡喃半乳糖变位酶转录的干预 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 RNA抽取及检测 |
| 4.2.3 设计与合成引物 |
| 4.2.4 cDNA模板的合成 |
| 4.2.5 荧光定量PCR检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 RNA浓度和纯度测定结果 |
| 4.3.2 荧光定量PCR产物特异性和内参引物通用性检测结果 |
| 4.3.3 基因glf相对定量结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 创新性 |
| 5.3 后续研究建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）Ipr1的转录调控及其通过p53调控Irgm1的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 结核抗性基因及相关信号通路的研究进展 |
| 1.1 结核病概述 |
| 1.1.1 结核病的发现以及重要发展回顾 |
| 1.1.2 结核病的现状 |
| 1.1.3 结核杆菌与宿主细胞之间的相互作用 |
| 1.1.4 结核病的宿主导向治疗 |
| 1.2 Ipr1和Irgm1的研究进展 |
| 1.2.1 Ipr1基因的研究进展 |
| 1.2.2 Irgm1的研究进展 |
| 1.3 小鼠巨噬细胞内信号通路的调控和功能 |
| 1.3.1 cGAS/STING/TBK/IRF3信号通路 |
| 1.3.2 cGAS通路在免疫调控中具有重要作用 |
| 1.3.3 p53信号通路 |
| 1.4 本研究的立项意义和内容 |
| 试验研究 |
| 第二章 IRF3调控Ipr1表达的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 乙型肝炎病毒、诺如病毒、仙台病毒以及流感病毒激活SP110/Ipr1的表达 |
| 2.2.2 H37Rv以及北京株激活Sp110/Ipr1的表达 |
| 2.2.3 依托泊苷和阿糖孢苷激活细胞中Sp110/Ipr1的表达 |
| 2.2.4 ISD激活Ipr1的表达 |
| 2.2.5 ISD处理激活Ipr1启动子区域的转录活性 |
| 2.2.6 Ipr1启动子区域具有高度保守性 |
| 2.2.7 小鼠Ipr1启动子区域含有ISRE,Statx以及Rel |
| 2.2.8 ISRE在Ipr1、 的转录激活中具有重要作用 |
| 2.2.9 IRF3特异性结合Ipr1启动子区的ISRE |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 Ipr1调控Irgm1表达的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 ISD激活RAW264.7细胞中Irgm1的表达 |
| 3.2.2 敲降Ipr1引起Irgm1的下调 |
| 3.2.3 参与调控Irgm1的microRNA预测 |
| 3.2.4 NUDR和 Ipr1的SAND结构域氨基酸组成相似 |
| 3.2.5 Ipr1 影响TNF-α和Irgm1的启动子活性 |
| 3.2.6 Ipr1 不能结合TTCG基序 |
| 3.2.7 Ipr1慢病毒表达载体的构建 |
| 3.2.8 稳定表达Ipr1的RAW264.7细胞系验证 |
| 3.2.9 ChIP数据质量检测 |
| 3.2.10 Ipr1在基因组上的结合位置 |
| 3.2.11 Ipr1的结合位点统计 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 p53调控Irgm1表达的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Irgm1启动子核心区域的确定 |
| 4.2.2 Irgm1启动子区域顺式作用元件预测 |
| 4.2.3 人IRGM基因启动子区域分析 |
| 4.2.4 ActD激活Irgm1的表达 |
| 4.2.5 ADR激活Irgm1 的表达 |
| 4.2.6 p53上调Irgm1的启动子活性 |
| 4.2.7 干扰p53抑制ISD诱导的Irgm1的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 Ipr1通过Rpl11和Mdm2调控p53 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Ipr1参与细胞内信号通路的调控 |
| 5.2.2 ISD处理导致RAW264.7细胞的G1-G0阻滞 |
| 5.2.3 干扰Ipr1下调ISD诱导的p21表达 |
| 5.2.4 Ipr1,p53以及Mdm2 的互作蛋白统计 |
| 5.2.5 Ipr1,p53以及Mdm2 通过核糖体蛋白联系在一起 |
| 5.2.6 Ipr1与Npm1,Rpl11和Mdm2存在相互作用 |
| 5.2.7 Ipr1 通过Rpl11调控Mdm2和p53的相互作用 |
| 5.2.8 ISD提高Mdm2和Ipr1,Rpl11的互作 |
| 5.2.9 Ipr1降低p53蛋白泛素化水平 |
| 5.2.10 ISD THP-1细胞系中SP100和IRGM的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 创新之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）转录因子NRF2在老龄大鼠巨噬细胞对结核分枝杆菌易感性中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 英文缩写 |
| 附录 B 常用试剂配置 |
| 附录 C 个人简历 |
| 附录 D 综述 |
| 参考文献 |
（9）BAG2在巨噬细胞抗结核分支杆菌感染过程中介导免疫调控的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 结核分支杆菌感染与巨噬细胞免疫调控 |
| 1.1.1 结核分支杆菌感染与细胞坏死和凋亡 |
| 1.1.2 结核分支杆菌感染与细胞自噬 |
| 1.1.3 结核分支杆菌感染与细胞炎症 |
| 1.2 BCL相关抗死亡基因(BAG2)的研究进展及其参与抗结核机制的可能性分析 |
| 1.2.1 BAG家族结构与功能简介 |
| 1.2.2 BAG2 功能的研究现状 |
| 1.2.3 BAG2 参与抗结核机制的可能性分析 |
| 1.3 细胞自噬研究进展 |
| 1.3.1 自噬简介 |
| 1.3.2 选择性自噬与细胞稳态 |
| 1.3.3 内质网自噬与自噬受体蛋白 |
| 1.4 内质网应激研究进展 |
| 1.4.1 内质网应激与结核分支杆菌感染 |
| 1.4.2 内质网应激与凋亡 |
| 1.4.3 内质网应激与自噬 |
| 1.5 microRNA研究进展 |
| 1.5.1 microRNA合成及作用机制 |
| 1.5.2 宿主microRNA的调控与结核分支杆菌感染 |
| 1.5.3 miR-27 的研究进展 |
| 1.6 本研究的内容和意义 |
| 第二章 结核分支杆菌感染条件下BAG2 的表达调节及功能 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 细胞培养 |
| 2.1.6 载体构建 |
| 2.1.7 细胞转染 |
| 2.1.8 结核分支杆菌的培养及感染实验 |
| 2.1.9 免疫印迹 |
| 2.1.10 RNA提取、反转录和定量PCR |
| 2.1.11 细胞凋亡检测 |
| 2.1.12 细胞活性检测 |
| 2.1.13 染色质免疫沉淀 |
| 2.1.14 CFU计数 |
| 2.1.15 双荧光素酶报告 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 结核分支杆菌感染巨噬细胞诱导内质网应激 |
| 2.2.2 感染条件下BAG2 表达情况 |
| 2.2.3 BAG2 表达载体和干扰RNA有效性的验证 |
| 2.2.4 ERN1 参与感染条件下BAG2 表达调节 |
| 2.2.5 感染条件下XBP1 通过与Bag2 启动子结合抑制其表达 |
| 2.2.6 感染条件下BAG2 调控细胞和结核分支杆菌的存活 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 结核分支杆菌感染条件下BAG2 影响细胞存活的机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 细胞培养 |
| 3.1.6 载体构建 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 结核分支杆菌的培养及感染实验 |
| 3.1.9 免疫印迹 |
| 3.1.10 细胞活性检测 |
| 3.1.11 免疫荧光 |
| 3.1.12 内质网和溶酶体染色 |
| 3.1.13 透射电子显微镜 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 感染条件下BAG2 促进细胞自噬 |
| 3.2.2 感染条件下BAG2 促进自噬流 |
| 3.2.3 感染条件下抑制自噬促进细胞凋亡 |
| 3.2.4 感染条件下自噬调控细胞活性 |
| 3.2.5 感染条件下BAG2 通过自噬促进细胞存活 |
| 3.2.6 感染条件下BAG2 促进内质网自噬的发生 |
| 3.2.7 感染条件下干扰Xbp1 激活自噬 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 结核分支杆菌感染条件下BAG2 促进细胞自噬的机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与耗材 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 细胞培养 |
| 4.1.6 载体构建 |
| 4.1.7 细胞转染 |
| 4.1.8 结核分支杆菌的培养及感染实验 |
| 4.1.9 免疫印迹 |
| 4.1.10 免疫荧光 |
| 4.1.11 内质网染色 |
| 4.1.12 蛋白质免疫共沉淀 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.2.1 感染条件下BAG2 通过ERK通路影响BCL2 磷酸化 |
| 4.2.2 感染条件下BAG2对BCL2和BECN1 相互作用的影响 |
| 4.2.3 BCL2对BAG2与BECN1 相互作用的影响 |
| 4.2.4 巨噬细胞中BAG2与SQSTM1 相互作用 |
| 4.2.5 感染条件下BAG2 通过SQSTM1 影响内质网自噬 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 结核分支杆菌感染条件下BAG2 调控炎性反应的机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与耗材 |
| 5.1.4 溶液配制 |
| 5.1.5 细胞培养 |
| 5.1.6 载体构建 |
| 5.1.7 细胞转染 |
| 5.1.8 结核分支杆菌的培养及感染实验 |
| 5.1.9 免疫印迹 |
| 5.1.10 RNA提取、反转录和定量PCR |
| 5.1.11酶联免疫吸附实验 |
| 5.1.12 CFU计数 |
| 5.1.13 双荧光素酶报告 |
| 5.1.14 免疫荧光 |
| 5.1.15 细胞核与细胞质蛋白分离提取 |
| 5.1.16 Griess法检测NO含量 |
| 5.2 研究结果 |
| 5.2.1 定量PCR检测结核分支杆菌感染对miR-27b表达的影响 |
| 5.2.2 感染条件下TLR2/MyD88/NF-κB调控miR-27b表达 |
| 5.2.3 感染条件下miR-27b抑制炎性因子的产生 |
| 5.2.4 生物信息学预测miR-27b的靶基因 |
| 5.2.5 双荧光素酶报告验证miR-27b靶向Bag2 |
| 5.2.6 免疫印迹验证miR-27b调控BAG2 蛋白表达 |
| 5.2.7 挽救实验验证miR-27b/BAG2 调控炎性因子产生 |
| 5.2.8 miR-27b/BAG2 调控炎性反应的机制研究 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）溧阳市肺结核病流行情况及等温多自配引发扩增技术在检测结核分枝杆菌中的应用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 2014-2017年溧阳市肺结核病的流行特征与治疗转归分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 地域人口资料 |
| 2. 资料来源 |
| 3. 治疗转归相关概念 |
| 4. 统计方法 |
| 5. 质量控制 |
| 二、结果 |
| 1. 2014-2017年溧阳市肺结核患者的流行特征 |
| 2. 治疗转归分析 |
| 三、讨论 |
| 1. 溧阳市肺结核流行特征 |
| 2. 治疗转归分析 |
| 第二部分 溧阳市结核分枝杆菌的检测方法比较 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二、结果 |
| 1. 痰涂片抗酸染色法与罗氏细菌培养法的检测结果的比较 |
| 2. 痰涂片染色法、罗氏细菌培养法和IMSA法检测结果的比较 |
| 三、讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
四、PCR技术检测结核杆菌的进展（论文参考文献）
- [1]荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色诊断肺结核的效果比较[J]. 路爱丽,廖卫. 深圳中西医结合杂志, 2021(24)
- [2]具有抗菌活性的新型喹恶啉-N1, N4-二氧化物的设计、合成和作用机制研究[D]. 张鹤营. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]山羊副结核病的检测和MHC-DRB3基因与副结核病感染相关抗病性的初步研究[D]. 丁涵. 内蒙古农业大学, 2021(02)
- [4]基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究[D]. 何如怡. 湖北大学, 2021(01)
- [5]牛结核病诊断技术的建立与初步应用[D]. 杨航. 石河子大学, 2020(01)
- [6]独山瓜馥木茎抗结核杆菌成分及作用机制初探[D]. 安婷婷. 贵州大学, 2020(02)
- [7]Ipr1的转录调控及其通过p53调控Irgm1的机理研究[D]. 刘发扬. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [8]转录因子NRF2在老龄大鼠巨噬细胞对结核分枝杆菌易感性中的作用研究[D]. 葛青. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [9]BAG2在巨噬细胞抗结核分支杆菌感染过程中介导免疫调控的机制研究[D]. 梁书鑫. 西北农林科技大学, 2019
- [10]溧阳市肺结核病流行情况及等温多自配引发扩增技术在检测结核分枝杆菌中的应用分析[D]. 张梦. 苏州大学, 2018(06)