一、应用在食品工业酶活力定性的检测方法（论文文献综述）
裴雯雯,曾艳,刘娟娟,张建刚,王敏,孙媛霞[1]（2022）在《β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌表达、酶学性质分析及其在宝藿苷Ⅰ制备中的应用》文中研究指明为获得安全高效的β-葡萄糖苷酶用于生物催化淫羊藿苷水解制备宝藿苷Ⅰ,通过大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA5在食品安全菌株枯草芽孢杆菌WB600中异源表达Thermotoga petrophila来源的耐热β-葡萄糖苷酶TpBgl3,研究了所表达重组酶的酶学性质及其水解宝藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺条件。结果表明,菌株在30℃、SR培养基中发酵培养48 h后,上清液中的β-葡萄糖苷酶酶活力达到69.68 U/mL。重组表达的TpBgl3最适温度为85℃,最适pH为4.0,在65℃、pH4.0下放置3 h仍能保持85%以上的相对酶活。在65℃、pH4.0、酶用量0.16 U/mg、反应时间20 min的优化条件下,其能将10 g/L的淫羊藿苷水解转化为7.50 g/L的宝藿苷Ⅰ,摩尔转化率为98.67%。β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌分泌表达为宝藿苷Ⅰ及其他高附加值苷元类化合物的工业化安全高效生物制备提供了新途径。
周霞[2]（2021）在《解淀粉芽孢杆菌脲酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达及尿素降解应用研究》文中认为氨基甲酸乙酯（EC）是一种存在于黄酒中的潜在致癌物,脲酶因其可降解EC的前体物质尿素而备受关注。为提高黄酒的食品安全,本研究在枯草芽孢杆菌中实现了基因挖掘所得的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IT-45中脲酶（Ba-urease）的表达与应用。通过对包含目的脲酶基因的重组枯草芽孢杆菌进行表达调控和发酵优化,提高了重组菌的脲酶活性,并验证了其有效降解尿素的功能。本研究为黄酒中尿素的降解提供了一种有效的方案,在传统发酵食品工业中具有一定的应用前景。（1）通过前期的脲酶基因序列、结构分析,挖掘获得来源于B.amyloliquefaciens IT-45的只包含三个结构亚基Ure A、Ure B、Ure C的脲酶基因簇Ba-urease。将该脲酶基因簇在枯草系统Bacillus subtilis WB168、B.subtilis WB600、B.subtilis WB800中分别重组表达,比较生长趋势与酶活,发现重组菌株B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure获得较高的脲酶活力,为6.85 U·m L-1。因此,选定B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure进行后续研究。（2）采用枯草密码子优化、核糖体结合位点优化重新组装Ba-urease的策略,使Ba-urease的酶活力从6.85 U·m L-1提升至9.01 U·m L-1;通过调整基因ure C至ure A、ure B前,强化了Ure C的表达,重组菌株B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure-2的脲酶活力进一步提升至10.15 U·m L-1,相对于原始脲酶活力提高了48%。通过更换高强度的组成型启动子重构脲酶表达菌株,但因质粒的不稳定性而未成功提高脲酶活性,依旧选定P43启动子作为表达启动子。对重组脲酶表达菌株B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure-2在500 m L摇瓶发酵的基础上进行发酵条件优化,最终确定TB培养基、3%接种体积分数、28℃表达温度、4 mmol·L-1 Ni2+添加量为最佳发酵条件。在此条件下,重组脲酶Ba-urease的活力达到12.5 U·m L-1,相对于原始脲酶活力提高了82%。（3）探究了重组脲酶的酶学性质,可得:最适反应温度为37℃,且在30℃-37℃范围内可以保持30%以上的酶活力;最适反应p H范围为6.5-7.0,为中性脲酶。此外,该重组脲酶在30℃-50℃及p H 6.0-7.0范围内具有相对较好的稳定性,亦可耐受一定低浓度（0%-15%）的乙醇。这为日后开发有效降解酒精饮料中尿素的技术奠定了基础与研究方向。通过高效液相色谱检测到,重组脲酶可以直接有效地降解尿素溶液中的尿素,降解率约为36%-68%;运用于模拟酒样时,尿素降解率为20%-35%;而在黄酒体系中降解率降低为7%,此时重组脲酶菌株的降解率也只能达到11%。基于该重组脲酶在混合体系中应用的局限性,本研究同时采用了包埋法、交联法的固定化方式处理重组脲酶菌株,随后应用在黄酒酒样中,尿素降解率分别约为30%、20%。重组脲酶安全有效、操作方便,反应p H及其稳定性仍需进一步提高。
吴玉峰[3]（2021）在《高产洛伐他汀红曲菌的选育及其在黄酒中的应用研究》文中进行了进一步梳理针对目前红曲黄酒降脂保健成分含量极低,色价低且不稳定的问题,本论文以提高红曲黄酒中洛伐他汀含量和色泽稳定性为主要目的,从各地红曲中分离筛选获得产洛伐他汀、红曲色素含量较高的红曲菌,通过诱变育种手段选育出酿酒用高产洛伐他汀、红曲色素菌株,将其应用于红曲黄酒的发酵酿造,最终提高了红曲黄酒中洛伐他汀的含量和色价。并且研究了避光储存条件下影响红曲黄酒色价的因素,以此提高红曲酒色价稳定性、改善货架期褪色现象。本论文的主要结果如下:1.对我国主要产地红曲中的红曲菌分离筛选。从40份红曲样品中分离筛选出49株红曲菌株,其中41株为紫色红曲菌（Monascus purpureus）,5株为高粱红曲菌（Monascus kaoliang）,2株为从毛红曲菌（Monascus pilosus）,1株为红色红曲菌（Monascus ruber）;经固态发酵筛选获得一株产洛伐他汀、色素能力较高的紫色红曲菌H5-3,洛伐他汀产量17.90 mg·g-1,色价3195.27μ·g-1,糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶的活力分别达2514.26U·g-1、0.32 U·g-1、300.19 U·g-1,且该菌株不产桔霉素,是可应用于红曲黄酒酿造的功能红曲霉菌。2.通过诱变育种提高了红曲菌H5-3产洛伐他汀和红曲色素的能力。对红曲菌H5-3进行紫外诱变,通过对82株突变菌株固态发酵初筛得到了10株正突变菌株,经复筛获得了一株产洛伐他汀、红曲色素及酶活性能优良的正突变菌株Z-27,洛伐他汀含量为23.41 mg·g-1,提高了30.78%左右。对菌株Z-27进行常温等压等离子体诱变,通过对47株突变菌株进行固态发酵初筛得到了4株正突变菌株,经复筛获得了一株高产洛伐他汀、红曲色素且稳定遗传的菌株W-4,洛伐他汀含量为32.47 mg·g-1,较菌株Z-27产量提高了38.70%左右,较菌株H5-3产量提高了81.39%左右,并且色价为4638.18μ·g-1,糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶的活力分别达2255.96 U·g-1、0.35 U·g-1、270.81 U·g-1,且该菌株不产桔霉素。3.以红曲W-4为发酵剂酿造富含洛伐他汀的红曲黄酒。将菌株H5-3、W-4制成红曲分别应用于3 L体系红曲黄酒的酿造,通过比较理化指标、风味物质和功能物质等指标,菌株W-4酿造的红曲黄酒各项指标均符合国家黄酒标准,酒体中的洛伐他汀含量明显高于菌株H5-3（P<0.05）。因此利用菌株W-4进行100 L发酵罐体系黄酒的酿造,制备的红曲黄酒洛伐他汀含量达115.02 mg·L-1,色价29.28μ·m L-1,经标准饮酒单位换算红曲酒中每一饮酒单位洛伐他汀含量为7.05 mg。并针对红曲黄酒中的洛伐他汀及色价的稳定性,通过避光室温贮藏6个月后发现洛伐他汀含量没有明显下降,在酒体中有着较好的稳定性;但色价下降了64.10%,稳定性较差。4.解析避光条件下影响红曲黄酒色价稳定性的因素,延长红曲黄酒货架期,改善红曲黄酒颜色不稳定现象。通过探究避光储存条件下影响红曲酒色价稳定性的关键因素,发现温度是影响红曲黄酒颜色不稳定的首要因素,红曲酒在60℃、80℃、100℃加热处理2 h后红色素保存率分别为88.97%、71.86%、58.18%,在4℃、25℃、37℃避光储存90 d后红色素保存率分别为72.01%、39.13%、29.90%;红曲酒中的乙酸、乳酸等酸类成分也是影响红曲酒颜色不稳定的因素,避光存放90 d后分别使红色素保存率降低了17.56%、15.68%;红曲酒中的酒精度、儿茶素等成分会减缓红色素的降解,添加20%（v/v）乙醇、8%（m/v）儿茶素避光37℃存放90 d后红色素稳定性较对照提高了56.86%、46.29%。因此在4℃条件下避光储存红曲黄酒效果最佳,较室温条件下（25℃、37℃）色价稳定性提高了84.03%、140.83%。综上所述,本论文从福建、广东、浙江等地红曲中分离筛选出产洛伐他汀、红曲色素含量较高的红曲菌,并通过紫外——常温等压等离子体诱变技术有效提高了红曲中洛伐他汀和红曲色素含量,从而提高了红曲黄酒中洛伐他汀的含量和色价,对推广功能性红曲在食品行业中的应用以及提高红曲黄酒的功能品质、延长货架期具有重要意义。
王梦超,郑宏臣,赵兴亚,徐健勇,肖冬光,宋诙[4]（2020）在《实验室芽孢杆菌菌种库中高产蛋白酶、糖基转移酶菌株的测定与筛选》文中指出该研究以实验室前期构建的小型芽孢杆菌菌种库中的335株芽孢杆菌菌株为研究对象,通过测定其产蛋白酶和糖基转移酶的特性挖掘到蛋白酶缺陷菌株68株、产中性蛋白酶菌株185株、产碱性蛋白酶菌株217株和具较强蛋白分泌能力的菌株87株。经进一步筛选获得22株高产碱性蛋白酶菌株和12株高产中性蛋白酶菌株;另外,基于此菌株资源库,同时进行了产新型糖基转移酶的菌株筛选,以甜菊苷为底物,得到了13株底物转化率达50%以上的菌株,其中菌株BAP#和114#的转化产物分别被鉴定为莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷E。综上可见,实验室的芽孢杆菌菌株资源库虽然规模较小,但无论是对于常用工业酶制剂的开发,还是对于新型食品用酶的定向挖掘,都提供了丰富和多样的菌种资源,显示了很好的菌种筛选应用前景。
王睿[5]（2020）在《基于理性设计及两亲聚合物修饰提升华根霉脂肪酶特性的研究》文中研究指明微生物是脂肪酶的重要来源,其中根霉是微生物脂肪酶的重要生产菌。根霉脂肪酶已广泛应用于酶促酯交换、酶促酯水解、油脂精炼等工业,但是根霉脂肪酶属于中温酶,高温下半衰期(t1/2)较短,而且酸碱耐受性差,在应用过程中易失活,其耐受性及催化活性还有待提高。本文综合利用了二硫键设计、基于折叠自由能（ΔΔG）的理性设计、分子动力学模拟等手段,对来源于华根霉（Rhizopus chinensis CCTCCM201021）的脂肪酶r27RCL进行设计、筛选和优化,从“小而精”的突变库中筛选到了热稳定性和耐碱性提高的突变体,再利用化学修饰的手段,进一步提高酶的活性。具体内容包括:（1）通过引入二硫键的方式提高酶分子的热稳定性。以Disulfide by Design软件对脂肪酶r27RCL内部及表面可能形成的二硫键突变位点进行预测,从中选择了表面7对、内部5对潜在的二硫键进行实验验证。最终筛选出分子表面的二硫键突变m9/10（S85C/Q145C）和分子内部的二硫键突变m17/18（F223C/G247C）。m9/10及m17/18的T5030值分别提高4.2℃和8.5℃,60℃下的t1/2比野生型分别提高4.5倍和19倍;m17/18的最适p H由8.0上升至9.0;碱性条件下的耐受性也有所提升。（2）通过理性设计（Fold X5）的方法提高酶分子的热稳定性。以突变位点的ΔΔG和位点的柔性（B-factor和RMSF）为筛选依据,综合选取了19个氨基酸位点（共30个点突变）进行实验验证,获得了热稳定性显着提升的突变酶m22（S142A）、m26（S250Y）、m28（Q239F）和m29（D217V）。突变酶中m29的Topt提升至45℃,T5030值分别提高了4.1℃,5.5℃,6.0℃和7.2℃,60℃下的t1/2比野生型分别提升4.6、5.3、7.6和14.5倍。突变体的模拟结构分析表明脂肪酶局部结构的疏水性是热稳定性提高的主要因素之一。分子动力学模拟（MD）结果表明,突变限制了脂肪酶局部区域的柔性从而提高了热稳定性。（3）组合正向突变位点获得组合突变酶m30（F223C/G247C/S85C/Q145C）,m31（S142A/S250Y/Q239F/D217V）和m32（F223C/G247C/S85C/Q145C/S142A/S250Y/Q239F/D217V）。m30、m31和m32的Topt上升至45℃、45℃和50℃,T5030值分别提高了14.2℃、15.8℃和21.2℃,60℃下的t1/2比野生型分别提升34.4、41.8和74.7倍。m30和m32的p Hopt均由8.0变化至9.0,耐碱性提升。（4）利用分子动力学模拟（MD）研究了m31和m32热稳定性提高的机制,结果表明,r27RCL中部分氨基酸残基的均方根涨落（RMSF）值远高于m31和m32中的对应位点,说明突变使得部分不稳定的氨基酸柔性变小,从而使整个酶更加稳定;m31和m32的溶剂可及表面积（SASA）、回旋半径（Rg）和吉布斯自由能变（ΔΔG）较r27RCL下降约7 nm2、0.02-0.03?和25-50 kcal/mol,表明热稳定性突变体的结构更加紧密;m31和m32较r27RCL均多形成了一对盐桥（Glu292-His171）,也使它们具有更好的稳定性。（5）基于两亲聚合物对酶的化学修饰提高脂肪酶催化活性。以均苯三甲醛、聚乙二醇（3-氨丙基）醚和1,6-二氨基己烷或1,12-二氨基十二烷为原料,设计并合成类亚胺型新型两亲聚合物P1和P2。它们在水溶液中形成纳米颗粒,并可以进一步包裹脂肪酶形成粒径为150-600 nm的纳米粒子。聚合物的包裹可以显着提升脂肪酶的催化性能,在P1和P2添加浓度为0.04 m M时,可将脂肪酶催化活性提升2.75和3倍。此外,P1还对热变性和化学变性脂肪酶的构象起到促进复性的作用。综合分析表明,聚合物起到促进酶活和辅助复性的作用可能主要通过以下因素实现:1)聚合物提供酶催化的油水界面,2)聚合物中亲水的乙二醇结构和酶分子中的氨基形成氢键。
曾君瑞[6]（2020）在《巨大芽孢杆菌来源的β-淀粉酶在枯草芽杆菌中的重组表达及应用研究》文中提出β-淀粉酶（α-1,4-D-glucan maltohydrolase,EC3.2.1.2）,是一种外切型淀粉酶,当作用于直链淀粉时,主要生成β-麦芽糖、葡萄糖以及麦芽三糖,而作用于支链淀粉时,主要生成麦芽糖及极限糊精。β-淀粉酶在啤酒酿造、制糖等生产领域有广泛的应用,商品化的β-淀粉酶主要来源于植物,热稳定性、p H耐受性较好,但工艺复杂,成本较高,且酶质量不稳定、纯度不高,而微生物来源的β-淀粉酶专一性、经济成本低,更易达到规模化生产,因此受到研究学者的青睐。本论文通过β-淀粉酶基因重组克隆表达技术,筛选单启动子、构建双启动子提升调控基因表达的强度,并同义突变高度保守的碳分解代谢物响应元件（catabolite responsive element,CRE）区域,以阻止分解代谢物控制蛋白（catabolite control protein A,Ccp A）形成的复合物与其结合,缓解碳分解代谢物阻遏效应（carbon catabolite repression,CCR）,最后经过培养条件优化,β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中表达水平达到8616.1 U/m L。主要研究内容如下:（1）β-淀粉酶基因重组表达体系的构建:成功扩增Bacillus.megaterium DSM 319来源的β-淀粉酶基因Amy M与来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解链淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的22个天然启动子连接,成功构建了22株由单一启动子介导β-淀粉酶表达的重组菌株,经过测定发酵上清液中β-淀粉酶酶活,结果显示由P43、Pamy Q、Psig W、Pspov G、Pgsi B、PB.liche-apr、Pnpr B启动子介导表达的β-淀粉酶酶活水平较高,进一步筛选了不同组合的双启动子,测定β-淀粉酶酶活水平,显示双启动子P43-P43组合介导的β-淀粉酶重组菌株,在摇瓶发酵培养条件下酶活最高为2950.8 U/m L。（2）重组β-淀粉酶的纯化及酶学性质研究:对重组菌株p BED01(P43-P43)摇瓶发酵,取发酵上清液进行镍柱亲和层析纯化,结果显示重组酶β-淀粉酶的比酶活为361.04 U/mg,回收率为17.29%,纯化倍数为3.04,SDS-PAGE电泳结果显示蛋白的分子量约为50 k Da,重组β-淀粉酶经酶学性质分析,显示重组β-淀粉酶最适温度为50℃,最适p H值为6.0,在温度为35～45℃以及p H在5.0～6.0范围内β-淀粉酶具有较好的稳定性,金属离子Co2+对重组β-淀粉酶酶活有明显的激活作用,Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+随着浓度的变化,β-淀粉酶酶活力一直处于抑制状态,其中Ba2+的抑制效果最为明显。（3）缓解碳分解代谢阻遏效应:β-淀粉酶的基因中存在高保守的分解代谢物响应元件（catabolite responsive element,CRE）,并与反式阻遏蛋白—分解代谢物控制蛋白（catabolite control protein A,Ccp A）结合。定点突变CRE相应元件中的碱基,导致阻遏复合物无法与CRE位点结合,从而缓解碳分解代谢阻遏（Carbon catabolite repression,CCR）的影响。本研究结果显示,经过定点突变CRE位点的保守碱基,β-淀粉酶的酶活表达水平最高为4663.0 U/m L,相较于未突变前提高了58.0%。（4）高表达重组菌株p BE05发酵培养条件优化及应用:优化碳源为2.5%马铃薯淀粉,优化氮源为3%的酵母粉和胰蛋白胨复合氮源（2:1）,培养基初始p H为7.0,同时发酵摇瓶温度为34℃时,经发酵培养27 h时,取样测定上清液中重组β-淀粉酶的酶活水平达到最高8616.1 U/m L,相较未发酵优化前β-淀粉酶酶活提高了84.8%。将发酵产生的重组β-淀粉酶应用于糖化过程,探究重组β-淀粉酶加入量对麦芽糖转化率的影响,经研究发现当重组β-淀粉酶液的加入量为200 U/g时,麦芽糖的转化率达到了最高水平为57.6%,继续添加β-淀粉酶,麦芽糖转化率则不再提高。
许忠豪[7]（2020）在《酶@MOF的制备及其在处理有机污染物中的应用》文中研究指明酶凭借其高专一性、高转化率等优势广泛应用于食品、纺织、医药、农业等领域。然而,大多数游离酶在使用过程中容易发生不可逆变性失活,难以重复利用,限制了其在苛刻或不确定因素较多的条件下使用,如水污染处理中的染料降解、农药降解等。通过游离酶的固定化能够有效地解决以上问题,产生积极的环境效益和社会效益。金属有机骨架（MOF）是一类多孔材料,由含金属的节点和通过配位键连接的有机配体组成,在各种应用中都具有广阔的前景。由于金属中心原子和有机配体的几何形状和化学键结合的多样性,可以针对特定功能设计和定制MOF的结构。因其非常高的表面积和孔体积非常高,且易于进行孔径调节,还可对有机配体上的功能团修饰,合成条件温和的MOF有望成为酶固定化的有效载体。1)本文首先筛选MOF载体材料,确定以锌离子为中心原子、2-甲基咪唑为有机配体,通过一步仿生矿化法合成过氧化氢酶@MOF酶复合物（CAT@ZIF-8）。通过电镜-元素分析、X射线衍射、红外光谱、热重分析等表明,复合材料的粒径为10μm左右,过氧化氢酶（CAT）成功负载且结构完整性高度保留,固定化酶的蛋白负载量为70.21w%,比活为1.42。2)研究了游离CAT与CAT@ZIF-8的酶催化反应动力学。结果表明游离CAT与CAT@ZIF-8的米氏常数Km分别为4.165和0.095 g（H2O2）/100g（H2O2,aq）,证明CAT@ZIF-8与底物的亲和力更强,固定化酶的活性中心在同等条件下与底物更容易接触,从而表现出更好的催化效果。CAT@ZIF-8去除H2O2的最适条件为:pH 7.0、温度25℃、H2O2浓度0.2w%、催化剂用量0.05 g,H2O2的去除率最高可达98%,在循环使用5次后仍然保持其原始活性的54%,而游离酶首次回收活性仅剩23%。选择大连理工大学盘锦校区八食堂的墨鱼清洗液,CAT@ZIF-8对废液中H2O2的去除率高达95%,远超游离酶的31%。3)研究了CAT@ZIF-8催化吡虫啉降解的反应。去除吡虫啉的最适条件为:pH 7.0、温度35℃、吡虫啉浓度10 ppm、酶浓度1 g/L。在最适条件下,CAT@ZIF-8对吡虫啉的去除率可以达到52.69%,是游离酶去除率（29.21%）的1.80倍,且在循环使用5次后仍然保持其原始活性的50%。选择市售小白菜喷涂吡虫啉,以考察CAT@ZIF-8农残的去除效果,CAT@ZIF-8的各组平均去除率为26%,仍然为游离酶（13%）的2倍。本论文提出了一种新型的CAT@ZIF-8复合材料的一步法封装工艺制备,固定化酶的负载率70 wt%,与游离CAT相比具有Km值低、酶活性高的优势。此外,在更苛刻的条件下,固定化酶也体现出了较游离酶更好的稳定性和耐受性。CAT@ZIF-8还在重复使用性上得到了显着的提高,这对于在苛刻的条件下有效去除处理食品加工废水、农业污水、染料废水中的难降解有机污染物具有明显优势。该研究拓展了MOF-酶固定化技术,使其能够应用于环境中难降解有机污染物的去除,具有更多实际应用潜能。
王升[8]（2020）在《AX公司食品酶大客户营销策略研究》文中进行了进一步梳理食品酶是通过动植物提取或者微生物发酵反应形成的,是以符合我国食品安全标准与添加剂标准的作为食品添加剂的一类酶制剂。食品酶以其天然环保、催化速度快、特性专一等优势,在食品工业中扮演着非常重要的角色。现阶段,食品酶市场规模已经突破20亿美元,在科技快速发展的过程中,食品酶以其针对性强、效果显着、节能高效等特性为我国食品工业的发展带来新的方向。AX公司成立于2001年,是广西产销量最大的食品酶生产、研发、销售和服务的高新技术企业。近年来,由于国内猪瘟疫情和国际市场中美贸易战的影响,销售增长乏力,在激烈的市场竞争环境中,如何利用大客户营销手段,提升商品销售规模是困扰企业发展的主要问题。本文以AX公司大客户市场营销为研究对象,根据市场营销理论、战略管理方法以及4P、4R等经典营销理论,探析食品酶产业大客户市场营销问题,深入分析AX公司大客户市场营销现状及目标市场定位,分析AX企业在大客户市场营销活动中主要存在的产品策略、定价策略、渠道策略以及促销策略等问题以及相应的改进思路与路径,制定出AX公司的营销战略和营销组合策略,优化公司的营销策略,在一定程度上帮助公司提高大客户营销的效果。
刘永康[9]（2020）在《碱性蛋白酶高产菌株的诱变选育》文中认为碱性蛋白酶指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶,最适p H在9～11之间。其活性中心大都含丝氨酸,又称丝氨酸蛋白酶。广泛应用于洗涤剂、食品、丝绸、制革、医疗等行业。目前,国外大公司垄断着蛋白酶制剂品,国内企业有生产但是酶产量低、价格昂贵、酶学性质不理想等问题使企业盈利低,因此,如何提高菌株的产酶能力和发酵条件的优化依然是研究的热点问题。本实验以河南仰韶生化工程有限公司的2709碱性蛋白酶菌株为研究对象,利用多种诱变方法选育出高产菌株,研究其酶学性质,并进行工艺优化。1.选育碱性蛋白酶高产菌株从碱性蛋白酶菌株2709分离出一株产酶稳定的菌株Y9（15582 U/m L）。对菌株Y9进行了诱变选育,结果发现,当紫外线为30 W,距离20 cm时,诱变60 s,正突变率较高;利用硫酸二乙酯与紫外线对菌株进行复合诱变,用浓度1.5%的硫酸二乙酯处理30 min后进行紫外诱变;又利用常压室温等离子体诱变技术对菌株进行诱变,气源用氩气,功率为100 W,诱变时间为70 s时,正突变率较高。菌株用多种诱变方法反复诱变,最后获得一株碱性蛋白酶高产菌株A59,其酶活为23485 U/m L,通过遗传稳定性分析,发现遗传稳定性较好。该菌株与出发菌株相比,酶活提高了50.72%。2.碱性蛋白酶酶学性质的研究对菌株A59所产碱性蛋白酶进行酶学性质的初步研究。结果发现,该酶的最适作用温度为55～60℃;酶的最适作用p H为9～11;温度在45℃以下时,酶具有良好的热稳定性;p H在8～10.5之间时,具有较好的p H稳定性和耐碱性;该酶对1 mol/L的H2O2具有较强的抗氧化性;Ca2+、Mn2+可稍微提高酶活,Fe2+、Zn2+几乎完全抑制酶反应,Mg2+、Na+、K+对酶活无明显影响。通过酶学性质研究,发现该菌株与出发菌株的酶学性质几乎一致,说明该菌株的酶成分几乎没有什么改变。3.碱性蛋白酶高产菌株发酵工艺的研究以菌株A59为研究对象,通过对影响该菌株的9个因素进行研究,结果发现,当豆粕粉3.6%、玉米粉5.2%、磷酸氢二钠浓度0.8%、Mg2+浓度0.15%、吐温-80浓度0.12%、接种量5%时,酶活为36829 U/m L。在这些因素中,影响产酶最显着的因素是Na2HPO4浓度、Mg2+浓度、吐温-80浓度。对这些因素进行3因素5水平的响应面试验,结果发现,当Na2HPO4浓度0.9115%、Mg2+浓度0.1593%、吐温-80浓度0.09%时,菌株的预测酶活达到38758.626 U/m L。该条件下,通过进一步验证,酶活为38650 U/m L,提高了64.57%。通过对菌株A59进行发酵动力学分析可知,培养到42 h,菌株的酶产量到最高值38650 U/m L,比出发菌株发酵时间提前了4 h左右。4.碱性蛋白酶的发酵罐试生产以摇瓶优化工艺为基础,对A59进行放大试验。优化后,1 m3发酵罐的发酵工艺参数为:装料系数0.7,接种量5%,温度38℃,溶氧维持在20%～30%,此时,转速200 r/min,通风量1:0.5～1:2.5。发酵液p H值7.0。在32 h时,酶活力最高。通过8批次试验,平均酶活为52000 U/m L。根据液相体积传氧系数kL·a相同原则放大到5 m3发酵罐,将溶氧控制在20%～30%。发酵时间约为30 h,产酶性能稳定,通过5批次试验,平均酶活为52764 U/m L,可以用于工业生产。通过35 m3发酵罐的放大试验,溶氧控制在20%～30%,此时,搅拌转速160 r/min,通风量1:0.5～1:2.5。发酵时间约为29 h,通过8批次试验,酶活平均达到52784 U/m L,产酶性能稳定。与小试的发酵动力学曲线对比,提前3 h达到最大产酶量,缩短了发酵时间。
刘雪莲[10]（2020）在《耐高温α-淀粉酶的分子进化和高效表达》文中提出耐高温α-淀粉酶是重要的工业酶制剂,广泛应用于淀粉制糖、发酵、酿造和纺织等工业领域。现有耐高温α-淀粉酶的工业化生产技术不断更新的基础是更高产酶水平工业生产菌株的选育与工业化应用。本实验室在前期的研究中,以地衣芽胞杆菌工业表达系统为基础,已经实现了耐高温α-淀粉酶的高效制备与工业应用,如何进一步提升其工业发酵水平,需在酶分子的性能与属性改进方面进行进一步研究与探索。为此,本文通过现代分子生物学技术,对淀粉酶基因进行定向进化、新酶分子的酶学性质分析及高表达菌株的初步构建,获得以下创新性结果:（1）耐高温α-淀粉酶突变体库的构建。以地衣芽胞杆菌耐高温α-淀粉酶突变体BLA（在地衣芽胞杆菌工业表达系统中已经实现高表达,但耐热性和耐酸性能有待提升）和嗜热菌来源的耐高温α-淀粉酶GNA（耐热性和耐酸性能优秀,但无法进行高表达）为基础,在进行其序列与结构分析后,采用类DNA体外混编技术,通过重叠PCR方法,将上述2种淀粉酶分子进行融合并表达,构建获得了含22个高温α-淀粉酶突变体的突变库。（2）突变体的酶学特征分析。通过透明圈对比、摇瓶发酵、酶学性质和酶动力学参数等分析方法,对上述获得的突变体进行表达与制备,并分析其酶学性质。突变体的酶学性质出现不同程度的改变,最适温变化范围在60～80℃,最适pH变化范围在pH 5.5～7.5,耐热性和酸碱耐受性也出现不同程度的提高,但此改变无特定规律性。（3）代表性突变体的酶学性质比较分析。对其中的突变体V-2、V-12和H-11进行了详细分析,其耐热性、耐酸性以及对淀粉水解效率明显优于BLA,且比酶活相较于BLA分别提高了 0.6、1.0和3.8倍,对金属离子尤其是Ca2+的依赖性显着降低。（4）性能提升突变体酶的高效表达与高产菌的构建。将突变体H-11的α-淀粉酶基因连接pBL-WZX载体,整合构建得到高效表达的耐高温α-淀粉酶工业菌株BL-H-11,初步实现了在地衣芽胞杆菌中的高效表达。
二、应用在食品工业酶活力定性的检测方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用在食品工业酶活力定性的检测方法（论文提纲范文）
（1）β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌表达、酶学性质分析及其在宝藿苷Ⅰ制备中的应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 重组菌株的构建 |
| 1.2.2 重组菌株的发酵表达 |
| 1.2.3 重组酶的酶活力测定 |
| 1.2.4 重组酶的酶学性质 |
| 1.2.4. 1 最适反应温度 |
| 1.2.4. 2 温度稳定性 |
| 1.2.4. 3 最适p H |
| 1.2.4. 4 p H稳定性[28] |
| 1.2.4. 5 金属离子对酶活的影响 |
| 1.2.5 宝藿苷I的酶解制备工艺 |
| 1.2.5. 1 酶用量考察 |
| 1.2.5. 2 酶解时间考察 |
| 1.2.5. 3 酶解p H考察 |
| 1.2.5. 4 酶解温度考察 |
| 1.2.6 宝藿苷I转化率的测定 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组菌株的构建与发酵表达 |
| 2.2 重组β-葡萄糖苷酶酶学性质分析 |
| 2.3 重组β-葡萄糖苷酶催化制备宝藿苷Ⅰ研究 |
| 3 结论 |
（2）解淀粉芽孢杆菌脲酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达及尿素降解应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 黄酒中氨基甲酸乙酯的形成及控制 |
| 1.1.1 氨基甲酸乙酯的危害与限量标准 |
| 1.1.2 黄酒中氨基甲酸乙酯的形成途径 |
| 1.1.3 黄酒中氨基甲酸乙酯的消减策略 |
| 1.2 脲酶及其催化尿素降解的应用 |
| 1.2.1 脲酶的微生物来源 |
| 1.2.2 脲酶的结构特征与催化机制 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 1.4 立题依据与意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 主要溶液与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因挖掘 |
| 2.2.2 感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.3 脲酶重组菌的构建 |
| 2.2.4 脲酶重组菌的培养 |
| 2.2.5 摇瓶发酵条件优化 |
| 2.2.6 脲酶活力的测定 |
| 2.2.7 SDS-PAGE的检测 |
| 2.2.8 脲酶酶学性质及应用特性的研究 |
| 2.2.9 尿素含量的测定 |
| 2.2.10 模拟酒样的制备 |
| 2.2.11 固定化酶的制备 |
| 2.2.12 尿素应用研究 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 脲酶基因的挖掘及异源表达 |
| 3.1.1 脲酶基因的序列分析 |
| 3.1.2 脲酶基因的结构分析 |
| 3.1.3 脲酶基因的异源表达 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 重组脲酶的表达及条件优化 |
| 3.2.1 重组脲酶表达的基因簇重构 |
| 3.2.2 重组脲酶表达的启动子优化 |
| 3.2.3 发酵培养基类型优化 |
| 3.2.4 接种体积分数优化 |
| 3.2.5 蛋白表达温度优化 |
| 3.2.6 金属离子Ni~(2+)浓度优化 |
| 3.2.7 表达发酵条件的正交试验优化 |
| 3.2.8 小结 |
| 3.3 重组脲酶酶学性质 |
| 3.3.1 最适反应条件 |
| 3.3.2 温度和p H的稳定性 |
| 3.3.3 乙醇耐受性 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 尿素降解应用研究与属性强化 |
| 3.4.1 应用于尿素溶液 |
| 3.4.2 应用于模拟酒样 |
| 3.4.3 应用于黄酒体系 |
| 3.4.4 应用属性强化 |
| 3.4.5 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）高产洛伐他汀红曲菌的选育及其在黄酒中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 红曲与红曲黄酒 |
| 1.1.1 红曲 |
| 1.1.2 红曲黄酒 |
| 1.2 红曲菌主要次级代谢产物及合成途径研究 |
| 1.2.1 洛伐他汀 |
| 1.2.2 红曲色素 |
| 1.2.3 桔霉素 |
| 1.3 红曲菌菌种选育研究现状 |
| 1.3.1 传统筛选 |
| 1.3.2 诱变育种 |
| 1.3.3 基因工程 |
| 1.4 洛伐他汀、红曲色素在红曲黄酒中的应用现状 |
| 1.4.1 红曲黄酒中洛伐他汀的研究现状 |
| 1.4.2 红曲黄酒色泽稳定性的研究现状 |
| 1.5 课题研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要菌株 |
| 2.1.3 主要培养基 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 高产洛伐他汀红曲菌的分离和筛选 |
| 2.3.2 红曲菌的诱变育种 |
| 2.3.3 红曲黄酒的酿造实验 |
| 2.3.4 红曲黄酒的色素稳定性研究方法 |
| 2.3.5 数据处理和分析方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 高产洛伐他汀红曲菌的分离筛选 |
| 3.1.1 红曲菌株的分离纯化结果 |
| 3.1.2 红曲菌的鉴定 |
| 3.1.3 产洛伐他汀红曲菌的初筛 |
| 3.1.4 产洛伐他汀红曲菌的复筛 |
| 3.2 高产洛伐他汀红曲菌的诱变育种 |
| 3.2.1 第一轮紫外诱变选育结果分析 |
| 3.2.2 第二轮常温等压等离子体诱变选育结果分析 |
| 3.2.3 初始菌株H5-3 及正突变菌株W-4 固态发酵产洛伐他汀的过程曲线 |
| 3.3 高产洛伐他汀红曲菌在黄酒中的应用 |
| 3.3.1 红曲菌H5-3 及W-4 在黄酒中的应用评价 |
| 3.3.2 富含洛伐他汀红曲黄酒的品质及稳定性评价 |
| 3.4 避光条件下影响红曲黄酒色泽稳定性的因素 |
| 3.4.1 pH对红曲酒色价的影响 |
| 3.4.2 灌坛温度及时间对红曲酒色价的影响 |
| 3.4.3 储存温度及时间对红曲酒色价的影响 |
| 3.4.4 储存过程中氧气对红曲酒色价的影响 |
| 3.4.5 酒精度对红曲酒色价的影响 |
| 3.4.6 乙酸、乳酸、多酚成分对红曲酒色价的影响 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:相关附表 |
| 附录2:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）实验室芽孢杆菌菌种库中高产蛋白酶、糖基转移酶菌株的测定与筛选（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 芽孢杆菌菌种 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 主要溶剂的配制 |
| 1.3.2 菌株培养及胞外发酵液制备 |
| 1.3.3 蛋白酶的检测及筛选 |
| 1.3.4 糖基转移酶的检测及筛选[20] |
| 1.3.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 芽孢杆菌菌种库中菌株产蛋白酶的总体情况分析 |
| 2.2 中性蛋白酶高产菌株的筛选 |
| 2.3 碱性蛋白酶高产菌株的筛选 |
| 2.4 产新型糖基转移酶菌株的筛选 |
| 2.5 芽孢杆菌菌种库中菌株胞外蛋白分泌情况分析 |
| 3 结论 |
（5）基于理性设计及两亲聚合物修饰提升华根霉脂肪酶特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质的稳定性 |
| 1.1.1 蛋白质的稳定性概念 |
| 1.1.2 影响稳定性的主要因素 |
| 1.2 理性、半理性和非理性设计对蛋白质稳定性的影响 |
| 1.2.1 理性设计的意义和价值 |
| 1.2.2 理性设计的方法 |
| 1.2.3 半理性设计 |
| 1.2.4 非理性设计 |
| 1.3 脂肪酶 |
| 1.3.1 脂肪酶概述 |
| 1.3.2 碱性脂肪酶及其在洗涤工业中的应用 |
| 1.3.3 根霉脂肪酶 |
| 1.3.4 根霉脂肪酶的热稳定性改造 |
| 1.4 化学修饰法提高酶催化性能的方法 |
| 1.5 本课题立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 本课题的目的及意义 |
| 1.5.2 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 理性设计二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种与质粒 |
| 2.2.2 培养基及缓冲液 |
| 2.2.3 主要试剂及仪器 |
| 2.2.4 脂肪酶分子中潜在二硫键突变位点的设计和选择 |
| 2.2.5 潜在二硫键位点的定点突变 |
| 2.2.6 重组脂肪酶工程菌的构建 |
| 2.2.7 重组脂肪酶的表达及纯化 |
| 2.2.8 酶活力测定 |
| 2.2.9 蛋白浓度测定 |
| 2.2.10 突变脂肪酶酶学性质研究 |
| 2.2.11 突变脂肪酶的三维结构模拟 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 理性设计分子表面及内部形成的潜在二硫键 |
| 2.3.2 定点突变 |
| 2.3.3 重组脂肪酶工程菌的构建、表达及纯化 |
| 2.3.4 分子表面七组二硫键突变的热稳定性初筛 |
| 2.3.5 分子内部五组二硫键突变的热稳定性初筛 |
| 2.3.6 脂肪酶突变体m9/10和m17/18的酶学性质研究 |
| 2.3.6.1 最适温度、温度稳定性、t_(1/2)、T_(50)~(30)和T_m |
| 2.3.6.2 最适pH和pH稳定性 |
| 2.3.6.3 酶动力学分析 |
| 2.3.6.4 底物特异性 |
| 2.3.7 突变脂肪酶的结构模拟和对酶稳定性作用的机理分析 |
| 2.3.7.1 二硫键位置对脂肪酶稳定性及催化活性的影响 |
| 2.3.7.2 二硫键突变位点的B-factor值对脂肪酶稳定性的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于自由能计算和分子动力学模拟解析提高华根霉脂肪酶的热稳定性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种与质粒 |
| 3.2.2 培养基及缓冲液 |
| 3.2.3 主要试剂及仪器 |
| 3.2.4 利用蛋白质分析软件Fold X5 对华根霉脂肪酶r27RCL潜在热稳定性突变位点进行预测 |
| 3.2.5 利用分子动力学模拟预测r27RCL结构中的热不稳定区域 |
| 3.2.6 全质粒PCR定点突变 |
| 3.2.7 重组脂肪酶工程菌的构建 |
| 3.2.8 重组脂肪酶的表达纯化和初筛 |
| 3.2.9 突变脂肪酶酶学性质研究 |
| 3.2.10 突变脂肪酶的三维结构模拟 |
| 3.2.11 利用分子动力学模拟解析含热稳定性突变位点的突变酶的热稳定机理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 FoldX5软件运行结果 |
| 3.3.2 利用分子动力学模拟解析r27RCL结构中的热不稳定性区域 |
| 3.3.3 目的位点的定点突变 |
| 3.3.4 重组脂肪酶工程菌的构建、表达及纯化 |
| 3.3.5 突变酶的热稳定性初筛 |
| 3.3.6 突变脂肪酶m22、m26、m28和m29的酶学性质研究 |
| 3.3.6.1 最适温度、温度稳定性、t_(1/2)、T_(50)~(30)和T_m |
| 3.3.6.2 最适pH和pH稳定性 |
| 3.3.6.3 酶反应动力学分析 |
| 3.3.6.4 底物特异性 |
| 3.3.7 突变脂肪酶的结构模拟 |
| 3.3.8 FoldX5 预测和MD模拟方法的对比和讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 组合突变提高华根霉脂肪酶的特性及其机制分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种与质粒 |
| 4.2.2 培养基及缓冲液 |
| 4.2.3 主要试剂及仪器 |
| 4.2.4 突变位点的组合设计 |
| 4.2.5 各突变位点的组合 |
| 4.2.6 突变脂肪酶酶学性质研究 |
| 4.2.7 组合突变脂肪酶的分子动力学模拟 |
| 4.2.8 突变酶的应用-洗涤性能评估 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 多突变位点的组合 |
| 4.3.2 组合突变脂肪酶工程菌的构建、表达及纯化 |
| 4.3.3 突变脂肪酶的酶学性质研究 |
| 4.3.3.1 最适温度、温度稳定性、t_(1/2)、T_(50)~(30)和T_m |
| 4.3.3.2 最适pH和pH稳定性 |
| 4.3.3.3 动力学分析 |
| 4.3.3.4 底物特异性 |
| 4.3.4 分子动力学模拟解析组合突变酶m31热稳定性提高的机制 |
| 4.3.4.1 组合突变酶m31的结构分析 |
| 4.3.4.2 组合突变酶m31的分子动力学模拟 |
| 4.3.5 分子动力学模拟解析组合突变酶m32热稳定性提高的机制 |
| 4.3.5.1 组合突变酶m32的结构分析 |
| 4.3.5.2 组合突变酶m32的分子动力学模拟 |
| 4.3.6 分子动力学模拟解析突变位点对突变酶m31和m32催化活性的影响 |
| 4.3.7 突变脂肪酶m32洗涤性能研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于两亲聚合物提高华根霉脂肪酶活性及机制分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂及仪器 |
| 5.2.2 聚合物的合成和核磁验证 |
| 5.2.3 GPC-光散射联用仪测定聚合物分子量 |
| 5.2.4 聚合物对脂肪酶活性的影响 |
| 5.2.5 两亲聚合物辅助脂肪酶复性的研究 |
| 5.2.5.1 聚合物对脂肪酶热变性后复性过程的影响 |
| 5.2.5.2 聚合物对脂肪酶化学变性后复性过程的影响 |
| 5.2.6 荧光分光光度计分析P0-P2和脂肪酶的相互作用 |
| 5.2.7 圆二色谱分析聚合物和脂肪酶的相互结合作用 |
| 5.2.8 不同浓度聚合物及聚合物\脂肪酶复合物的粒径分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 聚合物的合成 |
| 5.3.2 聚合物分子量的测定 |
| 5.3.3 聚合物P0-P2对脂肪酶酶活的影响 |
| 5.3.4 聚合物的亲疏水程度差异对脂肪酶活力的影响 |
| 5.3.5 聚合物辅助脂肪酶复性的研究 |
| 5.3.5.1 聚合物对脂肪酶热变性后复性的影响 |
| 5.3.5.2 聚合物对脂肪酶化学变性后复性的影响 |
| 5.3.6 荧光分光光度计分析聚合物与脂肪酶的相互结合作用 |
| 5.3.7 圆二色谱检测聚合物和酶相互作用 |
| 5.3.8 不同配比的聚合物和酶形成复合物的粒径分析 |
| 5.3.9 聚合物对脂肪酶活性影响的机理分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 1主要结论 |
| 2展望 |
| 致谢 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（6）巨大芽孢杆菌来源的β-淀粉酶在枯草芽杆菌中的重组表达及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 淀粉及淀粉酶 |
| 1.1.1 淀粉的结构及特性 |
| 1.1.2 淀粉酶 |
| 1.2 β-淀粉酶 |
| 1.2.1 β-淀粉酶来源 |
| 1.2.2 β-淀粉酶结构与催化机理 |
| 1.2.3 β-淀粉酶酶活的测定方法 |
| 1.2.4 β-淀粉酶的应用 |
| 1.2.5 微生物来源的β-淀粉酶重组表达研究进展 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌基因表达系统概述 |
| 1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌表达系统的控制元件 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌碳分解代谢物阻遏效应 |
| 1.4.1 细菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统转运机制 |
| 1.4.2 碳分解代谢物阻遏效应的机制 |
| 1.5 论文研究的主要内容及意义 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌系统中高效表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种与质粒 |
| 2.2.2 引物序列 |
| 2.2.3 试剂与试剂盒 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pBE-Amy M载体的构建 |
| 2.3.2 pBE-Amy M质粒转化大肠杆菌克隆及验证 |
| 2.3.3 单启动子pBE-promoter-Amy M表达载体的构建 |
| 2.3.4 pBE-promoter-Amy M质粒的克隆与验证 |
| 2.3.5 含有单启动子质粒在枯草芽孢杆菌中的转化 |
| 2.3.6 β-淀粉酶的酶活力测定 |
| 2.3.7 单启动子重组菌株酶活水平测定 |
| 2.3.8 双启动子pBE-P43-promoter-Amy M表达载体的构建 |
| 2.3.9 pBE-P43-promoter-Amy M质粒的克隆与验证 |
| 2.3.10 双启动子重组质粒在枯草芽孢杆菌中的转化、验证及发酵 |
| 2.3.11 双启动子重组菌株酶活水平测定 |
| 2.3.12 突变型Amy M-CRE重组质粒的构建 |
| 2.3.13 突变型Amy M-CRE重组质粒在宿主中的转化 |
| 2.3.14 突变型Amy M-CRE重组菌株摇瓶发酵及酶活测定 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 β-淀粉酶基因生物信息分析 |
| 2.4.2 β-淀粉酶基因和pBE载体片段的扩增与验证 |
| 2.4.3 载体pBE-Amy M构建、克隆与验证 |
| 2.4.4 单启动子pBE-promoter-Amy M表达载体的构建与验证 |
| 2.4.5 单启动子质粒转化宿主B.subtilis ATCC6051?10 的验证 |
| 2.4.6 单启动子对β-淀粉酶表达水平的影响 |
| 2.4.7 双启动子pBE-P43-Promoter-Amy M质粒的构建与验证 |
| 2.4.8 双启动子对β-淀粉酶表达水平的影响 |
| 2.4.9 突变型Amy M-CRE重组载体的构建、克隆与转化 |
| 2.4.10 缓解CCR效应对重组菌株β-淀粉酶酶活水平的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 发酵菌株摇瓶培养条件的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 试剂与培养基 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 生长曲线的测定 |
| 3.3.2 发酵培养基成份的优化 |
| 3.3.3 发酵不同条件的优化 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 生长曲线的绘制 |
| 3.4.2 培养基成份的优化 |
| 3.4.3 摇瓶培养条件的优化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 重组β-淀粉酶纯化、酶学性质及应用效果研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌种与质粒 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组β-淀粉酶的纯化和蛋白含量的测定 |
| 4.3.2 重组β-淀粉酶SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot分析 |
| 4.3.3 重组β-淀粉酶的酶学性质分析 |
| 4.3.4 重组β-淀粉酶在糖化反应过程中的应用 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 重组β-淀粉酶的亲和层析纯化 |
| 4.4.2 重组β-淀粉酶酶学性质分析 |
| 4.4.3 重组β-淀粉酶在糖化过程的应用效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）酶@MOF的制备及其在处理有机污染物中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 过氧化氢酶 |
| 1.1.1 过氧化氢酶的来源 |
| 1.2 过氧化氢酶的结构及催化机理 |
| 1.2.1 过氧化氢酶的结构 |
| 1.2.2 过氧化氢酶的作用机理 |
| 1.2.3 过氧化氢酶的应用 |
| 1.3 酶的固定化 |
| 1.3.1 酶的固定化意义 |
| 1.3.2 酶的固定化方法 |
| 1.4 金属有机框架(MOF)材料 |
| 1.4.1 MOF材料概述 |
| 1.4.2 MOF材料应用 |
| 1.4.3 MOF材料固定化酶的研究 |
| 1.5 吡虫啉 |
| 1.5.1 吡虫啉的作用 |
| 1.5.2 农药残留的降解 |
| 1.6 本课题的主要研究内容与意义 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 研究意义 |
| 2 ZIF-8 固定化CAT的制备与表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ZIF-8的制备 |
| 2.3.2 CAT@ZIF-8 的制备 |
| 2.3.3 CAT、ZIF-8与CAT@ZIF-8 的表征 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 CAT、ZIF-8与CAT@ZIF-8 的形貌尺寸(SEM、TEM) |
| 2.4.2 CAT、ZIF-8与CAT@ZIF-8 的元素(EDS、EA)分析 |
| 2.4.3 ZIF-8与CAT@ZIF-8的X射线衍射(XRD)分析 |
| 2.4.4 CAT、ZIF-8与CAT@ZIF-8 的傅里叶红外光谱(FTIR)分析 |
| 2.4.5 CAT、ZIF-8与CAT@ZIF-8 的热重(TGA)分析 |
| 2.4.6 CAT、ZIF-8与CAT@ZIF-8 的氮气(N_2)吸附曲线分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 ZIF-8 固定化CAT去除水中H_2O_2 的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 CAT@ZIF-8 的蛋白负载量的测定 |
| 3.3.2 CAT与 CAT@ZIF-8 的酶活力的测定 |
| 3.3.3 CAT与 CAT@ZIF-8 的动力学参数 |
| 3.3.4 CAT与 CAT@ZIF-8 的酶学性质表征 |
| 3.3.5 CAT与 CAT@ZIF-8 的循环能力表征 |
| 3.3.6 CAT与 CAT@ZIF-8 的实际应用模拟 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 CAT@ZIF-8 的蛋白负载量、酶活力的结果 |
| 3.4.2 CAT@ZIF-8 去除H_2O_2 随时间变化的研究 |
| 3.4.3 降解条件对CAT与 CAT@ZIF-8 降解H_2O_2 的影响 |
| 3.4.4 CAT与 CAT@ZIF-8 的稳定性 |
| 3.4.5 CAT与 CAT@ZIF-8 的动力学参数 |
| 3.4.6 CAT与 CAT@ZIF-8 的循环能力的研究 |
| 3.4.7 CAT与 CAT@ZIF-8 的实际应用模拟研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 ZIF-8 固定化CAT去除水中吡虫啉的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 CAT@ZIF的制备结果与讨论 |
| 4.3.2 CAT@ZIF-8 的蛋白负载量 |
| 4.3.3 CAT与 CAT@ZIF-8 的动力学参数 |
| 4.3.4 CAT与 CAT@ZIF-8 的酶学性质表征 |
| 4.3.5 CAT与 CAT@ZIF-8 的循环能力表征 |
| 4.3.6 CAT与 CAT@ZIF-8 的实际应用模拟 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 CAT@ZIF-8 的选择 |
| 4.4.2 CAT@ZIF-8 的蛋白负载量的结果 |
| 4.4.3 CAT@ZIF-8 去除吡虫啉随时间变化的研究 |
| 4.4.4 降解条件对CAT与 CAT@ZIF-8 降解吡虫啉的影响 |
| 4.4.5 CAT与 CAT@ZIF-8的pH稳定性 |
| 4.4.6 CAT与 CAT@ZIF-8 的热稳定性 |
| 4.4.7 CAT与 CAT@ZIF-8 的蛋白酶耐受性 |
| 4.4.8 CAT与 CAT@ZIF-8 的有机溶剂耐受性 |
| 4.4.9 CAT与 CAT@ZIF-8 的吸附动力学参数 |
| 4.4.10 CAT@ZIF-8 的循环能力的研究 |
| 4.4.11 CAT与 CAT@ZIF-8 的实际应用模拟研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 ZIF-8 固定化漆酶(LAC)去除水中邻苯二酚的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 主要仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 LAC@ZIF-8 的制备 |
| 5.3.2 LAC与 LAC@ZIF-8 的反应动力学的测定 |
| 5.3.3 时间对LAC与 LAC@ZIF-8 降解酚类的影响 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 LAC与 LAC@ZIF-8 的吸附动力学参数 |
| 5.4.2 LAC与 LAC@ZIF-8 去除酚类物质随时间变化的研究 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A MOF的合成和吸附性能的研究 |
| 1 MIL-101(Cr)的合成 |
| 2 正交实验 |
| 3 结果与讨论 |
| 附录 B MOF固定化酶的筛选 |
| 附录 C 干燥方式对CAT@ZIF-8 的活性影响 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）AX公司食品酶大客户营销策略研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 研究综述 |
| 1.2.1 国外研究综述 |
| 1.2.2 国内研究综述 |
| 1.3 文献评述 |
| 1.4 研究的内容方法及研究框架 |
| 1.4.1 研究的内容 |
| 1.4.2 研究方法 |
| 1.4.3 研究框架 |
| 第二章 食品酶行业及现行营销策略状况 |
| 2.1 食品酶行业的发展 |
| 2.1.1 食品酶种类及用途 |
| 2.1.2 食品酶生产销售趋势 |
| 2.2 食品酶营销特点 |
| 2.1.1 食品酶产品的特点 |
| 2.1.2 食品酶大客户营销特点及要点 |
| 2.3 食品酶常见营销策略 |
| 2.3.1 食品酶产品需要根据客户的需求和工艺条件设计 |
| 2.3.2 食品酶产品主要通过渠道代理商销售给客户 |
| 2.3.3 食品酶定价策略主要采用撇脂定价 |
| 2.3.4 食品酶产品促销 |
| 2.4 食品酶营销策略存在问题及影响因素 |
| 2.4.1 缺乏对终端消费市场需求的研究 |
| 2.4.2 大客户市场研究欠缺 |
| 2.4.3 食品酶营销手段单一,缺乏营销组合策略 |
| 2.4.4 食品酶营销团队难以有效执行既定策略 |
| 第三章 AX公司经营现状与大客户的重要性 |
| 3.1 AX公司食品酶生产经营概况 |
| 3.1.1 AX公司食品酶生产经营概况 |
| 3.1.2 AX公司食品酶近年营销趋势 |
| 3.2 AX公司食品酶的营销管理 |
| 3.2.1 AX公司的营销组织结构 |
| 3.2.2 AX公司的营销管理 |
| 3.2.3 AX公司的营销策略的制订 |
| 3.3 AX公司食品酶营销策略 |
| 3.3.1 产品策略分析 |
| 3.3.2 定价策略分析 |
| 3.3.3 渠道策略分析 |
| 3.3.4 促销策略分析 |
| 3.4 AX公司大客户营销的地位 |
| 3.4.1 AX公司近五年大客户区域市场分布和销售情况 |
| 3.4.2 AX公司大客户营销策略 |
| 第四章 AX公司大客户营销面临的问题及策略改进思路 |
| 4.1 AX公司大客户营销面临的问题 |
| 4.1.1 缺少营销战略,缺乏目标市场细分和定位 |
| 4.1.2 渠道过分依赖厂家直销,代理商与经销商渠道不足 |
| 4.1.3 产品技术储备不足,新产品开发乏力 |
| 4.1.4 营销策略单一,缺少营销组合 |
| 4.1.5 销售实施和绩效管理的欠缺 |
| 4.24 P策略框架下大客户营销存在的问题 |
| 4.2.1 产品策略存在的问题 |
| 4.2.2 价格策略存在的问题 |
| 4.2.3 渠道策略存在的问题 |
| 4.2.4 促销策略存在的问题 |
| 4.2.5 4P营销策略存在的问题汇总 |
| 4.3 AX公司大客户营销策略改进思路 |
| 4.3.1 运用STP理论进行营销定位 |
| 4.3.2 全面考虑公司营销策略的改进 |
| 4.3.3 尝试建立以渠道为核心的大客户营销策略组合 |
| 第五章 AX公司食品酶大客户营销策略方案 |
| 5.1 AX公司食品酶大客户营销市场细分和营销定位 |
| 5.2 4P模式下AX公司大客户营销策略的改进 |
| 5.2.1 改进产品营销策略 |
| 5.2.2 改进价格营销策略 |
| 5.2.3 改进渠道营销策略 |
| 5.2.4 改进促销营销策略 |
| 5.3 4R模式下AX公司食品酶大客户营销策略改进方向 |
| 5.3.1 AX公司关联营销策略改进方向 |
| 5.3.2 AX公司反应营销策略改进方向 |
| 5.3.3 AX公司关系营销策略改进方向 |
| 5.3.4 AX公司回报营销策略改进方向 |
| 5.4 AX公司不同地域大客户营销策略的组合方案 |
| 5.4.1 国内大客户:渠道+产品+关系的营销组合 |
| 5.4.2 欧日大客户:渠道+价格+关系的营销组合 |
| 5.4.3 美国大客户:渠道+促销+关系的营销组合 |
| 第六章 研究结论和展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究不足与展望 |
| 6.2.1 论文的不足之处 |
| 6.2.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）碱性蛋白酶高产菌株的诱变选育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 碱性蛋白酶概述及其菌种 |
| 1.2 碱性蛋白酶的应用 |
| 1.2.1 在食品行业中的应用 |
| 1.2.2 在洗涤行业中的应用 |
| 1.2.3 在丝绸行业中的应用 |
| 1.2.4 在皮革行业中的应用 |
| 1.2.5 在其他行业中的应用 |
| 1.3 碱性蛋白酶研究现状 |
| 1.4 微生物的诱变育种 |
| 1.4.1 紫外诱变 |
| 1.4.2 硫酸二乙酯诱变 |
| 1.4.3 常压室温等离子体诱变 |
| 1.4.4 原生质体融合 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 第2章 碱性蛋白酶高产菌株的筛选 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 培养基配方 |
| 2.2.2 溶剂配制 |
| 2.2.3 酪氨酸标准曲线的绘制 |
| 2.2.4 酶活的测定方法 |
| 2.2.5 出发菌株的活化分离 |
| 2.2.6 紫外诱变 |
| 2.2.7 硫酸二乙酯-紫外复合诱变 |
| 2.2.8 常压室温等离子体诱变 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 出发菌株的活化分离 |
| 2.3.2 生长曲线 |
| 2.3.3 诱变育种 |
| 2.3.4 遗传稳定性实验 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 碱性蛋白酶酶学性质的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 碱性蛋白酶的来源 |
| 3.1.2 碱性蛋白酶酶学性质的研究 |
| 3.2 酶学性质结果与分析 |
| 3.2.1 酶的最适温度 |
| 3.2.2 酶的最适pH |
| 3.2.3 酶的热稳定性 |
| 3.2.4 酶的pH稳定性 |
| 3.2.5 酶的抗氧化性 |
| 3.2.6 金属离子对酶活的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 碱性蛋白酶高产菌株发酵工艺的研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 培养基配方 |
| 4.2.2 单因素优化 |
| 4.2.3 响应面优化 |
| 4.2.4 发酵动力学曲线 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 单因素实验 |
| 4.3.2 响应面试验 |
| 4.3.3 验证试验 |
| 4.3.4 发酵动力学曲线 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 碱性蛋白酶的发酵罐试生产 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 放罐pH对产酶的影响 |
| 5.2.2 1m~3发酵罐小试试验 |
| 5.2.3 5m~3发酵罐中试试验 |
| 5.2.4 35m~3发酵罐工业化试生产 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）耐高温α-淀粉酶的分子进化和高效表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 淀粉与α-淀粉酶 |
| 1.1.1 淀粉 |
| 1.1.2 α-淀粉酶及淀粉制糖工艺 |
| 1.2 耐高温α-淀粉酶 |
| 1.2.1 耐高温α-淀粉酶来源 |
| 1.2.2 耐高温α-淀粉酶的结构与性质 |
| 1.2.3 耐高温α-淀粉酶的应用 |
| 1.2.4 耐高温α-淀粉酶的国内外研究进展 |
| 1.3 定向进化在酶改良中的应用 |
| 1.4 本课题的立题依据及研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 酶与试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液与缓冲液 |
| 2.1.6 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆通用方法 |
| 2.2.2 基因扩增与基因编辑 |
| 2.2.3 摇瓶发酵实验 |
| 2.2.4 耐高温α-淀粉酶纯化 |
| 2.2.5 耐高温α-淀粉酶酶活测定 |
| 2.2.6 突变体的酶学性质分析 |
| 2.2.7 蛋白含量的测定 |
| 2.2.8 SDS-PAGE |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 耐高温α-淀粉酶突变体库的构建 |
| 3.2 突变体的初筛 |
| 3.2.1 转化子淀粉平板透明圈筛选 |
| 3.2.2 突变体摇瓶发酵产酶水平 |
| 3.2.3 突变体酶的基本酶学性质 |
| 3.3 代表性突变体的酶学性质比较分析 |
| 3.3.1 突变体的分离纯化与比酶活改变 |
| 3.3.2 热稳定性 |
| 3.3.3 pH稳定性 |
| 3.3.4 金属离子对酶活的影响 |
| 3.3.5 突变体的酶促反应动力学变化 |
| 3.4 突变体的高效表达与重组菌的构建 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 8 致谢 |
四、应用在食品工业酶活力定性的检测方法（论文参考文献）
- [1]β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌表达、酶学性质分析及其在宝藿苷Ⅰ制备中的应用[J]. 裴雯雯,曾艳,刘娟娟,张建刚,王敏,孙媛霞. 食品工业科技, 2022
- [2]解淀粉芽孢杆菌脲酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达及尿素降解应用研究[D]. 周霞. 江南大学, 2021(01)
- [3]高产洛伐他汀红曲菌的选育及其在黄酒中的应用研究[D]. 吴玉峰. 江南大学, 2021(01)
- [4]实验室芽孢杆菌菌种库中高产蛋白酶、糖基转移酶菌株的测定与筛选[J]. 王梦超,郑宏臣,赵兴亚,徐健勇,肖冬光,宋诙. 中国酿造, 2020(12)
- [5]基于理性设计及两亲聚合物修饰提升华根霉脂肪酶特性的研究[D]. 王睿. 江南大学, 2020(03)
- [6]巨大芽孢杆菌来源的β-淀粉酶在枯草芽杆菌中的重组表达及应用研究[D]. 曾君瑞. 华南理工大学, 2020(06)
- [7]酶@MOF的制备及其在处理有机污染物中的应用[D]. 许忠豪. 大连理工大学, 2020(02)
- [8]AX公司食品酶大客户营销策略研究[D]. 王升. 广西大学, 2020(07)
- [9]碱性蛋白酶高产菌株的诱变选育[D]. 刘永康. 河南科技大学, 2020(07)
- [10]耐高温α-淀粉酶的分子进化和高效表达[D]. 刘雪莲. 天津科技大学, 2020(08)