一、细胞粘附分子的表达与食管癌转移预后的关系（论文文献综述）
赵巧云[1]（2021）在《PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究》文中提出研究背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,预后较差。胃癌的发生发展经过了一系列漫长的演变过程,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是该演变过程中最重要的始动因子。H.pylori通过多种毒力因子如Cag A、Oip A、Vac A等调控胃上皮细胞生物学行为的改变,但其致病机制目前尚不明确。我们前期利用H.pylori 7.13和CCS9803两种野生菌株分别感染胃上皮细胞GES-1,构建体外细菌细胞共培养模型,并进行细胞转录组学测序分析和实验验证,发现H.pylori感染可上调胃上皮细胞GES-1的前列腺跨膜蛋白雄激素诱导基因1（prostate transmembrane protein androgen inducible gene 1,PMEPA1）的m RNA和蛋白的表达,提示了PMEPA1可能参与H.pylori感染相关的胃黏膜病变过程。PMEPA1是于2000年在前列腺组织中被发现的一种新型雄激素诱导基因,主要在细胞膜和亚细胞器如溶酶体、高尔基体等的亚细胞器膜上表达。已知PMEPA1基因是一种TGF-β诱导基因,负性调控TGF-β信号通路。研究发现,PMEPA1在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。然而,PMEPA1在胃癌中的研究尚不明确,且PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜改变过程中的作用也未见报道。因此本文通过生物信息学、PMEPA1基因干预、细胞转录组学等多种方法研究了PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜病变过程中的作用及机制,为进一步挖掘H.pylori感染致病的新的分子机制及为H.pylori相关胃癌的靶向调控提供新的理论依据。材料方法:（一）PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中的表达分析:（1）利用Oncomine数据库、GEO数据库、TCGA数据库的胃癌测序数据,分析PMEPA1在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达及PMEPA1在不同劳伦分型胃癌中的表达;（2）从南昌大学第一附属医院手术室收集18对胃癌及癌旁组织标本,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹（western blot,WB）的方法检测了PMEPA1在胃癌及癌旁组织的表达。2.PMEPA1表达与胃癌患者的预后分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线分析数据库,评价PMEPA1与胃癌患者的总体生存期（over survival,OS）,无进展生存期（progression-free survival,FP）和进展后生存期（post-progression survival,PPS）的关系,明确PMEPA1的表达与胃癌患者预后的关系。3.PMEPA1在胃癌的诊断价值:利用p ROC包对TCGA数据库中的375例胃癌和32例正常胃黏膜组织测序样本进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,并计算曲线下面积（Areas under the curve,AUC）,评估PMEPA1在胃癌的诊断价值。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）根据PMEPA1的中位表达值,将TCGA数据库的375个胃癌样本分为PMEPA1高表达组和低表达组,利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析两个差异基因集富集的生物学过程;（2）用R语言对TCGA数据库中与PMEPA1基因相关的基因进行批量计算,并对相关基因进行KEGG信号通路富集。（二）H.pylori感染及其毒力因子对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.H.pylori及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）构建H.pylori 7.13和PMSS1的oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）,并制备抗Oip A抗原的抗体,在基因和蛋白水平对oip A基因的敲除效果进行验证;（2）将H.pylori PMSS1野生菌株以不同感染复数（MOI）与胃上皮细胞GES-1共培养不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,检测PMEPA1蛋白表达水平,并检测感染6h时PMEPA1的m RNA表达水平;（3）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）分别以不同MOI感染AGS细胞6h,检测PMEPA1蛋白的表达水平;（4）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）、cag A基因敲除菌株（Hp7.13Δcag A和Hp PMSS1Δcag A）及oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）分别与胃上皮细胞GES-1细胞和AGS细胞共培养6h,检测PMEPA1的蛋白和m RNA表达水平。2.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:从南昌大学第一附属医院病理科收集H.pylori感染的不同胃黏膜病理阶段的内镜标本石蜡切片,通过免疫组化法检测PMEPA1的表达。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1过表达及敲减稳转细胞株的构建:分别构建过表达PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1highGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1highGES-1)、敲减PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1lowGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1lowGES-1)、过表达PMEPA1的BGC-823细胞(PMEPA1highBGC-823)及对照细胞(NC-PMEPA1highBGC-823)。2.PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响及机制:（1）通过平板克隆形成实验、实时无标记细胞分析（Real Time Cellular Analysis,RTCA）技术、CCK8法检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖的影响;（2）通过transwell侵袭和迁移实验、划痕修复实验检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭和迁移的影响;（3）通过生物信息学分析TCGA数据库胃癌数据集中PMEPA1与EMT转录因子的相关性;（4）Western Blot检测EMT相关分子的蛋白表达水平。3.PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响:（1）H.pylori PMSS1的野生菌株、cag A及oip A敲除菌株感染PMEPA1highBGC-823细胞及其对照细胞,RTCA技术、transwell侵袭和迁移实验检测PMEPA1过表达对H.pylori感染的胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;（2）H.pylori 7.13野生型菌株感染PMEPA1lowGES-1及其对照细胞NC-PMEPA1lowGES-1,transwell实验检测PMEPA1敲减对H.pylori感染的胃上皮细胞的侵袭和迁移能力的影响。（四）转录组学分析PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响1.转录组学样品准备:将Hp7.13wt和Hp PMSS1wt分别感染PMEPA1lowGES-1及NC-PMEPA1lowGES-1细胞（MOI=100）,将Hp7.13wt、Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染PMEPA1highGES-1及NC-PMEPA1highGES-1细胞（MOI=100）,H.pylori感染6h后收集细胞总RNA;同时收集PMEPA1highBGC-823及NC-PMEPA1highBGC-823细胞总RNA;每个组设置三个生物学重复,共收集48个RNA样品。2.转录组测序及分析:（1）转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司,基于Illumina Novaseq 6000测序平台,通过c DNA文库构建、上机测序、测序数据质控、基因注释等步骤获得基因表达量数据;（2）利用DESeq2软件对表达基因进行差异分析,筛选标准为差异基因表达倍数（Fold Change）>1.5,校正P<0.05;（3）采用Goatools软件对差异基因进行GO富集分析,校正P<0.05为显着富集;采用R语言对差异基因进行KEGG富集分析,P<0.05为显着富集。结果:（一）PMEPA1在胃癌组织的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中高表达:（1）Oncomine数据库分析结果显示,PMEPA1在多种癌症组织中显着高表达（P<0.05）,包括乳腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌及多个消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。（2）利用GEPIA数据库,共纳入408例TCGA胃癌样本和211例包含TCGA及GETx数据库的正常胃黏膜组织样本,分析结果显示,PMEPA1在胃癌组织样本的表达显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（3）从GEO数据库中下载三个胃癌测序数据集（GSE54129,GSE79973,GSE118916）,分析结果显示,在三个GEO数据集中,PMEPA1在胃癌组织中的转录水平均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（4）利用Oncomine数据库分析PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织中的表达情况,结果显示PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织的表达均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（5）18例胃癌及癌旁手术标本的q RT-PCR及WB结果显示,PMEPA1在胃癌组织的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.PMEPA1高表达与胃癌患者不良预后有关:Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示,PMEPA1是胃癌患者预后不良的风险因素（HR>1）,PMEPA1高表达的胃癌患者总体生存期（HR=1.52）、无进展生存期（HR=1.38）及进展治疗后生存期（HR=1.67）显着缩短（P<0.05）。3.PMEPA1诊断胃癌的临床价值:对TCGA数据库的胃癌数据集绘制PMEPA1基因的受试者工作曲线（ROC）,曲线下面积AUC为0.893,说明PMEPA1是良好的胃癌诊断标志物。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）GSEA分析结果显示,PMEPA1高表达与TGF-β、上皮间充质转化（EMT）、血管生成、缺氧、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路显着正相关（FDR q-value<0.05）;（2）批量相关性基因的KEGG富集分析结果显示,PMEPA1及其相关性基因主要富集在E2F靶基因、有丝分裂纺锤体、MYC靶基因、蛋白质分泌、DNA修复、G2M细胞周期检查点、血管生成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、紧密连接、EMT等信号通路,其中PMEPA1与EMT信号通路呈显着正相关（校正P值=0.005）。（二）H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.成功构建了Hp7.13和Hp PMSS1菌株的oip A基因敲除菌株,及抗Oip A抗原的兔多克隆抗体。2.H.pylori感染上调胃上皮细胞PMEPA1蛋白和m RNA表达水平:（1）前期转录组学分析结果显示,Hp7.13和Hp CCS9803菌株感染感染GES-1细胞24h,与未感染H.pylori的细胞相比,PMEPA1表达分别上调1.59倍和1.13倍,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Hp PMSS1以不同MOI感染胃上皮GES-1细胞1、3、6、12、24h,在感染6h和12h时随着MOI增大,PMEPA1蛋白表达水平逐渐上升,在MOI=50表达水平最高（P<0.05）,PMEPA1的m RNA表达水平在感染6h时MOI=100表达最高（P<0.05）。（3）将Hp 7.13和PMSS1以不同MOI感染胃癌细胞株AGS 6h,随着MOI的增加,PMEPA1蛋白表达水平上升,其中MOI=50在两个菌株中都有统计学差异（P<0.05）。3.Hp毒力因子Cag A和Oip A对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1 6h,Western Blot结果显示,Hp7.13wt或PMSS1wt感染后PMEPA1蛋白表达高于未感染的对照组,而cag A和oip A基因敲除菌感染的PMEPA1蛋白表达低于野生组;（2）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1和AGS细胞6h,荧光定量PCR结果显示,Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染GES-1和AGS细胞后,PMEPA1的m RNA表达水平显着高于未感染细胞（P<0.05）,而cag A和oip A基因敲除菌感染时PMEPA1的m RNA表达显着低于野生菌感染的细胞（P<0.05）。4.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:（1）PMEPA1在炎细胞和腺细胞中均有表达,主要定位于细胞质及核膜。（2）在腺细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的轻度慢性非萎缩性胃炎、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）;在炎细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的重度非萎缩性炎症、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）。（3）在H.pylori感染的标本中,PMEPA1在轻度和重度非萎缩性胃炎患者标本腺细胞中的表达显着低于肠化生、异型增生和胃癌组（P<0.05）;在轻度非萎缩性胃炎的炎细胞中的表达显着低于其它各组（P<0.05）;在H.pylori未感染患者,无论是腺细胞还是炎细胞,PMEPA1的表达在胃癌组均显着高于其它各组（P<0.05）。以上结果提示,PMEPA1可能参与了H.pylori感染的胃黏膜病变过程。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖:（1）平板克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highGES-1的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;PMEPA1lowGES-1的增殖能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）体外克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highBGC-823的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;2.PMEPA1促进胃上皮和胃癌细胞的侵袭和迁移:（1）Transwell侵袭和迁移实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的侵袭和迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1lowGES-1细胞的侵袭和迁移能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）划痕修复实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）。3.PMEPA1与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有关:（1）利用Cbioportal数据库分析了PMEPA1与EMT有关基因的相关性,分析结果显示,PMEPA1与间充质细胞标志物N-cadherin的编码基因CDH2、Vimentin的编码基因VIM、EMT间充质细胞转录因子ZEB1、TWIST1、TWIST2显着正相关（P<0.05）,与Snail转录因子编码基因SNAI1和Slug转录因子编码基因SNAI2显着正相关（P<0.05）;与基质金属蛋白酶分子编码基因MMP11、MMP14、MMP7、MMP2、MMP1、MMP17、MMP13和MMP24显着正相关（P<0.05）;（2）Western Blot结果显示,PMEPA1lowGES-1的E-cadherin蛋白表达显着高于NC细胞（P<0.05）,N-cadherin蛋白表达显着低于NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1high GES-1则反之（P<0.05）。4.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞BGC-823增殖的影响:Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823细胞和对照细胞,RTCA结果显示,H.pylori感染18小时后开始促进NC组细胞的增殖,在感染后的40-78h内,Hp PMSS1wt菌株显着促进NC-PMEPA1highBGC-823细胞的增殖（P<0.05）,而Hp PMSS1Δcag A及Hp PMSS1Δoip A感染组与Hp PMSS1wt感染组相比,细胞增殖无统计学差异（P>0.05）;Hp PMSS1wt菌株及cag A和oip A敲除菌株对PMEPA1highBGC-823细胞的增殖无统计学差异（P>0.05）。5.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞和胃上皮细胞迁移和侵袭的影响:（1）PMEPA1过表达对H.pylori感染的BGC-823胃癌细胞迁移和侵袭的影响:H.pylori未感染组中,过表达PMEPA1显着促进BGC-823细胞的迁移和侵袭（P<0.05）;Hp7.13wt感染PMEPA1highBGC-823及对照细胞后细胞迁移和侵袭能力显着高于未感染细胞（P<0.05）,同时Hp7.13wt感染组细胞的迁移和侵袭能力显着高于Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染组（P<0.05）;Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823和NC细胞后,细胞侵袭能力同Hp7.13菌株,而迁移能力在PMEPA1highBGC-823细胞各组无统计学差异（P>0.05）。（2）PMEPA1敲减对Hp7.13wt感染的胃上皮GES-1细胞的迁移和侵袭的影响:Hp7.13wt感染PMEPA1lowGES-1及对照细胞后,细胞迁移和侵袭能力显着增加（P<0.05）。（四）转录组学分析PMEPA1在H.pylori感染的胃上皮细胞作用的生物学功能1.PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞GES-1转录水平的影响:（1）GES-1过表达PMEPA1后共有1025个差异基因,敲减PMEPA1后共有1376个差异基因;（2）差异基因主要富集的GO通路有细胞运动相关如质膜黏附分子的细胞间黏附作用、趋化运动、黏附过程、细胞迁移、细胞运动、细胞外基质成分、细胞运动的调节等生物过程;（3）差异基因富集到的KEGG信号通路主要有细胞粘附分子、TGF-β、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）PMEPA1过表达对胃癌细胞株BGC-823转录水平的影响:（1）共有132个差异基因;（2）主要富集的GO通路有细胞外基质组成、组织形态发生、急性炎症反应、TGF-β的分泌调控等生物过程;（3）主要富集到的KEGG通路包括耶尔森菌感染、小细胞肺癌、内吞、抗坏血酸和醛酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、ECM-受体相互作用。综上,PMEPA1过表达或敲减主要影响细胞运动、迁移、细胞黏附、受体配体相关作用、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等生物学过程。2.H.pylori感染对敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响（1）H.pylori感染对敲减PMEPA1的GES-1细胞转录水平的影响:（1）Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染PMEPA1lowGES-1细胞后,分别有2315和959个差异基因;（2）差异基因富集的GO通路相似,主要包括细胞对缺氧的反应、细胞分裂、血管发育的调控、细胞周期的正向调控、细胞运动的正向调控等生物过程;（3）共同富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）H.pylori感染对过表达PMEPA1的GES-1转录水平的影响:（1）Hp7.13wt感染NC-PMEPA1highGES-1后,共有1646个差异基因,富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路的研究、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路等;（2）Hp7.13wt与Hp7.13Δcag A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因富集到了17条信号通路,主要有肿瘤中的micro RNAs、细胞周期、P53信号通路、细胞衰老、FOXO信号通路、癌症中的转录调控异常、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路等,说明cag A可能通过以上这些通路起作用。（3）Hp7.13wt与Hp7.13Δoip A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因未富集到KEGG通路。综上,H.pylori感染可能通过转录因子的调控作用、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路介导敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的变化,其中毒力因子Cag A可能发挥重要作用。3.PMEPA1对不同H.pylori菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响（1）PMEPA1敲减对Hp7.13（或PMSS1）感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp PMSS1wt）感染PMEPA1lowGES-1及其对照组细胞,差异基因富集的KEGG通路相似,主要包括AGE-RAGE信号通路的研究、癌症中胆碱代谢、细胞衰老、Hippo信号通路、EGFR酪氨酸酶抑制耐受、癌症中的micro RNA、Fox O信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞骨架调控等;（2）PMEPA1过表达对不同H.pylori菌株感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）感染PMEPA1highGES-1及其对照细胞,差异基因富集的信号通路相似,主要的GO富集有TGF-β的反应、趋化性的调节、质膜粘附分子的粘附、细胞对生长因子刺激反应等过程等生物过程;主要的KEGG富集有细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等。综上,在H.pylori感染胃上皮细胞的过程中,PMEPA1可能通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。结论:1.PMEPA1在胃癌组织高表达,与胃癌不良预后有关,是良好的胃癌诊断标志物。2.PMEPA1高表达促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与EMT表型相关。3.H.pylori感染调控PMEPA1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭和迁移,部分依赖于毒力因子Cag A和Oip A的作用。4.H.pylori感染胃上皮细胞调控多种生物学过程;PMEPA1通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。
赵汝霖[2]（2021）在《VASN在幽门螺杆菌致病及胃癌发生发展中的作用和机制》文中认为背景和目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染是慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一演变过程的始动因素,被国际癌症研究机构（IARC）定为I类致癌物,但是其致病机制目前尚不清楚。因此,寻找Hp致病过程中的关键驱动分子并阐明它们在胃癌发生发展过程中的作用及机制对有效防治Hp相关胃癌极为重要。课题组前期的转录组学研究发现Hp及其主要毒力因子细胞毒素相关基因A（Cag A）可上调胃上皮细胞中Vasorin（VASN）的表达,进一步进行生物信息学分析发现,VASN在胃癌组织中的表达显着高于癌旁组织,且VASN高表达的胃癌患者较VASN低表达的患者预后差,提示VASN可能在胃癌中发挥作用且影响胃癌患者预后。VASN是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,它在胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞中高表达,具有促增殖、抗凋亡作用,且与肿瘤的侵袭和不良预后有关。据此,我们推测VASN可能是Hp致胃黏膜癌变的关键分子,能够促进胃癌的发生和发展。然而,至今未有研究报道VASN在胃癌发生发展及Hp致病中作用,VASN与胃癌、Hp感染的关系及其表达调控机制有待阐明。因此,本文研究了VASN和Hp感染相关胃黏膜癌变过程的关系,以及在胃癌中的分子功能和机制,以期为胃癌的预防和分子治疗提供实验和理论依据。材料和方法:（一）筛选和鉴定Hp感染致胃黏膜上皮细胞病变的核心基因VASN1.转录组学筛选Hp及Cag A致胃上皮细胞改变的核心基因:（1）体外构建野生型（WT）及Δcag A Hp菌株感染的GES-1细胞模型,提取细胞总RNA进行RNA测序分析,并进行基因表达差异分析;（2）q RT-PCR验证核心差异基因在Hp WT及HpΔcag A菌株感染后GES-1细胞中的表达变化,选择其中经验证后最关键的核心基因进行后续研究。2.细胞水平验证Hp及Cag A对VASN蛋白表达的影响:（1）不同Hp WT菌株包括7.13、PMSS1、ATCC43504、G27和CCS9803分别感染GES-1细胞;（2）7.13和PMSS1以不同感染复数（MOI）分别感染GES-1细胞和AGS细胞,确定最适MOI;（3）7.13和PMSS1 WT及Δcag A菌株分别以最适MOI感染GES-1细胞和AGS细胞,Western blot检测VASN的表达。3.动物水平验证Hp感染对VASN蛋白表达的影响:构建Hp感染的C57BL/6小鼠模型,Western blot检测小鼠胃黏膜组织中VASN的表达。4.VASN在临床患者胃黏膜病变过程中的表达以及与Hp感染的关系:分别收集Hp阳性和Hp阴性的不同胃黏膜病变阶段包括轻度非萎缩性胃炎、重度非萎缩性胃炎、肠上皮化生、胃癌患者的胃黏膜标本,免疫组化检测VASN的表达。（二）VASN在胃癌组织中的表达及与胃癌患者预后的关系1.VASN在胃癌中的表达:（1）利用Oncomine数据库分析VASN在不同癌症中的表达情况,以及VASN在不同Lauren分型胃癌中的表达情况;（2）利用GEO数据库分析VASN在正常胃黏膜组织、胃癌及癌旁胃黏膜组织中的表达;（3）收集临床胃癌和癌旁胃黏膜组织,免疫组化和Western blot检测VASN的表达。2.VASN和胃癌患者预后的关系:利用Kaplan-Meier plotter数据库分析VASN的表达和胃癌患者预后的关系。（三）VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞生物学表型的影响1.VASN高表达和VASN低表达的稳转细胞株的构建:通过慢病毒方法构建VASN高表达的GES-1稳转细胞株(VASNhighGES-1)、VASN低表达的GES-1稳转细胞株(VASNlowGES-1)和VASN高表达的AGS稳转细胞株(VASNhighAGS)。2.VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖能力的影响:分别使用实时无标记细胞分析术、CCK8法和平板克隆形成实验检测VASNhighGES-1、VASNlowGES-1和VASNhighAGS以及它们对应的WT细胞的增殖能力。3.VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响:使用Trasnwell实验检测VASNhighGES-1、VASNlowGES-1和VASNhighAGS以及它们对应的WT细胞的的迁移能力和侵袭能力。（四）转录组学和蛋白质组学分析VASN的生物学功能1.VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）细胞转录组学测序及分析:提取VASNhighGES-1、VASNlowGES-1和VASNhighAGS以及它们对应的WT细胞的总RNA,经过Oligo d T富集m RNA、片段化m RNA、反转合成c DNA、片段筛选和文库富集等步骤,最后通过Illumina Hi Seq Xten上机测序;（2）差异表达分析:差异基因分析软件为:DESeq2,筛选阈值为:差异倍数≥2或≤0.5,FDR<0.05。（3）生物信息学分析:对差异基因进行GO和KEGG富集分析。2.VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞蛋白水平的影响:（1）细胞蛋白质组学测序及分析:提取VASNhighGES-1、VASNlowGES-1和VASNhighAGS以及它们对应的WT细胞的总蛋白并进行蛋白定量分析,随后经过酶解烷基化和标记、RPLC一维分离、液相串联质谱分析,最后进行蛋白质搜库。差异基因分析软件为:DESeq2,筛选阈值为:差异倍数≥1.2或≤0.83,FDR<0.05;（3）生物信息学分析:对差异蛋白进行GO和KEGG富集分析。（五）VASN通过PI3K/AKT信号通路调控胃上皮细胞和胃癌细胞的生物学改变上述组学研究发现VASN可调控PI3K/AKT信号通路,后续重点研究该信号通路。1.VASN和PI3K/AKT信号通路中关键分子的相关性分析:利用Tumor IMmune Estimation Resource（TIMER）数据库分析了在胃癌中VASN和AKT1、AKT2、AKT3的相关性。2.VASN对PI3K/AKT信号通路的调控作用:Western blot检测VASNhighGES-1、VASNlowGES-1和VASNhighAGS中PI3K/AKT信号相关分子表达。3.AKT抑制剂对VASN促增殖作用的影响:VASNhighGES-1细胞和VASNhighAGS分别给予0（即DMSO处理组）、1u M和3u M的AKT抑制剂MK-2206,CCK8法检测6h、24h、48h、72h和96h细胞增殖水平,实时无标记细胞分析术检测0-96h内细胞的增殖水平。4.VASN对PI3K/AKT信号网络的影响:PCR array检测VASNlowGES-1细胞及对应的WT细胞中PI3K/AKT信号网络中84个信号分子的表达变化。结果:（一）筛选和鉴定Hp感染致胃黏膜上皮细胞病变的核心基因VASN1.转录组学筛选Hp及Cag A致胃上皮细胞改变的核心基因:共筛选到Hp感染后表达水平显着改变且依赖于其毒力因子Cag A的28个核心差异基因（P<0.05）。挑选差异最显着的前11个基因包括VASN进行q RT-PCR验证,发现Hp感染上调VASN的表达,且依赖Cag A。2.细胞水平和动物水平验证Hp感染及Cag A对核心基因VASN蛋白表达的影响:（1）不同Hp菌株（7.13、PMSS1、ATCC43504、G27、CCS9803）感染GES-1细胞后VASN表达均明显上调;（2）不同MOI的7.13 Hp菌株和PMSS1 Hp菌株分别感染胃上皮细胞和胃癌细胞时,无论GES-1细胞还是AGS细胞中,VASN表达随着MOI的增加逐渐增多,且在MOI=100时VASN的表达上调较为显着;（3）7.13 HpΔcag A和PMSS1 HpΔcag A株感染GES-1和AGS细胞6h,其VASN的表达均低于相应的Hp WT株;（4）C57BL/6小鼠感染Hp SS1菌株后胃黏膜组织中VASN表达上调。3.VASN在临床患者胃黏膜病变过程中的表达以及与Hp感染的关系:（1）VASN在胃黏膜腺细胞和炎症细胞中均表达,在轻度非萎缩性胃炎组的表达显着低于其它各组（P<0.05）;（2）在各病理阶段中无论是腺细胞还是炎症细胞中,Hp阳性患者的VASN表达均显着高于Hp阴性患者（P<0.05）;（3）在腺细胞中,无论是Hp感染还是未感染者,VASN在胃癌中的表达均高于其它各组（P<0.05）,在Hp未感染者重度非萎缩性胃炎和肠上皮化生中的表达还显着高于轻度非萎缩性胃炎（P<0.05）,在Hp感染者轻度非萎缩性胃炎、重度非萎缩性胃炎和肠上皮化生之间VASN表达无统计学差异（P>0.05）;（4）在炎症细胞中,Hp未感染者VASN表达在轻度非萎缩性胃炎组显着低于重度非萎缩性胃炎和肠上皮化生组（P<0.05）,Hp感染者VASN表达在轻度非萎缩性胃炎组显着低于重度非萎缩性胃炎组和胃癌组（P<0.05）。（二）VASN在胃癌组织中的表达及与胃癌患者预后的关系1.VASN在胃癌中的表达:（1）Oncomine数据库中的分析结果表明,VASN在多个肿瘤中异常表达且在胃癌中高表达;此外,VASN在弥漫型胃癌、肠型胃癌和混合型胃癌等不同Lauren分型胃癌中均显着高表达（P<0.05）;（2）在GEO数据库中的分析结果显示VASN在胃癌中的表达显着高于正常胃黏膜（P<0.01）和癌旁组织（P<0.01）;（3）免疫组化结果显示,无论是在胃黏膜腺细胞还是炎症细胞中,胃癌组织中VASN的表达均显着高于癌旁组织(（P<0.01）;Western blot结果表明VASN在胃癌组织表达明显高于癌旁组织。2.VASN和胃癌患者预后的关系:VASN高表达的胃癌患者的总生存期（OS）、无进展生存期（first progression,FP）和进展后生存期（post progression survival,PPS）显着短于VASN低表达的胃癌患者（P<0.001）。（三）VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞生物学表型的影响1.VASN对胃上皮细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响:（1）实时无标记细胞分析术和CCK8结果均显示VASNhighGES-1的增殖能力显着高于WT型GES-1（P<0.05）,而VASNlowGES-1增殖能力显着低于WT型GES-1(（P<0.05）;（2）平板克隆形成实验结果表明VASNhighGES-1的克隆形成数显着高于WT型GES-1（P<0.001）,而VASNlowGES-1的克隆形成数显着低于WT型GES-1（P<0.001）;（3）Transwell迁移和侵袭实验显示:VASNhighGES-1的迁移和侵袭能力显着高于WT型GES-1（P<0.05）,而VASNlowGES-1的迁移和侵袭能力显着低于WT型GES-1（P<0.05）。2.VASN对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响:（1）实时无标记细胞分析术和CCK8结果均显示VASNhighAGS增殖能力显着高于WT型AGS（P<0.05）;（2）平板克隆形成实验结果表明VASNhighAGS的克隆形成数显着高于WT型AGS（P<0.01）;（3）Transwell迁移和侵袭实验显示:VASNhighAGS的迁移和侵袭能力显着高于WT型AGS（P<0.05）。（四）转录组学和蛋白质组学分析VASN的生物学功能1.VASN对胃上皮细胞及胃癌细胞转录水平的影响（1）VASN对胃上皮细胞转录水平的影响（1）VASN过表达对胃上皮细胞转录水平的影响:i.差异基因统计:共有419个差异基因,其中上调基因190个,下调基因229个;ii.差异基因GO富集分析:主要富集到33种细胞组分、28种分子功能和405种生物过程（P<0.05,FDR<0.05）,包括细胞质和细胞膜等细胞组分,蛋白结合和信号受体结合等分子功能,以及细胞增殖和分化、炎症和免疫反应等生物过程;iii.差异基因KEGG富集分析:差异基因主要富集到51条信号通路（P<0.1）,包括幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、Jak-STAT信号通路和PI3K/AKT信号通路等。（2）VASN低表达对胃上皮细胞转录水平的影响:i.差异基因统计:共有573个差异基因,其中上调基因403个,下调基因170个;ii.差异基因GO富集分析:显着富集到67种细胞组分、41种分子功能和461种生物过程,例如细胞膜、细胞质和细胞外区域等细胞组分,绑定、信号受体结合和细胞因子活性等分子功能,细胞增殖、分化、细胞迁移调节、炎症应答、细胞表面受体信号通路等生物过程;iii.差异基因KEGG富集分析:差异基因主要富集到54条信号通路（P<0.1）,包括细胞因子-细胞因子受体信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、Hp感染的上皮细胞信号和PI3K/AKT信号通路等。（3）胃上皮细胞VASN高表达和低表达的差异基因KEGG富集到的共同信号通路:包括TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、Hp感染中上皮细胞信号、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和PI3K/Akt信号通路等共31条信号通路（P<0.1）。（2）VASN对胃癌细胞转录水平的影响VASN过表达对胃癌细胞转录水平的影响:（1）差异基因统计:共有186个差异基因,其中上调基因158个,下调基因28个;（2）差异基因GO富集分析:主要富集到7种细胞组分、10种分子功能和53种生物过程,包括细胞外区域、细胞质、质膜的固有成分等细胞组分,羧酸跨膜转运活性和蛋白结合等分子功能,抗肿瘤药物的反应、信号传导和炎症反应等生物过程;（3）差异基因KEGG富集分析:主要富集到35条信号通路（P<0.1）,包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、AMPK信号通路、粘着斑和白细胞跨内皮迁移等。（3）VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平差异基因共同影响的信号通路GES-1细胞中VASN分别过表达、敲减后的差异基因和AGS细胞中过表达VASN后差异基因KEGG富集到的共同信号通路主要包括粘蛋白型o-聚糖的生物合成、细胞因子-细胞因子受体相互作用、人类巨细胞病毒感染、PI3K/Akt信号通路、胞质DNA-sensing通路和松弛素信号通路等共6条信号通路（P<0.1）。2.VASN对胃上皮细胞及胃癌细胞蛋白水平的影响（1）VASN对胃上皮细胞蛋白水平的影响（1）VASN过表达对胃上皮细胞蛋白水平的影响:i.差异蛋白统计:共有790个差异蛋白,其中上调蛋白367个,下调蛋白423个;ii.差异蛋白GO富集分析:显着富集到45种细胞组分、97种分子功能和584种生物过程,包括外泌体、细胞外基质和锚定连接等细胞组分,信号受体活性、蛋白结合和细胞粘附分子结合等分子功能,细胞增殖的调节、细胞粘附的调节和炎症反应等生物过程;iii.差异蛋白KEGG富集分析:主要富集到44条信号通路（P<0.1）,包括ECM受体相互作用、HIF-1信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Wnt信号通路和PI3K/AKT信号通路等。（2）VASN低表达对胃上皮细胞蛋白水平的影响:i.差异蛋白统计:共有1223个差异蛋白,其中上调蛋白579个,下调蛋白644个;ii.差异蛋白GO富集分析:显着富集到64种细胞组分、42种分子功能和207种生物过程,包括细胞外基质、质膜和细胞骨架等细胞组分,细胞粘附分子结合、细胞外基质绑定和药物结合等分子功能,细胞分化、细胞迁移和急性炎症反应等生物过程;iii.差异蛋白KEGG富集分析:主要富集到33条信号通路（P<0.1）,包括ECM受体相互作用、黏着斑、抗原处理和递呈、代谢途径、细胞粘附分子和癌症通路等。（3）胃上皮细胞VASN高表达和低表达的差异蛋白KEGG富集到的共同信号通路:主要包括ECM受体相互作用、代谢通路、癌症通路、细胞粘附分子和Wnt信号通路等共13条KEGG通路（P<0.1）。（2）VASN对胃癌细胞蛋白水平的影响VASN过表达对胃癌细胞蛋白水平的影响:（1）差异蛋白统计:共有915个差异蛋白,其中上调蛋白421个,下调蛋白494个;（2）差异蛋白GO富集分析:显着富集到50种细胞组分、56种分子功能和331种生物过程,包括内质网腔、细胞外囊泡和细胞外区域等细胞组分,细胞粘附分子结合、周期蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性和细胞-细胞粘附介质活性等分子功能,生物粘附、细胞迁移、上皮细胞凋亡过程的调控和炎症反应的正向调节等生物过程;（3）差异蛋白KEGG富集分析:主要富集到47条信号通路（P<0.1）,包括代谢途径、细胞粘附分子和ECM受体相互作用等信号通路。（3）VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞蛋白水平共同影响的信号通路:GES-1细胞中VASN分别过表达、敲减后的差异蛋白和AGS细胞中过表达VASN后差异蛋白KEGG富集到的共同信号通路主要包括ECM-受体相互作用、代谢通路、碳代谢、细胞粘附分子和氨基酸的生物合成等共5条信号通路（P<0.1）。（五）VASN通过PI3K/AKT信号通路调控胃上皮细胞和胃癌细胞的生物学改变上述组学研究发现VASN可调控PI3K/AKT信号通路,后续重点研究该信号通路。1.VASN和PI3K/AKT信号通路中关键分子的相关性分析:TIMER数据库人体胃癌数据分析结果表明,VASN和AKT1（P=1.03e-11,r=0.328）、AKT2（P=0e-0,r=0.426）和AKT3（P=9.01e-31,r=0.525）均显着相关。2.VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞中PI3K/AKT信号通路的调控作用:（1）VASNhighGES-1中PI3K和AKT的磷酸化水平均高于WT型GES-1,而VASNlowGES-1中PI3K和AKT的磷酸化水平均显着低于WT型GES-1;（2）VASNhighAGS中PI3K和AKT的磷酸化水平均显着高于WT型GES-1。3.AKT抑制剂对VASN促增殖作用的影响:使用不同浓度的MK-2206处理VASNhighGES-1细胞和VASNhighAGS细胞后,细胞的增殖能力都显着降低（P<0.05）。4.VASN对PI3K/AKT信号网络的影响:PCR array结果表明,VASN敲减后PI3K/AKT信号网络中84个信号分子中有72个基因表达显着变化（P<0.05）,其中71个基因表达下调,例如FOXO1、ELK1、CHUK、APC、ADAR、RBL2、PIK3CA、PIK3R1、CDKN1B、CCND1等基因均显着下调（P<0.05）;此外1个基因即GRB10表达上调（P<0.05）。结论:1.Hp感染可上调VASN的表达,且Hp对VASN表达的调控依赖于其毒力因子Cag A。2.VASN和Hp介导的胃黏膜病变过程有关。3.VASN在胃癌中高表达,和胃癌患者的不良预后有关。4.VASN促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。5.VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞的转录水平和蛋白水平均有调控作用,它们涉及细胞分化、增殖、凋亡和迁移等多种细胞生长和死亡相关生物过程,以及炎症免疫、信号传导相关生物过程,并影响多条肿瘤和炎症免疫相关信号通路,这可能是其在胃癌发生发展和Hp致病作用中的分子基础。6.VASN可能通过PI3K/AKT信号发挥其生物学功能,阻断AKT信号可抑制VASN的促增殖能力。
高佳佳[3]（2021）在《功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究》文中指出食管癌（Esophageal cancer,ECA）是我国致死率排名第四位的恶性肿瘤,其中约90%的组织学类型为食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。食管癌早期诊断难,患者就诊时多为中晚期,预后差,探讨促进食管癌进展的分子机制对食管癌的诊断和治疗具有重要意义。富含嘌呤元件结合蛋白α（Purine-rich element binding protein alpha,PURα）是PUR蛋白家族成员之一,具有保守的核酸结合结构域,参与DNA复制、转录和修复以及RNA转运和翻译等多种生物学功能。PURα蛋白的异常表达除了参与神经系统疾病的发生外,近年发现PURα还参与一些恶性肿瘤的增殖调控,然而,PURα在食管癌中的表达和作用机制尚不清楚。本研究,首先探讨了 DNA结合蛋白PURα调控食管癌进展的分子机制。首先,分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中PURA基因在食管癌组织中mRNA表达水平,免疫组化分析评估PURα蛋白在食管癌中的表达水平,分析食管癌组织中PURα的表达水平与患者临床病理参数和预后的相关性,以及观察PURα对食管癌体外和体内肿瘤生物学表型的影响。通过构建稳定过表达和敲降PURα的食管鳞癌细胞系,利用CCK-8和平板克隆实验、划痕愈合和Transwell实验检测PURα对体外培养细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;建立裸鼠皮下移植瘤和尾静脉注射肝肺转移瘤模型,检测PURα对体内肿瘤增殖和肝肺等脏器转移能力的影响。进一步,探讨了 PURα影响食管癌进程的分子机理。对过表达和敲降PURA基因的食管鳞癌细胞的RNA-seq分析,发现受PURA调控的信号通路和差异表达基因。利用qPCR、Western blot和免疫荧光分析验证候选通路和基因,双荧光素酶报告基因和ChIP实验探究PURα对候选基因转录调控的影响,利用回复性实验验证候选基因影响PURα介导的食管癌表型改变中的作用。通过以上实验,我们发现,PURA mRNA和蛋白水平在食管癌组织中高表达,PURα高表达与食管癌患者的淋巴结转移和AJCC分期呈正相关（P<0.05）,且PURα高表达患者生存期更短（P<0.05）,提示PURα促进了食管鳞癌进展和不良预后。体内外功能实验发现,PURα促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进食管癌细胞的裸鼠致瘤和肝、肺等远处器官的转移能力。解析其机制,RNA-seq分析结果提示PURα参与细胞粘附分子和细胞外基质-受体相互作用等通路的调控,影响多个上皮和间质相关基因的表达;PURα下调E-钙黏蛋白（E-Cadherin,CDH1）、上调N-钙黏蛋白（N-Cadherin,CDH2）和波形蛋白（Vimentin,VIM）的表达,诱导食管癌细胞发生上皮-间叶转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。深入的机制分析表明,PURα可以与Snail家族锌指转录因子2（Snail family transcriptional repressor 2,SNAI2）基因启动子区-896至-431 bp的序列结合,促进SNAI2的转录活性,上调Snail2蛋白的表达。敲降SNAI2可抑制PURα诱导的EMT表型,降低食管癌细胞的运动、侵袭和转移的能力。总之,本研究发现PURα通过与SNAI2基因启动子区域结合,促进SNAI2转录活性,上调Snail2的表达,诱导食管鳞癌细胞发生EMT,进而促进食管鳞癌的增殖、侵袭和迁移,促进肿瘤进展。该研究为食管癌的诊断和治疗提供了新的分子靶标。肝癌（Liver cancer）是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在所有的恶性肿瘤中排名第四位,致死率高,预后差。RuvB-like 2（RUVBL2）蛋白属于与多种细胞活性相关的保守ATPase（AAA+）蛋白亚家族,其保守的WalkerA和B结构域可以参与ATP的结合和水解。有文献报道RUVBL2可能参与肝癌的发生,然而,RUVBL2的表达、调控和临床意义尚未系统性地在大规模肝癌临床样本中分析和验证。本实验室前期研究发现,RUVBL2蛋白在肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma.HCC）中表达上调,本研究探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能和表达调控机制。前期用免疫组化分析了 153例肝癌患者组织芯片的RUVBL2表达水平,在此工作基础上,我们对TCGA数据库中收录的371例肝癌患者的转录组测序数据、体细胞拷贝数改变数据和DNA甲基化数据进行整合分析,探究RUVBL2在肝癌中表达上调的原因和临床意义。进而在体外培养的肝癌细胞上探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能。在HepG2和Huh7肝癌细胞中瞬时敲降RUVBL2,利用CCK-8和平板克隆实验,以及Transwell实验检测RUVBL2对体外细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响:Western blot检测RUVBL2对热休克蛋白90（HSP90）、细胞分裂周期蛋白37（CDC37）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）和细胞外调解蛋白激酶（ERK）信号通路的影响。结果发现,RUVBL2基因启动子低甲基化、拷贝数增加,MYC基因扩增和CTNNB1基因突变可能参与调控RUVBL2在肝癌中表达水平增高。高水平的RUVBL2 mRNA与肝癌患者较短的无复发生存时间（Recurrence-free survival time.RFS）相关,但不影响总生存时间（Overall survival time,OS）。敲降RUVBL2肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低,并抑制HSP90-CDC37、AKT和ERK的磷酸化。以上结果提示,RUVBL2在肝细胞肝癌中的表达受到转录水平和表观遗传水平的调控。RUVBL2可能通过激活HSP90-CDC37、AKT和ERK通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,提示RUVBL2是肝癌的一个潜在预后预测标志和治疗靶标。本实验室前期采用全基因组关联分析（Genome-wide association analysis.GWAS）鉴定到位于2q33.1区域的5个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）位点与中国汉族人群食管鳞癌的发生显着相关。本研究还探讨了一个位于CASP8基因内含子中的主效位点调控食管癌易感性的机制。发现该位点通过影响剪接因子的结合而参与调控CASP8基因的选择性剪接,产生一个新的CASP8剪接亚型Caspase-8X。新剪接亚型编码C端催化结构域缺失的Caspase-8截短体蛋白Caspase-8X,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,与食管癌发生发展相关。该研究发现了一个参与调控食管鳞癌发生的新机制,为认识食管鳞癌癌变机理积累了科学数据。
王惠[4]（2021）在《新疆哈密哈萨克族食管癌病理特点及治疗预后的影响因素》文中研究指明背景食管癌为人类常见恶性肿瘤之一,而新疆哈萨克族中食管癌发生率也有较多报道,本地区多以游牧为生,文化程度低,家庭生活水平较差,日常饮食单一,营养物质摄入不足,有较高的食管癌发生风险。了解哈萨克族食管癌的病理特征,对于判断疾病发生发展至关重要,对于完善分子病理学理论进行早期诊断,预测食管癌患者的疗效和预后有重要意义。目的分析新疆哈密哈萨克族食管癌的病理特点,并采用门诊、住院复查及电话等方式跟踪调查,获得预后资料,分析治疗预后影响因素。方法选取2012年12月～2017年12月哈密市第二人民医院收治的新疆哈萨克族食管癌患者72例,统计所有患者临床资料,分析食管癌的病理特点,同时记录其术前实验室指标、影像学资料及治疗情况。采用门诊、住院复查及通过电话和其他随访方法获得预后数据。术后3年内3月随访一次,到患者死亡日期为总的存活时间,至2020年年底。以寿命表法对术后1年、2年、3年生存率进行计算,Kaplan-Meier法分析累积生存率,并绘制生存曲线。将随访截止死亡的患者记为死亡组,存活者（除外失访病例）记为生存组,比较两组的临床资料,采用单因素法分析新疆哈萨克族食管癌预后的相关因素,多因素Logistics回归法分析影响哈萨克族食管癌预后的独立因素。结果1.新疆哈萨克族食管癌的术前资料72例食管癌患者,术前纤维蛋白原（FIB）升高19例、血小板计数（PLT）升高15例、D-二聚体升高23例、血脂水平升高35例、预后营养指数（PNI）低26例,磁共振成像显示T1WI轴位围绕管腔不均匀增厚,腔内狭窄不规整,T2WI环状高密度黏膜线不连续,DWI影像见肿物呈高密度,表观扩散系数（ADC）上可见低密度,ADC值范围为1.12～1.86×10-3mm2/s。2.新疆哈萨克族食管癌的治疗情况行Lvor-lewis手术37例,经Mckeown手术35例,经现代二野或二野半淋巴结清扫清除胸腔内、腹腔与颈部两侧的淋巴结群。单纯接受手术治疗43例,术后予以辅助放化疗29例,适形调强放疗方案:1.8 Gy/次,1次/d,5次/周,共28次。化疗方案（均28天一周期）（1）:紫杉醇+顺铂/奈达铂,放疗时2周期,同步放化疗后2周期。化疗方案（2）:顺铂+氟尿嘧啶,放疗时2周期,同步放化疗后2周期。术后免疫组织化学染色可见ki-67、EGFR、Cyclin D1阳性表达分别46例、38例、59例。3.总生存时间分析以寿命表法评估随访所得72例食管癌术后患者的数据,在3年随访结束,共17例死亡,55例存活,其中4例未达随访终点,51例在随访结束时仍存活。食管鳞癌术后平均生存时间为30.57个月,均未达中位生存,其1年、2年、3年累积生存率分别为89.42%、79.26%、62.50%。4.新疆哈萨克族食管癌的病理特点72例新疆哈萨克族食管癌患者中,男46例,女26例,年龄41～72岁,平均（57.38±7.03）岁,肿瘤直径（3.91±0.74）cm,体质指数（BMI）（23.73±2.55）kg/m2,83.33%（60/72）的患者年龄<65岁,且有吸烟饮酒史、病变集中在食管中下段、肿瘤直径≤5 cm、组织学分型多为溃疡型、病理分型为鳞癌、低中分化、神经侵犯、淋巴结转移、脉管瘤栓、TNM分期以Ⅱ～Ⅲ期为主是其主要病理特征。5.影响新疆哈萨克族食管癌治疗预后的因素分析多因素Logistics回归分析发现,年龄、饮酒史、肿瘤直径>5 cm、低分化、神经侵犯、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、食管憩室、术前FIB升高是影响食管癌预后独立影响因素,而PNI、术后辅助治疗为保护性因素（P<0.05）。结论新疆哈萨克族食管癌患者以鳞癌、低中分化、神经侵犯、淋巴结转移、脉管瘤栓、TNM分期以Ⅲ～Ⅳ期为主是其主要病理特征;年龄、饮酒史、肿块直径>5 cm、低分化、神经侵犯、有淋巴结转移、TNM分期、食管憩室、术前FIB为影响新疆哈萨克族食管癌患者治疗预后的独立影响因素。
马晓丽[5]（2021）在《ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究》文中研究表明目的:本研究目的是探讨整合素连接激酶（ILK）基因对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,研究其在食管癌中功能,为食管癌的精准诊疗奠定理论基础和临床参考。方法:1)采用meta分析评价ILK在消化系统肿瘤组织中的表达,及与消化系统肿瘤临床表型及预后间的相关性;2)筛选ILK高表达的人食管鳞癌细胞系,建立ILK慢病毒干扰序列。将ILK慢病毒干扰序列转染食管鳞癌细胞系TE-1和KYSE-150,用q RT-PCR检测干扰载体转染后ILK的表达。在细胞水平上,利用MTT增殖、克隆检测、流式细胞仪凋亡检测、Transwell小室侵袭及划痕愈合等技术,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;3)建立ILK慢病毒干扰载体,转染KYSE-150细胞。在裸鼠皮下分别接种sh ILK及对照细胞株,建立KYSE-150细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。在动物水平上,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞生长的影响。基于RNA-seq技术筛选食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测其可能的发病机制,筛选可能参与食管癌发生发展的关键调控基因及相关信号通路。结果:第一部分:meta分析结果显示ILK在消化系统肿瘤组中高表达,ILK表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默ILK基因后,可显着抑制TE-1、KYSE-150细胞增殖和集落形成,促进TE-1、KYSE-150细胞凋亡。ILK基因消减后,TE-1、KYSE-150细胞侵袭及迁移能力明显减弱。第三部分:裸鼠移植瘤动物模型结果发现,ILK干扰组裸鼠肿瘤生长缓慢,相比较于对照组,肿瘤的重量及体积均偏小,ILK基因消减后影响了裸鼠成瘤的能力。基于RNA-seq技术,ILK基因干扰后挖掘到5540个食管癌差异表达基因,其中上调基因为2839个,下调基因为2601个。上调的基因有SOD2、IRF6、PER1、PHLDB2、TNFAIP3等,下调的基因有RPL21、HYOU1、WARS、SUPT16H、DHCR24等。可能参与TNF信号通路、AMPK信号通路、Fox O信号通路、P53信号通路、NF-k B信号通路等。结论:ILK在消化系统肿瘤中高表达,与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。ILK基因消减抑制ESCC细胞增殖、克隆形成、侵袭及转移,促进细胞凋亡。体内致瘤研究证实,ILK基因消减会阻碍KYSE-150移植瘤的生长。基于RNA-seq技术筛选出食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测差异表达基因,可能相关的信号传导通路。
骆芳[6]（2021）在《CADM4在非小细胞肺癌生长和转移中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理前言肺癌是世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤,按照病理类型分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,其中,NSCLC约占所有肺癌患者的85%。肺癌的早期症状并不典型,并且极易被忽视,近70%的肺癌患者在诊断时已经出现局部或远处转移,降低了治疗预期。目前,临床NSCLC的治疗,早期以根治性手术为主,辅以放化疗、靶向治疗,晚期则以全身治疗为主。这其中传统放、化疗的治疗效果有限,靶向治疗、抗血管生成治疗、免疫检查点抑制剂的临床应用使患者的预后有了较大的提升。据2021年最新统计,NSCLC患者2年相对生存率达到42%。这与NSCLC的临床治疗探索以及基础相关研究的努力密不可分。因此,深入探讨NSCLC发生、发展的分子机制对于新型抗肿瘤药物的研发和预后的改善至关重要。CADM4是一种免疫球蛋白样细胞粘附分子,研究表明CADM4在前列腺癌、胶质瘤、结直肠癌、肾透明细胞癌和乳腺癌等多种肿瘤组织或肿瘤细胞中存在下调表达。通过体内外过表达CADM4的方式,能在体外抑制结直肠癌细胞的增殖、促进其凋亡,并且能在体内抑制结直肠肿瘤的生长。肾透明细胞癌患者中低表达的CADM4与血管浸润、肿瘤大小以及转移密切相关,同时也在体内证明了CADM4的抗肿瘤生长的作用。而且,CADM4还被证明与结直肠腺癌患者的不良预后有相关性。然而,CADM4在NSCLC中的表达高低情况、及在其生长和转移中是否发挥影响作用、及相关的机制是如何的从未见报道。PI3K/Akt信号通路被多项研究证实参与肿瘤细胞的生长、转移和侵袭等重要生理过程。而且Akt在很多肿瘤中都被证明受到激活,其中也包括NSCLC。然而,CADM4在NSCLC中是否可以调控Akt信号通路并不确定。基于上述情况,本课题首先明确CADM4在NSCLC临床新鲜组织中是否异常表达。随后,在人NSCLC细胞系中改变CADM4水平,观察其对该细胞的生长及转移是否有影响。之后,进一步采用Akt信号通路激动剂SC79或抑制剂LY294002作用于细胞,明确由CADM4介导的NSCLC细胞生长及转移是否得到逆转,以明确NSCLC中CADM4调控细胞生长及转移的机制。最后,建立裸鼠移植瘤模型,在体内干预CADM4表达,观察肿瘤的生长及转移情况,进一步验证细胞实验的结论。本研究旨在为NSCLC确定一个具有潜在开发价值的靶点。研究方法本实验分为三部分:首先,通过western blot及real-time PCR检测方法,明确临床中收集的40例NSCLC患者的癌及癌旁组织中,CADM4在蛋白及m RNA水平上的表达。然后,对人NSCLC细胞A549及NCI-H1299进行瞬时转染,过表达或下调CADM4,使其在细胞中表达升高或降低。通过CCK-8实验方法检测细胞的增殖能力,通过流式细胞术检测各组细胞的周期是否有差异,通过western blot方法检测细胞周期相关蛋白CDK6、cyclin E1、cyclin D1以及p27的表达情况,采用划痕实验检测各组细胞的迁移距离,采用transwell实验方法检测各组细胞的侵袭差异,用明胶酶谱方法检测与侵袭相关的蛋白MMP-2和MMP-9的活性。western blot检测CADM4过表达、下调后对Akt磷酸化水平的影响,初步判断Akt信号通路是否与CADM4有关。在对人NSCLC细胞CADM4过表达、干扰的基础上,用Akt激动剂SC79或抑制剂LY294002作用于细胞,再通过上述多种检测方法明确激活或阻断Akt信号通路后,CADM4介导的对肿瘤细胞增殖、周期、迁移、侵袭的影响是否逆转。最后,通过皮下注射CADM4稳定过表达或下调的两株NSCLC细胞方法建立裸鼠移植瘤模型,测量并计算肿瘤的体积和重量,western blot方法检测肿瘤组织中CADM4蛋白的表达水平,免疫组化方法检测ki67表达,明确CADM4在体内对NSCLC生长的影响。通过尾静脉注射CADM4稳定过表达或敲除的细胞,建立裸鼠肿瘤转移模型,HE染色观察肺组织及肝组织中病理变化。研究结果一、NSCLC临床样本中CADM4的表达临床收集40对NSCLC患者手术切除的新鲜癌组织及对应的癌旁组织,检测每个组织中CADM4蛋白及m RNA水平的表达情况。结果显示:与癌旁组织相比,在NSCLC组织中CADM4在蛋白水平及m RNA水平的表达均显着降低。二、CADM4在体外调节NSCLC细胞的生长和转移对A549及NCI-H1299细胞进行瞬时转染,过表达或下调CADM4。实验分为Vector组、CADM4过表达组、si NC组、si CADM4组。检测各组细胞增殖能力、细胞周期变化、增殖和周期相关蛋白表达情况、迁移、侵袭能力。结果显示:与Vector组细胞相比,CADM4过表达细胞的增殖、迁移与侵袭能力均显着下降,而处在S期、G2的细胞占总细胞的比例显着降低,同时与细胞周期相关的CDK6、cyclin E1、cyclin D1蛋白的表达量均显着下调、P27的表达水平则显着提高,明胶酶谱结果显示代表侵袭能力的两种蛋白MMP-9和MMP-2的活性显着降低。与si NC组相比,si CADM4组各种结果表现出与上述变化完全相反的趋势。并且,A549及NCI-H1299细胞系中结论相同。三、Akt通路在CADM4调控NSCLC细胞生长及转移中发挥的作用A549及NCI-H1299细胞中,分别过表达、下调CADM4后,检测Akt信号通路的活化状态,即p-Akt/Akt的比值。实验分组为:Vector组、CADM4过表达组、si NC组、si CADM4组。再用Akt信号通路激动剂SC79及抑制剂分别作用于过表达及下调CADM4细胞。首先,实验分组为CADM4+DMSO及CADM4+SC79组,用相应的实验方法检测各组细胞的增殖能力变化、细胞周期变化、以及同增殖和周期相关蛋白表达情况变化、迁移、侵袭能力变化。随后,实验分组为si CADM4+DMSO及si CADM4+LY294002,同样进行上述检测。结果显示:在两株细胞中CADM4过表达都会抑制Akt信号通路的活化,而下调CADM4后会促进Akt信号通路的活化。与CADM4+DMSO组相比,CADM4+SC79组细胞的增殖、迁移与侵袭能力显着提高,处在S期、G2的细胞比例显着提高,与细胞周期相关的CDK6、cyclin E1、cyclin D1蛋白的表达量均显着升高,而P27蛋白的表达水平则显着下降,激动剂SC79阻断了由于CADM4过表达对细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用。与si CADM4+DMSO组相比,si CADM4+LY294002组细胞的增殖、迁移与侵袭能力显着下降,处在S期、G2的细胞比例显着降低,与细胞周期相关的CDK6、cyclin E1、cyclin D1蛋白的表达量均显着降低、而P27蛋白的表达水平则显着升高。Akt信号通路抑制剂LY294002作用于CADM4下调的NSCLC细胞后,CADM4下调对细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用被显着减弱。四、CADM4在体内调控NSCLC肿瘤的生长和转移在细胞实验中,我们构建并筛选出稳定过表达及下调CADM4的A549和NCI-H1299细胞。通过皮下注射CADM4稳定过表达或敲除的细胞,建立裸鼠移植瘤模型。测量并计算肿瘤的体积和重量,检测肿瘤中CADM4水平及ki67表达水平。通过尾静脉注射CADM4稳定过表达或敲除的细胞,建立裸鼠肿瘤转移模型,观察肺组织及肝组织中病理变化。实验分为Vector组、CADM4过表达组、sh NC组、sh CADM4组。结果显示:与Vector组相比,CADM4组形成的肿瘤体积、质量显着减小,CADM4的表达水平依然显着提高,Ki67显着降低,肝组织及肺组织中转移的结节数量显着减少。与sh NC组相比,CADM4组形成的肿瘤体积、质量显着增大,CADM4的表达水平依然显着降低,Ki67显着升高,肝组织及肺组织中转移的结节数量显着增多。结论1、CADM4在人NSCLC临床新鲜组织中的表达显着降低。2、体外实验过表达CADM4时,NSCLC的两株细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力均显着下降;而在细胞中下调CADM4时,细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力则显着提高。3、在NSCLC细胞中CADM4的过表达被证明可以抑制Akt信号通路的活性。4、使用Akt信号通路激动剂SC79后,之前因过表达CADM4对细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用被减弱。使用Akt信号通路抑制剂LY294002作用于CADM4下调的细胞,先前因下调CADM4对细胞增殖、迁移、侵袭的促进作用被减弱。5、在体外实验中CADM4被证实通过Akt信号通路对NSCLC细胞的增殖、迁移与侵袭进行调控。6、在体内实验中过表达CADM4,NSCLC的生长和转移能力显着下降;而下调CADM4后,细胞的生长和转移能力显着上升。
王从高[7]（2020）在《贲门腺癌淋巴结转移的临床病理特征和对生存影响及与CDH1蛋白表达的关系》文中提出1 研究背景和目的贲门腺癌是世界范围常见的上消化道恶性肿瘤之一,近年来西方国家贲门腺癌发病率呈现上升态势,中国在内的诸多亚洲国家的贲门腺癌患者发病率逐渐升高。贲门腺癌的预后较差,5年生存期在20%-54%范围内,远期生存结果也不甚理想,其早期确诊比例较低。淋巴结转移是贲门腺癌进展重要的标志,淋巴结转移被认为是影响患者预后的主要因素之一。发生淋巴结转移患者预后生存明显下降。明确贲门腺癌患者淋巴结转移的特点不仅能更精确评估患者状况,也有利于临床医师制订合理的治疗方案和有效的评估患者的预后,具有重要的临床意义。肿瘤的演进是一个复杂的过程,多种基因与蛋白改变涉及其中,了解这些因素不仅可能提供新的个体化精准治疗方案,而且能改善患者整体预后生存。钙黏蛋白对维持机体组织结构和和功能有重要作用。钙黏蛋白（CDH1蛋白）的缺失或低表达会导致肿瘤的侵袭与转移,使肿瘤患者预后变差。在本研究中,笔者通过大样本数据探讨贲门腺癌淋巴结转移特点及预后方面的关系,并进一步分析CDH1蛋白表达在贲门腺癌患者中的表达情况及临床意义,期望为贲门腺癌早期发现、临床个体化治疗方案及预后提供指导依据。2 材料与方法2.1 研究对象研究对象来自于郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室50万例食管癌和贲门癌临床信息数据库（1973-2019年）,选取病理确诊的贲门腺癌手术患者,同时未合并其他恶性肿瘤,且非双灶或多灶贲门腺癌患者,有明确淋巴结分级记录,肿瘤分期明确,基本临床信息完整。2.2 研究方法①回顾性分析38533例贲门腺癌手术患者临床诊疗资料,主要包括:姓名、性别、年龄、家庭住址、吸烟史、饮酒史、家族史、临床诊断、病理诊断、确诊时间、病理诊断详情、肿瘤长径、分化程度、浸润程度、淋巴结转移、有无远处转移、治疗方式等。分析淋巴结转移与其他临床病理因素的关系,并对患者进行生存分析。②选取5288例贲门腺癌患者进行免疫组化染色,检测CDH1蛋白表达情况,并分析CDH1蛋白表达与贲门腺癌患者临床病理特征及预后的关系。2.3 统计学方法采用SPSS25.0进行统计学分析,淋巴结转移及CDH1蛋白表达分布特征采用卡方检验。单因素生存分析根据Kaplan-Meier法,并用Log-rank检验分析组间生存率的差异;采用Cox 比例风险回归模型对影响贲门腺癌患者预后的多因素进行分析。检验水准:a=0.05。3 结果3.1 淋巴结转移的临床病理特征和对生存的影响在本研究纳入的38533例贲门腺癌患者中,男性30152例,平均年龄为60.93±8.69岁;女性8381例,平均年龄为60.24±8.96岁。淋巴结转移在性别,年龄,吸烟史,饮酒史,家族史上没有分布差异。在高/低发区、肿瘤长径,分化程度,T分期,M分期均与淋巴结转移有显着的差异。贲门腺癌早期占比3.6%,中晚期占比96.4%。年龄、饮酒史、分化程度、T分期、N分期是患者预后的独立影响因素。淋巴结转移,年龄增加,分化程度降低,浸润程度加深是贲门腺癌患者预后的危险因素。3.2 CDH1蛋白表达与淋巴结转移的关系及对生存的影响在本研究纳入的5288例贲门腺癌患者中,男性4159例,平均年龄为61.93±8.65岁;女性1129例,平均年龄为61.47±8.87岁。CDH1蛋白阳性表达率为83.9%。CDH1蛋白表达在性别、肿瘤长径,分化程度,浸润程度上分布有显着的差异。在年龄、高/低发区、吸烟史、饮酒史、家族史、N分期、M分期、病理分期等因素上无分布差异。N分期、性别、年龄、高/低发区、肿瘤长径、分化程度是患者预后的独立影响因素。淋巴结转移、男性、年龄增加、肿瘤长径增加、分化程度降低是患者预后的危险因素。单因素生存分析结果显示CDH1蛋白表达阳性、肿瘤浸润程度加深、病理分期增加是患者预后危险因素。4结论4.1 淋巴结转移是影响患者预后的独立危险因素,随着淋巴结转移数目增加,患者整体生存变差。4.2 在合理范围内,增加淋巴结清扫数目有利于阳性淋巴结的检出,影响患者治疗方案,有助于患者生存获益。4.3 肿瘤浸润程度、分化程度与淋巴结转移密切相关,是贲门腺癌预后的独立影响因素。4.4 CDH1蛋白是贲门腺癌患者预后判定的分子标指标,CDH1蛋白的低表达是贲门腺癌患者预后不良的表现。4.5 CDH1蛋白与贲门腺癌肿瘤细胞侵袭与转移有关。肿瘤长径的逐渐增加,肿瘤分化变差,肿瘤浸润程度加深时,CDH1蛋白表达降低。
程纪伟[8]（2020）在《组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响》文中指出食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤,位居全球恶性肿瘤发病率的第8位,死亡率的第6位。食管癌发病高风险区发病率可达低风险区的500倍,表现出明显的地区差异性,其中我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。因此,寻找新的食管癌防治手段是我国食管癌研究领域的重要课题。近年来免疫检查点治疗（Checkpoint therapy）在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。提示,阐明肿瘤浸润关键免疫细胞亚群及其与肿瘤微环境的交互作用机制是进行有效免疫治疗干预的关键。TRM（Tissue resident memory T cells,TRM cells）细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显着强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。因此,本研究拟依托临床生物样本资源优势,以人食管癌组织特异性记忆T细胞为切入点,试图探明食管癌浸润TRM细胞生物学特征,从而为寻找新的食管癌防治方法提供新的思路。第一部分食管癌TILs细胞亚群构成研究研究背景食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤。我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。近年来免疫检查点治疗（Checkpoint therapy）在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。TRM（Tissue resident memory T cells,TRM cells）细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显着强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。我们通过单细胞分析平台Cytobank对食管癌及配对正常组织浸润 T 细胞进行 SPADE（Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events,SPADE）分析发现,人食管癌组织内CD8+TRM细胞（CD8+CD103+CD69+TRM细胞）含量较正常组织明显增高,通过传统设门分析方法我们同样确认了人CD8+TRM细胞特异性表达于食管癌组织及配对正常食管组织,且人食管癌组织CD8+TRM细胞含量较正常组织明显增高。以上初步研究结果提示:CD8+TRM细胞的异常增高是人食管癌炎性微环境内T细胞组成改变的非常重要的一个特征。因此,进一步探明CD8+TRM细胞在人食管癌免疫微环境中的作用及其参与肿瘤免疫应答及调控的潜在机制,能为寻找靶向干预食管癌免疫微环境关键细胞的免疫治疗新策略提供方向。目的探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。方法这部分研究工作将在医院伦理委员会批准和患者知情同意下,告知患者研究相关事项并签署知情同意书后,首先收集食管癌手术患者配对新鲜肿瘤组织和相对正常食管组织,通过原代组织浸润淋巴细胞分离方法制备单细胞悬液。然后通过多色荧光抗体标记,高通量多色流式检测食管癌及配对正常组织内TILs细胞及其亚群表达情况,探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。为下一步分离并鉴定食管癌CD8+TRM细胞在食管癌组织内的分布及特征奠定基础。结果（1）对人食管癌及配对正常组织CD3+T细胞SPADE分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显着增高。（2）流式设门分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显着增高。结论CD8+TRM细胞在人食管癌组织显着富集。第二部分食管癌浸润CD8+TRM细胞亚群、分布、表型及生物学特征研究研究背景目前TRM细胞被认为具有以下特征:（1）具有长时期自我更新能力;（2）大量表达于上皮粘膜等免疫屏障组织;（3）识别微生物产物、细胞因子、危险信号分子及应激相关配体;（4）快速分泌多种炎症因子。经典的感染免疫学研究显示,在初始感染后小鼠阴道粘膜CD8+TRM细胞能够快速识别病原并产生特异性免疫记忆;而再次接触同类抗原的时候通过分泌大量细胞因子促进体液免疫应答、DC细胞成熟及自然杀伤细胞活化。提示TRM细胞广泛参与机体多种免疫应答的调节。但其在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。我们前期的研究发现CD8+TRM细胞在人食管癌组织内显着增高,加之先前的研究显示CD8+TRM细胞在慢性炎症模型中能够启动固有免疫及获得性免疫,并能对多种免疫应答进行调控。由此我们推测CD8+TRM细胞是人食管癌炎症免疫失调及肿瘤进展的关键因素之一。目的这部分研究工作重点通过多种CD8+TRM细胞相关细胞表面标记抗体,运用多色流式检测分析技术,检测食管癌及其配对正常组织单细胞悬液内CD8+TRM细胞的亚群、组织分布及其他表型特征。阐明食管癌组织浸润CD8+TRM细胞的组织分布、分化相关表型表达特征。从而初步明确其分化表型及组织趋向性等基本生物学特征。为进一步明确其在食管癌相关炎症组织中功能重塑及进一步极化的调控机制打下基础。方法（1）食管癌浸润CD8+TRM细胞组织分布特征检测:取手术切除新鲜配对食管癌及正常组织,无菌环境制备单细胞悬液,然后通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69）,分析不同组织CD8+TRM细胞比例及数量。（2）分化相关表型鉴定:通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、CD45RA、CD45RO）,分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞分化相关表型特征。（3）免疫检查点分子检测:通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、PD-1、Tim-3）,分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞免疫检查点分子表达特征。结果（1）食管癌肿瘤浸润T细胞以CD4和CD8细胞为主,因此我们对人食管癌配对组织CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞进一步分析显示,食管癌患者配对正常食管组织及肿瘤中均表达较高比例的CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞。然而,统计学分析显示人食管癌组织CD8+TRM细胞比例和绝对数量均较配对正常组织均显着增高（P<0.0001）。相反,虽然CD4+TRM细胞数量在食管癌组织也呈增高趋势,但其在人食管癌组织中比例较配对正常食管组织却呈降低趋势。（2）我们对人食管癌及配对正常组织CD3+TRM细胞的研究显示,人食管癌浸润CD3+TRM细胞较正常配对组织显着增高。进一步分析显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞主要以CD8+TRM细胞和CD4+TRM细胞为主,仅有少量TRM细胞亚群为γδT细胞和iNKT细胞。更重要的是我们对肿瘤组织TRM细胞亚群的平行比较发现,人食管癌浸润CD8+TRM细胞在比例和数量上较其余TRM细胞亚群均占有绝对优势。（3）基于小鼠慢性自身免疫性疾病模型的研究显示,持续存在于病变组织的CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭状态（Immune exhaustion）,且能持续募集促炎性CD4+Th细胞及巨噬细胞。提示,在慢性炎症持续存在的情况下CD8+TRM细胞发生免疫耗竭,并进一步促进局部炎症反应。我们的研究显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞以效应记忆T细胞（Effector memory T cells,TEM）及中央型记忆T细胞（Central memory T cells,TCM）为主,进一步研究显示,人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显着增高。我们通过viSNE（visual stochastic network embedding,viSNE）分析也同样证实 了人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显着增高。提示,人食管癌炎性免疫微环境内某些因素促进CD8+TRM细胞免疫耗竭。而肿瘤微环境内慢性炎症的持续存在已被公认与肿瘤免疫调控失衡密切相关。因此,我们有理由相信人食管癌组织CD8+TRM显着增高并表现为免疫耗竭状态这一现象与肿瘤炎性微环境稳态失衡有密切关联。结论（1）CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位。（2）人食管癌浸润CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭表型。第三部分 食管癌浸润TRM细胞与肿瘤临床病理特征及预后相关性研究研究背景以上研究证明CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位,通过分析食管癌浸润CD8+TRM细胞数量与肿瘤临床特征及预后的相关性,为靶向干预食管癌相关炎症免疫调节的关键细胞（分子）提供新的思路,也为临床运用CD8+TRM细胞作为食管癌预后预测指标及靶向干预CD8+TRM细胞介导的食管癌免疫抑制提供了潜在可能性,具有临床转化意义。目的这部分研究工作重点将应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测,结合患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期、临床病理特征的相关性。从而明确人CD8+TRM细胞与食管癌临床病理特征及预后的相关性。方法（1）应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测。（2）食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者临床病理特征的相关性分析:收集患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期及其他临床病理特征的相关性。（3）食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者预后相关性分析:应用既往患者食管癌组织芯片免疫组织化学染色的方法,分析CD8+TRM细胞数量与患者预后的关系。结果（1）CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者总生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,（log-rank P<0.05）（2）CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者无病生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,（log-rank P<0.05）结论（1）CD8+TRM细胞高表达的食管癌患者预后良好,CD8+TRM细胞可以作为一个判断食管癌患者预后的生物学指标。（2）CD8+TRM细胞可以作为预测指标筛选接受免疫治疗临床实验的食管癌患者。
于兰[9]（2020）在《食管癌阴性淋巴结数目与患者预后相关性以及食管癌免疫治疗相关研究》文中研究表明中文摘要第一部分胸段食管鳞癌根治术后阴性淋巴结数目与患者预后的相关性分析研究背景食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率以及死亡率分别占全世界恶性肿瘤的第七位和第六位。亚洲以及非洲东、南部地区高发。2015年,我国新诊断食管癌患者47.79万例和食管癌相关死亡患者37.5万例。食管癌的主要病理类型是腺癌和鳞癌,以鳞癌为主,中国患者鳞癌占90%以上。近年来,尽管食管癌在多学科综合治疗方面取得了较大进展,但手术根治切除仍是目前唯一能治愈食管癌的治疗方式。目前研究已证实,淋巴结转移的数目是食管癌患者重要的独立预后因素。而术中淋巴结的清扫程度反映了淋巴结转移数目的准确性,同时一定程度上反映了术后病理分期的准确性。虽然第七版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）分期系统建议,为了更准确地对食管癌根治术后患者进行分期,至少清扫15个淋巴结,但目前对于食管癌根治术中淋巴结清扫的最佳范围和数目仍存在争议。近年来,阴性淋巴结（negative lymph nodes,NLNs）数目在乳腺癌、胃癌以及结直肠癌中被证实比转移的阳性淋巴结数目更准确的判断患者预后,成为预测患者预后的重要指标。部分研究者分析了 NLNs数目和食管癌患者生存预后的关系,Greenstein等研究发现对于淋巴结阴性的食管腺癌患者,NLNs计数的增加与患者长期生存有关,而对于鳞癌患者,NLNs计数的增加与患者长期生存无关。另一项研究表明,在淋巴结阳性的食管癌患者中,NLNs计数的增加是患者预后的有利因素,而在淋巴结阴性的患者中则未显示NLNs计数与患者预后相关。吴等对429例接受二野淋巴结清扫术的食管癌患者进行了分析研究,结果显示NLNs是淋巴结阴性食管癌患者的独立预后指标。这些研究结果之间存在差异性,结论存在争议。因此,本研究通过对食管癌根治术后胸段鳞癌患者的回顾性分析,探讨NLNs数目与患者预后的相关性,探索NLNs在食管癌术后患者中的临床作用。方法本研究回顾性分析了 2009年1月至2012年12月在山东大学齐鲁医院胸外科接受根治性食管癌切除术的579例胸段食管鳞癌患者。入组标准:患者年龄40～70岁;经组织病理学证实为胸段食管鳞癌;术前未接受过放疗、化疗和/或靶向治疗;无第二原发肿瘤病史;术前检查完善,包括上消化道造影、胸腹部增强计算机体层摄影（computed tomography,CT）、颈部超声、胃镜以及颅脑磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）;手术完全切除（R0）;临床资料完整,至少随访3年或者患者死亡;生存期>3个月。排除标准:非食管癌相关性死亡患者;非R0切除;颈段食管癌;失访患者。根据患者NLNs数目不同,将患者分为4组,分别为0～9、10～14、15～19和≥2 0。随访时间截止到2015年12月30日。采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析。对数秩（Log-rank）检验进行单因素分析,Cox回归模型进行多因素分析。单变量分析变量包括年龄、性别、肿瘤长度、肿瘤分化程度、肿瘤位置、T分期、N分期以及NLNs数目。多因素分析包括肿瘤长度、T分期、N分期和NLNs数目。患者生存时间定义为自手术日期到患者随访截止或死亡日期。生存分析采用Kaplan-Meier方法。所有P值双侧检验,P值<0.05表示具有统计学意义。结果1.患者生存情况所有患者均接受了随访,中位随访时间为36个月（3～80个月）。患者中位生存时间（median survival time,MST）36 个月,3 年生存率（overall survival,OS）为 50.8%。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者 3 年 OS 分别为 86.1%、53.7%、31.6%（χ2=67.604,P=0.000）。579例患者中0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为13个月、27个月、39个月和47个月,3年OS分别为21.7%、40.0%、61.2%和77.5%（χ2=120.475,P=:0.000）。淋巴结阴性组患者344例,0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为18个月、36个月、42.5月和48个月,3年 OS 分别为 34.9%、50.9%、65.6%和 89.0%（χ2=35.284,P=0.000）。淋巴结阳性组患者235例,0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为12个月、22个月、36个月和45个月,3年OS分别为14.3%、19.3%、51.8%和68.9%（χ2=67.604,P=0.000）。2.患者预后因素分析单因素分析显示,性别（P=0.023）、肿瘤长度（P=0.000）、肿瘤分化程度（P=0.011）、T 分期（P=0.000）、N 分期（P=0.000）以及 NLNs（P=0.000）是影响胸段食管鳞癌术后患者3年总生存率的显着因素。多因素分析显示,肿瘤长度（P=0.042）、T 分期（P=0.000）、N 分期（P=0.000）和 NLNs（P=0.000）是影响胸段食管鳞癌术后患者3年总生存率的显着因素。结论NLNs数目是影响胸段食管鳞癌根治术后患者生存的独立预后指标。建议在控制手术并发症前提下,增加食管癌淋巴结清扫数目,以提高患者的生存。中文摘要第二部分EpCAM在食管癌中的表达以及与免疫治疗相关性研究研究背景食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,对于可手术切除的食管癌,治疗以根治性切除术为主,但局部复发和远处转移是术后患者治疗失败的主要原因。而且约2/3的患者在确诊时已为局部晚期或出现远处转移,失去手术机会,全身化疗联合局部放疗是目前晚期食管癌的主要治疗手段,然而全身化疗后很快出现耐药和治疗失败,患者预后差,总体5年生存率（overall survival,OS）仍保持在15～25%。研究报道食管癌干细胞的存在是肿瘤放化疗抵抗以及治疗失败的主要原因。这部分细胞亚群具有无限增殖、高侵袭性、高致瘤性和多重耐药性等干细胞特性,导致治疗失败。因此,寻找有效的药物针对这部分放化疗抗拒的细胞亚群是治疗食管癌这一致命癌症的关键。上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）目前被认为是重要的癌症生物标志物之一,主要表达在上皮肿瘤中表达,同时也过表达于某些肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）,也被认为是某些恶性肿瘤干细胞的标记物。而EpCAM在食管癌干细胞中的表达情况尚不清楚。Solitomab是一种EpCAM/CD3双特异性单链抗体构建体,可同时与表达EpCAM的肿瘤细胞和T细胞相结合,从而激活机体免疫系统的T细胞,起到杀伤肿瘤细胞的目的。研究已经显示Solitomab对结肠癌、胰腺癌以及子宫肉瘤等细胞系有杀伤抑制作用。然而关于Solitomab对食管癌细胞的作用,目前尚未见报道。因此,本研究选取以无血清培养基诱导的食管癌Eca109细胞球为研究对象,分别进行食管癌细胞球的体外增殖、克隆、侵袭性和多药耐药实验以及EpCAM表达水平的检测,并进步观察双特异性抗体Solitomab联合γδT细胞对食管癌细胞球的细胞毒性作用,从而探索有效的食管癌免疫药物。方法1.无血清成球培养法培养Eca109细胞球,镜下和流式细胞仪比较野生型Eca109细胞和Eca109细胞球细胞形态的区别;2.3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4,5-DimethylthiaZOL-2-y1）-2,5-DIPHenyltetrazolium bromide,MTT）法和克隆形成实验检测并比较两组细胞的体外增殖能力;3.Transwell侵袭实验检测并比较两组细胞的侵袭能力;4.MTT法检测并比较两组细胞在纳米白蛋白结合型紫杉醇（Nab-PTX）和顺铂作用后的细胞存活比例;5.流式细胞仪检测EpCAM在两组细胞中的表达水平;6.流式细胞仪检测双特异性抗体Solitomab联合γδT细胞对野生型Eca109细胞和Eca109细胞球的细胞毒性作用。结果1.Eca109细胞在无血清培养基中培养3天后逐渐形成悬浮生长的细胞球,培养至第12天可传代,第2代细胞球形成时间比第1代快,而且体积小,形态规则。流式细胞仪分析可见Eca109细胞球较野生型Eca109细胞的FSC和SSC值偏低,提示Eca109细胞球细胞体积较小,细胞内颗粒较少。2.MTT法和克隆形成实验显示Eca109细胞球细胞的体外细胞增殖率和>50个细胞数的克隆形成率均明显高于野生型Eca109细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Eca109细胞球细胞较野生型Eca109细胞穿过Matrigel基质胶到达滤膜的细胞数多,差异存在统计学意义（P<0.05）。4.MTT法显示不同浓度Nab-PTX和顺铂作用下,Eca109细胞球细胞的存活率均比野生型Eca109细胞高,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.流式细胞仪检测显示野生型Eca109细胞和Eca109细胞球细胞均表达EpCAM,细胞球细胞的表达水平高于野生型Eca109细胞。6.将培养γδ T细胞分别与野生型Eca109细胞以及Eca109细胞球细胞共培养,结果显示不加Solitomab时,γδ T细胞对野生型Eca109细胞或Eca109细胞球细胞的细胞毒作用无明显差别（P>0.05）;加入Solitomab后,γδT细胞能够显着增强对二者杀伤的同时,γδ T细胞对Eca109细胞球细胞的毒性作用明显高于野生型Eca109细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.食管癌Eca109细胞球具有较强的增殖、侵袭能力以及多药耐药等干细胞特性,可能含有较高比例的食管癌干细胞;2.食管癌Eca109细胞球高表达EpCAM,EpCAM可能是食管癌干细胞的标志物之一;3.EpCAM可能是潜在的食管癌免疫治疗分子靶点,Solitomab有可能成为化疗抗拒的食管癌免疫治疗的有效药物。
张晓珊[10]（2020）在《食管鳞状细胞癌中CD166、CD44、Lgr5的表达 ——对癌症进展和预后的影响》文中进行了进一步梳理背景和目的食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是我国常见的恶性肿瘤,其发病率及致死率都较高。病因与饮食习惯（过热、过硬的食物）、生活环境（微量元素钼缺乏）及遗传因素等相关。由于食管鳞状细胞癌早期常缺乏明显的临床症状,患者被确诊时往往已处于转移阶段,因此预后较差。肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）是肿瘤中具有显着自我更新能力的一小部分细胞,通常占全部肿瘤细胞的5%以下,肿瘤的生长和增殖依赖于这部分细胞。研究表明,在很多实体肿瘤中CSCs已被证实与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。CSCs表面存在多种标记物,且CSCs可由细胞表面标记物识别。但对于肿瘤中的CSCs表面的最佳标记物尚无共识。CD166、CD44、Lgr5是常见的表面标记物,在其它肿瘤中已有研究证实了它们的表达与肿瘤发生、发展及预后的关系。但关于它们与食管鳞状细胞癌关系的研究相对较少,因此在本研究中着重探讨食管鳞状细胞癌中CD166、CD44、Lgr5的表达对癌症进展和预后的影响。材料与方法从郑州大学第二附属医院病理科的生物样本库中收集了 65个食管鳞状细胞癌（ESCC）石蜡块和16个对照组织石蜡块,查询和收集这些ESCC患者的基本临床信息及随访信息（45例ESCC）。用免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测了 65例和16例对照食管组织中CSCs表面标记因子CD166、CD44和Lgr5的表达,并分析了这些CSCs表面标记因子的表达与临床病理变量之间的相关性。进一步评估了食管鳞状细胞癌患者CD166、CD44和Lgr5表达的预后意义。结果（1）IHC结果表明,未在食管对照组织中检测出的CD166的表达,而ESCC组织中CD166的表达率为87.69%（57/65）,两者相比 有统计学意义（P<0.05）。食管对照组织和ESCC组织之间CD44的表达没有差异（P>0.05）,同样Lgr5的表达未在两组之间发现差异（P>0.05）。（2）在ESCC组织中CD166、CD44和Lgr5表达水平之间没有发现相关性。（3）临床病理分析显示,ESCC组织中的CD166的过表达与淋巴结转移（P<0.05）及TNM分期（P<0.05）相关。并且发现ESCC晚期TNM患者CD44表达水平降低（P<0.05）。未发现Lgr5的表达水平与临床病理参数之间的关系。（4）Kaplan-Meier生存曲线表明,CD166的过表达与ESCC患者术后的总体生存期（Overall survival,OS）呈负相关,差异有统计学意义（P<0.05）。未在另外两种因子中发现同样的结果。单因素分析显示,CD166的表达量（P=0.001）是影响ESCC患者预后的危险因素。多因素分析显示,CD166的表达增加（P=0.000）是ESCC患者预后的独立危险因素。结论CD166是潜在的预后标记物,且与食管鳞状细胞癌的晚期进展相关。
二、细胞粘附分子的表达与食管癌转移预后的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞粘附分子的表达与食管癌转移预后的关系（论文提纲范文）
（1）PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 H.pylori主要的致癌因子 |
| 1.3 H.pylori感染胃黏膜改变的关键分子PMEPA1 |
| 第2章 PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及其生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织标本及资料收集 |
| 2.1.2 生物信息学数据库 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学数据挖掘 |
| 2.2.2 组织蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 2.2.3 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PMEPA1在胃癌组织中显着高表达 |
| 2.3.2 PMEPA1与胃癌患者预后的关系 |
| 2.3.3 PMEPA1诊断胃癌的临床价值 |
| 2.3.4 生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 H.pylori感染及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床组织标本收集 |
| 3.1.2 细胞系及实验菌株 |
| 3.1.3 质粒及感受态细胞 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 幽门螺杆菌的复苏、鉴定、传代 |
| 3.2.2 H.pylori7.13和PMSS1 oipA基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.3 制备抗oipA重组抗原的免疫兔多克隆抗体 |
| 3.2.4 细胞培养及细菌细胞共培养模型的构建 |
| 3.2.5 蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 3.2.6 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.7 石蜡切片及免疫组织化学 |
| 3.2.8 细胞转录组学 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hp7.13和PMSS1 菌株的oipA基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 H.pylori感染上调胃上皮细胞中PMEPA1的表达水平 |
| 3.3.3 H.pylori cag A和 oipA影响胃上皮细胞PMEPA1的表达 |
| 3.3.4 PMEPA1在不同胃黏膜病变阶段的表达及与H.pylori感染的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 4.2.2 CCK8 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 实时无标记细胞增殖实验 |
| 4.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 4.2.5 划痕修复实验 |
| 4.2.6 克隆形成实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 成功构建PMEPA1过表达和敲减稳转细胞株 |
| 4.3.2 PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.3 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞的生物学行为的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 PMEPA1在H.pylori感染胃上皮细胞改变的转录组学研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞转录组测序流程 |
| 5.2.2 转录组测序数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 测序样品的RNA验证 |
| 5.3.2 PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.3.3 Hp感染对过表达或敲减PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.3.4 PMEPA1对不同Hp菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 小结和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 PMEPA1在肿瘤中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 幽门螺杆菌外膜蛋白致病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）VASN在幽门螺杆菌致病及胃癌发生发展中的作用和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 筛选和鉴定Hp感染致胃黏膜病变的核心基因VASN |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 Hp感染及Cag A致胃上皮细胞改变的核心基因 |
| 2.2.2 Hp感染及Cag A对胃上皮细胞VASN蛋白表达的影响 |
| 2.2.3 VASN在临床患者胃黏膜病变过程中的表达以及与Hp感染的关系 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 VASN在胃癌组织中的表达及与胃癌患者预后的关系 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 VASN在胃癌中的表达 |
| 3.2.2 VASN和胃癌患者预后的关系 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞生物学表型的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 VASN高表达和低表达稳转细胞株的构建和鉴定 |
| 4.2.2 VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 4.2.3 VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2.4 VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭能力的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 转录组学和蛋白质组学分析 VASN 的生物学功能 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.2.2 VASN对胃上皮细胞和胃癌细胞蛋白水平的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 VASN通过PI3K/AKT信号通路调控胃上皮细胞和胃癌细胞的生物学改变 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 VASN调控胃上皮细胞和胃癌细胞中PI3K/AKT信号通路 |
| 6.2.2 AKT抑制剂对VASN促增殖作用的影响 |
| 6.2.3 VASN对 PI3K/AKT信号网络的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 VASN 在肿瘤发生发展中的作用 |
| 参考文献 |
（3）功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究（论文提纲范文）
| 基金支持 |
| 缩略语索引表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 PURα在食管鳞癌组织中的表达与临床病理特征分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 食管癌组织中PURA mRNA水平显着升高 |
| 2. 食管鳞癌组织中PURα蛋白水平显着升高 |
| 3. PURα高表达与AJCC分期和淋巴结转移正相关 |
| 4. PURα高表达的ESCC患者生存期更短 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 PURα影响食管癌生物学特性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 建立PURα稳定过表达和敲降的食管鳞癌细胞系 |
| 2. PURα促进体外食管癌细胞的增殖 |
| 3. PURα促进体外食管鳞癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4. PURα促进体内食管鳞癌的肿瘤增殖和转移能力 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 PURα促进食管癌进展的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. PURα调控食管鳞癌细胞转录组的RNA-seq分析 |
| 2. PURα调控食管鳞癌细胞EMT相关分子的转录 |
| 3. PURα上调EMT关键转录因子Snail2的表达 |
| 4. PURα通过促进Snail2的表达诱导食管鳞癌细胞发生EMT |
| 5. PURα通过调控Snail2促进食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 6. PURα通过Snail2在体内诱导食管鳞癌细胞EMT转变 |
| 7. PURα调控SNAI2的转录活性 |
| 8 PURα直接与SNAI2的启动子区域结合 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 RUVBL2在肝细胞肝癌中的调控机制和生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 在肝癌组织中RUVBL2的mRNA水平显着升高 |
| 2. RUVBL2 mRNA水平与患者临床病理参数相关性分析 |
| 3. RUVBL2 mRNA水平与患者生存的相关性 |
| 4. 肝癌组织中RUVBL2 mRNA的异常转录调控 |
| 5. RUVBL2促进体外肝癌细胞的增殖 |
| 6. RUVBL2促进体外肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 7. RUVBL2激活HSP90-CDC37、AKT和ERK通路 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 CASP8基因单核苷酸多态性调控食管鳞癌易感性的机理研究 |
| 文献综述 选择性剪接与细胞癌变研究进展 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文和获奖证书 |
（4）新疆哈密哈萨克族食管癌病理特点及治疗预后的影响因素（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 资料及方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 治疗方式 |
| 1.3 临床资料收集 |
| 1.4 随访 |
| 1.5 统计学方法 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 新疆哈萨克族食管癌基线资料及病理特点 |
| 2.2 新疆哈萨克族食管癌的术前资料 |
| 2.3 新疆哈萨克族食管癌的手术治疗相关情况 |
| 2.4 总生存时间分析 |
| 2.5 影响新疆哈萨克族食管癌治疗预后的因素分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新疆哈密哈萨克族食管癌的病理特点 |
| 3.2 食管癌的影像学特点分析 |
| 3.3 食管癌的生存情况分析 |
| 3.4 影响食管癌患者生存预后的因素分析 |
| 4 结论 |
| 5 本研究不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述 新疆哈萨克族食管癌发病学的分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（5）ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ILK表达与消化系统恶性肿瘤临床表型及预后相关性的Meta分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 检索数据库 |
| 1.2 文献纳入和排除标准 |
| 1.3 文献筛选和资料提取 |
| 1.4 研究方法学质量评价 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 ILK对食管鳞癌细胞恶性表型的功能影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系及来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ILK对食管鳞癌体内成瘤性的影响及生物信息学分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素连接激酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（6）CADM4在非小细胞肺癌生长和转移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略 |
| 第一部分 CADM4在NSCLC患者癌组织中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 CADM4在NSCLC生长和转移中的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 动物实验验证CADM4在NSCLC生长和转移中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 CADM4 及 Necl、Nectin家族其它成员在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）贲门腺癌淋巴结转移的临床病理特征和对生存影响及与CDH1蛋白表达的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英符号对照一览表 |
| 第一部分: 贲门腺癌淋巴结转移的临床病理特征和对生存的影响 |
| 1 研究背景和目的 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 第二部分: CDH1蛋白表达与贲门腺癌淋巴结转移的关系及对生存期的影响 |
| 1 研究背景与目的 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 综述 贲门腺癌淋巴结转移的影响因素及机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 贲门腺癌的定义及分型 |
| 3 淋巴结引流规律 |
| 4 临床上常用淋巴结检查方法 |
| 5 外科手术中淋巴结清扫范围 |
| 6 淋巴结转移与预后的关系 |
| 7 淋巴结转移的相关分子学研究 |
| 8 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 食管癌TILs细胞亚群构成研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 食管癌浸润CD8~+TRM细胞亚群、分布及表型特征研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 食管癌浸润TRM细胞与肿瘤临床病理特征及预后相关性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组织特异性记忆T细胞在实体肿瘤免疫中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（9）食管癌阴性淋巴结数目与患者预后相关性以及食管癌免疫治疗相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 胸段食管鳞癌根治术后阴性淋巴结数目与患者预后的相关性分析 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EpCAM在食管癌中的表达以及与免疫治疗相关性研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ |
| 致谢 |
| 发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）食管鳞状细胞癌中CD166、CD44、Lgr5的表达 ——对癌症进展和预后的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表(Abbreviation) |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ALCAM/CD166在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、细胞粘附分子的表达与食管癌转移预后的关系（论文参考文献）
- [1]PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究[D]. 赵巧云. 南昌大学, 2021(01)
- [2]VASN在幽门螺杆菌致病及胃癌发生发展中的作用和机制[D]. 赵汝霖. 南昌大学, 2021
- [3]功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究[D]. 高佳佳. 北京协和医学院, 2021
- [4]新疆哈密哈萨克族食管癌病理特点及治疗预后的影响因素[D]. 王惠. 新乡医学院, 2021(01)
- [5]ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究[D]. 马晓丽. 新疆医科大学, 2021
- [6]CADM4在非小细胞肺癌生长和转移中的作用及机制研究[D]. 骆芳. 大连医科大学, 2021(01)
- [7]贲门腺癌淋巴结转移的临床病理特征和对生存影响及与CDH1蛋白表达的关系[D]. 王从高. 郑州大学, 2020(02)
- [8]组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响[D]. 程纪伟. 郑州大学, 2020(02)
- [9]食管癌阴性淋巴结数目与患者预后相关性以及食管癌免疫治疗相关研究[D]. 于兰. 山东大学, 2020(12)
- [10]食管鳞状细胞癌中CD166、CD44、Lgr5的表达 ——对癌症进展和预后的影响[D]. 张晓珊. 郑州大学, 2020(02)