一、甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析（论文文献综述）
丁玉梅[1]（2019）在《黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制及NBS类抗病基因筛选》文中提出黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia Bouche）是南瓜属一年或多年生瓜类作物,对瓜类枯萎病有较强抗性,已作为嫁接砧木有效控制了瓜类枯萎病的发生和危害。中国是全球瓜类生产大国,枯萎病是影响瓜类产量和品质的重要病害之一,为镰孢属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）寄生引起的一种真菌土传病害,在世界范围内的瓜类种植区普遍发生,一般使瓜类减产20%60%,而培育抗病品种是防控该病最经济、最有效和环境友好的途径。有关瓜类对枯萎病菌侵染的免疫应答机制及瓜类-枯萎病菌互作的分子机制至今未完全阐明。利用高通量的测序技术,从转录组学和蛋白组学水平上研究黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的分子机制。一方面,可以较系统分析抗性基因和抗性蛋白的差异表达特性,有助于从整体水平上揭示黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的代谢通路、信号传导和分子调控网络,深入解析黑籽南瓜-枯萎病菌互作的分子机制,为阐明瓜类寄主响应枯萎病菌胁迫的抗性机制提供分子生物学基础信息。另一方面,可获得差异基因和差异蛋白表达谱的全景图,有利于筛选和鉴定起关键作用的抗病基因,为瓜类抗枯萎病基因工程育种提供可利用的基因资源。基于此,本研究从黑籽南瓜基因组中克隆NBS类抗病基因同源序列（RGAs）,并分析不同抗性品种中NBS同源片段的表达差异,结合枯萎病症状的表现确定抗性基因表达丰度较高的取样时间。在此基础上,选取抗病材料,利用高通量RNA-Seq技术和iTRAQ技术,通过多点时序比较,构建黑籽南瓜应答枯萎病菌胁迫的差异基因和差异蛋白表达谱,分析黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的代谢通路和分子调控网络;锁定和鉴别黑籽南瓜NBS类关键抗病基因,构建NBS类基因的VIGS沉默载体进行基因功能的初步验证。获得的主要研究结果如下:1.设计NBS类抗病基因保守结构域的简并引物,从黑籽南瓜基因组中分离了8条RGAs,其中HQRGA2（GenBank ID:MG946756）包含NBS类抗病基因的4个保守模块:P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL区,且具有NB-ARC（nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4）结构,为CC-NBS-LRR类抗病基因序列。HQRGA2与部分抗病基因序列的核苷酸相似性达到87%99%,与中国南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13的氨基酸同源性较高,达到96.6%,与其余抗病基因同源性在16.6%43.8%之间。Q-PCR分析显示3个黑籽南瓜品种中HQRGA2的表达均受枯萎病菌胁迫（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）的诱导,其中感病白皮品种呈多个升-降的表达趋势,中抗花皮品种呈多个降-升的趋势,抗病绿皮品种HQRGA2的表达水平增加迅速且持续能力强,呈增加-降低的表达特点。结合接种后枯萎病出现和发展特征,确定转录组和蛋白组测序取样时间为接种枯萎病菌后48h（无肉眼可见症状的潜伏期）和96h（病症扩展期）。2.以抗病绿皮品种为材料,采用伤根法加灌根法接种枯萎病菌,对接种后48h、96h和对照（伤根加无菌水灌根后48h）的黑籽南瓜叶片进行RNA-Seq高通量测序,用Trinity软件对Clean reads进行组装,组装获得的Unigene在NR、SWISSPROT、KOG、GO、KEGG数据库中比对得到注释结果,FPKM法计算Unigene表达量筛选差异表达基因并进行GO功能和Pathway富集分析,研究黑籽南瓜响应枯萎病病原菌侵染过程中同一时间点及不同时间点的差异基因表达变化,构建了黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的转录组表达谱。主要结果如下:（1）黑籽南瓜转录组测序经组装后共获得62,169条Unigene,N50为1,640bp,最长Unigene为15,877bp,最短Unigene为301bp,平均长度为1,160bp。将Unigene和NR、SWISSPROT、KOG、GO和KEGG数据库进行比对,共获得47,521条Unigene（76.44%）的生物信息学注释结果,其中11,676条Unigene（29.40%）能与甜瓜基因组比对上,11,674条Unigene（29.39%）能与黄瓜基因组比对上。另有14,648条Unigene（23.56%）未被注释到,推测该部分序列可能是新转录本,或者是黑籽南瓜区别于其他瓜类作物的特有基因。本研究构建的转录组数据库可为研究其他瓜类抗病机制的基因注释提供参考。（2）通过接种后不同时间点的基因表达量和差异表达基因分析,对差异基因进行功能注释和代谢通路富集,Q-PCR验证转录组测序结果较为可靠。结果显示:（1）受枯萎病菌侵染后,不同时间点被诱导的大多数Unigene的功能都是常见的,几乎涵盖了植物生长发育的各个方面。共有25,020条Unigene被富集到25个分子功能家族,其中4,437条Unigene被富集到仅一般功能预测（General function prediction only）,是富集基因数最多的一类,其次2,744条Unigene富集到翻译后修饰（Posttranslational modification）、蛋白质周转（Protein turnover）和分子伴侣（Chaperones）,2,368条Unigene富集到信号转导机制（Signal transduction mechanisms）,而富集到次生代谢物的合成、运输及分解（Secondary metabolites biosynthesis,Transport and catabolism）与防御机制（Defense mechanisms）上的基因数分别是837条和228条。（2）枯萎病菌激活的黑籽南瓜差异表达基因随侵染时间的延长而增多。接种后48h和96h的差异表达基因分别为939和2,021个,且下调基因的数量大于上调基因,其中有大量转录因子和抗病R基因发生了上调或下调表达。并集分析显示有721个差异表达基因在2个时间点中共同差异表达,355个基因上调表达,366个基因下调表达;具有相同的表达趋势的有444个,238个持续上调表达,206个持续下调表达。（3）Pathway富集分析显示,接种后48h时差异表达基因参与了细胞程序性死亡（Necroptosis）、过氧化物酶体（Peroxisome）、硫胺素代谢（Thiamine metabolism）、淀粉和糖代谢（Starch and sucrose metabolism）、细胞凋亡（Apoptosis）、糖酵解/糖异生（Glycolysis/gluconeogenesis）、溶菌酶（Lysosome）、细胞色素P450代谢（Cytochrome P450 metabolism）、丙酮酸盐代谢（Pyruvate metabolism）、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）、抗坏血酸和醛酸盐代谢（Ascorbate and aldarate metabolism）、植物激素信号转导途径（Plant hormone signal transduction）等抗病相关代谢途径。接种后96h,除上述代谢途径外,还激活了P53信号、VEGF信号和TNF信号等抗病相关信号途径,枯萎病菌激发了黑籽南瓜体内多种抗病途径、差异表达基因涉及防御反应及信号转导等,显示黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的分子机制受到多基因网络系统的调控。3.在转录组学研究的基础上,以相同处理的材料,利用iTRAQ技术研究黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的差异蛋白表达谱。结果表明:（1）总共鉴定到的可信蛋白数量为1,907个,差异表达蛋白总数为567个,CK-VS-48h处理组的差异表达蛋白有113个,其中60个差异蛋白通过KEGG富集到55个代谢通路;CK-VS-96h处理组有329个,198个富集在82条通路;48h-VS-96h有125个。发现在差异表达蛋白中有4个未知功能蛋白,其中的1个上调蛋白CL11145contig1是gpi锚定的非特异性脂质转移蛋白,对于抵抗非生物胁迫具有重要作用。另一个上调蛋白CL9717contig1为未知蛋白。2个下调的未知蛋白CL29643contig1和CL4168contig1均为假定的Csa蛋白,功能有待研究。（2）对差异表达蛋白进行并集分析找到3个处理组中有13个共性差异蛋白,其中与抗性相关的是S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAM1和SAM2）,推测SAM合成相关基因也在抗病过程中发挥了重要作用。差异基因和差异蛋白与KEGG通路之间的互作分析表明,接种后48h的基因和蛋白间的相互作用差异比96h大,上调表达的互作基因和蛋白数量比96h多。（3）差异表达基因与差异表达蛋白关联性分析表明,接种后48h和96h与转录组差异基因关联表达的差异蛋白分别有11个和39个;KEGG富集分析表明差异基因、差异蛋白和相关调节基因富集到20个代谢途径,主要参与了核糖体、苯丙素类生物合成、光合生物的碳固定、过氧化物酶体、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢和糖酵解/糖异生、半乳糖代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及植物激素信号传导等途径。研究结果为确定需深入研究的代谢通路及鉴定关键抗性蛋白提供依据。4.综合黑籽南瓜接种枯萎病菌后的转录组和蛋白组学中的pathway富集分析数据,提出了黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的抗病信号转导网络,初步明确了黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的分子调控和信号传导途径,为黑籽南瓜抗病基因的进一步挖掘奠定了基础。（1）受枯萎病菌侵染后,黑籽南瓜通过膜锚定的枯萎病菌受体蛋白识别真菌诱导子/PAMPs（病原体相关分子模式）,诱导下游信号传导。（2）钙通道的激活和胞质钙的增加触发NADPH氧化酶的激活,导致H2O2的产生和活性氧（ROS）爆发。（3）黑籽南瓜去除根尖后,枯萎病菌快速入侵,病菌的效应因子/无毒基因（AVR）使黑籽南瓜相关基因作出误判,从而导致木质素合成降低、细胞间隙扩大、细胞壁降解、光合速率下降、蜡质合成下降等过程,植株的物理抗性并未发挥作用。（4）随着病原菌的增多,黑籽南瓜通过特定的病原体受体（PRRS）和NBS类抗病蛋白识别病菌效应因子,从而激活MAPK信号转导途径。（5）ABA途径在MYB和NAC等转录因子的参与下,通过提高丙酮酸盐、介导气孔关闭、减少蒸腾作用及细胞程序性死亡来防御病菌。（6）茉莉酸（JA）途径主要是通过茉莉酸甲酯的增加来促进相关转录因子或基因的表达,但其中的基因有上调或下调,预测细胞色素P450和细胞程序性死亡参与了后期的防御;（7）水杨酸（SA）途径作为主要的抗病信号转导途径,通过WRKY和BZIP转录因子激发了PR1蛋白的表达,从而开启系统性防御过程（SAR）,调动硫胺素、溶菌酶、细胞程序性死亡,细胞凋亡、吞噬体等过程来清除病菌;（8）产生的ROS通过抗坏血酸-谷胱苷肽循环（ASA-GSH）循环来清除。（9）过氧化物酶体在抗病过程中通过CAT来调节和平衡ROS的产生。5.针对NBS-LRR类基因在黑籽南瓜抗病信号转导中的重要作用,本研究采用二代转录组Unigene和全长转录组Unigene结合方法对NBS类基因进行了鉴别和筛选。（1）以NB-ARC作为参考氨基酸序列,从黑籽南瓜CDS中鉴定了43条CfNBS（NBS-type gene from C.ficifolia）类基因序列,分属于TNL、CNL、TN、RPW8-N和N类六个亚基因家族,典型的TNL和CNL类分别有2个和13个。进化树分析表明,CfNBS类基因可以分为4大类群,黑籽南瓜的NBS类抗病基因数量较少但其基因分化比其它瓜类物种丰富。（2）与二代转录组进行比对,筛选获得11个差异表达的CfNBS类关键基因,显着富集在防卫反应、谷胱苷肽转运、受体丝氨酸/苏氨酸激酶结合等生物学过程和分子功能,富集通路最多的是与TMV抗性蛋白同源的2个基因（CL19588contig1和CL21402contig1）,表明这2个基因在抗病过程中起到了重要的作用。接种枯萎病菌后的Q-PCR验证表明,有10个基因表达趋势同转录组数据变化趋势基本一致。组织表达特异性分析表明,在根、茎和果皮中表达量最高的基因分别是CL34065Contig1、CL52011Contig1和CL19588Contig1。6.从黑籽南瓜转录组数据库中获得了HQRGA2片段的全长基因,其Unigene编码为CL7398Contig1,经实体克隆测序该基因全长4,303bp,命名为CfRFN2（Gene Bank ID:MK618462）,ORFfinder分析发现其有一个完整的编码框,长度4,092bp,编码1,363个氨基酸。（1）CfRFN2注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录突变体X1同源基因。CfRFN2与其他瓜类抗病基因核苷相似性在87%98%之间,保守结构域分析该基因含有1个NB-ARC和2个LRR结构域;推导该基因的信号肽序列在1920个氨基酸之间且不属于分泌蛋白;CfRFN2蛋白与美洲南瓜和中国南瓜的RPS2蛋白同源性亲缘关系最近。（2）从克隆载体pEASY-CfRFN2片段3中扩增415bp的CfRFN2基因片段,连接入VIGS载体pTRV2,构建完成VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN2。以含有沉默载体和共转化载体pTRV1的农杆菌同时侵染黑籽南瓜幼苗,28d后以共侵染的植株接种枯萎病菌为处理,以野生型植株接种枯萎病菌为对照,接种7d后,处理植株较对照发病严重,Q-PCR分析显示处理植株中CfRFN2的相对表达量在接种后48h和96h比对照分别减低34.75%和98.27%,初步表明黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的功能。
薛丽君[2]（2015）在《苎麻性别分化相关基因的克隆、表达及遗传转化研究》文中研究表明苎麻（Boehmeria nivea （L.） Gaud）是一种重要的多年生韧皮纤维作物,而苎麻开花不利于其营养生长,特别是三麻期会大量开花结实,从而使纤维品质和产量严重下降。另外,苎麻是雌雄同株,异花授粉作物,杂种优势利用潜力较大。但是由于苎麻品种高度杂合,F1代分离严重,需要在杂种优势利用中隔离和去雄,费时费力。因此生产中利用无花,或单一性别的苎麻具有重要意义。有研究发现,苎麻花发育和性别分化与乙烯密切相关,因此,研究苎麻性别分化相关基因,并对乙烯合成关键酶基因进行克隆、表达特征分析和遗传转化,对进一步了解苎麻性别决定分子机制和改良苎麻品种具有重要意义。本研究以苎麻GBN-08、GBN-09为材料,克隆了2个ACO基因和1个ACS基因的全长cDNA序列,进行了生物信息学分析,组织表达特异性分析,构建了过表达载体,获得了转BnACO1拟南芥植物。具体主要研究成果如下：1、苎麻BnACO1, BnACO2, BnACS2基因的cDNA序列全长分别为1476 bp,1377bp,1680bp。开放阅读框分别为981 bp,957bp,1503bp。编码氨基酸分别为326个,318个,500个。经Blast比对,BnACO.1基因与无花果等物种的ACO基因核苷酸序列相似性在79%以上,氨基酸序列的相似性在78%以上。苎麻BnAC02基因与桑白皮等物种ACO基因核苷酸序列相似性在82%以上,氨基酸序列相似性在84%以上。BnACS2基因与杂交种玫瑰等物种的ACS基因核苷酸序列的相似性在70%以上,氨基酸序列的相似性分别为65%以上。保守结构域分析,BnACO1基因和BnACO2基因属于20G-Fe ⅡOxy superfamily。BnACS2基因属于以磷酸吡哆醛（PLP）为辅酶的天门冬氨酸转氨酶家族（AAⅠ superfamily）。2、实时荧光定量PCR分析表明苎麻BnACO1在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根、茎中表达最低,且该基因受ABA、干旱和NaCl胁迫诱导表达。该基因可能在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式。BnACO1、 BnAC02、BnACS2三个基因在GBN-08、GBN-09的雌花发育初期均有表达,特别在雌花花芽长度为2.0cm左右时表达差异性显着。3、成功构建了原核表达载体pQE-BnAC02,在37℃C条件下,1.0mmol/LIPTG诱导PQE-BnAC02表达出目的蛋白,诱导蛋白分子量大小约为36.15 kDa,与预测的蛋白大小一致。成功构建了过表达载体pRI 101-BnACO2,农杆菌介导转化拟南芥初步获得阳性转基因植株,并收获转基因拟南芥种子。
吴凯朝[3]（2013）在《干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究》文中指出干旱是制约我国甘蔗生产的主要影响因子。选育抗旱能力强、地域适应性广的高产高糖新品种是解决季节性干旱给我国甘蔗生产带来不利影响的有效途径。挖掘抗旱力强、水分高效利用的基因并通过遗传转化进行分子育种是提高甘蔗抗旱能力研究的新方向。抗旱甘蔗品种既应具有在干旱胁迫状态下的耐受能力,还应具有干旱胁迫状态解除后恢复快速生长的能力,因此研究甘蔗对干旱和干旱后复水的生理和分子响应机理对如何提高甘蔗抗旱能力的遗传改良都具有同样重要的意义。甘蔗是高光效C4作物,具有耐旱、耐涝、耐瘠、抗病、高生物量等特性,是作物重要耐旱基因资源。为了研究甘蔗响应水分胁迫的生理和分子机理,挖掘甘蔗的耐早、水分高效利用及促进生长的基因,本研究选用优良抗旱育种杂交亲本GT11为试验材料,在渗透调节、保护酶活性、物质代谢和内源激素等几个方面探讨甘蔗伸长期在干旱及干旱后复水状态下生理响应；利用cDNA-AFLP和cDNA-SCoT两种基因差异分析方法分离和筛选甘蔗在干旱及干旱后复水诱导的差异表达基因,并对获得的部分特异基因片段进行克隆获得基因全长cDNA,为作物抗旱性的遗传改良提供相应的基因资源。主要研究内容和结果如下：1.在干旱胁迫下,甘蔗品种GT11伸长期在渗透调节、保护酶系统、物质代谢和内源激素等几个方面都做出积极的生理响应,表明了GT11在水分胁迫下可能有较强的适应能力。（1）干旱胁迫下,甘蔗的渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸大量增加,P5CS活力增强,而可溶性蛋白质含量下降,ProDH活力受到限制。复水处理后,叶片中可溶性糖含量急剧下降后回调；脯氨酸含量很快下降；可溶性蛋白质含量快速回升；P5CS活力很快下降；ProDH活力急剧上升。（2）干旱胁迫下,甘蔗的丙二醛含量和超氧阴离子含量升高,保护系统酶POD、 CAT、SOD和GSH-R活力都在不同程度提高。复水处理后,丙二醛含量和超氧阴离子含量很快下降,保护系统酶SOD和GSH-R活力降低,CAT活性表现为先下降后升高。与对照相比,保护系统酶活力在复水前期保持较高活力水平。（3）干旱胁迫下,甘蔗的ABA含量随受干旱胁迫进程不断加大累积,PAO活力上升。复水处理后,ABA含量先上升后下降,PAO活力很快降低。2.使用cDNA-AFLP差异显示方法分离得到406个与水分胁迫相关TDFs,167个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。通过对27个TDFs进行克隆、测序、比对分析,涉及新陈代谢、能量代谢、转录调控、结合功能蛋白、环境互作等相关功能基因。3.使用cDNA-SCoT差异显示方法分离得到316个与水分胁迫相关TDFs,180个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。对177个TDFs进行克隆、测序、比对分析,其中107个TDFs在NCBI数据库有较高相似度已知功能基因,28个TDFs在NCBI数据库有相似性很高的未知功能基因和假想蛋白。135个TDFs可以分为14类：新陈代谢、能量代谢、运输途径、通信及信号转导、细胞循环及DNA加工、转录调控因子、蛋白质合成、蛋白质加工、结合功能蛋白、转座子、毒性及质粒蛋白、细胞分生物合成、防御和未分类蛋白。4.利用半定量RT-PCR对12个从cDNA-SCoT分离获得的TDFs进行表达验证分析,全部12个基因表达量都在一定程度上受到干旱诱导或干旱后复水的诱导。其中4个基因受到干旱胁迫诱导上调表达,为抗旱类基因；7个基因受复水诱导上调表达,为恢复生长调节类基因；1个基因在干旱和复水都被诱导上调表达,为双重功能基因。从12个基因的表达模式分类结果和该基因的生物学信息功能分析结果基本是一致的。5.以GT11的cDNA第一链为模板,采用同源克隆方法成功克隆到5个水分胁迫相关基因全长cDNA,分别为Sc-atpI基因、Sc-SUTl基因、Sc-SAMDC3基因、Sc-Tuba3基因和Sc-HSP70基因,并对这些基因的核苷酸序列及其编码氨基酸序列进行分析,结果表明5个基因在NCBI数据都有同源性很高的禾本科作物（玉米、高粱）基因。Sc-atpI基因、Sc-Tuba3基因、Sc-HSP70基因、Sc-SAMDC3基因为首次在甘蔗中克隆得到。
许轲[4]（2013）在《石斛属植物亲缘关系研究及ACC氧化酶基因的克隆》文中进行了进一步梳理石斛属植物为兰科多年生植物,是兰科最大的属之一,也是重要的园艺植物。石斛属植物除了具有较高的观赏价值外,还有部分品种也是我国传统中药中的重要药材。对石斛属植物的传统分类主要是依靠形态学和地理分布,分类的准确性较低,而且不同学者有不同的分类体系,往往得到的差异较大。近几年,分子标记已经应用在石斛的遗传多样性和亲缘关系分析的研究中。铁皮石斛又被称为黑节草,是药用石斛中最为珍贵的品种之一,常生长于海拔500-1600M的山间河谷的石头或树上。由于它的生境条件较为独特,自身繁殖能力较低,并且人们过度采挖,现在铁皮石斛的野生资源濒临灭绝。为保护铁皮石斛资源和增加药源,现已有许多学者在铁皮石斛组织培养快繁方面开展研究,但对铁皮石斛人工授粉获得种子后再进行无菌播种的研究和利用分子标记进行亲缘关系的研究相对较少。ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-carboxylic oxidase）是乙烯合成演化中的-个关键酶。乙烯可以诱导如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶、多酚氧化酶和几丁质酶的活性。有报道显示,铁皮石斛的生物碱含量与PAL的活性有着密切的关系。采用ISSR分子标记技术对收集到的26个石斛属材料进行了亲缘关系的分析,并研究了铁皮石斛人工授粉与无菌萌发的条件。此外,克隆了铁皮石斛的ACC氧化酶基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达。主要研究结果如下：1.采用ISSR标记,对26个材料的亲缘关系进行了分析。从100条ISSR引物中筛选出5条引物对26个石斛材料DNA进行PCR扩增。共扩增出了70条带,其中63条具有多态性,多态性条带百分率为90.00%,平均为每个引物12.6条多态性带。2利用计算机软件DPS软件统计ISSR数据,得出所研究的26个材料遗传距离介于0.0334-0.7314之间；用UPGMA进行聚类,当遗传距离为0.43时,可以将26份材料聚为6大类群：第一类：尖刀唇石斛、迭鞘石斛、流苏石斛、束花石斛、玫瑰石斛、大苞鞘石斛、重唇石斛、兜唇石斛、金钗石斛、报春石斛、齿瓣石斛、串珠石斛、细茎石斛和铁皮石斛；第二类：美花石斛、长距石斛、短棒石斛、聚石斛、细叶石斛和竹枝石斛；第三类：鼓槌石斛和密花石斛；第四类：黑毛石斛和翅萼石斛；第五类：刀叶石斛；第六类：翅梗石斛。3.通过采用（1）异株异花授粉；（2）同株不同花序异花；（3）同花序异花授粉；（4）自花授粉；（5）对照（套袋后自然授粉）等方式进行人工授粉,结果表明铁皮石斛花在开放后的第2d至第4d时采用异株异花,且在每天上午10点以前的人工授粉成功率最高。4.选择通过人工授粉获得的健康种子（8个月种龄）进行无菌播种,结果表明,铁皮石斛种子萌发最佳培养体系：MS+NAA0.5mg/L+土豆汁10%+活性炭0.5%暗处理7天后转光培养。5.通过PCR的方法,从铁皮石斛的花中克隆了一个同源ACC氧化酶基因。克隆到的cDNA长度为970bp（在NCBI中登录号为JX679494）,含有一个编码314个氨基酸的蛋白质。6.构建了pET-28a-ACO原核表达载体,并转入大肠杆菌（Escherichia coli）中表达,获得1个与预测大小一致的外源蛋白。该研究为生物调控铁皮石斛的生物碱含量提供了理论基础。
张帅[5]（2013）在《无花果ACC合成酶基因克隆及其植物表达载体的构建》文中提出无花果（Ficus carica L.）属桑科（Moraceae）榕属（Ficus），果实味美，且具有抗癌防衰老等保健价值，应用前景广阔。但无花果采后迅速软化，适宜条件下冷藏也仅可保证7～10d的货架期，严重阻碍了无花果产业的发展。培育抗软化、耐贮运无花果的品种具有重要的实际意义：传统保鲜技术在生产中成本高、管理困难且收效甚微，所以培育耐贮运的高品质无花果品种，成为无花果育种的重要目标之一。乙烯是导致跃变型果实衰老软化的关键因素，抑制果实成熟期间乙烯的生物合成，可有效延缓果实的衰老软化过程。因此通过转基因技术调控乙烯生物合成过程中两个关键酶——ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO），有望解决无花果的完熟软化问题。本研究以无花果果实为研究对象，从绿果无花果“青皮”基因组DNA中分离了ACS1基因片段，构建了ACS1基因的反义及RNAi植物表达载体，并将其转化到农杆菌中，为采用生物技术方法延缓或抑制无花果软化、提高其耐贮性奠定基础。主要研究结果如下：1、青皮无花果ACS1基因片段的克隆。根据GenBank中登录的Masui Dauphine无花果ACS1基因保守氨基酸序列，设计合成了一对特异引物，PCR扩增得到一条长590bp的特异片段，序列分析结果表明，除引物外，该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%，氨基酸的同源性达98%，无内含子序列。表明该克隆片段是青皮无花果ACS1基因片段。2、无花果反义植物表达载体的构建。将克隆到的无花果ACS1基因片段反向插入到中间载体pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间，构建成反义中间表达载体pBI221-anti-ACS1。用XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切pBI221-anti-ACS1表达载体及pBI121质粒，酶切下中间表达载体pBI221-anti-ACS1的反义片段、GusA基因和NOS终止子，定向插入到切除了GusA基因和NOS终止子的pBI121质粒中，构建成反义植物表达载体pBI121-anti-ACS1。3、无花果RNAi植物表达载体的构建。先将无花果ACS1基因片段正向插入到反义中间表达载体pBI221-anti-ACS1质粒的BamHⅠ-SmaⅠ酶切位点之间，构建成RNAi中间表达载体pBI221-RNAi-ACS1；再用XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切pBI221-RNAi-ACS1表达载体及pBI121质粒，将从载体pBI221-anti-ACS1切下的的反义片段、正义片段、GusA基因和NOS终止子，定向插入到切除了GusA基因和NOS终止子的pBI121质粒中，构建成RNAi植物表达载体pBI121-RNAi-ACS1。重组质粒经PCR和酶切的方法验证。4、农杆菌转化。利用冻融法将pBI121-anti-ACS1、pBI121-RNAi-ACS1两个表达载体转化到农杆菌LBA4404中，转化菌液经PCR验证，证实表达载体已转入农杆菌。
刘进平[6]（2013）在《乙烯生物合成关键酶基因研究进展》文中进行了进一步梳理ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）是催化乙烯生物合成的两个关键酶,这两个酶的基因在调控果品和花卉完熟及衰老方面具有重要意义,本文综述了ACS和ACO基因最新研究进展。
黄东亮,李双喜,廖青,方锋学,李杨瑞[7]（2012）在《甘蔗基因克隆研究进展》文中进行了进一步梳理甘蔗是重要的糖料和能源作物,在我国,其糖产量占全国食糖产量的94%。甘蔗是高光合效率C4作物,其蔗糖含量是所有植物中最高的,其基因组中蕴藏着大量重要基因。因此,甘蔗基因克隆对甘蔗品种定向改良具有重要意义。从蔗糖代谢、生长发育和抗逆性三个方面全面总结甘蔗基因克隆的研究进展,并提出今后研究的建议,以期为今后甘蔗基因研究提供参考。
齐靖[8]（2009）在《鸭梨ACC氧化酶基因克隆及反义转化与枣遗传连锁图谱加密的研究》文中研究说明梨和枣均是我国重要的经济树种,在我国栽培面积极广,是我国农业经济的重要组成部分。深化对这两种果树的分子生物学研究,并应用生物技术对其进行遗传改良,对于加速育种进程至关重要。在本研究中,围绕梨和枣分别开展了基因克隆、遗传转化、遗传图谱加密和QTL分析等一系列研究,填补了相关研究的空白,并为今后生物技术在果树育种中的进一步应用增添了新的理论依据。取得的主要成果如下所示:1.根据ACC氧化酶保守序列设计一对引物,以鸭梨果实cDNA为模板扩增得到831bp的鸭梨ACC氧化酶基因cDNA片段,并以此序列为基础RACE扩增该基因cDNA全长,得到了长度的1235bp的鸭梨ACC氧化酶基因cDNA序列,进一步根据得到的cDNA序列开放性读码框设计引物得到鸭梨ACC氧化酶基因DNA序列,结果显示该基因有4个外显子和3个内含子组成,外显子和内含子的长度分别为942bp和634bp。2.对鸭梨ACC氧化酶基因所翻译的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明该氨基酸序列与其它14种植物的ACC氧化酶高度同源,包含一个92个氨基酸残基的2OG-Fe（II） oxygenase超级家族保守结构域,且与异青霉素-N合酶及相关双脱氧酶（PcbC）的功能区域同源性较高,说明鸭梨ACC氧化酶应属于2OG-Fe（II） oxygenase超级家族的异青霉素合酶（IPNS）家族,该家族酶成员在发挥酶促作用时不需要以2-OG作为辅因子。3.对所获得的鸭梨ACC氧化酶氨基酸序列进行二级结构和三级结构预测,结果发现该蛋白疏水性氨基酸位于分子内部,亲水性氨基酸位于分子表面,具有可溶性亲水蛋白的典型特征,不属于膜内在蛋白;但研究同时发现该蛋白具有3个豆蔻酰化位点,豆蔻酸可以通过与这些位点的甘氨酸残基相连接将鸭梨ACC氧化酶以可逆共价连接的方式锚定在膜上,故推测鸭梨ACC氧化酶应该是具有酰胺-连接豆蔻酰锚钩结构的脂锚定膜蛋白。4.分别用Southern杂交和Northern杂交分析获得的ACC氧化酶基因在鸭梨基因组中的拷贝数及在不同组织中的表达情况,结果发现该基因仅在生殖器官中表达,且在基因组中以单拷贝形式存在,说明该基因主要参与系统Ⅱ型乙烯的内源合成,而系统Ⅰ型乙烯的合成是由与该基因同源性较低的另外ACC氧化酶家族成员控制的。鸭梨上应至少存在两个ACC氧化酶基因家族成员。5.首次构建了鸭梨ACC氧化酶基因的反义表达载体,并在农杆菌LBA4404的介导下对鸭梨组培苗进行了遗传转化,经PCR鉴定证实共有4株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化。Southern杂交显示在这4株转基因鸭梨中除有1株外源基因呈双拷贝外,其余3株中外源基因均以单拷贝形式存在。6.对影响ISSR扩增的因素进行了优化,建立了枣属植物最适ISSR扩增反应体系,即25μL反应液中包含1×PCR Buffer、2.0 mmol·L-1 Mg2+、0.25 mmol·L-1dNTP、1.5U Taq酶、1.25μmol·L-1引物和50ng模板,PCR反应的最适退火温度为58℃。7.应用18条ISSR引物对150株冬枣×临猗梨枣杂交F1代群体进行扩增,共获得ISSR标记44个,其中34个被成功加入到了已有的枣遗传连锁图谱中,使图谱总图距增加了24.41cM,标记间平均距离减少了0.18cM,并填补了原图谱中3个大于10cM的标记空缺,使枣遗传连锁图谱的饱和度得到了进一步提高。8.比较了枣针刺长度相关性状包括中心干上长针刺长度、中心干上短针刺长度、二次枝上长针刺长度和二次枝上短针刺长度QTL在新构建的遗传连锁图谱和原图谱上的定位结果,发现仅有10个QTL位点一致,证实遗传连锁图谱的饱和度是影响QTL定位精确性的重要因素之一,同时也推测这10个QTL位点可信度较高,与其紧密连锁的标记可为日后分子标记辅助育种提供指导。
解燕[9]（2009）在《花特异表达启动子调控ACC氧化酶基因RNAi载体构建及转化拟南芥》文中研究说明百合（LiLium spp.）是世界主要的切花品种之一,但是百合花期短,影响它的观赏价值和瓶插寿命,因此培育花期较长的百合新品种非常重要。研究结果表明:百合为乙烯释放型花卉,百合花朵开放时,伴随着乙烯的释放而衰老。ACC氧化酶（ACC oxidase）是催化乙烯生成的最后一步关键酶,控制着乙烯的生成速率。因此,通过RNA干扰技术可使内源ACC氧化酶基因转录的mRNA被降解,对ACC氧化酶基因进行有效沉默,抑制乙烯生成,达到延长花期的目的。在本课题组前期已克隆获得百合查尔酮合成酶（chalcone synthase）基因启动子序列和百合ACC氧化酶基因序列的基础上,本研究取得的主要结果如下:1、构建了植物中间表达载体pCAM-CHSA分别以chsA-F、chsA-R和tNOS-F、tNOS-R为引物, pCHS和pBin19为模板进行PCR扩增花特异表达启动子和终止子,得到的目的基因片段克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒pCHS-T和pNOS-T。对载体pCAMBIA 1300和载体pPZP-RCS进行Hind III和EcoR I双酶切,对pCAMBIA1300载体进行改造,将pPZP-RCS的多酶切位点构建到pCAMBIA 1300上,得到重组质粒pCAM-PZP。将启动子片段和终止子片段分别克隆进pCAM-PZP,得到含有花特异表达启动子的植物中间表达载体pCAM-CHSA。2、构建了花特异表达启动子调控的ACC氧化酶基因RANi载体pCAM-ACOi分别以ACOZ-F、ACOZ-R和ACOF-F、ACOF-R为引物,以pACO为模版进行PCR扩增,将ACC氧化酶正、反义基因片段克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒pACOZ-T和pACOF-T。分别将pACOZ-T、pACOF-T克隆进辅助载体pAUX3131、pAUX3166,得到重组质粒pAU-ACOZ和pAU-ACOF。再将重组质粒上的目的基因克隆到植物中间表达载体pCAM-CHS上,最终获得了花特异表达启动子调控的ACC氧化酶基因RNAi载体。3、转化拟南芥并进行了PCR检测通过Floral Dip法转化拟南芥,经潮霉素抗性筛选,获得阳性植株20株。采用CTAB法提取DNA,用潮霉素基因和根据ACC氧化酶RNAi载体设计特异引物进行了PCR检测,转化植株的DNA扩增出了潮霉素基因和目的基因。
曹迪[10]（2009）在《西瓜黄瓜乙烯合成及传导途径中基因克隆与分析》文中研究表明西瓜、黄瓜和甜瓜是重要的葫芦科瓜类作物,乙烯对瓜类作物果实的成熟、性别分化和产量具有重要影响,因此探索乙烯生物合成、信号转导与瓜类作物果实发育、性别分化和产量的关系一直是瓜类作物的研究重点。目前,多数研究集中在黄瓜、甜瓜乙烯生物合成和信号转导途径中相关基因的分离、克隆,关于西瓜乙烯合成和信号转导途径中关键基因克隆的研究报道相对较少。本试验依据甜瓜、黄瓜等作物乙烯合成和信号转导途径中关键基因的保守序列设计引物,分别以西瓜的强雌性（新红宝突变体）/普通性型材料（新红宝）以及黄瓜的强雌性（欧洲8号）/普通性型材料（秋棚）基因组DNA为模板,采用同源序列克隆方法从西瓜、黄瓜基因组中分别克隆获得ACS、ACO、ETR1、ETR2、ERS、EIN3、ERF等7个乙烯合成和信号转导途径中关键酶的基因/片段。同时利用生物信息学方法对相关瓜类作物基因/片段序列进行比较分析和功能预测,对进一步研究瓜类作物性别分化的分子调控机制具有实践意义。实验结果如下:1根据ACS基因的保守序列设计引物,分别从西瓜新红宝突变体和新红宝基因组DNA中克隆获得一条具有完整阅读框的ACS基因序列,二者核苷酸序列100%相同,命名为CLACS。CLACS全长3385bp,该序列编码区长度为1485bp,编码494个氨基酸,与报道的甜瓜、黄瓜ACS氨基酸序列同源性都在90%以上。CLACS蛋白质有7个保守的区域,其中第5个保守区为ACS酶的活性中心。推测CLACS的分子量为5.57KD,等电点为6.61,其三维结构与番茄ACS（MMDB:15810;PDB:1IAX）的三维晶体结构十分类似。2根据ACO基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1522bp的西瓜基因片段,命名为CLACO,包含4个外显子,3个内含子,编码区序列长912bp,编码303个氨基酸;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1270bp的黄瓜基因片段,命名为CSACO,包含4个外显子,3个内含子,编码区序列长909bp,编码302个氨基酸。CLACO和CSACO的编码序列92.3%同源,氨基酸序列93.4%同源。推测CLACO、CSACO蛋白质三级结构与矮牵牛中的ACO蛋白质（MMDB:35451;PDB:1W9Y）的三维晶体结构类似。系统进化树分析表明,CLACO和CSACO片段与葫芦科作物中的同类基因亲缘关系最近。3根据ETR1基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1633bp的基因片段,命名为CLETR1;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1491bp的黄瓜基因片段,命名为CSETR1。去除内含子后,CLETR1和CSETR1编码序列均为795bp,编码264个氨基酸,二者编码序列96%同源,氨基酸序列98%同源。CLETR1和CSETR1的编码序列存在明显的单核苷酸变异,共23个核苷酸位点存在SNPs,其中5个SNPs导致4个编码氨基酸的改变。4根据ETR2基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致基因片段,命名为CLETR2;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致的黄瓜基因片段,命名为CSETR2。CLETR2和CSETR2序列长度均为417bp,属于编码区序列,推测编码138个氨基酸,二者编码区序列同源达95.68%,氨基酸序列98.5%同源。获得的基因克隆片段编码的蛋白质具有REC信号保守结构域特征,结构域三维结构预测与拟南芥乙烯受体（PDB:1DCFA）的三维晶体结构相似性极高。5根据ERS基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为837bp西瓜基因片段,命名为CLERS;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为757bp黄瓜基因片段,命名为CSERS。CLERS和CSERS都由2个外显子片段、1个内含子和3’UTR区组成,编码序列长度均为291bp,编码96个氨基酸,二者编码区序列94.85%同源,氨基酸序列93.76%同源,获得的基因克隆片段编码的蛋白质具有HATPase-c保守结构域特征。6根据西瓜果实发育EST文库中相关EIN3序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为603bp的西瓜基因片段,命名为CLEIN3;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列长度分别为619bp和604bp的基因片段,命名为CSEIN3A、CSEIN3B,三者编码序列长度分别为399bp、423bp、408bp,推测编码132、140、135个氨基酸。三者编码区序列92.83%同源,氨基酸序列93.1%同源。CSEIN3A比CSEIN3B在靠近羧基端多5个天冬酰胺。7根据本实验室西瓜枯萎病菌SSH文库中相关ERF的序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为627bp西瓜基因片段,命名为CLERF;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为625bp黄瓜基因片段,命名为CSERF。CLERF和CSERF编码序列长度均为363bp,推测编码120个氨基酸,二者编码区序列94.49%同源,氨基酸序列95%同源。
二、甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制及NBS类抗病基因筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 黑籽南瓜利用与研究进展 |
| 1.1.1 黑籽南瓜栽培与资源利用概况 |
| 1.1.2 黑籽南瓜遗传多样性 |
| 1.1.3 黑籽南瓜抗逆性及其生理基础 |
| 1.1.4 细胞生物学及细胞工程 |
| 1.1.5 基因克隆 |
| 1.1.6 总结与展望 |
| 1.2 瓜类枯萎病研究进展 |
| 1.2.1 枯萎病致病机制 |
| 1.2.2 尖孢镰刀菌基因组测序及致病相关基因 |
| 1.2.3 寄主枯萎病抗性遗传及其相关基因 |
| 1.2.4 瓜类—枯萎病菌互作分子机制 |
| 1.2.5 总结与展望 |
| 1.3 转录组学在作物应答病原菌胁迫中的研究概况 |
| 1.4 蛋白组学在作物应答病原菌胁迫中的研究概况 |
| 1.5 转录组学与蛋白组学的联合研究 |
| 1.6 植物NBS类抗病基因(蛋白)研究进展 |
| 1.6.1 抗病基因(蛋白)的类型 |
| 1.6.2 NBS-LRR抗病基因(蛋白)的结构和功能 |
| 1.6.3 NBS-LRR抗病基因(蛋白)对效应分子的识别 |
| 1.6.4 总结与展望 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要试剂和试剂盒 |
| 3.2.3 主要溶液和培养基 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 序列分析及同源性比较 |
| 3.2.6 黑籽南瓜室内抗性鉴定 |
| 3.2.7 NBS类抗病基因序列表达分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 黑籽南瓜RGAs的克隆 |
| 3.3.2 RGAs聚类分析及相似性比较 |
| 3.3.3 HQRGA2的核苷酸序列相似性分析 |
| 3.3.4 HQRGA2的保守结构域分析和氨基酸同源性比较 |
| 3.3.5 系统进化树分析 |
| 3.3.6 3种黑籽南瓜枯萎病抗性鉴定 |
| 3.3.7 枯萎病菌胁迫下3种黑籽南瓜NBS同源序列的表达差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的转录组学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料及接种方法 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 测序数据的处理 |
| 4.2.4 Unigene功能注释 |
| 4.2.5 差异表达基因筛选 |
| 4.2.6 差异表达基因的功能富集分析 |
| 4.2.7 Q-PCR验证关键差异表达基因 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 测序数据统计 |
| 4.3.2 unigene的功能注释 |
| 4.3.3 蛋白编码区预测(CDS) |
| 4.3.4 差异表达基因分析 |
| 4.3.5 差异表达基因的GO富集分析 |
| 4.3.6 差异表达基因的KEGG代谢通路分析 |
| 4.3.7 抗性相关代谢途径及基因分析 |
| 4.3.8 差异表达的转录因子TF家族分析 |
| 4.3.9 差异基因R基因家族分析 |
| 4.3.10 差异表达基因的Q-PCR验证及转录组与Q-PCR的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 枯萎病菌胁迫下黑籽南瓜的转录组测序 |
| 4.4.2 关于的生物信息学注释问题 |
| 4.4.3 硫胺素与抗病性的关系 |
| 4.4.4 过氧化物酶体与抗病的关系 |
| 4.4.5 ABA和SA介导黑籽南瓜主要的抗枯萎病信号传导途径 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 黑籽南瓜应答枯萎病菌侵染的蛋白组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验仪器与试剂 |
| 5.2.3 实验方法与步骤 |
| 5.2.4 蛋白组分析方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 蛋白质检测 |
| 5.3.2 蛋白质基本鉴定信息 |
| 5.3.3 差异表达蛋白分析 |
| 5.3.4 差异表达蛋白的GO富集分析 |
| 5.3.5 差异表达蛋白的Pathway富集分析 |
| 5.3.6 蛋白相互作用(PPI分析) |
| 5.3.7 差异表达蛋白表达模式聚类 |
| 5.3.8 差异蛋白和差异表达基因的关联分析 |
| 5.3.9 黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 黑籽南瓜NBS类基因的鉴别与关键基因分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 黑籽南瓜三代转录组测序 |
| 6.2.3 全长转录组的数据分析 |
| 6.2.4 NBS类抗性基因的鉴别 |
| 6.2.5 进化分析 |
| 6.2.6 CfNBS类差异表达关键基因的鉴定 |
| 6.2.7 差异表达CfNBS类基因的GO功能分析 |
| 6.2.8 CfNBS类关键基因的Q-PCR验证与组织表达特性分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 CfNBS类基因的鉴定 |
| 6.3.2 CfNBS类基因的分类 |
| 6.3.3 黑籽南瓜CfNBS类基因的进化树分析 |
| 6.3.4 黑籽南瓜CfNBS类差异表达基因的鉴定 |
| 6.3.5 CfNBS类基因的GO功能分析 |
| 6.3.6 黑籽南瓜差异表达的CfNBS类关键基因的Q-PCR验证 |
| 6.3.7 CfNBS类关键基因的组织表达特性 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 NBS类抗病基因CfRFN2的克隆与功能验证 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.2.1 材料 |
| 7.2.2 菌株及载体 |
| 7.2.3 仪器及试剂 |
| 7.2.4 黑籽南瓜总RNA提取及反转录PCR |
| 7.2.5 CfRFN2全长基因序列的克隆 |
| 7.2.6 CfRFN2全长基因序列分析 |
| 7.2.7 接种枯萎病菌后CfRFN2表达量检测、组织表达特性分析 |
| 7.2.8 CfRFN2基因的VIGS体系功能初步验证 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 黑籽南瓜总RNA的提取 |
| 7.3.2 黑籽南瓜CfRFN2基因的扩增及拼接 |
| 7.3.3 CfRFN2的核苷酸相似性分析 |
| 7.3.4 CfRFN2的保守结构域分析 |
| 7.3.5 CfRFN2的亲疏水性分析 |
| 7.3.6 CfRFN2的信号肽分析 |
| 7.3.7 CfRFN2的蛋白跨膜域预测 |
| 7.3.8 CfRFN2蛋白进化树分析 |
| 7.3.9 黑籽南瓜CfRFN2的组织表达特性分析 |
| 7.3.10 黑籽南瓜CfRFN2的VIGS载体构建 |
| 7.3.11 VIGS侵染黑籽南瓜的体系有效性验证 |
| 7.3.12 VIGS侵染黑籽南瓜植株的PCR检测 |
| 7.3.13 pTRV2-CfRFN2沉默植株观察和Q-PCR分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加课题一览表 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（2）苎麻性别分化相关基因的克隆、表达及遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 内源乙烯对植物性别表达的研究进展 |
| 1.2 乙烯的生物合成 |
| 1.2.1 ACC合成酶基因的克隆与功能研究进展 |
| 1.2.2 ACC合成酶基因的表达调控 |
| 1.2.3 ACC氧化酶基因克隆的研究进展 |
| 1.2.4 ACC氧化酶基因的表达调控 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第2章 苎麻ACO和ACS家族部分基因的克隆和序列分析 |
| 2.1 试验材料、试剂与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 苎麻组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 首链cDNA的合成 |
| 2.2.3 RACE引物设计 |
| 2.2.4 PCR扩增及目的基因片段的纯化回收 |
| 2.2.5 PCR产物的TA克隆 |
| 2.2.6 连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1 |
| 2.2.7 PCR筛选阳性克隆 |
| 2.2.8 cDNA开放读码框序列扩增 |
| 2.2.9 克隆基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 BnACO1、BnACO2、BnACS2全长基因的克隆 |
| 2.3.2 BnACO1、BnACO2、BnACS2基因的生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 苎麻ACO1,ACO2,ACS2基因的表达特征分析 |
| 3.1 试验材料、试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 苎麻各组织总RNA的提取 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR引物设计 |
| 3.2.3 gDNA去除和第一链cDNA的合成 |
| 3.2.4 实时荧光定量PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RNA提取 |
| 3.3.2 BnACO1基因不同部位表达差异性及胁迫诱导表达分析 |
| 3.3.3 BnACO1、BnACO2、BnACS2基因的时空表达分析 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第4章 BnACO2基因原核表达、过表达载体构建以及及转化拟南芥研究 |
| 4.1 试验材料、试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 原核表达载体构建 |
| 4.2.2 植物转基因过表达载体的构建 |
| 4.2.3 重组质粒转化农杆菌 |
| 4.2.4 转化拟南芥 |
| 4.2.5 转基因拟南芥的筛选和PCR鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BnACO2基因原核表达载体的构建与重组质粒的酶切验证 |
| 4.3.2 BnACO2基因过表达载体的构建与重组质粒的酶切验证 |
| 4.3.3 转基因拟南芥的获得 |
| 4.3.4 转基因拟南芥的PCR鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 论文结论 |
| 5.2 后续研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 植物抗旱分子机理研究进展 |
| 1.1.1 渗透调节 |
| 1.1.1.1 脯氨酸 |
| 1.1.1.2 海藻糖 |
| 1.1.1.3 甜菜碱 |
| 1.1.2 Lea蛋白、AQP和DHNs |
| 1.1.2.1 Lea蛋白 |
| 1.1.2.2 AQP |
| 1.1.2.3 DHNs |
| 1.1.3 受ABA等内源激素调节基因 |
| 1.2 植物复水机制研究进展 |
| 1.3 基因差异表达研究方法技术原理及其应用 |
| 1.3.1 cDNA-AFLP差异显示分析技术原理、特点及其研究进展 |
| 1.3.2 cDNA-SCoT差异显示分析技术原理、特点及其研究进展 |
| 1.4 甘蔗抗旱分子机理研究进展 |
| 1.5 本研究的立项依据及意义 |
| 第2章 甘蔗伸长期对水分胁迫的生理响应 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料和材料种植 |
| 2.1.2 试验处理 |
| 2.1.3 试验测定的指标和方法 |
| 2.1.3.1 土壤相对含水量测定 |
| 2.1.3.2 脯氨酸(Pro)含量测定 |
| 2.1.3.3 △~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性测定测定 |
| 2.1.3.4 脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性测定 |
| 2.1.3.5 过氧化物酶(POD)活性测定 |
| 2.1.3.6 过氧化氢酶(CAT)活性测定 |
| 2.1.3.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 |
| 2.1.3.8 超氧阴离子(O_2~-)含量测定 |
| 2.1.3.9 脱落酸(ABA)含量测定 |
| 2.1.3.10 丙二醛(MDA)含量测定 |
| 2.1.3.11 谷胱甘肽还原酶(GSH-R)活性测定 |
| 2.1.3.12 可溶性糖含量测定 |
| 2.1.3.13 可溶性蛋白质含量测定 |
| 2.1.3.14 多胺氧化酶(PAO)活性测定 |
| 2.1.4 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 土壤相对含水量 |
| 2.2.2 甘蔗叶片MDA含量变化 |
| 2.2.3 甘蔗叶片可溶性糖含量变化 |
| 2.2.4 甘蔗叶片可溶性蛋白质含量变化 |
| 2.2.5 甘蔗叶片O_2~-含量变化 |
| 2.2.6 甘蔗叶片POD活性变化 |
| 2.2.7 甘蔗叶片CAT活性变化 |
| 2.2.8 甘蔗叶片SOD活性变化 |
| 2.2.9 甘蔗叶片GSH-R活性变化 |
| 2.2.10 甘蔗叶片脯氨酸含量变化 |
| 2.2.11 甘蔗叶片P5CS活性变化 |
| 2.2.12 甘蔗叶片ProDH活性变化 |
| 2.2.13 甘蔗叶片ABA含量变化 |
| 2.2.14 甘蔗叶片PAO活性变化 |
| 2.3 小结 |
| 2.3.1 渗透调节物质 |
| 2.3.2 膜损伤及保护系统 |
| 2.3.3 内源激素及相关酶 |
| 第3章 甘蔗伸长期水分胁迫诱导相关基因差异表达分析 |
| 3.1 甘蔗干旱和干旱后复水基因cDNA-AFLP差异显示分析 |
| 3.1.1 材料种植和处理 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 总RNA的提取 |
| 3.1.2.2 cDNA第一链合成 |
| 3.1.2.3 cDNA第二链的合成 |
| 3.1.2.4 双链cDNA纯化 |
| 3.1.2.5 双链cDNA酶切反应 |
| 3.1.2.6 接头退火及连接 |
| 3.1.2.7 预扩增 |
| 3.1.2.8 选择性扩增 |
| 3.1.2.9 选择性扩增产物电泳检测 |
| 3.1.2.10 差异片段的回收、再扩增、再回收 |
| 3.1.2.11 反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.1.2.12 差异片段克隆 |
| 3.1.2.13 质粒抽提 |
| 3.1.2.14 测序 |
| 3.1.2.15 序列比较及基因功能分析 |
| 3.1.3 cDNA-AFLP分离水分胁迫诱导表达基因结果与分析 |
| 3.1.3.1 总RNA提取和第一链cDNA合成 |
| 3.1.3.2 甘蔗叶片干旱和复水诱导基因表达分谱分析 |
| 3.1.3.3 差异片段回收及反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.1.3.4 部分验证为阳性TDFs的克隆及核苷酸序列分析 |
| 3.1.3.5 受干旱和干旱后复水诱导表达基因功能分析和功能类群 |
| 3.2 甘蔗干旱和干旱后复水基因cDNA-SCoT差异显示分析 |
| 3.2.1 材料种植和处理 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 总RNA的提取 |
| 3.2.2.2 cDNA第一链合成 |
| 3.2.2.3 SCoT引物设计及SCoT-PCR扩增反应体系、反应程序 |
| 3.2.2.4 电泳检测 |
| 3.2.2.5 差异片段的回收、再扩增、再回收 |
| 3.2.2.6 反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.2.2.7 差异片段克隆 |
| 3.2.2.8 质粒抽提 |
| 3.2.2.9 测序 |
| 3.2.2.10 序列比较及基因功能分析 |
| 3.2.3 cDNA-SCoT分离水分胁迫诱导表达基因结果与分析 |
| 3.2.3.1 总RNA提取和cDNA第一链合成 |
| 3.2.3.2 甘蔗叶片水分胁迫下基因差异表达谱分析 |
| 3.2.3.3 差异片段回收及反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.2.3.4 部分验证为阳性差异片段的克隆、核苷酸序列分析和基因功能推测分析 |
| 3.2.3.5 受干旱和干旱后复水诱导表达基因功能类群 |
| 3.3 小结 |
| 3.3.1 cDNA-AFLP差异显示表达分析 |
| 3.3.2 cDNA-SCoT差异显示表达分析 |
| 第4章 水分胁迫诱导基因片段的半定量RT-PCR表达分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料种植和处理 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 总RNA提取 |
| 4.1.2.2 cDNA第一链合成 |
| 4.1.2.3 半定量RT-PCR |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 甘蔗水分胁迫诱导表达基因全长CDNA克隆与结构分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料种植 |
| 5.1.2 甘蔗叶片总RNA提取 |
| 5.1.3 甘蔗cDNA第一链的合成 |
| 5.1.4 引物设计、合成 |
| 5.1.5 目的基因片段回收纯化 |
| 5.1.6 目的基因克隆 |
| 5.1.7 质粒抽提 |
| 5.1.8 测序 |
| 5.1.9 基因序列的生物学信息分析软件及网站 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成 |
| 5.2.2 甘蔗Sc-atpI基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.2.1 甘蔗Sc-atpI基因的RT-PCR扩增 |
| 5.2.2.2 甘蔗Sc-atpI基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.2.3 甘蔗Sc-atpI基因编码的氨基酸序列结构分析 |
| 5.2.2.4 甘蔗Sc-atpI基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.3 甘蔗Sc-SUT1基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.3.1 甘蔗Sc-SUT1基因的RT-PCR扩增 |
| 5.2.3.2 甘蔗Sc-SUT1基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.3.3 甘蔗Sc-SUT1基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.3.4 甘蔗Sc-SUT1基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.4 甘蔗Sc-SAMDC3基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.4.1 甘蔗Sc-SAMDC3基因的RT-PCR扩增 |
| 5.2.4.2 甘蔗Sc-SAMDC3基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.4.3 甘蔗Sc-SAMDC3基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.4.4 甘蔗Sc-SAMDC3基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.5 甘蔗Sc-Tuba3基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.5.1 甘蔗Sc-Tuba3基因RT-PCR扩增 |
| 5.2.5.2 甘蔗Sc-Tuba3基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.5.3 甘蔗Sc-Tuba3基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.5.4 甘蔗Sc-Tuba3基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.6 甘蔗Sc-HSP70基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.6.1 甘蔗Sc-HSP70基因RT-PCR扩增 |
| 5.2.6.2 甘蔗Sc-HSP70基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.6.3 甘蔗Sc-HSP70基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.6.4 甘蔗Sc-HSP70基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 讨论与结论 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 GT11对水分胁迫的生理响应机制 |
| 6.1.1.1 渗透调节物质 |
| 6.1.1.2 膜损伤及保护系统 |
| 6.1.1.3 内源激素及相关酶 |
| 6.1.2 水分胁迫诱导基因差异表达分析 |
| 6.1.2.1 cDNA-AFLP差异显示分析 |
| 6.1.2.2 cDNA-SCoT差异显示分析 |
| 6.1.2.3 两种差异表达方法比较 |
| 6.1.2.4 两种基因差异显示方法结果比较 |
| 6.1.2.5 甘蔗水分胁迫相关基因筛选和分离 |
| 6.1.3 基因Semi-QRT-PCR表达分析 |
| 6.1.3.1 抗旱类基因 |
| 6.1.3.2 恢复生长调节类基因 |
| 6.1.3.3 双重功能类基因 |
| 6.1.3.4 基因定量表达方法 |
| 6.1.4 基因克隆与结构分析 |
| 6.2 全文结论 |
| 6.3 论文创新点 |
| 6.4 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）石斛属植物亲缘关系研究及ACC氧化酶基因的克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 前言 |
| 1.1 石斛属植物概况 |
| 1.2 石斛属植物DNA分子标记研究进展 |
| 1.2.1 常见分子标记及其原理 |
| 1.2.1.1 限制性片段长度多态性RFLP |
| 1.2.1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD) |
| 1.2.1.3 简单重复序列(SSR) |
| 1.2.1.4 简单重复序列区间(ISSR) |
| 1.2.1.5 扩增片段长度多态性(AFLP) |
| 1.2.1.6 酶切扩增多态性序列(CAPS) |
| 1.2.2 分子标记在石斛研究中的应用 |
| 1.2.2.1 种质资源鉴定研究 |
| 1.2.2.2 亲缘关系与分类研究 |
| 1.2.2.3 遗传多样性分析 |
| 1.2.2.4 遗传图谱的构建 |
| 1.3 |
| 1.3.1 铁皮石斛概述 |
| 1.3.2 石斛人工授粉研究进展 |
| 1.3.3 石斛组织培养研究进展 |
| 1.3.3.1 石斛属植物组织培养外植体的选择 |
| 1.3.3.2 基本培养基成分对石斛属植物组织培养的影响 |
| 1.3.3.3 植物生长调节剂对石斛属植物组织培养的影响 |
| 1.3.3.4 培养环境对石斛属植物组织培养的影响 |
| 1.4 ACC氧化酶基因研究进展 |
| 1.4.1 ACC氧化酶基因概述 |
| 1.4.2 国内外研究进展 |
| 1.4.2.1 乙烯调控苯丙氨酸解氨酶研究进展 |
| 1.4.2.2 苯丙氨酸解氨酶与生物总碱变化的研究进展 |
| 1.4.2.3 ACC氧化酶研究进展 |
| 1.5 本研究的立体依据及意义 |
| 1.5.1 石斛属植物亲缘关系的研究 |
| 1.5.2 铁皮石斛人工授粉及组织培养研究 |
| 1.5.3 ACC氧化酶基因的研究 |
| 1.6 研究内容 |
| 2 采用ISSR标记研究石斛属植物的亲缘关系 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA的提取 |
| 2.2.2 模板DNA样品浓度及质量的测定 |
| 2.2.3 ISSR-PCR反应 |
| 2.2.3.1 PCR扩增反应体系优化 |
| 2.2.3.2 PCR扩增程序 |
| 2.2.3.3 引物筛选 |
| 2.2.3.4 电泳检测扩增产物 |
| 2.2.4 数据处理 |
| 2.2.4.1 谱带记录 |
| 2.2.4.2 ISSR标记共享度 |
| 2.2.4.3 统计数据 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 DNA提取 |
| 2.3.2 引物筛选 |
| 2.3.3 ISSR反应体系及反应程序的优化 |
| 2.3.4 PCR结果 |
| 2.3.5 石斛亲缘关系分析 |
| 2.4 小结 |
| 3 铁皮石斛的人工授粉与无菌播种 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.1.4 常用试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 人工授粉的方法 |
| 3.2.2 种子萌发 |
| 3.2.3 数据整理分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 人工授粉 |
| 3.3.2 铁皮石斛种子在5种不同培养基上的萌发情况 |
| 3.3.3 不同植物生长调节剂对铁皮石斛种子萌发的作用 |
| 3.3.4 不同添加物对铁皮石斛种子萌发的作用 |
| 3.4 小结 |
| 4 铁皮石斛ACC氧化酶基因的克隆 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.1.4 常用试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 铁皮石斛ACC氧化酶基因扩增与克隆 |
| 4.2.1.1 引物设计 |
| 4.2.1.2 RNA提取 |
| 4.2.1.3 cDNA合成 |
| 4.2.1.4 PCR扩增ACC氧化酶基因 |
| 4.2.1.5 ACC氧化酶基因的TA克隆 |
| 4.2.1.6 连接产物的转化 |
| 4.2.1.7 重组质粒的筛选和鉴定 |
| 4.2.1.8 目的基因序列测定及生物信息学分析 |
| 4.2.2 ACC氧化酶基因片段表达载体的构建 |
| 4.2.2.1 ACC氧化酶基因的扩增和TA克隆 |
| 4.2.2.2 ACC氧化酶基因片段和载体pET-28a(+)的制备 |
| 4.2.2.3 连接及转化 |
| 4.2.2.4 重组表达质粒的酶切鉴定 |
| 4.2.3 重组ACC氧化酶蛋白的表达与条件优化 |
| 4.2.3.1 ACC氧化酶基因片段的表达 |
| 4.2.3.2 表达条件的筛选优化 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 RNA提取 |
| 4.3.2 PCR扩增 |
| 4.3.3 ACC基因片段测序结果 |
| 4.3.3.1 同源性分析 |
| 4.3.3.2 遗传进化分析 |
| 4.3.4 蛋白质组成结构、功能分析与三维结构模型构建 |
| 4.3.5 原核表达载体的构建 |
| 4.3.5.1 表达基因的T克隆 |
| 4.3.5.2 原核表达载体的构建 |
| 4.3.6 重组蛋白的表达 |
| 4.3.6.1 重组蛋白表达产物SDS-PAGE鉴定结果 |
| 4.3.6.2 表达条件的筛选结果 |
| 4.4 小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 影响ISSR反应的因素及26种材料聚类分析 |
| 5.2 铁皮石斛的人工授粉与无菌播种 |
| 5.2.1 关于铁皮石斛的人工授粉 |
| 5.2.2 关于铁皮石斛种子的无菌萌发 |
| 5.3 铁皮石斛ACC氧化酶基因的克隆 |
| 5.3.1 铁皮石斛总RNA的提取 |
| 5.3.2 ACC氧化酶基因的克隆 |
| 5.3.3 ACC氧化酶基因蛋白质组成结构、功能分析与三维结构模型构建 |
| 5.3.4 ACC氧化酶基因的原核表达 |
| 6 参考文献 |
| 附录 石斛属植物属下分类系统 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 本论文创新点 |
（5）无花果ACC合成酶基因克隆及其植物表达载体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1 无花果研究现状 |
| 1.1 无花果应用研究现状 |
| 1.2 无花果贮藏保鲜研究现状 |
| 2 乙烯与果实的成熟衰老 |
| 2.1 乙烯生物合成途径 |
| 2.2 ACC 合成酶 |
| 2.3 ACC 氧化酶 |
| 3 调控果实成熟的相关基因工程技术研究 |
| 3.1 反义 RNA 技术 |
| 3.2 RNA 干扰技术 |
| 4 研究的设计思想及内容 |
| 4.1 本研究的目的、意义 |
| 4.2 研究内容 |
| 第二章 无花果 ACC 合成酶基因片段的克隆 |
| 1 实验材料与试剂 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 质粒载体和菌株 |
| 1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 主要试剂溶液的配制 |
| 2 试验内容与方法 |
| 2.1 无花果基因组 DNA 的提取 |
| 2.2 引物设计与合成 |
| 2.3 PCR 扩增 |
| 2.4 目的片段的回收 |
| 2.5 目的片段与 T 载体连接 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 阳性克隆的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 电泳检测 PCR 产物 |
| 3.2 阳性克隆的菌落 PCR 检测 |
| 3.3 阳性克隆的酶切鉴定 |
| 3.4 阳性克隆的序列测定及同源性分析 |
| 第三章 无花果 ACS1 基因植物表达载体的构建 |
| 1 实验材料与试剂 |
| 1.1 质粒和载体 |
| 1.2 试剂及试剂盒 |
| 1.3 主要试剂溶液的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 无花果 ACS1 基因反义植物表达载体的构建 |
| 2.3 无花果 ACS1 基因 RNAi 表达载体的构建 |
| 2.4 无花果 ACS1 基因植物表达载体向农杆菌中转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 电泳检测正、反向片段 PCR 产物 |
| 3.2 反义中间表达载体 pBI221-Anti-ACS1 的构建及检测 |
| 3.3 反义植物表达载体的构建与检测 |
| 3.4 RNAi 中间表达载体 pBI221-Anti-ACS1 的构建检测 |
| 3.5 RNAi 植物表达载体的构建与检测 |
| 3.6 农杆菌中表达载体的菌液 PCR 鉴定 |
| 第四章 讨论 |
| 1 无花果 ACS1 基因的克隆 |
| 2 无花果 ACS1 基因载体的构建 |
| 2.1 载体的选择 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 载体的连接转化 |
| 2.4 菌液的浓度对质粒提取的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）乙烯生物合成关键酶基因研究进展（论文提纲范文）
| 1 ACS基因 |
| 2 ACO基因 |
（7）甘蔗基因克隆研究进展（论文提纲范文）
| 1 蔗糖代谢相关基因 |
| 1.1 蔗糖磷酸合成酶 |
| 1.2 蔗糖合成酶 |
| 1.3 转化酶 |
| 1.4 蔗糖代谢途径中的其他酶 |
| 1.4.1 磷酸蔗糖磷酸化酶 |
| 1.4.2 果糖-1, 6-二磷酸酯酶 |
| 1.4.3 果糖6-磷酸-2-激酶和果糖-2, 6-二磷酸酶 |
| 1.4.4 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 |
| 2 生长发育相关基因 |
| 2.1 乙烯生物合成途径中的2个关键酶 |
| 2.2 赤霉素生物合成途径中的关键酶 |
| 2.3 延伸因子 |
| 3 抗性相关基因 |
| 3.1 非生物胁迫相关基因 |
| 3.1.1 脯氨酸代谢相关酶 |
| 3.1.1. 1 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶 (Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS) |
| 3.1.1. 2 Δ-鸟氨酸转氨酶 |
| 3.1.2 醛脱氢酶 |
| 3.1.3 转录因子 |
| 3.2 生物胁迫相关基因 |
| 3.2.1 蛋白酶抑制剂 (proteinase inhibitor) |
| 3.2.2 抗病基因同源序列 (resistance gene analog, RGA) |
| 4 结语 |
（8）鸭梨ACC氧化酶基因克隆及反义转化与枣遗传连锁图谱加密的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 鸭梨ACC 氧化酶基因克隆及其分析 |
| 1 引言 |
| 1.1 乙烯 |
| 1.2 ACC 氧化酶 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭梨ACC 氧化酶基因cDNA 片段的克隆 |
| 3.2 鸭梨ACC 氧化酶基因cDNA 全长的克隆 |
| 3.3 鸭梨ACC 氧化酶基因基因组序列的克隆 |
| 3.4 鸭梨ACC 氧化酶基因推导蛋白的生物信息学分析 |
| 3.5 鸭梨ACC 氧化酶基因的Southern 杂交分析 |
| 3.6 鸭梨ACC 氧化酶基因的组织特异性表达分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于鸭梨ACC 氧化酶基因的克隆 |
| 4.2 关于鸭梨ACC 氧化酶的保守结构 |
| 4.3 关于鸭梨ACC 氧化酶在细胞中的定位 |
| 4.4 关于鸭梨ACC 氧化酶基因的表达 |
| 5 结论 |
| 第二章 ACC 氧化酶基因反义转化鸭梨的研究 |
| 1 引言 |
| 1.1 反义RNA 技术的概念及其作用机理 |
| 1.2 反义RNA 技术的优越性及其在育种上的应用 |
| 1.3 应用反义RNA 技术抑制植物ACC 氧化酶基因表达的研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭梨ACC 氧化酶基因植物反义表达载体的构建 |
| 3.2 农杆菌介导的鸭梨ACC 氧化酶基因反义表达载体转化鸭梨 |
| 3.3 转基因鸭梨的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于ACC 氧化酶基因的反义转化鸭梨 |
| 4.2 关于转基因鸭梨的鉴定 |
| 5 结论 |
| 第三章 枣遗传连锁图谱的加密及针刺长度QTL 的比较定位 |
| 1 引言 |
| 1.1 目前应用于枣遗传研究的分子标记类型 |
| 1.2 ISSR 标记技术及其在果树遗传育种中的应用 |
| 1.3 枣遗传连锁图谱研究现状 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 叶片DNA 提取结果 |
| 3.2 枣ISSR 扩增体系的建立 |
| 3.3 枣遗传群体ISSR 分析 |
| 3.4 遗传图谱的构建 |
| 3.5 新增ISSR 标记对原枣遗传连锁图谱的影响 |
| 3.6 枣针刺长度性状在新遗传连锁图谱上的定位 |
| 3.7 枣针刺长度性状两次QTL 定位结果间的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于利用ISSR 标记构建枣遗传连锁图谱 |
| 4.2 关于新增标记引发的原遗传连锁图谱的变化 |
| 4.3 关于枣针刺长度的QTL 定位 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（9）花特异表达启动子调控ACC氧化酶基因RNAi载体构建及转化拟南芥（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 乙烯与切花衰老的关系 |
| 1.1.1 乙烯与切花衰老 |
| 1.1.2 乙烯的生物合成 |
| 1.1.3 ACC 氧化酶基因研究 |
| 1.1.4 ACC 氧化酶基因生物技术育种研究 |
| 1.2 植物启动子的研究进展 |
| 1.2.1 启动子概念 |
| 1.2.2 启动子结构及功能 |
| 1.2.3 启动子的分类 |
| 1.3 RNA 干扰 |
| 1.3.1 RNA 干扰的发现 |
| 1.3.2 RNA 干扰的定义及特征 |
| 1.3.3 RNA 干扰的作用机制 |
| 1.3.4 RNA 干扰在植物中的应用 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 试验部分 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 试剂药品 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 拟南芥植株的培养 |
| 2.2.2 植物中间表达载体的构建 |
| 2.2.3 花特异表达启动子调控的ACC 氧化酶基因RNAi 载体的构建 |
| 2.2.4 pCAM-ACOi 质粒导入农杆菌菌株及其检测 |
| 2.2.5 花序浸润法转化拟南芥 |
| 2.2.6 抗生素筛选及移栽 |
| 2.2.7 拟南芥DNA 提取 |
| 2.2.8 转基因植株的PCR 检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 植物中间表达载体的构建 |
| 2.3.2 花特异表达启动子调控的ACC 氧化酶基因RNAi 载体构建 |
| 2.3.3 根癌农杆菌的转化及鉴定 |
| 2.3.4 花序浸润法转化拟南芥及抗性筛选 |
| 2.3.5 拟南芥PCR 检测 |
| 第三章 讨论与结论 |
| 3.1 讨论 |
| 3.1.1 组成型启动子调控ACC 氧化酶的RNAi 载体转化百合的研究 |
| 3.1.2 植物干扰载体的构建 |
| 3.1.3 转基因植株检测及下一步需要开展的研究 |
| 3.2 结论 |
| 3.2.1 构建了植物中间表达载体 |
| 3.2.2 构建了花特异表达启动子调控的ACC 氧化酶基因RANi 载体 |
| 3.2.3 转化拟南芥并进行PCR 检测 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）西瓜黄瓜乙烯合成及传导途径中基因克隆与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 乙烯的生物合成途径 |
| 1.1.1 关于 ACC 合成酶 （ACC synthase，ACS）的研究进展 |
| 1.1.2 关于 ACC 氧化酶（ACC oxidase，ACO）的研究进展 |
| 1.2 乙烯的信号转导 |
| 1.2.1 膜上乙烯受体蛋白 |
| 1.2.2 膜内信号传递体 |
| 1.3 乙烯组分在瓜类作物性别分化中的作用简述 |
| 1.4 生物信息学的综述 |
| 1.4.1 生物信息学的诞生和发展 |
| 1.4.2 生物信息学的应用 |
| 1.5 立题目的背景和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 感受态细胞和载体 |
| 2.1.3 工具酶和生化试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 DNA 提取与检测 |
| 2.2.1 DNA 提取 |
| 2.2.2 DNA 检测 |
| 2.3 PCR 引物的设计与合成 |
| 2.4 最优化PCR 反应体系的建立 |
| 2.4.1 PCR 体系的建立 |
| 2.4.2 PCR 扩增 |
| 2.5 目的片段克隆与测序 |
| 2.5.1 目的片段纯化回收 |
| 2.5.2 载体的连接 |
| 2.5.3 感受态细胞 |
| 2.5.4 重组质粒的转化和筛选 |
| 2.5.5 质粒DNA 的提取 |
| 2.5.6 检测重组质粒检测 |
| 2.6 生物信息学分析 |
| 2.6.1 序列拼接及聚类 |
| 2.6.2 序列完整性分析 |
| 2.6.3 蛋白质理化性质的分析 |
| 2.6.4 蛋白质亲疏水性分析 |
| 2.6.5 跨膜区结构预测 |
| 2.6.6 蛋白质二级结构分析 |
| 2.6.7 蛋白质结构域与功能分析 |
| 2.6.8 蛋白质三维结构分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA 的提取及检测 |
| 3.2 西瓜ACS 基因克隆与分析 |
| 3.2.1 ACS 基因克隆 |
| 3.2.2 ACS 基因生物信息学分析 |
| 3.3 西瓜和黄瓜ACO 基因片段克隆与分析 |
| 3.3.1 西瓜和黄瓜ACO 基因片段克隆 |
| 3.3.2 CLACO 和CSACO 比较分析 |
| 3.3.3 CLACO 和CSACO 生物信息学分析 |
| 3.4 西瓜和黄瓜乙烯受体基因（ETR1）片段的克隆与分析 |
| 3.4.1 西瓜和黄瓜ETR1 基因片段克隆 |
| 3.4.2 CLETR1 和CSETR1 比较分析 |
| 3.4.3 CLETR1 和CSETR1 聚类分析 |
| 3.4.4 CLETR1 和CSETR1 蛋白质结构域的生物信息学分析 |
| 3.5 西瓜和黄瓜乙烯受体（ETR2）基因片段的克隆与分析 |
| 3.5.1 西瓜和黄瓜ETR2 基因片段的克隆 |
| 3.5.2 CLETR2 和CSETR2 比较分析 |
| 3.5.3 CLETR2 和CSETR2 蛋白质结构域的生物信息学分析 |
| 3.6 西瓜和黄瓜乙烯受体基因（ERS）片段的克隆与分析 |
| 3.6.1 ERS 基因片段在西瓜和黄瓜中的克隆 |
| 3.6.2 CLERS 和CSERS 比较分析 |
| 3.6.3 CLERS 和CSERS 结构域生物信息学分析 |
| 3.7 西瓜和黄瓜 EIN3（ethylene insensitive 3）片段的克隆与分析 |
| 3.7.1 EIN3 基因片段在西瓜和黄瓜的克隆 |
| 3.7.2 CLEIN3、CSEIN3 A 和CSEIN3 B 序列的分析 |
| 3.8 西瓜和黄瓜ERF 基因片段克隆和分析 |
| 3.8.1 西瓜和黄瓜ERF 基因片段克隆 |
| 3.8.2 CLERF 和CSERF 比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于PCR 技术探讨 |
| 4.1.1 引物设计方法探讨 |
| 4.1.2 高效PCR 体系探讨 |
| 4.2 关于提高测序结果准确性技术探讨 |
| 4.3 关于内含子作用探讨 |
| 4.4 关于利用同源保守序列进行基因克隆的探讨 |
| 4.5 瓜类作物乙烯合成和转导途径中重要基因序列比较分析 |
| 4.6 实验的展望 |
| 5 全文的结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
四、甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]黑籽南瓜对枯萎病菌侵染的应答机制及NBS类抗病基因筛选[D]. 丁玉梅. 西南大学, 2019(01)
- [2]苎麻性别分化相关基因的克隆、表达及遗传转化研究[D]. 薛丽君. 湖南农业大学, 2015(02)
- [3]干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究[D]. 吴凯朝. 广西大学, 2013(04)
- [4]石斛属植物亲缘关系研究及ACC氧化酶基因的克隆[D]. 许轲. 四川农业大学, 2013(03)
- [5]无花果ACC合成酶基因克隆及其植物表达载体的构建[D]. 张帅. 河北农业大学, 2013(03)
- [6]乙烯生物合成关键酶基因研究进展[J]. 刘进平. 热带农业科学, 2013(01)
- [7]甘蔗基因克隆研究进展[J]. 黄东亮,李双喜,廖青,方锋学,李杨瑞. 生物技术通报, 2012(08)
- [8]鸭梨ACC氧化酶基因克隆及反义转化与枣遗传连锁图谱加密的研究[D]. 齐靖. 河北农业大学, 2009(02)
- [9]花特异表达启动子调控ACC氧化酶基因RNAi载体构建及转化拟南芥[D]. 解燕. 西北农林科技大学, 2009(S2)
- [10]西瓜黄瓜乙烯合成及传导途径中基因克隆与分析[D]. 曹迪. 东北农业大学, 2009(02)