一、血管抑素抑制人脑胶质瘤生长及病理学研究（论文文献综述）
常渊[1]（2020）在《COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺良恶性肿瘤的表达》文中提出目的通过研究环氧合酶2（COX-2）、程序性死亡分子配体-1（PD-L1）、膜联蛋白A2（ANXA2）在腮腺良恶性肿瘤中的特异性表达及其表达强度,结合其在不同临床病理学分级的恶性肿瘤中的梯度表达变化及其相关程度,可以辅助判断肿瘤的恶性或为术后评估提供较为可靠的病理学依据,为腮腺良恶性肿瘤的鉴别诊断及腮腺恶性肿瘤的临床预估和治疗思路提供有意义的病理学参考。方法收集2014年9月1日到2019年9月2日这五年期间在华北理工大学附属医院口腔科住院并经过手术治疗的,且由本院病理科确诊证实的腮腺恶性肿瘤组织标本存档蜡块50例,作为恶性标本实验组。再从同期组织标本存档中随机选取肿瘤组织和正常腺叶各50例,分别作为良性标本实验组和正常标本对照组。上述病理切片来源患者均为初次手术治疗,术前均未经任何手术治疗和放化疗或激素治疗,全身无其它肿瘤病史。在本院病案科和病理科收集以上患者完整的病历资料和病理信息。其中,腮腺恶性肿瘤依据2019年6月美国国立综合癌症网络修订的《Head and Neck Cancer》的标准进行病理学分类。利用免疫组化SP法分别检测COX-2、PD-L1及ANXA2在腮腺良恶性标本实验组和对照组中的表达及其表达强度。所得实验结果基于统计软件SPSS 21.0进行相关性和显着性检验。结果1在腮腺正常、良性腮腺肿瘤、恶性腮腺肿瘤组织,COX-2的阳性表达率分别为10.0%、42.0%、90.0%;PD-L1的阳性表达率分别为8.0%、46.0%、82.0%;ANXA2的阳性表达率分别为38.0%、58.0%、78.0%,分析可得COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺正常、腮腺良性、腮腺恶性肿瘤组织中的阳性表达率均呈递增趋势,统计验证有效（检验水准取P<0.05）。2（1）在腮腺恶性肿瘤组织中,COX-2在不同的T分类的四组中的阳性表达率分别为33.3%、92.9%、100.0%、100.0%,在四组间存在明显差异;在长期吸烟和非长期吸烟患者中的表达率分别为100.0%、77.3%,个人吸烟史不同的两组中表达具有显着差异（P<0.05）;但其表达与性别、肿瘤的淋巴结和组织转移无统计学意义（P>0.05）。（2）在腮腺恶性肿瘤组织中,PD-L1在T分类组织中的阳性表达率分别为33.3%、78.6%、90.5%、100.0%,不同T分类的四组,组间表达存在显着差异（P<0.05）;其表达率与肿瘤的淋巴结转移、远端转移、性别和吸烟史的差异结果无统计学意义（P>0.05）;（3）在腮腺恶性肿瘤组织中,ANXA2的阳性率在N分类组织中分别为62.5%、94.1%、88.9%,不同N分类的三组组间差异有统计学研究意义（P<0.05）;在长期吸烟和非长期吸烟患者中阳性率分别为92.8%、59.1%,个人吸烟史不同的两组中表达不同,结果有统计意义（P<0.05）。ANXA2的阳性表达差异与性别、肿瘤的大小和远端转移情况无统计学意义（P>0.05）。3在恶性腮腺肿瘤组织,COX-2与PD-L1的表达强度互为正向相关,r=0.468,相关程度具有统计学研究意义（P<0.05）;PD-L1与ANXA2的阳性表达率存在正相关的关系,r=0.364,关系具有统计学意义（P<0.05）;COX-2与ANXA2阳性表达率为正相关,r=0.505（P<0.05）,相关性具有统计意义。结论1 COX-2、PD-L1及ANXA2在腮腺正常组织、良性肿瘤和恶性肿瘤中的阳性表达均呈递增趋势。2 COX-2的阳性表达率与肿瘤的直径有关,而且长期吸烟患者肿瘤组织中表达率更高;PD-L1的阳性表达率在直径越大的恶性腮腺肿瘤组织中表达越强;ANXA2的阳性表达率与腮腺恶性肿瘤淋巴结转移和吸烟史有关。3在腮腺恶性肿瘤中,COX-2、PD-L1和ANXA2均互为正相关。图7幅;表7个;参45篇。
郭高超[2]（2020）在《IKBKE通过磷酸化Amotl2促进YAP1的表达调控脑胶质瘤恶性进展的机制研究》文中进行了进一步梳理国内外研究结果表明,IKBKE（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon）为促癌基因,在乳腺癌,前列腺癌,非小细胞肺癌,子宫内膜癌和胶质瘤中过度高表达。我们课题组前期研究证实,IKBKE基因在人脑胶质母细胞瘤中异常高表达,并且表达量与胶质母细胞瘤患者预后呈负相关,且与人胶质母细胞瘤的恶性程度呈正相关;沉默IKBKE基因的表达,显着抑制人胶质母细胞瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及迁移能力。在本论文研究中,我们通过CGGA,TCGA和GEO公共数据库及胶质瘤组织芯片发现IKBKE在胶质瘤中高表达,并且与胶质瘤的恶性程度呈正相关与患者预后呈负相关。另外,我们通过SILAC标记磷酸化定量蛋白质组学检测发现IKBKE能够直接磷酸化Amotl2的丝氨酸166位点。通过phos-tag磷酸化胶和蛋白质泛素化实验进一步证实IKBKE直接磷酸化Amotl2,并且促进其发生泛素化降解。此外,在胶质瘤中Amotl2与YAP1相互作用,抑制YAP1核移位并促进其降解,我们实验证实IKBKE可以解除Amotl2对YAP1抑制作用,促进YAP1的表达及核转位,从而参与Hippo通路的调控作用。在体内实验中,建立裸鼠颅内胶质瘤模型,我们发现沉默IKBKE基因后,明显抑制颅内肿瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存期。综上所述,IKBKE能够通过IKBKE↑-Amotl2↓-YAP1↑调控轴调控胶质瘤的恶性进展,为胶质瘤靶向治疗提供新的研究方向。方法我们分析公共数据库CGGA,TCGA和GEO,通过分析IKBKE m RNA的表达量确定IKBKE与胶质瘤的恶性程度及胶质瘤患者的预后的关系。我们收集149例临床胶质瘤样本,进行免疫组织化学染色,确定IKBKE的表达量与胶质瘤级别的关系。我们选取胶质母细胞瘤组织培养出的原代细胞G4和经典胶质母细胞瘤细胞系U87MG用于后续研究。我们构建沉默IKBKE基因的sh IKBKE慢病毒,下调胶质瘤细胞IKBKE基因的表达,然后应用平板克隆,CCK-8和Ed U等细胞增殖实验检测沉默IKBKE基因后,胶质母细胞瘤细胞的增殖情况的变化。分子机制研究中,我们首先沉默U87MG中IKBKE基因进行SILAC标记磷酸化定量蛋白质组学检测,发现Amotl2的s166位点为IKBKE的潜在磷酸化位点。然后我们在293T细胞中分别转染野生型IKBKE或/和野生型Amotl2质粒,通过蛋白免疫共沉淀的方法检测两个外源性蛋白直接结合作用;接着在胶质母细胞瘤细胞系中通过蛋白质免疫共沉淀方法进一步确定内源性IKBKE和Amotl2直接结合的作用。然后,在293T细胞中分别转染野生型IKBKE或/和野生型Amotl2质粒,使用phos-tag磷酸化胶检测IKBKE磷酸化Amotl2的作用关系;为进一步确定IKBKE磷酸化Amotl2的关系,在293T细胞转染野生型Amotl2质粒,然后分别转染IKBKE活性型和失活性质粒,体内激酶实验的方法检测Amotl2中p-ser的表达量变化。通过三个公共数据库根据IKBKE和Amotl2表达量做相关性分析;然后在胶质瘤细胞系沉默或者过表达IKBKE基因后,蛋白免疫印迹和q RT-PCR实验检测Amotl2基因的变化。MG132和CHX试剂处理各组细胞,蛋白免疫印迹实验检测IKBKE促进Amotl2降解的调控作用。最后,293T细胞中转染野生型IKBKE,野生型Amotl2,野生型Ub质粒,通过蛋白泛素化实验确定IKBKE调控Amotl2泛素化降解途径。构建shAmotl2慢病毒敲低Amotl2基因,通过蛋白免疫印迹实验检测Amotl2,YAP1和p-YAP1（s172）的变化;然后蛋白免疫印迹实验检测沉默或过表达后IKBKE后Amotl2,p-YAP1（s172）,YAP1及其下游CTGF和CYR61的变化及沉默IKBKE基因后YAP1细胞浆及胞核内蛋白的变化;通过免疫荧光的方法确定沉默IKBKE基因后YAP1细胞浆及胞核内蛋白的变化。回复实验中,同时沉默或者过表达IKBKE和Amotl2基因后,通过蛋白免疫印迹检测YAP1的变化,通过Edu实验检测细胞增殖的情况。裸鼠颅内成瘤实验中,G4细胞和G4 sh IKBKE细胞转染luciferase成像病毒,使用立体定向仪建立裸鼠颅内胶质瘤模型,定期检测颅内肿瘤的大小、裸鼠生存状态及裸鼠生存时间,最后将裸鼠脑制成组织切片免疫组化检测各指标变化。结果1.IKBKE基因在胶质瘤中异常高表达,与胶质瘤的恶性程度呈正相关,并且表达量越高患者预后越差;2.沉默IKBKE能显着抑制胶质瘤细胞的增殖能力;3.IKBKE能够与Amotl2直接结合,并且能够磷酸化Amotl2;4.IKBKE可以促进Amotl2发生泛素化降解;5.沉默IKBKE可以显着增加Amotl2蛋白的表达,但不影响Amotl2 m RNA的表达,过表达IKBKE则抑制Amotl2蛋白的表达,同样但不影响Amotl2 m RNA的表达;6.IKBKE能够通过调控Amotl2的表达,而影响Hippo通路,沉默IKBKE能抑制YAP1及其下游靶基因CTGF和CYR61的表达,过表达IKBKE能够增加YAP1及其下游靶基因CTGF和CYR61的表达;7.沉默IKBKE能够抑制YAP1从细胞浆向细胞核转运;8.胶质瘤细胞中,Amotl2明显抑制IKBKE对Hippo通路的影响;9.沉默IKBKE可以显着抑制裸鼠颅内肿瘤生长,延长荷瘤鼠的生存时间。结论1.IKBKE基因在胶质瘤中异常高表达,表达量与胶质瘤恶性程度正相关,与患者预后负相关;2.沉默IKBKE基因,能够显着抑制人胶质母细胞瘤细胞体内、体外的增殖能力,并且明显延长荷瘤鼠的生存时间;3.IKBKE能够直接磷酸化Amotl2;4.IKBKE能够促进Amotl2发生泛素化降解,抑制Amotl2的表达;5.IKBKE能够阻断Amotl2对YAP1的抑制作用,促进YAP1的表达及核转运,从而参与Hippo通路的调控胶质瘤的恶性进展;综上所述,IKBKE能够通过IKBKE↑-Amotl2↓-YAP1↑信号通路参与胶质瘤的恶性进展。
卞静[3]（2020）在《miRNA-411-5p对胶质瘤微血管内皮细胞迁移和管形成的影响及作用机制初探》文中指出目的胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤。尽管在手术、化疗和放疗等方面取得重大进展,但恶性胶质瘤患者的预后效果仍不理想。胶质瘤是典型的血管依赖性实体肿瘤,其生长主要依赖于肿瘤血管生成。因此,如何抑制胶质瘤血管新生是胶质瘤分子靶向治疗的热点,受到国内外学者的广泛关注。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是一类长度为2224个核苷酸的非编码内源性小RNA,主要通过与其下游靶基因的mRNA 3’非翻译区（3’untranslated regions,3’UTR）靶向结合,降解mRNA或抑制mRNA翻译来发挥调控作用。研究表明,多种差异表达的miRNA参与胶质瘤的血管新生,发挥抑癌或促癌作用。MiR-411是14q32.31 miRNA基因簇的成员。该基因簇多个成员在新生血管中发挥重要作用。但miR-411是否参与调控胶质瘤血管新生目前还不清楚。有研究报道,miR-411在胶质瘤组织和细胞中的表达显着下调,并参与进化保守的非编码RNA对胶质瘤细胞增殖的调控,提示它可能是潜在的抑癌基因。然而,miR-411在胶质瘤微血管内皮细胞（glioma-exposed microvascular endothelial cells,GECs）中的表达尚不明确。miR-411能否通过抑制胶质瘤微血管内皮细胞的迁移和管形成进而抑制胶质瘤血管新生,发挥抑癌作用,目前尚未见报道。G补缀FHA域血管生成因子1（angiogenic factor with G patch and FHA domains1,AGGF1）是在研究人类先天性静脉肢体肥大综合征（Klippel-Trenaunay Syndrome,KTS）时新发现的一种血管生成相关因子。AGGF1在血管内皮细胞中高表达,参与介导内皮细胞增殖、迁移、管形成和以主动脉环为中心的血管生成。前期研究显示AGGF1参与调控胶质瘤血管新生。但是关于AGGF1是否参与miR-411对胶质瘤微血管内皮细胞迁移和管形成的影响,进而调控血管新生,目前还不清楚。本研究首先明确miR-411-5p在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达水平,进一步研究miR-411-5p对胶质瘤微血管内皮细胞迁移和管形成能力的影响,最后探讨miR-411-5p是否通过靶向结合AGGF1影响胶质瘤血管新生,为胶质瘤的抗血管新生治疗提供新的靶标。方法实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）方法检测miR-411-5p在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达水平。分别转染miR-411-5p agomir或antagomir过表达或表达沉默miR-411-5p,qRT-PCR验证其转染效率;并用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Matrigel胶体外血管形成实验分别检测胶质瘤微血管内皮细胞的迁移能力和体外管形成能力变化,研究其在胶质瘤血管新生中的作用。分别构建野生型和突变型AGGF1 3’UTR报告基因质粒,分别与miR-411-5p agomir共转染293T细胞,双荧光素酶报告基因系统分析miR-411-5p与AGGF1的靶向结合。qRT-PCR和western blot方法检测过表达或表达沉默miR-411-5p后AGGF1 mRNA和蛋白的表达水平变化。结果miR-411-5p在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达显着低于正常脑微血管内皮中的表达（P<0.05 vs.ECs group）。在转染miR-411-5p agomir的细胞中,miR-411-5p的表达水平显着上调（P<0.01 vs.miR-411-5p agomir NC group）;在转染miR-411-5p antagomir的细胞中,miR-411-5p的表达水平并未显着下调（P>0.05 vs.miR-411-5p antagomir NC group）。过表达miR-411-5p显着抑制胶质瘤微血管内皮细胞的迁移（P<0.05或P<0.01 vs.miR-411-5p agomir NC group）和管形成能力（P<0.01 vs.miR-411-5p agomir NC group）;表达沉默miR-411-5p显着促进胶质瘤微血管内皮细胞的迁移（P<0.05或P<0.01vs.miR-411-5p antagomir NC group）和管形成能力（P<0.01和P<0.05 vs.miR-411-5p antagomir NC group）。miR-411-5p与AGGF1存在靶向结合作用（P<0.05 vs.AGGF1-wt+miR-411-5p NC group）。过表达miR-411-5p显着下调AGGF1 mRNA（P<0.05 vs.miR-411-5p agomir NC group）和蛋白（P<0.01 vs.miR-411-5p agomir NC group）的表达水平;表达沉默miR-411-5p显着上调AGGF1 mRNA（P<0.01 vs.miR-411-5p antagomir NC group）和蛋白（P<0.01 vs.miR-411-5p antagomir NC group）的表达水平。结论1.miR-411-5p在胶质瘤微血管内皮细胞中低表达。2.过表达miR-411-5p抑制胶质瘤微血管内皮细胞的迁移和管形成能力,表达沉默miR-411-5p促进胶质瘤微血管内皮细胞的迁移和管形成能力。3.miR-411-5p靶向结合AGGF1并下调其表达水平,可能是miR-411-5p抑制胶质瘤血管新生的机制。
罗斌华[4]（2019）在《异甘草素对缺氧环境下SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态的影响》文中指出目的:1.探讨二氯化钴模拟缺氧微环境对SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态及相关生物学行为（包括增殖、迁移）的影响。2.探讨异甘草素对缺氧环境下SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态及相关生物学行为（包括增殖、迁移）的影响。方法:1.第一部分实验:分别以不同浓度（100、200、400uM）Cocl2作用于SHG44胶质瘤细胞24h,采用三维培养检测胶质瘤细胞形成血管生成拟态能力,应用CCK-8法和划痕实验分别检测胶质瘤细胞增殖和迁移能力,采用Western blotting技术检测EphA2、MMP-2、VEGF等VM相关蛋白表达情况。2.第二部分实验:氯化钴模拟缺氧环境下,分别用低（20uM）、中（40uM）、高（80uM）浓度异甘草素处理SHG44胶质瘤细胞24h,采用三维培养检测胶质瘤细胞形成血管生成拟态能力;应用CCK-8法和划痕实验分别检测胶质瘤细胞增殖和迁移能力,采用Western blotting技术检测EphA2、MMP-2、VEGF等VM相关蛋白表达情况。结果:1.第一部分实验1.1与空白对照组相比,当二氯化钴浓度为100uM、200uM时VM数量、总长度增加,同时,细胞增殖活性及迁移距离增加,差异有统计学意义（P<0.05）;当氯化钴浓度达400uM时,VM数量、长度减少,细胞增殖活及迁移距离减小;差异具有统计学意（P<0.05）。1.2Western blotting结果显示:与空白对照组相比,浓度为100uM、200uM的二氯化钴组EphA2、MMP-2、VEGF等VM相关蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;当氯化钴浓度达400uM时,EphA2、MMP-2及VEGF蛋白表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.第二部分实验2.1与缺氧空白对照组比较,随着异甘草素浓度的增加VM数量、长度明显减少,细胞增殖活性及迁移距离减小,呈现一定的量效关系,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.2Western blotting结果显示:异甘草素可以抑制EphA2、MMP-2蛋白的表达,且呈一定的剂量依赖性,即随着异甘草素浓度增加,EphA2、MMP-2蛋白表达下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。缺氧环境下,当异甘草素浓度为20uM、40uM时,VEGF蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。当异甘草素浓度达80uM时,VEGF蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.第一部分实验1.1微缺氧环境可诱导胶质瘤形成VM,同时细胞增殖、迁移能力增加;缺氧程度加重时可抑制VM及相关生物学行为（包括增殖、迁移）。1.2微缺氧可使胶质瘤细胞EphA2、MMP-2、VEGF等VM蛋白表达上调:缺氧程度严重时抑制EphA2、MMP-2、VEGF蛋白表达。2.第二部分实验2.1微缺氧环境下,异甘草素可抑制胶质瘤细胞血管生成能力及细胞增殖、迁移能力,其机制可能是通过下调EphA2、MMP-2、VEGF蛋白的表达。
王非一凡,王苟思义,曹航,李学军[5]（2018）在《脑胶质瘤血管生成研究进展》文中提出即使应用积极的手术、放疗和化疗等手段,恶性胶质瘤仍是死亡率最高的中枢神经系统肿瘤。胶质瘤通过VEGF等血管内皮生长因子驱动刺激新血管的形成。同时,由此产生的血管结构和功能异常进一步构成了肿瘤微环境,使得恶性胶质瘤的发病率与死亡率增加。最新的基础研究和临床数据表明,抗血管生成治疗在胶质母细胞瘤中具有极大潜力,并可使肿瘤组织血管正常化。这些研究为未来的放化疗增敏与综合治疗带来了更多的希望。
郭兴[6]（2017）在《低氧下miR224-3p和MIF在人脑胶质母细胞瘤中作用及其机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景人脑胶质母细胞瘤（Glioblastoma Mutiforme,GBM）是成人中枢神经系统中最常见并且恶性程度最高的原发性肿瘤,在全部类型的脑胶质瘤中能够占到50%以上。根据组织病理学特征,世界卫生组织（World Health Organization,WHO）将脑胶质瘤按照恶性程度由低到高分为Ⅰ-Ⅳ四个等级,其中GBM被认定为星形细胞瘤病理类型中恶性程度最高的Ⅳ级。近年来,虽然针对GBM的传统手术切除联合放化疗、新型的抗血管生成治疗以及靶向免疫治疗等策略不断丰富和改进,但是在临床实践中仍未能取得令人满意的效果,GBM治愈率低,复发率高,患者预后极差。为了完善和补充当前的GBM治疗策略,改善患者的生存预后,进一步探索和揭示GBM恶性生物学进展的分子调控机制仍然十分迫切。低氧（Hypoxia）是实体性肿瘤微环境中最为普遍存在的标志性特征。由于氧气输送和氧气消耗之间的不平衡,约一半以上的实体肿瘤中存在广泛的低氧区域。低氧微环境和低氧诱导因子（Hypoxia Inducible Factor,HIF）所依赖的下游分子通路在肿瘤的恶性生物学进展中起到关键性的调节作用,其参与调控了肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移,上皮表型向间充质表型的转变（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）,内皮血管新生,以及免疫逃逸。此外,临床研究数据表明低氧与多种肿瘤的远处转移、放化疗耐受性以及患者的不良预后有着紧密的联系。GBM作为恶性程度极高的实体肿瘤,存在广泛的低氧区域,然而其低氧下的分子调控机制尚未完全阐明。因此对这一机制的深入探索,有利于寻找新的治疗靶点,进而采取适当的手段降低胶质瘤细胞的恶性进展,改善胶质瘤患者的预后。细胞自噬（Autophagy）是一种利用自噬溶酶体回收、清除细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器的自我消化分解代谢过程。这种自我清除代谢废物、重新回收能量的生理性代谢过程在细胞正常运转、自我修复、逃避恶劣环境等方面起到重要的作用。肿瘤细胞自噬的诱导为其自身提供了有效的额外供养途径,提高了清除细胞内有害物质的能力,有利于肿瘤细胞在低氧、低养、饥饿等恶劣微环境中的生存以及恶性生物学进展。越来越多的研究表明,低氧能够诱导GBM细胞自噬活性的增强,并且在一定程度上提高了其对化疗药物的耐受性。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是一类长约19-22核苷酸的内源性、非编码单链RNA,通过作用于靶基因的3’非翻译区（3’ untranslated region,3’ UTR）导致靶基因mRNA降解或抑制其翻译,在转录后水平对基因进行调控。MiRNA在细胞生理学活动过程中的调节作用极其广泛,其中包括增殖、分化、凋亡以及自噬等。在GBM中,低氧微环境诱导大量miRNAs产生了差异性的表达,给miRNA表达谱留下了特定的低氧印迹。这些差异表达的miRNAs可能在低氧诱导的GBM细胞自噬水平的增高、侵袭迁移能力的增强以及耐药性的产生中起到关键性的调控作用。然而,低氧在GBM自噬活性以及恶性进展中作用的关键调控miRNAs仍然不十分明确,需要进一步深入研究。血管拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）是完全不依赖于血管内皮细胞,由恶性肿瘤细胞自身形成的管道样脉络结构,具有供血功能。从血管拟态这种现象被定义以来,它在多种恶性肿瘤中被发现,其中包括GBM。血管拟态的形成增加了 GBM血流量,能够为低氧下生长迅速的胶质瘤细胞提供额外营养物质和氧气的供应。之前的研究表明,形成VM的肿瘤细胞具有产生可塑性表型的特性,这种表型的可塑性改变能够受到低氧的调节。值得我们注意的是,低氧能够通过诱导GBM细胞发生EMT促进血管拟态的形成。巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage Migration Inhibitory Factor,MIF）是具有促进炎症发生和促进肿瘤恶性进展双重功能的细胞因子。MIF在多种类型的恶性肿瘤中高度表达,其中包括GBM。近年来,对胶质瘤的深入的研究发现MIF表达水平与其临床病理分级以及浸润扩散程度具有密切的正相关关系。更重要的是,低氧能够进一步增加GBM中MIF的表达和分泌,而且MIF与GBM细胞的自噬、侵袭迁移、血管生成和免疫逃避有着密切联系。然而,低氧下MIF对GBM的作用和具体调控分子机制尚不清楚,仍有待进一步深入研究。本课题主要从低氧促进GBM细胞自噬以及血管拟态生成两方面进行研究,分别深入探讨了相关的miR224-3p和MIF对GBM的作用以及其具体作用机制。首先,从低氧下GBM细胞miRNA表达谱基因芯片入手,我们通过全面分析筛选发现芯片中显着下调的miR224-3p参与介导了低氧诱导的GBM自噬水平增强。随后,进一步深入研究了其对GBM的自噬作用及其具体机制。除此以外,我们发现MIF对低氧下GBM细胞血管拟态的形成有着关键的调控作用,并且进一步探索了其具体的分子机制。本课题对低氧下GBM恶性生物学进展的基础研究,为GBM患者提供了新的治疗靶点,有着重要学术意义和广阔的临床应用前景。第一部分MiR224-3p对低氧下胶质母细胞瘤自噬水平的影响及其作用机制的研究1.目的（1）基于miRNA表达谱基因芯片,通过分析常氧、低氧下GBM细胞miRNAs的差异表达,筛选出低氧下调的miRNAs中与自噬相关的miRNAs（miR224-3p）。（2）明确miR224-3p对低氧下GBM细胞自噬水平的调节作用,阐明miR224-3p调节GBM细胞自噬的具体作用机制和直接作用靶基因。（3）揭示胶质瘤组织中mmiR224-3p的表达水平,以及miR224-3p与靶基因表达量之间的相关性。（4）探究miR224-3p对GBM细胞增殖和低氧诱导凋亡的作用。（5）明确miR224-3p对GBM细胞体内成瘤生长的影响。2.方法（1）细胞低氧处理及m i RNA芯片的检测通过低氧培养箱实现物理性低氧,培养条件设定为:37℃,5%CO2,1%O2。分别提取低氧处理组（24h）和对照组U251细胞的总miRNAs,进行miRNA表达谱的检测,经过分析获取全面的miRNA表达谱原始数据。（2）mRNA,miRNA和蛋白水平的检测收集不同WHO级别临床胶质瘤组织后,提取总mRNA和制备石蜡切片,应用荧光实时定量PCR（q-PCR）和免疫组织化学技术分别检测各相关miRNAs、mRNAs和蛋白分子的表达水平。对U251和U87两种GBM细胞系进行特定的处理并分别提取总RNA和总蛋白,使用q-PCR和Western blot技术检测U251和U87细胞内相关mRNAs,miRNAs和蛋白分子的表达水平。（3）细胞转染及GFP-LC3稳定细胞系的构建分别用 miR224-3p mimics,miR224-3p inhibitor,ATG5 质粒,FIP200 质粒,含有miR224-3p互补结合序列的ATG5 3’ UTR突变型或野生型荧光素酶报告基因质粒,含有miR224-3p互补结合序列的FIP200 3’ UTR突变型或野生型荧光素酶报告基因质粒对U251和U87细胞进行Lipo2000脂质体瞬时转染,用于过表达或敲除目的蛋白或miR224-3p,进而研究各种相关指标的表达水平的变化。将含有GFP-LC3B编码序列的质粒用慢病毒进行包装,通过共培养转染U251和U87细胞系,构建稳定表达GFP-LC3B绿色荧光蛋白细胞系后,对自噬水平进行动态监测。（4）胶质瘤细胞自噬水平检测对自噬水平的检测分为以下几种方法:①透射电子显微镜直接观察U251细胞中典型双层膜结构自噬小体的数量,此方法为监测自噬的金标准。②Western blot技术检测U251和U87细胞自噬主要标志性蛋白LC3B和P62表达水平。③倒置荧光显微镜观察GFP-LC3B稳定表达U251和U87细胞中荧光自噬小体阳性细胞,并统计计算阳性细胞比例。④自噬小体和溶酶体融合抑制剂巴弗洛霉素A1（BafilomycinAl,BAF）药物应用于自噬流的检测。（5）M i R224-3p下游调控靶点预测以及荧光素酶报告基因实验利用miRNA靶基因数据库（如:targetscan、PicTar、miRanda等）筛选出miR224-3p最可能直接作用的自噬相关靶基因。之后通过q-PCR和Western blot进行验证。最后,分别对U251和U87细胞进行miR224-3p mimics和含有靶基因突变型或野生型结合位点的荧光素酶报告基因质粒共转染后,进行双荧光素酶基因报告实验确定miR224-3p直接作用的靶基因。（6）胶质瘤细胞增殖和凋亡检测分别对 U251 和 U87 细胞进行 miR224-3p mimics 和 miR224-3p inhibitor 瞬时转染,然后用CCK-8和EdU试剂盒检测不同时间点GBM细胞活力和增殖能力。用Annexin V-FITC双染流式试剂盒和抗裂解的caspase3免疫细胞化学方检测低氧诱导转染miR224-3p mimics的U251和U87细胞凋亡水平。（7）裸鼠皮下人脑GBM细胞成瘤实验用U87细胞系建立裸鼠皮下异位成瘤模型。U87细胞在皮下成瘤后,行瘤内注射lenti-miRNA224-3p mimics和lenti-NCm慢病毒,同时间隔1天测量miR224-3p mimics组和NCm组肿瘤体积以及终末肿瘤重量。3.结果（1）低氧诱导GBM明细胞自噬水平的增强Western blot和GFP-LC3B稳定细胞系荧光自噬小体检测分别显示,与常氧组相比,GBM细胞U251和U87在低氧下自噬水平增强（LC3BⅡ升高,P62降低,自噬小体阳性细胞比例升高）,且呈处理时间梯度依赖效应。BAF自噬流阻断实验显示低氧诱导U251和U87细胞自噬流被明显阻断（LC3BⅡ和P62表达均明显升高）,进一步验证了以上结论。（2）在GBM细胞中,低氧诱导miR224-3p表达下调;在人脑胶质瘤组织中,miR224-3p呈低水平表达U251细胞miRNA表达谱芯片分析结果显示,miR224-3p为筛选出的低氧下调最显着的mmmiRNA。Q-PCR检测结果进一步验证,低氧下U251和U87细胞中miR224-3p表达水平明显下降。30例临床胶质瘤组织（14例低级别胶质瘤,WHOⅠ,Ⅱ级和16例高级别胶质瘤,WHO Ⅱ,Ⅳ级）和6例正常脑组织q-PCR结果显示,与正常脑组织相比,miR224-3p在胶质瘤组织中明显低表达。(3M i R224-3p参与调控低氧诱导的胶质瘤母细胞瘤细胞自噬水平的增强透射电子显微镜、Western blot和GFP-LC3B细胞系荧光自噬小体检测分别发现,常氧下,敲除内源性miR224-3p的U251和U87细胞自噬及自噬流水平明显增强;低氧下,过表达miR224-3p能够阻断U251和U87细胞自噬水平的升高。（4）MiR224-3p通过直接作用于下游靶基因ATG5和FIP200调节胶质瘤母细胞瘤细胞的自噬水平Q-PCR和Western blot检测显示,在众多miR224-3p预测的自噬相关靶基因中,过表达和敲除miR224-3p分别同时明显降低和升高FIP200和ATG5表达。而且,共同过表达FIP200和ATG5能够逆转miR224-3p过表达对低氧诱导自噬的阻断作用。更进一步的双荧光素酶报告基因实验结果发现,miR224-3p能够分别与FIP200和ATG5的3’ UTR中的互补序列结合发挥直接靶向抑制作用。（5）在人脑胶质瘤组织中,m i R224-3p含量与FIP200和ATG5的表达水平具有负性相关关系免疫组化检测发现,胶质瘤组织中低氧标志物HIF1 α和自噬标志物LC3B较正常脑组织明显高表达。同时经过定量和统计学分析发现,30例不同病理级别胶质瘤组织FIP200和ATG5的表达水平分别和miR224-3p的含量呈现出有明显统计学意义的负相关关系。（6）MiR224-3p减弱胶质瘤母细胞瘤细胞增殖能力,并且能够增加低氧诱导的GBM细胞的凋亡。CCK-8法和EdU法检测分别显示,过表达miR224-3p的U251和U87细胞活力和增殖能力明显增强,反之亦然。Annexin V-FITC双染流式试剂盒和抗裂解的caspase3免疫细胞化学方法检测发现,过表达miR224-3p能够显着提高低氧诱导的U251和U87细胞凋亡水平。（7）在体内实验中,m i R224-3p抑制GBM的生长利用U87细胞系建立裸鼠皮下人脑胶质瘤异位成瘤模型进行体内实验发现,miR224-3p mimics慢病毒组肿瘤平均体积和平均终末重量均显着低于对照慢病毒组。4.结论（1）通过miRNA表达谱分析,首次筛选出并且证实了 miR224-3p在低氧诱导的GBM细胞自噬增强中起到关键性的调节作用。（2）低氧能够明显降低GBM细胞miR224-3p的表达水平。（3）MiR224-3p通过抑制自噬相关基因FIP200和ATG5的表达来负性调节GBM细胞的自噬水平。（4）MiR224-3p通过结合FIP200和ATG5 mRNA的3’ UTR直接抑制靶基因的表达水平。（5）在胶质瘤组织中,miR224-3p较正常脑组织表达水平低;并且miR224-3p分别与FIP200和ATG5的表达量成负相关的关系。（6）MiR224-3p能够减弱GBM细胞的增殖能力以及增强低氧诱导的GBM细胞凋亡敏感性。（7）MiR224-3p能够抑制GBM细胞体内的生长。第二部分MIF在低氧诱导胶质母细胞瘤EMT和血管拟态生成中的作用以及其具体机制的研究1.目的（1）在胶质瘤临床组织中,研究低氧指标HIF1α分别与MIF和MIF受体CXCR4表达量之间的相关性。（2）在胶质瘤临床组织中,揭示HIF1α,MIF,CXCR4和VM四者之间的相关性;并且对MIF、CXCR4的表达水平以及VM阳性对胶质瘤患者预后的影响进行统计学分析。（3）明确低氧对GBM细胞EMT以及VM生成的影响。（4）阐明MIF在低氧诱导GBM细胞EMT和VM形成中的关键调节作用。（5）通过特异性药物阻断MIF的下游CXCR4相关信号通路,探究MIF在低氧诱导的GBM细胞EMT和VM生成中的具体作用机制。（6）应用裸鼠皮下GBM细胞成瘤实验,在体内水平验证MIF在EMT中的作用及其下游的具体通路机制。2.方法（1）细胞低氧处理及mRNA和蛋白水平的检测常氧和低氧下,对U251和U87两种GBM细胞进行相应的rhMIF、AMD3100、LY294002,ISO-1处理刺激后,分别提取总RNA和总蛋白。然后使用q-PCR和Western blot方法检测U251和U87细胞内需要检测的相关EMT标志物mRNAs和蛋白分子的表达水平。（2）细胞转染用Lipofectamine 2000对siMIF进行瞬时转染,用于敲除U251和U87细胞内源性MIF的表达,进而检测各种相关EMT标志蛋白表达水平的变化。（3）临床组织标本免疫组化和免疫荧光收集临床不同WHO级别的胶质瘤组织[25例临床胶质瘤组织（12例低级别胶质瘤,WHO Ⅰ,Ⅱ级和13例高级别胶质瘤,WHO Ⅲ,Ⅳ级）和6例正常脑组织],制备石蜡切片。然后应用免疫组化检测不同级别胶质瘤组织中HIF1 α、MIF、CXCR4的表达水平及血管拟态的生成[CD34与PAS（过碘酸希夫反应）共染阳性]情况。应用免疫组织化学和免疫荧光检测连续石蜡切片中HIF1 α、MIF、CXCR4以及血管拟态的共定位现象。（4）细胞免疫荧光对U251和U87细胞分别进行低氧以及相应的rhMIF、AMD3100、LY294002、ISO-1处理刺激。然后用4%多聚甲醛固定,通过免疫荧光方法检测细胞中MIF、CXCR4、上皮表型标志物E-Cadherin的表达水平。（5）胶质瘤细胞血管拟态形成实验利用基质胶3D环境,对低氧以及rhMIF、AMD3100、LY294002、ISO-1分别处理后的U87细胞进行血管拟态形成实验,检测不同处理因素对U87细胞形成血管拟态能力的影响。（6）裸鼠体内试验用GBM细胞系U87建立人脑胶质瘤荷瘤裸鼠皮下异位模型。U87细胞在皮下成瘤后,随机分为五组,分别行瘤周注射PBS,rhMIF,rhMIF和AMD3100,rhMIF和LY294002,ISO-1。三周后进行终末肿瘤体积的测量,并且对肿瘤进行石蜡包埋切片,进行免疫组化染色,检测组间N-cadherin（间充质表型标志物）和E-cadherin（上皮表型标志物）的表达水平。3.结果（1）在临床胶质瘤标本中,MIF和CXCR4的表达水平与HIF1 α含量呈正相关关系免疫组化检测结果显示,MIF、CXCR4和HIF1α的表达水平在胶质瘤中明显高于正常脑组织,并且高级别胶质瘤高于低级别胶质瘤。同时,定量统计学分析结果表明,HIF1α分别与MIF和CXCR4的表达水平呈线性正性相关关系。连续石蜡切片免疫荧光检测结果发现,MIF和CXCR4的表达与HIF1 α在胶质瘤组织中存在共定位现象。（2）在胶质瘤组织中,血管拟态的形成与MIF和CXCR4的共同高表达密切相关PAS染色和CD34免疫组化共染结果显示,VM形成标本阳性率在高级别胶质瘤中明显高于低级别,并且共同高表达MIF和CXCR4与VM的形成明显正相关。连续石蜡切片免疫组化结果发现,MIF、CXCR4、HIF1α和VM在胶质瘤组织中存在共定位现象。进一步的生存分析结果显示,VM阳性的胶质瘤患者生存期明显低于VM阴性患者。（3）MIF和CXGR4的表达水平在低氧下升高,并且低氧和MIF诱导EMT和VII的形成Western blot、q-PCR和细胞免疫荧光检测结果发现,MIF和CXCR4的表达在低氧下明显升高,以及低氧和MIF促进EMT（上皮样表型标志物E-cadherin的下降和间充质表型标志物N-cadherin、Vimentin的升高）。VM形成实验结果表明,低氧和MIF能够促进GBM细胞VM形成。（4）低氧通过MIF-CXCR4-AKT-EMT通路促进胶质瘤母细胞瘤细胞的VM形成Q-PCR、Western blot检测和VM形成实验结果显示,MIF诱导的EMT和VM形成能够被CXCR4和AKT抑制剂阻断。而且,低氧诱导的EMT和VM形成能够被MIF、CXCR4和AKT抑制剂阻断。（5）在体内,MIF促进GBM的EMT和生长。裸鼠皮下成瘤实验结果发现,MIF处理组皮下肿瘤体积明显高于PBS组、MIF+AMD3100组和MIF+ LY294002组,并且ISO-1组肿瘤体积小于PBS组。裸鼠皮下肿瘤免疫组化结果显示,MIF组肿瘤细胞有显着的EMT表现（E-cadherin降低,N-cadherin升高）,而其它组无明显影响。4.结论（1）胶质瘤组织中存在抗内皮细胞血管新生治疗的补偿途径VM。（2）在胶质瘤组织中,HIF1α分别与MIF和CXCR4的表达水平呈正相关关系。（3）在胶质瘤组织中,HIFIα、MIF、CXCR4和VM四者存在共定位的密切联系。（4）低氧能够分别增强GBM细胞MIF和CXCR4的表达水平,并且促进GBM细胞EMT和VM的形成。（5）MIF在低氧诱导的GBM细胞EMT和VM形成中起到关键性的调节作用。（6）低氧下MIF和CXCR4表达水平的共同升高激活了 GBM细胞CXCR4下游AKT通路,促进了 EMT的发生,进而增强了 VM形成的能力。（7）MIF通过CXCR4-AKT-EMT通路促进了 GBM细胞体内的恶性生物学进展。
彭仁君[7]（2014）在《RACK1在胶质瘤中的表达及其功能的实验研究》文中指出背景：脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤。手术彻底切除困难,且其生长迅速,术后易复发,复发间隔时间短,预后差。高级别胶质瘤平均生存期仍然在一年左右。胶质瘤生物遗传学及分子生物学的研究进展,揭示了胶质瘤的发生发展同样是一个复杂的生物学过程,涉及到许多相关基因的异常表达。因此积极地探索胶质瘤的发生发展的分子生物学机制对指导临床治疗具有重要的意义。已有研究证实了RACK1基因在细胞的生长、分化、恶变、转移、侵袭等方面发挥了关键的调节作用,但该基因如何调控并作用于神经上皮组织,与胶质瘤发生,发展的关系究竟如何,以及与胶质瘤生物学行为的相关性等问题,目前国内外尚未见系统的研究和报道。我们推测RACK1基因可能参与了胶质瘤的发生发展过程并发挥了重要的调节作用,RACK1基因可能具有成为胶质瘤靶向治疗新靶点的应用前景,可能给临床基因诊断及预后评价提供参考。目的：探讨RACK1基因在人脑胶质瘤组织中的表达情况及与病理分级关系。通过瞬时和稳定RNA干扰技术在人胶质瘤细胞株中下调RACK1的表达,探讨RACK1对胶质瘤细胞生长、增殖、迁移、凋亡等多种生物学特性的影响,并初步分析其发挥作用的分子生物学机制,结合临床病理初步评价其临床应用前景。方法：对收集的45例各级别临床胶质瘤及10例正常脑组织标本以及U87-MG, CHG-5细胞株进行Real-Time PCR和Western-Blot分别检测RACK1mRNA和蛋白的表达水平,证实了RACK1在人脑胶质瘤中的异常高表达,然后用siRNA瞬时干扰U87-MG, CHG-5细胞株中RACK1的基因,观察RACK1基因干扰前后胶质瘤细胞株生物学特性（增殖,侵袭,凋亡等）的改变,再通过慢病毒为载体稳定转染U87-MG细胞株后,RACK1表达下调后进行裸鼠成瘤试验,于体内进一步证实RACK1对胶质瘤增殖的调控作用,最后初步探讨其调控胶质瘤的发生发展的机制,并结合临床病理资料,来评价RACK1用于人脑胶质瘤中基因诊断及治疗的潜在价值。结果：结果显示低级别胶质RACK1表达较正常脑组织增高有统计学差异（P<0.05）,高级别胶质瘤和正常脑组织统计学差异更为显着（P<0.01）,低级别与高级别胶质瘤之间亦有统计学差异（P<0.05）RACK1的表达增高和胶质瘤病理级别正相关。U87-MG和CHG-5细胞株中RACK1的表达也较正常明显升高。RACK1经RNAi后,细胞的抗凋亡及迁移侵袭能力形成明显受到抑制（P<0.01）,并降低了细胞株的增殖率（P<0.05）,裸鼠成瘤试验中,经慢病毒介导的shRNA干扰后,U87-MG细胞株成瘤与对照组同时期内瘤体相比明显减小,成瘤速度也明显减慢,结果有统计学差异（P<0.01）。RACK1经siRNA干扰后,无论U87-MG还是CHG-5其Bcl-2的表达均明显下降,Bax的表达显着升高（P<0.01）, Bcl-2/Bax比值也明显下降,siRNA下调了RACK1的表达后检测Src/Akt磷酸化,两者在两组细胞株中均显着的表达下调（P<0.01和P<0.05）。同时证实RACK1可能与胶质瘤的大小,血运,累及部位有一定的相关性（P<0.05）结论：1. RACK1在胶质瘤中高表达；2. RACK1在体外及体内试验中均能正向调控胶质瘤的增殖,侵袭及抗凋亡；3. RACK1可能通过Bcl-2/Bax, Src/Akt相关的信号传导通路发挥作用。
朱玉德[8]（2013）在《胶质瘤干细胞的生物学特性及其与胶质瘤血管发生的关系》文中认为一、研究背景与目的虽然大家都知道，血管发生（angiogenesis）的过程对于胶质瘤的生长、恶性浸润等特性来讲是一个关键性事件，但如何发生的，研究者苦苦地探索了数十年，至今仍有争论，特别是随着本世纪初才发现的肿瘤干细胞以及与之相关的肿瘤干细胞微环境（Niche）研究的深入，对肿瘤血管的生成有了新的认识，目前有如下三种观点：A.肿瘤细胞诱导宿主血管内皮细胞增生,出芽,迁移后形成；B.先由肿瘤细胞随机排列组成,而后刺激宿主内皮细胞加入；C.依托肿瘤干细胞巢（Niche,微环境）转分化形成。详见英文摘要中的图1。本研究主要在自建的胶质瘤干/祖细胞（Glioma Stem/Progenitor Cells，GSPCs）基础上探索其与肿瘤血管生成的关系，即是否存在图1中的C模式。二、实验方法1建立GSPCs体外生长模型：用新鲜的恶性胶质瘤临床标本消化成单细胞悬液，在无血清（含生长因子）条件下于CO2箱中培养，再从呈悬浮生长的肿瘤球中用CD133免疫磁珠分离阳性细胞，单克隆后一部分液氮冻存;另一部分在含血清（不含生长因子）条件下培养，作干祖细胞和分化细胞相关标志蛋白的流式细胞及细胞化学检测，最后用GSPCs球吹打成单个细胞进行裸小鼠脑尾状核移植，观察致瘤情况。2建立RFP/GFP可移植性肿瘤模型与检测血管:用经病毒载体转染红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）基因的GSPCs，接种于本室培育的表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因的NC裸小鼠脑内（10μl，1×106细胞），或皮下（200μl，1×106细胞），2～3周出现症状或恶病质时处死，取移植瘤组织压成簿片后在荧光显微镜下观察、或用冰冻切片在荧光激光扫描共聚焦显微镜下观察肿瘤血管.三、结果与分析1GSPCs的特征:克隆到的CD133+细胞，在含生长因子条件下培养的肿瘤球中CD133+细胞只占少数，多数细胞是Nestin+细胞，免疫细胞化学染色后在共聚焦显微镜下还见到即使是CD133+细胞，也同时表达Nestin，据此我们用于实验的细胞都称为胶质瘤干/祖细胞（Glioma Stem/Progenitor Cells，GSPCs），与神经干细胞（neuralstem cell，NSCs）比，最大的不同点是在含血清条件下培养，NSCs可分化成终末细胞，GSPCs不但到不了终末分化状态，而且还可以逆向分化成前体细胞.GSPCs接种GFP裸小鼠体内，无论是脑内还是皮下，都能100％致瘤，而且呈高侵袭性生长。2RFP/GFP模型特征:GSPCs-RFP细胞与GSPCs细胞一样，无论接种在脑内还是皮下，也都能100％致瘤，而且呈高侵袭性生长.因为接种的肿瘤细胞与宿主细胞分别表达RFP和GFP，根据显示的红色和绿色加以区别。在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下，能清晰显示肿瘤细胞在对宿主组织重构过程中所发生的细胞和蛋白质分子事件是谁起的作用.3被荧光示踪的肿瘤血管和宿主血管:在肿瘤组织中，见到了参与组成肿瘤血管壁的细胞或血管壁，有红、绿和黄三种颜色，红、绿分别代表来自接种肿瘤细胞的子代细胞和宿主组织来源的细胞;黄色的则是红、绿两种细胞相互融合的细胞。在肿瘤组织压片，所取的组织最终压成的厚度大约在20μm，比通常5μm的病理切片要厚，因此容易看到整条的长血管，减少了病理切片取材上的局限性。在冰冻切片共聚焦显镜下见到了包括平滑肌细胞，内皮细胞等组成肿瘤血管壁的细胞共表达RFP/GFP。四、结论与创新点1作为以分化走向时段界定的CD133+胶质瘤干细胞，只是指处于静止期的细胞，一旦启动了分化程序，则变为Nestin+的祖细胞，即使是CD133+细胞也因同时表达Nestin而被称之为胶质瘤干/祖细胞（GSPCs）。在与神经干细胞作为对照的实验中，首次证明了只有GSPCs具备逆向分化潜能和到不了终末分化阶段。2RFP/GFP双色荧光示踪的可移植性胶质瘤模型，因其能清晰显示肿瘤组织中的肿瘤细胞与宿主细胞之间的解剖位置、组织结构关系，在研究肿瘤组织重构，特别是细胞融合方面，揭示了传统的肿瘤模型无法显示二者的新关系。在国内，这一实验平台是我们课题组首先建立。3课题组用RFP/GFP双色荧光示踪模型，己经在国际上首先报告了GSPCs通过细胞融合和肿瘤血管拟态两方面在肿瘤组织重构中发挥了重要作用。本文则在上述基础上，在国内首先使用组织压片法展示了在传统组织切片上很少能见到的长条血管壁细胞，有单纯来源于肿瘤细胞，单纯来源于宿主细胞和既来源于肿瘤又来源于宿主的三种类型血管。第三种类型的血管不仅表现在RFP/GFP细胞水平上的镶嵌关系,而且还表现在蛋白质表达水平上的融合关系,这对进一步研究肿瘤血管的发生和转化机制有重要意义.
邵国强[9]（2012）在《99mTC-3P-RGD2显像定量评价肿瘤整合素αvβ3表达及其应用的实验研究》文中研究表明目的：探讨99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c（RGDfk）]2(简称99mTc-3P-RGD2)整合素αvβ3受体靶向U-SPECT-II/CT显像定量肿瘤整合素αvβ3受体表达水平及早期探测肿瘤复发转移灶进行准确的分期、分级，为新生血管治疗适应症的筛选、个体化治疗疗效早期预测、实时监测提供科学依据。方法：本课题首先利用U-SPECT-II/CT考察了U-SPECT-CT融合显像对肿瘤体积（存活、坏死）及99mTc放射性活度精确定量的方法学，然后合成99mTc-3P-RGD2，并以整合素αvβ3受体靶向的99mTc-3P-RGD2在荷瘤鼠内生物学分布及免疫组化对肿瘤整合素αvβ3表达水平的定量数据为基础，构建裸鼠皮下移植瘤、肿瘤复发、肺及骨骼转移模型，探讨99mTc-3P-RGD2肿瘤U-SPECT-II/CT显像定量肿瘤整合素αvβ3受体表达水平的可行性及对肿瘤复发、转移灶的早期探测，最后对整合素αvβ3高表达和低表达的肿瘤在抗新生血管治疗前及治疗过程中进行U-SPECT-CT显像,考察其对肿瘤抗血管疗效的治疗前预测和治疗过程中实时监测价值。结果：基于U-SPECT-II/CT的U-SPECT-CT融合显像，结合microCT和microSPECT信息进行肿瘤感兴趣区勾画精确定量肿瘤体积（包括存活和坏死组织的单独体积测定），且U-SPECT-CT融合显像可有效定量99mTc放射性活度（R2=0.9997，y=1.0885x+0.0618），偏倚性小。99mTc-3P-RGD2前体可制备试剂盒，标记简单、方便，且荷瘤鼠体内理化特性好，肿瘤放射性摄取高且能稳定滞留一定时间，血、肝、肾等清除快。99mTc-3P-RGD2尾静脉注射通过生物学分布实验和U-SPECT-CT显像分别定量肿瘤放射性摄取（%ID和%ID/g），与肿瘤体积变化趋势相似，其中脑胶质瘤内99mTc-3P-RGD2放射性摄取（%ID）逐渐增加，通过二次方程曲线拟合（R2均大于0.95），而在肿瘤重量小于1.0g时，肿瘤放射性摄取（%ID）与肿瘤大小（g）呈直线相关（R2分别为0.8963和0.8929）。而肿瘤%ID/g随着肿瘤大小的增加而增加，在0.15-0.25g时达到峰值，随后由于肿瘤组织坏死逐渐降低，与免疫组化所示整合素αVβ3表达水平呈线性相关（R2=0.8117），即99mTc-3P-RGD2在脑胶质瘤内分布可有效反应肿瘤整合素αVβ3表达水平。整合素αvβ3作为乳腺癌细胞等肿瘤细胞及其新生血管内皮细胞表面高表达的粘附因子，可早期（长径为1.0mm）发现乳腺癌术后复发灶和肺、淋巴结、骨骼等多发转移灶，有效评价乳腺癌等恶性肿瘤的分期、分级，尤其是肺癌等微小转移灶（大于1mm）方面具有显着优势。99mTc-3P-RGD2U-SPECT-CT显像通过定量肿瘤99mTc-3P-RGD2摄取、整合素受体表达水平、密度，抗新生血管治疗疗效监测明显早于肿瘤体积的变化，治疗后第5天即表现出99mTc-3P-RGD2放射性摄取差异（P<0.05），是抗新生血管治疗方案病人治疗前适应症筛选、疗效预测及早期评价的显像手段。结论：U-SPECT-II/CT通过U-SPECT-CT融合显像可对肿瘤体积及99mTc放射性活度进行精确定量，99mTc-3P-RGD2U-SPECT-CT显像可有效评价肿瘤整合素αvβ3受体表达水平，且通过对肿瘤复发、转移灶及时早期的探测和诊断，为肿瘤分期、分级及抗新生血管治疗适应症的筛选、个体化治疗剂量的确定、疗效早期预测、实时评价提供科学依据。
刘保良[10]（2009）在《血管抑素研究进展》文中进行了进一步梳理
二、血管抑素抑制人脑胶质瘤生长及病理学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血管抑素抑制人脑胶质瘤生长及病理学研究（论文提纲范文）
（1）COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺良恶性肿瘤的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料与分组 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验方法 |
| 1.2.2 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 免疫组化染色结果 |
| 1.3.2 HE染色结果 |
| 1.3.3 在三种组织中COX-2、PD-L1和ANXA2 的表达情况及其差异性 |
| 1.3.4 在腮腺恶性肿瘤中,COX-2、PD-L1和ANXA2 的表达情况与临床因素间的关系 |
| 1.3.5 C0X-2、PD-L1和ANXA2 在恶性腮腺肿瘤中表达的相关性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 分子水平的诊断对颌面外科肿瘤诊治的意义 |
| 1.4.2 COX-2在腮腺恶性肿瘤中差异性表达的意义 |
| 1.4.3 PD-L1在恶性腮腺肿瘤中表达差异性的意义 |
| 1.4.4 ANXA2在腮腺恶性肿瘤的差异性表达及其意义 |
| 1.4.5 COX-2、PD-L1和ANXA2 在恶性腮腺肿瘤中表达水平的关系 |
| 1.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 Annexin A2对癌症的作用及机制 |
| 2.1 Annexin家族 |
| 2.1.1 Annexin家族概述 |
| 2.1.2 Annexins的演变 |
| 2.1.3 Annexins的分子结构 |
| 2.1.4 Annexins的生化特性 |
| 2.2ANXA2 |
| 2.2.1 ANXA2概述 |
| 2.2.2 ANXA2基本结构 |
| 2.2.3 ANXA2的生理功能 |
| 2.2.4 ANXA2与其他蛋白的相互作用 |
| 2.2.5 ANXA2表达与癌症的关系 |
| 2.2.6 ANXA2在肿瘤细胞学行为中的表现和影响 |
| 2.2.7 对ANXA2表达调控的研究进展 |
| 2.3 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（2）IKBKE通过磷酸化Amotl2促进YAP1的表达调控脑胶质瘤恶性进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、胶质母细胞瘤中 IKBKE 的体外作用研究 |
| 1.1 对象和材料 |
| 1.1.1 实验数据库 |
| 1.1.2 实验临床标本 |
| 1.1.3 实验细胞系 |
| 1.1.4 实验材料 |
| 1.1.4.1 实验试剂 |
| 1.1.4.2 实验仪器 |
| 1.1.4.3 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 慢病毒转染细胞 |
| 1.2.3 细胞蛋白质提取 |
| 1.2.4 测定蛋白浓度 |
| 1.2.5 免疫蛋白印迹(Western blot)实验 |
| 1.2.6 细胞RNA提取及浓度测定 |
| 1.2.7 RNA反转录及q RT-PCR操作 |
| 1.2.8 细胞增殖CCK-8实验 |
| 1.2.9 细胞平板克隆实验 |
| 1.2.10 细胞EdU增殖实验 |
| 1.2.11 免疫组化实验 |
| 1.2.12 所用统计学方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 IKBKE m RNA表达量与胶质瘤病理级别呈正相关,与患者预后呈负相关 |
| 1.3.2 敲低IKBKE基因能够抑制胶质母细胞瘤细胞增殖能力 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 二、IKBKE 调控 Amotl2 表达的机制研究 |
| 2.1 对象和材料 |
| 2.1.1 实验细胞系 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.2.1 实验试剂 |
| 2.1.2.2 实验仪器 |
| 2.1.2.3 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞siRNA转染 |
| 2.2.2 质粒提取及浓度测定 |
| 2.2.3 细胞质粒转染 |
| 2.2.4 免疫荧光实验 |
| 2.2.5 免疫共沉淀实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 IKBKE 磷酸化 Amotl2 的丝氨酸 166 位点 |
| 2.3.2 IKBKE抑制Amotl2 蛋白的表达 |
| 2.3.3 IKBKE促进Amotl2 蛋白发生泛素化降解 |
| 2.3.4 IKBKE能够通过Amotl2 调控YAP1 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 三、IKBKE 调控胶质瘤恶性进展的体内机制研究 |
| 3.1 对象和材料 |
| 3.1.1 实验细胞系 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 实验器械及仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞重组慢病毒转染 |
| 3.2.2 建立裸鼠颅内肿瘤模型 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 沉默IKBKE基因可以抑制裸鼠颅内肿瘤的生长 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 PD-1/PD-L1靶向免疫抑制剂在治疗胶质母细胞瘤的挑战和潜力 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）miRNA-411-5p对胶质瘤微血管内皮细胞迁移和管形成的影响及作用机制初探（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）异甘草素对缺氧环境下SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 实验一 缺氧对SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用细胞株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂制备 |
| 1.5 SHG44 胶质瘤细胞培养技术 |
| 1.6 三维培养观察血管生成拟态 |
| 1.7 CCK-8检测细胞增殖 |
| 1.8 划痕实验检测细胞迁移 |
| 1.9 Western blotting技术检测EphA2、MMP-2、VEGF蛋白表达水平 |
| 1.10 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺氧(不同氯化钴浓度)对SHG44 胶质瘤细胞血管生成拟态的影响 |
| 2.2 缺氧(不同氯化钴浓度)对SHG44 胶质瘤细胞增殖的影响 |
| 2.3 缺氧(不同氯化钴浓度)对SHG44 胶质瘤细胞迁移的影响 |
| 2.4 缺氧(不同氯化钴浓度)对SHG44 胶质瘤细胞EphA2、MMP-2、VEGF蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 实验二 异甘草素对缺氧环境下SHG44 胶质瘤细胞血管生成拟态的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用细胞株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂制备 |
| 1.5 SHG44胶质瘤细胞培养技术 |
| 1.6 三维培养检测不同浓度异甘草素对缺氧环境下胶质瘤血管生成拟态的影响 |
| 1.7 CCK-8法检测不同浓度异甘草素对缺氧环境下胶质瘤细胞增殖的影响 |
| 1.8 细胞划痕法检测不同浓度异甘草素对缺氧环境下胶质瘤迁移的影响 |
| 1.9 Western blotting技术检测异甘草素对EphA2、MMP-2、VEGF蛋白的影响 |
| 1.10 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 异甘草素对缺氧环境下胶质瘤细胞血管生成拟态的影响 |
| 2.2 异甘草素对缺氧环境下胶质瘤细胞增殖影响 |
| 2.3 异甘草素对缺氧环境下胶质瘤细胞迁移影响 |
| 2.4 异甘草素对缺氧环境下VM相关蛋白表达的影响 |
| 3.讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述一 血管生成拟态在胶质瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 异甘草素抗胶质瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间主要成果 |
（5）脑胶质瘤血管生成研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 胶质瘤的血管发生方式 |
| 1.1 血管新生 |
| 1.2 血管形成 |
| 1.3 血管生成拟态 |
| 2 促胶质瘤血管生成因子 |
| 3 抑制性血管因子 |
| 4 胶质瘤干细胞在血管生成中的作用 |
| 5 胶质瘤抗血管生成治疗 |
| 6 前景及展望 |
（6）低氧下miR224-3p和MIF在人脑胶质母细胞瘤中作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: MiR224-3p对低氧下胶质母细胞瘤自噬水平的影响及其作用机制的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: MIF在低氧诱导胶质母细胞瘤EMT和血管拟态生成中的作用及其机制的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
| 附件 |
（7）RACK1在胶质瘤中的表达及其功能的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 研究背景 |
| 2 总体思路 |
| 第一章 RACK1 mRNA及蛋白的表达检测 |
| 研究对象 |
| 1 标本来源 |
| 2 细胞株 |
| 试验仪器,耗材与试剂 |
| 1 主要试验仪器及耗材 |
| 2 主要实验试剂 |
| 试验方法 |
| 1 HE染色确定病理性质及病理分级 |
| 2 胶质瘤细胞株的培养及处理 |
| 3 实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)检测组织标本及细胞株中RACK1mRNA |
| 4 Western Blot(蛋白质免疫印迹)检测RACK1蛋白 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 RACK1 siRNA瞬时干扰U87-MG及CHG-5细胞系后对其生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 实验对象 |
| 试验仪器,耗材与试剂 |
| 1 试验仪器和耗材 |
| 2 主要试剂 |
| 试验方法 |
| 1 siRNA靶向干扰RACK1的表达 |
| 2 Real-Time PCR检测siRNA干扰后U87-MG和CHG-5细胞株RACK1mRNA的表达 |
| 3 Western-Blot检测干扰siRNA后U87-MG和CHG-5细胞株RACK1蛋白的表达 |
| 4 MTT检测细胞的增殖 |
| 5 Transwell法检测细胞的侵袭能力 |
| 6 凋亡检测 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三章 体内试验重组慢病毒载体稳定转染U87-MG细胞株干扰RACK1基因及裸鼠成瘤模型的建立 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 主要试验仪器 |
| 2 主要实验试剂 |
| 3 实验对象 |
| 试验方法 |
| 1 酶切pLV克隆载体 |
| 2 连接和转化 |
| 3 阳性克隆的鉴定 |
| 4 用质粒大量抽提试剂盒制备不含内毒素用于转染的质粒DNA |
| 5 病毒收集及浓缩 |
| 6 转染U87-MG |
| 7 裸鼠成瘤实验 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 RACK1正向调控胶质瘤细胞的分子机制的初步研究及临床应用分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验方法 |
| 1 细胞处理 |
| 2 检测方法 |
| 3 统计学分析处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新性及意义 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）胶质瘤干细胞的生物学特性及其与胶质瘤血管发生的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胶质瘤干/祖细胞体外培养及其分化的生物学特性 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 红绿双色荧光示踪人脑胶质瘤干/祖细胞移植瘤(SU3‐RFP/NC‐EGFP)模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 利用 SU3‐RFP/NC‐EGFP 移植瘤模型探讨胶质瘤血管形成的新机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）99mTC-3P-RGD2显像定量评价肿瘤整合素αvβ3表达及其应用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ~(99m)Tc-3P-RGD_2的制备及其荷脑胶质瘤裸鼠体内生物学分布研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 U-SPECT-CT 显像定量肿瘤体积和~(99m)Tc 放射性活度的方法学研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 ~(99m)Tc-3P-RGD_2整合素 v 3靶向 U-SPECT-CT 显像定量监测脑胶质瘤生长和坏死的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 ~(99m)Tc-3P-RGD_2整合素αvβ3 受体靶向 U-SPECT-CT 显像早期诊断乳腺癌复发和肺、骨骼转移的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 ~(99m)Tc-3P-RGD_2整合素αvβ3 受体靶向 U-SPECT-CT 显像监测整合素αvβ3 受体高丰度表达肿瘤抗血管治疗疗效的初步研究 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
四、血管抑素抑制人脑胶质瘤生长及病理学研究（论文参考文献）
- [1]COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺良恶性肿瘤的表达[D]. 常渊. 华北理工大学, 2020(02)
- [2]IKBKE通过磷酸化Amotl2促进YAP1的表达调控脑胶质瘤恶性进展的机制研究[D]. 郭高超. 天津医科大学, 2020(06)
- [3]miRNA-411-5p对胶质瘤微血管内皮细胞迁移和管形成的影响及作用机制初探[D]. 卞静. 沈阳医学院, 2020(01)
- [4]异甘草素对缺氧环境下SHG44胶质瘤细胞血管生成拟态的影响[D]. 罗斌华. 甘肃中医药大学, 2019(03)
- [5]脑胶质瘤血管生成研究进展[J]. 王非一凡,王苟思义,曹航,李学军. 转化医学电子杂志, 2018(07)
- [6]低氧下miR224-3p和MIF在人脑胶质母细胞瘤中作用及其机制的研究[D]. 郭兴. 山东大学, 2017(08)
- [7]RACK1在胶质瘤中的表达及其功能的实验研究[D]. 彭仁君. 中南大学, 2014(02)
- [8]胶质瘤干细胞的生物学特性及其与胶质瘤血管发生的关系[D]. 朱玉德. 苏州大学, 2013(09)
- [9]99mTC-3P-RGD2显像定量评价肿瘤整合素αvβ3表达及其应用的实验研究[D]. 邵国强. 南京医科大学, 2012(01)
- [10]血管抑素研究进展[J]. 刘保良. 临床合理用药杂志, 2009(24)