一、软骨源性生长因子研究进展（论文文献综述）
李凯明[1]（2021）在《补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床研究及对人髓核细胞活性与功能的影响》文中认为椎间盘源性腰痛（Discogenic lowback pain,DLBP）作为一种临床常见的腰椎间盘退行性疾病,多由椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IDD）引起,以“腰痛”为主要临床症状,一般无神经组织受压表现。近年来,随着科学技术的进步,尤其是磁共振影像技术的广泛应用,人们对DLBP的诊断和治疗方面取得了巨大进展。目前临床治疗DLBP主要包括西药、手术等疗法。尽管具体治疗方式多种多样,短期内疗效显着,但缺乏显着特异性,且主要停留在对症治疗层面,未对产生症状的病变椎间盘本身进行干预,复发率较高。中医学认为DLBP属于“腰痛”的范畴,且在治疗此类慢性脊柱骨伤科疾病方面积累了丰富的临床经验。课题组前期通过小样本的临床观察发现,将古方青娥丸化裁而来的补肾活血方应用到DLBP的治疗,能够减轻患者的疼痛,改善腰椎活动功能,提高患者的生存质量。但是,目前我们仍缺乏高等级的循证学临床研究,且评价指标仅限于主观指标,也未进行药物安全性评定;同时该方治疗DLBP的具体调控机制仍缺乏基础研究进一步阐释。因此,本项目在课题组前期研究的基础上,首先应用平行、双盲、随机、安慰剂对照的试验设计,进一步采用公认主观评分结合客观评价的方法,以期更加全面的评定补肾活血方治疗DLBP的临床疗效及安全性。然后采用HE染色、Masson染色、免疫组织化学分析等以观察药物对兔退变椎间盘组织结构形态及MMP-3、VEGF等相关蛋白表达的影响。最后采用MTT、免疫荧光技术、蛋白质印迹法、β-半乳糖苷酶染色等技术观察药物对IL-1β或H2O2诱导的人髓核细胞外基质内相关蛋白表达水平的影响。旨在从分子细胞水平探究补肾活血方调控椎间盘髓核细胞活性与功能延缓或抑制IDD进程的作用机制,也为下一步补肾活血中药延缓IDD的机理研究提供新思路。研究一补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床疗效及安全性目的:评价补肾活血方治疗DLBP的临床疗效及安全性,为进一步临床应用推广提供高等级的循证医学依据。方法:本研究严格按照纳入、排除标准,共纳入来自于我院脊柱骨科、骨伤综合科门诊的DLBP患者70例。应用平行、双盲、随机、安慰剂对照的试验设计方法,其中治疗组35例,对照组35例,以腰椎牵引为基础疗法,治疗组服用补肾活血方颗粒剂,对照组服用补肾活血方安慰剂,总疗程为3周,随访期3个月。分别于入组时,治疗后7、14、21天,及疗程结束后1个月与3个月随访,共六个时间点对比观察两组患者的VAS评分、ODI评分,与肌肉软组织张力位移、腰部压痛阈值、腰椎活动度,以及实验室检查、不良反应等指标,并记录分析相关临床试验数据。结果:两组患者在性别（P=0.208）、年龄（P=0.363）、病变节段（P=0.771）、病程（P=0.781）等方面的差异无统计学意义（P>0.05）,一般资料具有可比性。相关结局评价指标比较结果如下:（1）VAS评分方面:①与治疗前比较,两组患者在治疗后至随访时均有统计学意义（P<0.05）;②与治疗前及治疗1周时比较,治疗组在治疗2周后及随访时差异均有统计学意义（P<0.05）;③两组间比较治疗2周后至随访时治疗组较对照组均有显着差异（P<0.05）。（2）ODI评分方面:①对照组患者治疗3周后至随访时较治疗前差异有统计学意义（P<0.05）,随访1月时较治疗1周后也有明显差异（P<0.05）,随访3月时较治疗1周后与2周后有显着差异（P<0.05）;②治疗组患者治疗1周后较治疗前就有差异（P<0.05）,治疗2周至随访时与治疗前及治疗1周时相比,时间效应均有统计学意义（P<0.05）;③两组间比较治疗2周后至随访1月时治疗组较对照组均有显着差异（P<0.05）。（3）软组织张力位移方面:①较治疗前相比,治疗3周后两组患者的张力位移均显着增加（P<0.05）;②两组间比较治疗组较对照组位移增加显着（P<0.05）。（4）腰部压痛阈值方面:①治疗3周后,两组患者的腰部压痛阈值较治疗前均显着增加（P<0.05）;②两组间比较治疗组较对照组阈值增加显着（P<0.05）。（5）腰椎活动度方面:①对照组患者治疗3周后与治疗前相比,腰椎左侧屈度数显着增加（P<0.05）;②治疗组患者治疗3周后前屈、后伸、左侧屈、右侧屈角度较治疗前均显着增加（P<0.05）。（6）临床治疗效果方面:经补肾活血方治疗1,2,3周后总有效率分别为47.06%,61.76%,70.59%,表现出优于对照组的趋势。（7）安全性评价方面:①两组患者在治疗期间一般生命体征均未出现异常;②均未发现与药物有关的不良反应;③实验室及心电图等检查未见异常。结论:补肾活血方对椎间盘源性腰痛患者具有较好的临床疗效,能够显着减轻疼痛程度、改善功能障碍,且安全性较高。研究二补肾活血方对兔退变椎间盘模型的影响目的:应用补肾活血方对实验兔椎间盘退变模型进行干预,观察补肾活血方对IDD进程的影响。方法:40只健康兔随机分为5组,每组8只,分别为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,连续给药8周。采用HE染色、Masson染色等以观察药物对椎间盘组织形态结构的影响;采用免疫组织化学分析药物对MMP-3、VEGF等蛋白表达水平的影响。并记录分析相关动物实验数据。结果:（1）HE染色:正常椎间盘组织可见大量NPCs,ECM的排列均匀。造模后纤维环疏松、紊乱,部分出现断裂,细胞数量减少,指纹样改变突出,裂隙增多。药物干预后,中、高剂量组NPCs数量较低剂量组增多,ECM排列较低剂量组及模型组也更加规则,纤维环断裂减少,其中中剂量组的髓核组织形态更接近对照组。（2）Masson染色:正常椎间盘纤维环结构完整,胶原排列有序,呈现蓝色,NPCs呈现深红色或褐色,细胞质呈现红色,髓核组织与纤维环分界清晰。造模后,纤维环内层出现裂隙,NPCs排列紊乱,细胞变性、凋亡,髓核与纤维环边界模糊,髓核组织逐渐纤维化。中药干预后,胶原纤维含量显着增多,髓核及纤维环之间裂隙减少,且中、高剂量组组织形态明显优于低剂量组。（3）免疫组织化学分析:模型组MMP-3、VEGF蛋白阳性染色率较对照组均明显增加（P<0.05）,而中、高剂量组MMP-3、VEGF的表达较模型组均显着下调（P<0.05）。结论:补肾活血方可下调兔退变椎间盘组织中的MMP-3、VEGF表达水平,其中中剂量组的效应最显着,提示可能在IDD的过程中发挥了作用。研究三补肾活血方对人髓核细胞活性和细胞外基质的影响目的:观察补肾活血方对IL-1β和H2O2诱导的人NPCs活性、功能和ECM分解、代谢的影响。方法:通过培养人原代髓核细胞系,取传代后NPCs备用;按一定比例制备补肾活血方（BSHXF）提取液,向NPCs中加入不同浓度的BSHXF,分别于干预后24 h、48 h对细胞活性进行MTT检测;将研究共分五组,组别及干预方案分别为:①Control 组;②IL-1β组;③H2O2组;④IL-1β+BSHXF 组;⑤H2O2+BSHXF组;分别采用MTT法检测NPCs增殖情况;细胞免疫荧光技术检测Ⅱ型胶原表达情况;WB法检测Collagen Ⅱ、Aggrecan、MMP-3及ADAMTS-5等蛋白表达水平;SA-β-gal染色检测NPCs衰老情况;并记录分析相关细胞实验数据。结果:（1）BSHXF适宜浓度检测:①所有浓度的BSHXF对NPCs均无毒副作用,且5、10、50、100或200μg/ml处理48h后可显着提高NPCs的增殖率（P<0.05）。其中100μg/ml处理48h后促细胞活性和增殖作用最显着（P<0.01）。（2）MTT法检测细胞增殖情况:①24h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降（P<0.01）;②48h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降（P<0.01）;与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.05）;与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.05）;③72h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降（P<0.01）;与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.01）;与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.01）。（3）Ⅱ型胶原免疫荧光检测:①与Contrl组相比,其余四组细胞中Ⅱ型胶原表达显着下调;②与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组Ⅱ型胶原表达明显上调;③与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组Ⅱ型胶原表达明显上调。（4）WB检测:CollagenⅡ、Aggrecan蛋白检测结果显示:①与Control组相比:其余四组蛋白表达量显着下调（P<0.01）;②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显上调（P<0.01）;③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显上调（P<0.01）。MMP-3蛋白检测结果显示:①与Control组相比:其余四组蛋白表达量显着上调（P<0.01）;②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）;③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）。ADAMTS-5蛋白检测结果显示:①与Control组相比:IL-1β组,H2O2组蛋白表达量显着上调（P<0.01）,而IL-1β+BSHXF组,H2O2+BSHXF组蛋白表达量明显下调（P<0.01）;②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）;③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）。（5）细胞衰老情况:①与Contrl组相比,其余四组细胞衰老数量明显增多（P<0.01）;②与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞衰老数量明显减少（P<0.05）;③与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞衰老数量明显减少（P<0.01）。结论:（1）不同浓度的补肾活血方均可提高人NPCs活性,促进细胞增殖,100μg/ml浓度是一个较为适宜的实验浓度,可为后续细胞实验提供参照;（2）补肾活血方可以改善人NPCs活性与功能,在一定程度上延缓IL-1β或H2O2刺激诱导的人NPCs衰老或凋亡,为中医药防治IDD提供一种新的思路。
王宝剑[2]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中指出黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
富昱[3]（2021）在《基于Wnt通路探讨经筋针刺调控KOA大鼠股四头肌再生修复的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本实验以膝关节制动法制备KOA动物模型,观察针刺结筋病灶点对膝骨性关节炎（Knee osteoarthritis,KOA）大鼠股四头肌结构功能以及与股四头肌再生修复相关的生肌分子标志物的影响,进而探索再生修复相关通路（Wnt/β-catenin）介导的针刺结筋病灶点促进KOA大鼠股四头肌再生修复的作用机制,为临床应用经筋疗法治疗膝骨性关节炎提供实验依据。材料与方法:将44只SPF级雄性SD大鼠（6周龄、体重180-220g）随机分为正常对照组（简称:正常组）、KOA模型组（简称:模型组）、针刺结筋病灶点组（简称:病灶点组）、针刺经穴组（简称:经穴组）,每组11只（1只用于检验模型是否成立,10只用于指标检测）。模型组、病灶点组、经穴组采用膝关节制动造模方法制备KOA模型。造模完成后,将正常组和模型组两组大鼠每日用固定器固定20min,连续进行14天;将病灶点组大鼠每日固定于固定器,类比《中国经筋学》中膝周结筋病灶点定位,视循膝关节经筋触诊结果,在大鼠右后肢股前侧的股直肌肌腱抵止处,腹股沟部的股直肌肌腱抵止处,以及臀后侧半腱肌和股二头肌长头之间当坐骨结节处软组织的拘挛、结节处标记结筋病灶点,并且对以上3个结筋病灶点进行针刺干预,一次20min,连续干预14天;将经穴组大鼠每日固定于固定器,针刺右后肢犊鼻穴、足三里穴、阳陵泉穴,一次20min,连续干预14天。在形态学方面,测量各组大鼠右后肢的大腿围度、股四头肌质量,采用HE染色法观察各组大鼠右后肢股四头肌的形态结构;在行为学方面,测量各组大鼠右后肢膝关节被动活动度和改良Lequesne MG膝关节功能指数,采用步态分析技术测量各组大鼠爪印面积、最大接触面积、最大压强、摆动速度以及站立时间等步态参数;在分子生物学方面,采用免疫组织化学法观察各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1蛋白表达;采用RT-PCR法检测各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1mRNA表达;采用Western blot法检测各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达以及GSK3β、β-catenin蛋白磷酸化水平;采用RT-PCR法检测各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1 mRNA表达。实验相关数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差（（?）±s）表示,组间数据比较采用单因素方差分析法（one-way ANOVA）比较各组差异,以P<0.05表示具有统计学差异。结果:1.各组大鼠右后肢大腿围度变化:膝关节制动法制备KOA大鼠腿围显着降低（P<0.05）;针刺干预后,与模型组比较,病灶点组以及经穴组大鼠大腿围度显着升高（P<0.05）。2.各组大鼠右后肢股四头肌质量比较:与正常组比较,模型组绝对湿重显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组绝对湿重显着升高（P<0.05）,病灶点组显着高于经穴组（P<0.05）。与正常组比较,模型组肌湿重维持率显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组和经穴组肌湿重维持率显着升高（P<0.05）。与正常组比较,模型组股四头肌肌湿重体重比值显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组和经穴组肌湿重体重比值显着升高（P<0.05）。3.各组大鼠右后肢步态参数变化情况比较（1）爪印面积变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠爪印面积显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组爪印面积显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组爪印面积显着增加（P<0.05）。（2）最大接触面积变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠最大接触面积显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组最大接触面积显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组最大接触面积显着增加（P<0.05）。（3）最大压强变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠最大压强显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组最大压强显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组最大压强显着升高（P<0.05）,病灶点组升高程度显着高于经穴组（P<0.05）。（4）摆动速度变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠摆动速度显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组摆动速度显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组摆动速度显着升高（P<0.05）,病灶点组升高程度显着高于经穴组（P<0.05）。（5）站立时间变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠站立时间显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组站立时间显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组站立时间均显着升高（P<0.05）。4.各组大鼠右后肢膝关节被动活动度比较:膝关节制动法制备KOA大鼠膝关节被动活动度显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组膝关节被动活动度显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组膝关节被动活动度显着增加（P<0.05）,病灶点组增加幅度显着高于经穴组（P<0.05）。5.各组大鼠改良Lequesne MG膝关节功能指数比较:膝关节制动法制备KOA大鼠改良Lequesne MG指数显着升高（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组改良Lequesne MG指数显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组改良Lequesne MG指数显着降低（P<0.05）。6.各组大鼠右后肢股四头肌HE染色结果分析:正常组肌纤维结构完整,排列整齐;模型组肌纤维形态改变,结构破坏;病灶点组肌纤维结构较完整,可见再生的肌纤维;经穴组肌纤维结构有所恢复,但肌纤维之间间隙较大。7.各组大鼠右后肢股四头肌生肌分子标志物免疫组化结果:7.1形态学结果显示:各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1的免疫反应阳性染色结果均呈棕黄色,其中Pax7、MyoD和MyoG在各组大鼠股四头肌中的免疫阳性反应表达在肌纤维的细胞核上,MyHC1免疫阳性反应表达在肌纤维的胞浆中。7.2积分光密度值比较结果:（1）Pax7积分光密度值比较:与正常组比较,模型组积分光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组与经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度明显高于经穴组（P<0.05）。（2）MyoD积分光密度值比较:与正常组比较,模型组积分光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组与经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度明显高于经穴组（P<0.05）。（3）MyoG积分光密度值比较:与正常组比较,模型组积分光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组与经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）。（4）MyHC1积分光密度值比较:与正常组相比,模型组积分光密度值显着降低（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）。8.各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1 mRNA的表达情况:（1）Pax7 mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组表达显着升高（P<0.05）。（2）MyoD mRNA表达水平比较:与正常组比较,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度显着高于经穴组（P<0.05）。（3）MyoG mRNA表达水平比较:与正常组比较,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组以及经穴组表达均显着升高（P<0.05）。（4）MyHC1 mRNA表达水平比较:与正常组比较,模型组表达显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组表达显着升高（P<0.05）。9.各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1 mRNA表达水平:（1）Wnt mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。（2）GSK3βmRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着降低（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着降低（P<0.05）,病灶点组下降幅度更加显着（P<0.05）。（3）β-catenin mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。（4）Cyclin D1 mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。10.各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对含量以及GSK3β、β-catenin蛋白磷酸化水平:（1）Wnt/β-actin:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。（2）p-GSK3β/GSK3β:与正常组比较,模型组显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组显着升高（P<0.05）。（3）p-β-catenin/β-catenin:与正常组相比,模型组显着下降（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组均显着下降（P<0.05）,病灶点组下降幅度更显着（P<0.05）。（4）Cyclin D1/β-actin:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更显着（P<0.05）。结论:1.针刺结筋病灶点可以重塑肌纤维的形态结构,增加KOA大鼠患侧后肢腿围以及肌肉质量,从而改善KOA大鼠股四头肌的病理形态。2.针刺结筋病灶点可以有效增加KOA大鼠患侧膝关节的被动活动度、纠正患侧后肢的异常步态以及降低KOA膝关节功能指数,从而改善KOA大鼠膝关节活动受限等功能异常。3.针刺结筋病灶点能显着提高KOA大鼠患侧后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1等生肌分子标志物的表达,促进骨骼肌干细胞增殖分化以实现对受损骨骼肌的再生修复。4.针刺结筋病灶点能够调节Wnt/β-catenin通路相关基因蛋白的表达,Wnt/β-catenin通路介导的骨骼肌干细胞再生修复可能是经筋刺法改善KOA大鼠股四头肌形态结构及功能的作用途径之一。
王晓寒[4]（2021）在《富血小板血浆（Platelet-rich Plasma,PRP）治疗薄型子宫内膜的研究》文中研究指明研究背景辅助生殖技术已成为解决不孕不育问题的重要技术手段,它的快速发展使得胚胎质量问题得到解决,但薄型子宫内膜所引起的子宫内膜容受性改变仍是辅助生殖技术中周期取消以及胚胎植入失败的主要因素之一[1]。目前加拿大的生殖和男科学会（CFAS）及《辅助生殖技术中异常子宫内膜诊疗的中国专家共识》中将薄型子宫内膜定义为子宫内膜在排卵日或新鲜体外受精（IVF）周期中注射人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin,HCG）当天或冻融胚胎移植（Freeze-thaw embryo transfer,FET）周期中开始孕酮的当天未达到7mm[2-3]。但薄型子宫内膜并不仅限于内膜变薄,还包括内膜功能层血流异常、影响内膜容受性因子的改变等多种子宫内膜容受性改变。临床上对于薄型子宫内膜的治疗主要包括基础激素治疗、子宫内膜微创刺激术激发免疫应答、低剂量阿司匹林的应用及促基质、血管形成等,从而起到增加子宫内膜的厚度、改善血流等容受性作用。但由于上述治疗方法的临床效果不确切,且患者的个体差异也较大,因此治疗效果并不理想,急需探寻新的有效治疗方式。随着再生医学的兴起及研究,在其领域中具有独特优势的干细胞成为当今研究的热点,它具体自我更新及多向分化潜能等特性,迄今已广泛应用于多个医学领域。其中便有关于将干细胞应用于子宫内膜修复并成功妊娠的报道[4]。尽管有成功的报道,但其来源受限、创伤大及免疫原性等限制了干细胞应用。近些年随着干细胞领域研究的不断深入,优势明显的经血子宫内膜间充质干细胞（Endometrium mesenchymal stem cells,EnMSCs）的研究也有了重大突破。EnMSCs具有较高的增殖活性,同时还能够向骨、脂肪、肌细胞和软骨细胞等分化,具有极强的多向分化潜能。体外细胞实验研究表明:在雌激素的诱导下,EnMSCs可以向子宫内膜上皮细胞分化[5]。在动物模型中,EnMSCs可重建子宫内膜组织并增加子宫内膜厚度[6]。Tan[7]及Zheng[8]等将经血源性EnMSCs移植治疗重度阿什曼综合征也取得良好疗效。以上研究结果均提示,每个月经周期子宫内膜的生长及功能恢复必定离不开EnMSCs的重要作用。但体外干细胞应用的远行归巢及局部定植非常困难,且临床治疗所需干细胞数量大,复制扩增过程中添加的胎牛血清及异体源性生长因子的加入亦有悖于伦理学范畴。能否寻求一种安全有效的自体资源培养干细胞;更有趣的是,假想这种自体资源能唤醒在体干细胞的功能,便能达到事半功倍的治疗效果。富血小板血浆（Platelet-richplasma,PRP）为一种高浓度的血小板血浆,可由静脉血离心得到。血小板内含有α-颗粒,其激活破裂时可释放出多种生长因子,如转化生长因子（Transforming growth factor,TGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和胰岛素样生长因子（Insulin like growth factor,IGF）等,这些生长因子能够促进细胞增殖、迁移等生物活性的改变,使损伤部位的生物微环境明显得到改善,从而促进组织和新生基质的形成,以达到组织修复和再生的功能,对于损伤后伤口愈合具有积极作用[9]。并且,PRP具有操作简单、安全经济、损伤小等自身特有的优点,故广泛应用于骨科、口腔、皮肤、美容整形等[10-12]。基于以上基础理论研究及相关应用,PRP的应用也逐步引入生殖领域,这为薄型子宫内膜的治疗引入了新的安全有效的自体生物材料。鉴于薄型子宫内膜需要得以治疗的迫切性,干细胞治疗有效但应用受限、难以推广及含有多种生长因子的自体PRP可影响多种细胞功能、应用安全等优良特性,我们设计了此课题,初步探讨PRP在治疗薄型子宫内膜方面的作用。研究目的首先探讨PRP对EnMSCs增殖、迁移和粘附的生物学功能影响;然后用95%乙醇宫腔灌注制作薄型子宫内膜小鼠模型,通过观察薄型子宫内膜小鼠宫腔灌注PRP后子宫内膜的形态学、容受性指标及在体EnMSCs标记物的变化,探讨PRP治疗薄型子宫内膜的效果及潜在机制;最后将自体PRP宫腔灌注应用到拟行FET的薄型子宫内膜患者中,观察宫腔灌注PRP治疗薄型子宫内膜的临床效果;以期寻找到一种治疗薄型子宫内膜的新的有效方法。研究方法1.采集5名健康志愿者静脉血,采用两步离心法分离制作并激活PRP。采用流式细胞仪检测EnMSCs表面标志物CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR的表达;采用成脂、成骨及成软骨分化培养液培养EnMSCs,观察细胞形态以及脂滴、矿化结节及软骨形成情况完成鉴定。利用添加不同浓度PRP的培养液培养EnMSCs,采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法绘制各组细胞在24h、48h、72h、96h的增殖曲线;采用Transwell法和划痕实验检测不同浓度PRP对EnMSCs迁移及粘附能力的影响。2.95%乙醇宫腔灌注制作薄型子宫内膜小鼠模型,给予宫腔灌注PRP治疗后,通过HE染色观察子宫内膜厚度、面积及微血管的改变;通过免疫组化、ELISA和Western-blot检测子宫内膜功能及容受性指标:细胞角蛋白（Cytokeratin）、波形蛋白（Vimentin）、VEGF、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）和白介素-6（Interleukin-6,IL-6）;通过免疫荧光双染方法检测小鼠EnMSCs的表面标记物:CD90和CD105,观察EnMSCs的在体变化情况,探讨宫腔灌注PRP修复薄型子宫内膜的效果和机制。3.采集20名行FET治疗的薄型子宫内膜不孕患者自身静脉血,2步离心法分离制作PRP,同周期宫腔内无菌灌注,且继续人工周期替代治疗。当子宫内膜达到移植厚度（≥7mm）时,添加孕激素转换内膜行FET。提供适当的黄体期支持并测量血清β-HCG水平。计算并分析子宫内膜厚度、形态及血流情况,并进行阳性β-HCG和临床妊娠情况等随访。结果（1）将不同浓度PRP加入培养液对EnMSCs进行体外培养发现:不同浓度PRP对EnMSCs的增殖具有不同程度的影响,2%PRP组的EnMSCs的增殖活性最大;1%PRP组和4%PRP组EnMSCs的增殖活性略低于2%PRP组;5%PRP组和0.5%PRP组的EnMSCs的增殖活性最弱（p<0.01）。（2）PRP可以促进EnMSCs的迁移。其中,2%PRP培养液培养的EnMSCs的迁移率最大;1%PRP组和4%PRP组EnMSCs次之;5%PRP组和0.5%PRP组EnMSCs的迁移率最小。（3）不同浓度的PRP对EnMSCs的粘附能力影响也不同:2%PRP培养液培养的EnMSCs的粘附能力最强（p<0.01）,其余各组粘附能力无明显差异（p>0.05）。（4）通过制作小鼠薄型子宫内膜模型行宫腔灌注PRP治疗后发现:宫腔灌注PRP可以改善薄型子宫内膜小鼠的子宫内膜容受性,包括子宫内膜形态学改善（内膜厚度、面积及微小血管的增加）和子宫内膜容受性指标的提高（CK9、VIM、VEGF、LIF）;此外,PRP还能抑制炎性因子IL-6的释放。免疫荧光追踪到小鼠EnMSCs在子宫内膜的表达情况,发现PRP宫腔灌注后在体EnMSCs增多。（5）通过观察自体PRP宫腔灌注治疗行FET的薄型子宫内膜患者的临床效果发现:20名患者中,接受PRP治疗前,患者的子宫内膜平均厚度为5.55±0.71 mm,PRP治疗后子宫内膜平均厚度为7.82±1.04 mm（p<0.0001）,且其子宫内膜形态及内膜血流信号也明显得到改善（分别是1.95±0.40 vs 2.75±0.44、2.60±0.50vs 3.40±0.68）。PRP宫腔灌注后所有患者子宫内膜达到移植厚度,其中有12例患者获得临床妊娠,妊娠率达60%,种植率为39.4%,早期流产率为16.7%。结论1.本研究使用不同浓度PRP体外培养EnMSCs,发现在2%PRP浓度范围内,细胞的增殖能力、迁移能力和粘附能力随着PRP浓度的升高而增强,呈剂量依赖性,而采用更高浓度PRP作用后上述作用则表现出回落现象,提示不同浓度PRP对EnMSCs的作用效果不同。首次验证PRP对EnMSCs的增殖、迁移和粘附的影响及与其浓度的关系。2.PRP可替代FBS及单一生长因子培养EnMSCs,为EnMSCs治疗薄型子宫内膜及其它疾病的临床应用提供扩增支持。3.PRP宫腔灌注薄型子宫内膜小鼠,可促进受损子宫内膜增殖修复,改善子宫内膜的容受性,减轻子宫内膜炎症反应。这种作用可能跟PRP影响在体EnMSCs的生物学功能有关。4.PRP宫腔灌注治疗薄型子宫内膜不孕患者,能够增加其子宫内膜厚度、改善血流,避免了周期取消,有利于胚胎植入以获得临床妊娠,且并未增加孕产妇并发症及子代出生畸形的风险。
宋华[5]（2021）在《FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究》文中提出研究背景椎间盘退行性变（intervertebral disc degeneration,IVDD）是一种影响腰椎间盘形态和正常生理功能的常见疾病,并最终导致脊柱承受压缩载荷的能力下降。作为一种多因素疾病,其病因至今仍不完全明确,其中遗传倾向、年龄、生活方式（肥胖、吸烟、抑郁症状）和非生理性机械负荷等多种因素,都是导致其进展的原因。研究表明,IVDD是诱发腰痛（LBP）的主要原因,约80%的成年人存在不同程度的腰痛症状。据估计,美国LBP引发的直接成本每年可高达900亿美元,同时因LBP引发的劳动能力下降对于整体社会经济影响造成了显着的挑战。多项研究指出,IVDD中的病理变化与椎间盘退变有关,其中细胞外基质降解、炎症产生和细胞损伤凋亡为最主要的原因。细胞外基质（ECM）在椎间盘的机械功能中发挥重要作用,其中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原提供拉伸强度,蛋白多糖参与形成间盘组织结构,然而位于椎间盘中心区域的髓核（NP）细胞合成ECM成分的能力降低,同时ECM降解分子（如基质金属蛋白酶等）分泌明显增多,导致间盘组织水结合能力持续降低,最终导致结构和功能损伤。研究证实,退行性变首先出现在髓核,随后损伤进一步扩展至椎间盘外部区域的纤维环（AF）,并引发两种不同组织间界限消失。在此过程中,细胞丢失以及密度降低是椎间盘退变的一个重要原因,并进一步增强了ECM的降解。多数研究指出,细胞丢失可由程序性细胞凋亡引发,并因细胞衰老、机械应力等潜在因素增加凋亡的发生。除ECM降解和细胞丢失外,炎症也在IVDD发生和进展中发挥重要作用,已成为区分无症状性椎间盘退变和有症状性椎间盘退变的一个重要因素。NP细胞在损伤过程中可导致多项炎症因子异常募集,并促进基质降解、激活宿主免疫反应,最终导致免疫细胞在神经纤维中浸润,从而诱发退行性变进行性加重,而神经浸润则是椎间盘退行性变疼痛的主要原因。多数研究证实,ECM降解、细胞凋亡、炎症反应被称为IVDD的标志,且三种病理反应相互关联并彼此依赖。促炎细胞因子可通过上调ECM降解酶的表达和降低ECM结构成分而导致代谢失调,同时ECM的大量固有降解导致ECM碎片在细胞外积聚,并作为自身免疫抗原进一步刺激NP细胞的炎症反应。此外,椎间盘组织中较高的细胞凋亡率和衰老率以及较低的ECM产生能力均与炎症密切相关。近年来,机械生物学指出,机械应力在IVDD的诱发因素中存在重要作用,且椎间盘的非生理机械负荷已被证明与基质降解和细胞生理变化密切相关。现阶段,多数研究学者发现机械应力、ECM降解、细胞丢失以及炎症反应在IVDD的发生和进展中存在相互依赖性,但对于各损伤过程中的具体机制尚缺乏共识。Ⅱ型胶原是ECM的重要组成部分,主要由软骨细胞分泌,对维持终板软骨稳定发挥重要作用。Ⅱ型胶原在一定程度上反应了软骨细胞合成代谢的能力。基质金属蛋白酶（MMP）,可对ECM中Ⅱ型胶原进行降解,是终板软骨中关键的分解代谢的酶之一。MMPs组织抑制物4（TIMP-4）为MMPs的特异性抑制因子,在代谢调控中可表现为MMP抑制作用,并降低ECM分解水平,因此TIMP-4也可作为软骨细胞合成代谢的关键标志物。现阶段,非甾体药物治疗以及物理治疗方式为IVDD的常规治疗方案,外科侵入性手术行脊柱融合或关节成型可作为常规治疗难以缓解的二线治疗方案。尽管目前手术成功率较高,但治疗过程中手术费用高昂、术后疼痛以及生活质量降低的局限性严重影响手术效果,因此探索新的治疗方案用以改善治疗现状成为临床亟需解决的热点问题。近年来,外源性生长因子应用在椎间盘退行性变的治疗中展现出较好的前景,并且在安全性和可行性方面得到证实。多数研究表明,生长因子治疗作为一种促进椎间盘组织再生的治疗方案,通过典型生长因子组合应用方式具有改善IVDD恢复能力的效果,并在体外和动物模型中显示出调节合成代谢和抑制分解代谢作用的潜力。既往研究指出,增加ECM合成代谢、减少分解代谢对于维持ECM稳定性、缓解椎间盘退行性变过程中具有重要意义,因此生长因子治疗有可能成为一种缓解和治疗IVDD的新方案。近年来,成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）以其具有促进有丝分裂和促进细胞增殖的作用,目前广泛应用于各种组织修复。有研究表明,FGF在骨骼系统中的作用,是通过与FGF受体结合而启动的,并在缓解椎间盘退行性变过程中可能存在一定的治疗作用。也有研究表明,骨关节炎（Osteoarthritis,OA）患者的FGF-2含量明显高于正常情况下的FGF-2含量,认为高FGF2含量可能引起软骨老化。有研究表明FGF的受体FGFR1及FGFR3在软骨老化过程中发挥重要作用。综合既往研究分析,FGF-2在人类软骨细胞（CHs）中发挥的作用是双向的,对OA患者有加速疾病发生作用。然而,有研究人员发现,FGF-2基因敲除小鼠比正常小鼠更容易发生OA,皮下注射FGF-2可以减缓这种效应。以上研究均指出,FGF2有可能在IVDD延缓病理过程和治疗中展现出独特的分子生物学作用,而目前对于其具体作用机制尚缺乏相关报道。因此本研究旨在探索FGF2在改善椎间盘退行性变过程中代谢调控作用机制及生物学意义。研究目的本研究通过观察FGF2在不同腰椎退行性变患者软骨终板组织中的表达水平,并采用外源性FGF2对体外培养正常软骨细胞、退行性变性软骨细胞,探讨FGF2在软骨终板细胞合成代谢和分解代谢间的调控作用。在本研究过程中,进一步分析FGF2在改善代谢反应过程中对Caspase-3、bcl-2表达的调控作用,深入探讨FGF2对于促进软骨终板细胞增殖并抑制凋亡中的具体作用机制,以阐明FGF2在缓解软骨终板细胞退行性变中的生物学意义。研究方法第一部分FGF2在不同程度腰椎退行性变患者软骨终板组织标本中的表达选取2017年3月至2018年11月间在我院骨科行脊柱融合术的8例患者病历资料进行分析,按照MRI影像学结果评估腰椎退行性病变等级分为轻度IVDD组和重度IVDD组,每组4人。对所有患者均行磁共振成像观察病变椎间盘形态,取手术切除的椎间盘组织行HE染色。将手术获取软骨终板细胞进行体外分离培养,采用 RT-qPCR 分析细胞中 FGF2、FGFR1、FGFR3 以及 MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。体外培养0、24、48、72h,采用CCK-8法检测软骨终板细胞增殖活力,分析细胞代谢状态。第二部分外源性FGF2对正常软骨终板细胞的代谢调控影响选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞加入不同浓度（5ng/mL和10ng/mL）外源性FGF2进行培养。同时设置空白对照组,未加FGF2蛋白处理。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR3以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对软骨细胞培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。第三部分体外诱导软骨终板细胞退行性变性中的代谢调控及Caspase-3、bcl-2表达的机制研究选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞应用IL-1β诱导退行性变性。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。采用蛋白印迹定量分析检测细胞中Caspase-3、bcl-2蛋白表达水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对软骨细胞培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。第四部分外源性FGF2联合FGFR1阻断剂对于延迟软骨终板细胞变性的影响选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞应用IL-1β诱导退行性变性。取外源性人重组FGF2蛋白对软骨细胞进行处理并分为两组:FGF2组和FGF2+PD（FGFR1抑制剂）组;另选取一空白组作为对照,其中未加FGF2、PD蛋白进行处理。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR3以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。研究结果1、严重退变的相邻椎体间的位置高度较轻度退变降低,且MRI图像中水分程度亦较轻度病变减低。HE染色发现软骨终板组织比髓核组织质地更硬、分布更密集,软骨终板细胞的分布位置比髓核细胞更近。椎间盘重度退变的软骨终板细胞中FGF2、FGFR1、MMP-3表达水平较椎间盘轻度退变表达显着增加（P<0.001）;但在两种不同程度退行性改变中,FGFR3的表达量无统计学意义（P>0.05）;重度椎间盘退变中Ⅱ型胶原和TIMP-4表达水平较轻度椎间盘退变降低（P<0.05）。2、外源性FGF2蛋白处理72h后,三组细胞中FGF2 mRNA表达无统计学意义（P>0.05）;FGF2处理组FGFR1和FGFR3水平均明显高于对照组（P<0.05）。对FGFR1表达水平进行分析,5ng/mL组与10ng/mL组间结果无统计学意义（P>0.05）;对FGFR3表达水平进行分析,1Ong/mL组表达水平明显高于5ng/mL组（P<0.001）。外源性FGF2蛋白处理72h后,两组细胞TIMP-4表达水平较对照组明显上升,且10ng/mL组表达水平高于5ng/mL组（P<0.05）;三组细胞MMP-13表达水平无统计学意义（P>0.05）。对Ⅱ型胶原荧光定量进行分析,10ng/mL组细胞表达水平显着高于对照组和5ng/mL组（P<0.001）;对照组和5ng/mL组间水平无统计学意义（P>0.05）。三组细胞72h不同时间点细胞增殖活力均随时间呈增加趋势（P<0.05）。三组间相同时间点增殖活力比较,提示:①培养0h时,三组细胞增殖活力无统计学意义（P>0.05）;②培养12h时,三组细胞增殖活力不相同,10ng/mL组增殖水平较5ng/mL组和对照组升高（P<0.05）,但5ng/mL组和对照组增殖水平无统计学意义（P>0.05）;③培养24h时,1Ong/mL组和5ng/mL组增殖水平均较对照组升高（P<0.05）,而10ng/mL组和5ng/mL组增殖活力比较无统计学意义（P>0.05）;④培养48h、72h后,10ng/mL组水平较5ng/mL组和对照组升高,且5ng/mL组水平明显高于对照组（P<0.05）。三组细胞凋亡率水平不全相同（P<0.05）,且培养后Oh,三组细胞凋亡率水平无统计学意义（P>0.05）;培养后12h,10ng/mL组凋亡率高于5ng/mL组和对照组,且5ng/mL组凋亡率低于对照组（P<0.05）;培养后24h、48h、72h,三组细胞凋亡率水平比较均无统计学意义（P>0.05）。3、IL-1 β处理后24h,FGF2表达水平低于对照组;但IL-1 β处理后48、72h,退行性变细胞FGF2表达水平较对照组升高,且IL-1 β处理后72h水平高于IL-1β处理后48h（P<0.05）。IL-1 β处理后24、48、72h,处理组退行性变细胞FGFR1含量均较对照组升高,且处理组细胞FGFR1水平随时间推移呈持续增高趋势（P.<0.05）。IL-1β处理后24h,处理组退行性变细胞表达水平与对照组分析无统计学意义（P>0.05）;处理后48、72h,处理组细胞表达水平均较对照组降低;IL-1 β处理后48h与处理后72h,退行性变细胞FGFR3水平比较无差异（P<0.05）。IL-1 β处理后72h,处理组退行性变细胞Ⅱ型胶原水平较对照组降低（P<0.05）。同时,IL-1 β处理后细胞MMP-13 水平较对照组明显上升（P<0.001）;两组细胞TIMP-4表达量比较无统计学意义（P>0.05）。两组细胞72h内不同时间点细胞增殖活力不全相同,增殖活力水平均呈表现为持续降低（P<0.05）,且培养Oh,两组细胞增殖活力水平无统计学意义（P>0.05）;培养12、24、48、72h,IL-1 β处理后细胞增殖活力低于对照组细胞（P<0.05）。IL-1 β处理组细胞Caspase-3蛋白表达量较对照组增强,但IL-1 β处理组细胞bcl-2表达量较对照组降低（P<0.05）。两组间72h内不同时间点细胞凋亡率不全相同,IL-1 β处理组细胞凋亡率呈持续上升趋势,对照组细胞凋亡率呈先降低后缓慢升高趋势（P<0.05）。对两处理组细胞相同时间点凋亡率进行对比分析,提示:①培养Oh,两组细胞凋亡率水平无统计学意义（P>0.05）;②培养后12、24、48、72h,IL-1 β处理组细胞凋亡率较对照组增加（P<0.05）。4、三组细胞中FGF2 mRNA表达水平无统计学意义（P>0.05）;三组间FGFR1、FGFR3 mRNA表达水平不全相同（P<0.05）。对FGFR1进行分析,IL-1β+FGF2处理组细胞表达水平较对照组显着升高,IL-1 β+FGF2+PD组细胞表达水平明显低于对照组和IL-1β+FGF2组（P<0.05）。对FGFR3表达进行分析,IL-1 β+FGF2+PD组表达水平明显高于IL-1 β+FGF2组和对照组,且IL-1 β+FGF2组表达水平较对照组升高（P<0.05）。三组细胞MMP-13、TIMP-4、Ⅱ型胶原表达无统计学意义（P<0.05）。对MMP-13表达进行分析,IL-1 β+FGF2组结果较IL-1 β+FGF2+PD组和IL-1 β组升高,且IL-1 β+FGF2+PD组表达水平高于IL-1 β组（P<0.05）。对TIMP-4表达进行分析,IL-1 β+FGF2+PD组表达水平较IL-1 β+FGF2组和IL-1 β组升高,IL-1 β+FGF2组和IL-1 β组表达水平比较无统计学意义（P>0.05）。对Ⅱ型胶原表达进行分析,IL-1 β+FGF2组表达水平明显低于IL-1 β+FGF2+PD组和IL-1 β组,IL-1 β+FGF2+PD组表达较IL-1β组升高（P<0.05）。三种方案处理组细胞72h不同时间点细胞增殖活力均随时间呈增加趋势（P<0.05）。三组间相同时间点增殖活力比较,提示:①培养Oh时,三组细胞增殖活力无统计学意义（P>0.05）;②培养12h时,IL-1 β+FGF2组与IL-1 β+FGF2+PD组增殖活力均高于IL-1 β组,而IL-1 β+FGF2组和IL-1β+FGF2+PD组结果比较无统计学意义（P>0.05）;③培养24、48、72h时,IL-1β+FGF2+PD组水平均明显高于IL-1 β+FGF2组和IL-1 β组,且IL-1 β+FGF2组水平较IL-1β组升高。Annexin V-FITC/PI双染后发现,三组细胞凋亡率水平不全相同,且呈现持续降低（P<0.05）。三组间相同时间点凋亡率比较,提示:①培养后0、12h,三组细胞凋亡率水平比较无统计学意义（P>0.05）;②培养后 24、48、72h,IL-1 β+FGF2+PD 组水平低于 IL-1 β+FGF2 组和 IL-1 β 组,且IL-1 β+FGF2组凋亡率水平较IL-1β组降低（P<0.05）。研究结论本研究阐明FGF2在软骨细胞退变中的作用,FGF2在椎间盘内稳态中的多种作用取决于退行性变的阶段和疾病过程的类型。在退变早期软骨细胞中,FGF2可能作用一种合成代谢介质,刺激TIMP-4和Ⅱ型胶原表达增加,下调MMP-13含量,诱导细胞增殖及降低细胞凋亡。对于退变晚期的软骨细胞,FGF2可能作为一种分解代谢介质,刺激MMP-13的表达,抑制蛋白多糖的合成,诱导Caspase-3表达上调,并下调bcl-2表达,诱导细胞凋亡效应并加剧椎间盘退变。此病理过程中FGFR1的异常激活可能为促进分解代谢的主要因素,靶向阻断FGFR1的表达可有效降低ECM分解,在改善椎间盘软骨退行性变治疗中存在积极意义,因此联合应用FGF2/FGFR1拮抗剂有望成为预防椎间盘软骨退变和促进终板软骨再生和修复的潜在治疗新方案。
薛禹伦[6]（2020）在《去白细胞富血小板血浆治疗出血性关节炎的实验研究》文中提出[目的]:出血性关节炎（Hemorrhagic arthritis,HA）是一种与出血相关的滑膜和软骨损伤,在血友病等出凝血疾病患者中更为常见。因其所含细胞因子和生长因子的作用,去白细胞富血小板血浆（Pure platet-rich plasma,P-PRP）被证实具有抗炎和再生作用。本研究旨在探讨P-PRP对HA的疗效与否,并且在轻度和重度HA治疗作用中的差异。[研究方法]:新西兰兔膝关节（后肢）内分别注射自体血8周和16周,建立轻度和重度HA模型。将自体P-PRP分别注入轻度HA组和重度HA组的左膝关节,并将等量的生理盐水注入相应的对侧膝（右侧）关节。分别进行双侧膝关节直径测量、MRI检查、H&E和甲苯胺蓝染色,评价P-PRP处理组和未处理组滑膜和软骨的组织学差异。正常膝关节作为对照组进行比较。[结果]:大体观察和MRI检查显示治疗组的膝关节滑膜增生及炎症程度优于未治疗组,滑膜切片H&E染色细胞计数中,轻度HA治疗组与轻度HA未治疗组差异有统计学意义（x=307.40±14.23;95%CI,241.54-343.26;p<0.001）,重度 HA 治疗组与重度HA 未治疗组有统计学差异（x=699.20±82.80;95%CI,508.26-890.14;p<0.001）,滑膜H&E染色及细胞计数显示轻度HA治疗组细胞形态及数量与正常对照组最接近（x=71.00±9.62;95%CI,48.81-93.19;p<0.001）。膝关节直径的测量显示轻度HA治疗组和轻度HA未治疗组间的直径差明显大于重度HA治疗组和重度HA未治疗组间的直径差（x=1.17±0.32mm;p<0.01）。软骨甲苯胺蓝染色的结果与MRI结果一致,甲苯胺蓝染色显示重度组软骨基质丢失明显,而轻度HA治疗组软骨基质与正常对照组无明显差异。[结论]:P-PRP可抑制HA滑膜炎形成和减缓软骨基质丢失方面的进展,尤其是在早期轻度病变的出血性关节炎中。本项体内动物研究为P-PRP治疗出血性关节病变提供了理论依据和临床应用的可能。
潘政军[7]（2019）在《Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理研究目的:探讨抑制细胞调亡的B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因（Bcl-xL）对人脐带血干细胞定向诱导分化的影响,观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞定向诱导分化以后修复兔关节软骨损伤的疗效。研究内容:（1）人脐带血干细胞的获取,分离培养、定向诱导分化成软骨细胞;（2）慢病毒编码的抑制细胞凋亡基因Bcl-xL转染人脐带血干细胞;（3）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞凋亡的影响;（4）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞分泌II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3等蛋白的影响;（5）制造兔膝关节软骨损伤模型;（6）海藻酸钠盐支架包被Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞,植入并修复兔软骨损伤;（7）检测植入的人脐带血干细胞是否能在异种动物体内存活;（8）HE、MASSON和改良蕃红O-固绿等染色方法观察软骨缺损的修复;（9）免疫组化、实时PCR、WB等方法检测Bcl-xL基因的表达对动物体内软骨细胞分泌II型胶原、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白影响。材料与方法:（1）在正常分娩过程中获得人脐带血,体外分离获取干细胞,贴壁培养。取P2代细胞用TGF-β1因子联合使用胰岛素样生长因-1和地塞米松诱导干细胞向软骨细胞方向分化,培养至细胞爬满玻片时,用甲苯胺蓝染色和免疫组化染色方法鉴定诱导分化的效果,并与对照组比较。（2）用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,取第3代人脐带血干细胞接种于6孔板,当细胞融合达到5070%时,用编码Bcl-xL基因的慢病毒载体转染人脐带血干细胞。实验分四组进行,分别为对照组、诱导组、诱导+Bcl-xL慢病毒转染组、诱导+慢病毒空载组。对照组只分离培养干细胞,不加任何诱导因子;诱导组加入TGF-β1等诱导因子;诱导+Bcl-xL慢病毒转染组是在诱导组的基础上再加入编码Bcl-xL基因的慢病毒;空载组是在诱导组的基础上只加入未编码Bcl-xL基因的慢病毒。以上四组继续培养48h,在倒置显微镜下连续观察并记录细胞形态特征;甲苯胺蓝染色证实Bcl-xL基因转染后的干细胞仍具有软骨细胞的特征;通过流式细胞仪鉴定软骨细胞特征性的表面抗原如:CD90和CD105的表达。通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,评价Bcl-xL基因对干细胞的凋亡的影响。实时PCR检测Bcl-xL基因在mRNA水平的表达;同时以β-actin为内参;Western blotting（WB）印迹法检测Bcl-xL基因在蛋白水平的表达;实时PCR及WB等方法检测Bcl-xL基因表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3、基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;SPSS17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。（3）制备海藻酸钠支架,加入人脐带血干细胞形成细胞-支架复合物。将1.2%的海藻酸钠溶液滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成无细胞的海藻酸钠支架;将人脐带血干细胞加入1.2%的海藻酸钠溶液制成1×106/ml的单细胞悬液,滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成含人脐带血干细胞的海藻酸钠支架复合物。（4）制造兔软骨损伤模型,30只三个月大的日本大耳兔,分为5组,每组12只膝关节。麻醉后备皮,双侧后腿膝关节内侧切口进入膝关节,在股骨髁关节面用电钻造成一个直径4mm,深度约3mm柱状缺损,穿透软骨下骨,造成全层关节软骨损伤。按照5种不同的方式修复软骨缺损:假手术组（对照组）:只进行假手术,软骨无损伤;模型组:进行软骨损伤造模而未予其它治疗干预措施,然后直接缝合;空载体治疗组:慢病毒空载体转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域;干细胞治疗组:未经慢病毒转染的人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。Bcl-xL基因修饰治疗组:Bcl-xL基因修饰慢病毒转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。饲养8周后全部动物处死,获取膝关节标本。采用抗人细胞核特异性抗体鉴定植入软骨缺损处的干细胞在正常免疫功能的兔体内是否能存活;观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞移植治疗关节软骨损伤的效果,用HE、MASSON、改良番红O-固绿等染色方法观察关节软骨损伤的修复效果,用免疫组化、实时PCR及WB等方法检测动物体内Bcl-xL基因的表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;用SPSS 17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。结果:1、人脐带血中可成功分离出具有多向分化潜能的干细胞,并可体外培养、定向诱导分化软骨细胞;2、用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,干细胞增殖分化后仍具有软骨细胞特征。干细胞内的Bcl-xL基因在mRNA和蛋白水平的表达均上调;Bcl-xL基因可抑制干细胞的调亡,Bcl-xL基因可促进软骨细胞II型胶原蛋白在mRNA和蛋白水平的表达,显着抑制半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,组间分析具有统计学意义,P<0.05。3、海藻酸钠盐支架-干细胞复合体植入动物体内,检测到干细胞存活;病理染色显示,各组软骨损伤均有修复,3种染色方式均显示:Bcl-xL基因修饰的干细胞组软骨结构修复最满意,而模型组的修复相对最不满意;免疫组化染色、实时PCR和WB检测结果基本一致:软骨损伤促进了II型胶原纤维在mRNA和蛋白水平的表达,而Bcl-xL基因修饰进一步增加了II型胶原纤维的表达;对于半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的检测结果显示:与假手术组比较,模型组的半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3表达均明显上调（P<0.05）,而Bcl-xl基因修饰组人脐带血干细胞相对模型组明显下调。组间分析差异显着（P<0.05）。此外,与正常人脐带血干细胞相比,Bcl-xL修饰的干细胞可进一步降低软骨损伤诱导的半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,提高II型胶原蛋白的表达。结论:1、人脐带血干细胞可定向诱导分化成软骨细胞,Bcl-xL基因修饰可降低干细胞凋亡。2、移植人脐带血干细胞有利于修复软骨损伤,而Bcl-xL修饰则能提高人脐带血干细胞移植修复软骨损伤的疗效。
孙东东,孙明林,高丽兰[8]（2019）在《生长因子在软骨组织工程中的研究进展》文中指出关节软骨自然退变或创伤,导致结构和功能上的损害,因其没有血供和神经支配,基质陷窝中的软骨细胞主要通过渗透获得必需的营养和排出代谢产物,代谢活性低,损伤后难以自我修复。目前临床上主要以药物保守治疗和外科手术治疗为主,但均不能很好的满足临床需要。软骨组织工程的发展为关节软骨损伤修复提供了新的方向,其中生长因子发挥着重要作用。生长因子与种子细胞、细胞支架共同组成构建软骨组织工程的三要素。生长因子可显着促进细胞增殖分化并诱导其功能的发挥,多种生长因子协同作用介导种子细胞分化成软骨细胞。近年来,软骨组织工程发展迅速,因其细胞来源丰富、对机体自身损伤小、增殖传代和定向分化能力强、可进行生物性修复等突出优点,为关节软骨损伤修复开辟了一条新的途径。不同类型的水凝胶和不同来源的干细胞,表现出不同的支持软骨形成的能力,需要不同的生长因子来诱导其向软骨细胞分化。传统用于组织工程的生长因子有转录生长因子β、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和软骨源性形态发生蛋白等。近年来,有学者研究发现富血小板血浆、富血小板纤维蛋白、kartogenin、力生长因子等也可以有效诱导干细胞向软骨分化并维持软骨细胞表型。此外,一些人工合成化合物如地塞米松和部分无机粒子也能够促进干细胞向软骨分化。本文将对传统生长因子的研究进展进行系统总结,重点介绍新发现的生长因子及其他可以诱导干细胞向软骨分化的人工合成化合物及无机粒子,分类总结不同来源干细胞软骨组织工程所适合的生长因子,并对生长因子的下一步研究方向进行展望。
陈鸿泰[9]（2019）在《棕榈酸促进大鼠骨髓间充质干细胞体外迁移及成骨、成软骨分化的基础实验研究》文中提出骨缺损、骨不连一直是困扰骨科临床医生的重要难题。随着严重骨折发生率明显增高,由其带来的骨缺损、骨不连等问题也越来越严唆。因此研究促进骨修复的机制、缩短骨折愈合时间的方法显得尤为必要。中医活血化瘀法在骨折愈合治疗中具有显着的积极作用,且前期大量实验证实活血化瘀药红花通过促进骨髓间充质干细胞迁移,进而对骨折愈合治疗具有显着效果。为探讨红花促进骨髓间充质干细胞迁移,深入研究其分子生物学机制,故本实验通过一系列筛选发现红花有效单体棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移具有显着促进作用,挑选红花有效单体棕榈酸以进一步深入研究,探讨棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移的影响作用。同时,进行相关实验研究证实棕榈酸对骨髓间充质干细胞的成骨及成软骨分化是否具有促进作用。目的:观察红花有效单体棕榈酸对骨髓间充质干细胞体外迁移、成骨分化及成软骨分化的影响作用,并深入探讨棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移及分化相关的分子生物学机制。从而为棕榈酸促进骨折愈合提供基础实验研究依据,为开发新药产品奠定基础,并申报专利。方法:1.采用全骨髓灌注法培养SD大鼠原代骨髓间充质干细胞,由于细胞贴壁生长的特性,采用贴壁筛选法不断提高细胞的纯度,取纯度高且状态良好的第3代细胞行细胞表面抗原流式检测及诱导成骨、成脂及成软骨三向分化鉴定。2.噻唑蓝（MTT）比色法检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响作用。3.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移相关CXCR4基因表达情况及CXCR4沉默后棕榈酸干预下CXCR4基因表达情况。4.细胞体外迁移实验（Transwell）检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移及CXCR4沉默后棕榈酸干预下细胞迁移的影响作用。5.免疫蛋白印迹法（Western Blot）检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移相关CXCR4蛋白表达情况及CXCR4沉默后棕榈酸干预下CXCR4蛋白表达情况。6.茜素红染色检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响作用。7.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化相关基因（ALP、、OPN、RUNX2、SOX9、COL2、ACAN）表达的影响作用。结果:1.细胞鉴定结果:检测细胞表面抗原标志物结果显示CD105、CD29、CD44、CD73、CD90阳性率分别为98.62%、99.20%、98.82%、98.57%,阳性率均大于95%。表达造血细胞的标志物CD34、CD45阳性率分别为0.40%、0.10%,阳性率均小于5%。同时,三向分化细胞鉴定结果:在成骨、成脂及成软骨诱导液干预下,细胞均能实现成骨分化、成脂分化及成软骨分化。由此证实,本实验所使用的细胞均为骨髓间充质干细胞。2.噻唑蓝（MTT）比色法细胞增殖结果:在棕榈酸各梯度浓度干预下,各组骨髓间充质干细胞呈现不同程度的细胞增殖,且在不同干预时间（24h、48h、72h）下,维持不同程度的增殖速度。最佳干预时间为48h,最佳浓度均为10μg/mL,增长率可达29.5%。相较空白组,棕榈酸干预下细胞增殖各实验组均有统计学意义（P<0.01）。可见,棕榈酸可促进骨髓间充质干细胞增殖。3.Transwell细胞迁移实验结果:在10h棕榈酸各梯度浓度干预下,各组骨髓间充质干细胞呈现不同程度的细胞迁移。其中,10μg/mmL浓度棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞穿膜下室细胞数量显着增多,与空白组比较,具有显着统计学差异（P<0.01）。而5μg/mL、20μg/mL浓度棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞穿膜下室细胞数量明显减少,但仍多于空白组,与空白组比较,具有显着统计学差异（P<0.01）。可见,棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移具有积极促进作用。4.RT-PCR基因表达量结果:在棕榈酸不同浓度梯度干预下,均可不同程度提高CXCR4的信使核糖核酸（mRNA）的表达,其中尤以10μg/mL浓度为最佳,具有显着统计学差异（P<0.01）。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞CXCR4基因表达有显着提高。5.CXCR4沉默后RT-PCR基因表达量结果:10μg/mL棕榈酸对沉默后细胞CXCR4基因的表达具有显着促进作用,具有统计学意义（P<0.05）。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞部分恢复CXCR4基因表达。6.CXCR4沉默后Transwell细胞迁移实验结果:10μg/mL棕榈酸对CXCR4沉默干预后的骨髓间充质干细胞迁移具有显着促进作用。棕榈酸+沉默组与空白对照组比较,不具有统计学意义（P>0.05）。而棕榈酸+沉默组与沉默组比较,P<0.01,具有显着统计学差异。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞部分恢复细胞的迁移能力。7.Western blot免疫蛋白印迹实验结果:10μg/mL棕榈酸对CXCR4沉默干预后的骨髓间充质干细胞CXCR4蛋白表达具有显着促进作用。棕榈酸+沉默组与空白对照组比较,不具有统计学意义（P>0.05）。而棕榈酸+沉默组与沉默组比较,具有显着统计学差异（P<0.01）。可见,在棕梢酸干预下,骨髓间充质干细胞部分恢复CXCR4蛋白表达。8.棕榈酸+成骨诱导干预下,茜素红染色以及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）结果:与诱导组比较,棕榈酸+诱导组对骨髓间充质干细胞RUNX2基因的表达具有显着促进作用,其中尤以20μg/mL浓度最佳,具有统计学意义（P<0.05）。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞有成骨分化的趋势。9.棕榈酸+成软骨诱导干预下逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）结果:与诱导组比较,棕榈酸+诱导组对骨髓间充质干细胞S0X9基因的表达具有显着促进作用,其中尤以20μg/mL浓度最佳,且与诱导组对比,具有统计学意义（P<0.05）。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞有成软骨分化的趋势。结论:活血化瘀药红花的有效单体棕榈酸对骨髓间充质干细胞增殖、体外迁移及成骨、成软骨分化具有积极促进作用,进一步证实了活血化瘀法治疗骨折愈合具有显着意义,并为红花在骨折愈合治疗中提供分子生物学依据,为棕榈酸促进骨折愈合奠定基础。同时,优化以中医活血理论为基础的创新中药设计,为加快骨折愈合开辟新的治疗思路,为骨折三期辨治原则提供研究基础。
刘肖男[10]（2019）在《半月板后根部撕裂发病特点、治疗进展及疗效总结》文中研究表明目的半月板后根在半月板生物力学及功能中发挥重要作用。近来来半月板后根撕裂/MPRT修复的作用得到肯定,成为新的研究热点。我们通过综合分析概括半月板后根/MPR的解剖特点,发病特点,治疗方法及效果;为进一步设计临床研究奠定基础。方法 检索 MEDLINE/PubMed,EMBASE and the Cochrane 等数据库结合教材分析,纳入MMPRT修复术相关研究,提取数据并用RevMan 5.1进行Meta分析。结果 术后Lysholm评分、IKDC评分及HSS评分分别改善了 30.51[26.94,34.07],P<0.01,32.23[27.43,37.03],P<0.01,33.90[27.59,40.20],P<0.01。术后K-L评分未见明显进展。研究并不能表明半月板挤压在术后得到明显改善。绝大多数研究半月板完全愈合率超过60%。结论半月板后根撕裂缝合术可以明显改善膝关节功能并预防膝骨关节炎发生及进展。然而,半月板环张力重建的有效性尚不清楚。
二、软骨源性生长因子研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、软骨源性生长因子研究进展（论文提纲范文）
（1）补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床研究及对人髓核细胞活性与功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 文献研究 |
| 综述一 椎间盘退变的分子病理学研究 |
| 1 正常椎间盘的解剖学结构和生物学特性 |
| 2 椎间盘退变的病理表现 |
| 3 椎间盘退变的分子病理机制 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 椎间盘源性腰痛的现代诊疗学研究 |
| 1 定义及分型 |
| 2 现代医学发病机制 |
| 3 诊断 |
| 4 治疗 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述三 补肾活血中药防治椎间盘退变的作用机理研究 |
| 1 中医学对椎间盘退变的认识与治则 |
| 2 补肾活血中药防治椎间盘退变的作用机理 |
| 3 补肾活血中药对相关信号通路的影响 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床疗效及安全性 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 补肾活血方对兔退变椎间盘模型的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 补肾活血方对人髓核细胞活性和细胞外基质的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 中医药科技查新报告书 |
（2）基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）基于Wnt通路探讨经筋针刺调控KOA大鼠股四头肌再生修复的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 经筋刺法对KOA大鼠股四头肌形态结构和功能的调节作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 经筋刺法对KOA大鼠股四头肌再生修复分子标志物表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 经筋刺法对KOA大鼠股四头肌Wnt/β-catenin信号通路的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 KOA的骨骼肌损伤机制以及经筋疗法治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）富血小板血浆（Platelet-rich Plasma,PRP）治疗薄型子宫内膜的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.薄型子宫内膜的研究现状 |
| 1.1 薄型子宫内膜的临床诊断及危害 |
| 1.2 薄型子宫内膜的病因 |
| 1.3 薄型子宫内膜的治疗 |
| 2.子宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)的研究概况及应用 |
| 2.1 干细胞概况及应用 |
| 2.2 EnMSCs的研究历程及应用 |
| 3.富血小板血浆(PRP)的研究进展 |
| 3.1 PRP的来源及成分 |
| 3.2 PRP的作用及临床应用 |
| 4.本课题的研究思路及意义 |
| 第二章 PRP对人子宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)增殖、迁移及粘附功能的影响 |
| 1.材料 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 PRP的制备 |
| 2.2 EnMSCs的培养 |
| 2.3 流式细胞仪的鉴定 |
| 2.4 体外EnMSCs的诱导分化 |
| 2.5 实验分组 |
| 2.6 CCK-8法测量不同浓度PRP对EnMSCs增殖活性的影响 |
| 2.7 Transwell实验和划痕实验检测不同浓度PRP对EnMSCs迁移活性的影响 |
| 2.8 粘附实验测定不同浓度PRP对EnMSCs粘附能力的影响 |
| 2.9 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 EnMSCs的形态 |
| 3.2 EnMSCs的细胞表面标记物表达 |
| 3.3 EnMSCs多系分化检测 |
| 3.4 PRP对EnMSCs增殖的影响 |
| 3.5 PRP对EnMSCs迁移的影响 |
| 3.6 PRP对EnMSCs粘附的影响 |
| 4.讨论 |
| 第三章 PRP修复薄型子宫内膜模型小鼠子宫内膜的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 PRP来源 |
| 1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 薄型子宫内膜小鼠模型制作 |
| 2.2 子宫内膜石蜡包埋切片及HE染色 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 蛋白免疫印迹(Western-blot)实验 |
| 2.5 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 HE染色结果 |
| 3.2 免疫组织化学结果 |
| 3.3 Western-blot结果 |
| 3.4 ELISA结果 |
| 3.5 免疫荧光结果 |
| 4.讨论 |
| 第四章 PRP宫腔灌注治疗薄型子宫内膜的临床观察 |
| 1.材料 |
| 1.1 患者收集 |
| 1.2 PRP来源 |
| 1.3 伦理审核及知情同意 |
| 1.4 主要实验试剂及仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 治疗前准备 |
| 2.2 子宫内膜的测量 |
| 2.3 内膜准备 |
| 2.4 PRP的制备 |
| 2.5 PRP宫腔灌注 |
| 2.6 胚胎移植 |
| 2.7 随访 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 一般资料统计 |
| 3.2 超声检查结果 |
| 3.3 妊娠结局 |
| 3.4 随访结果 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 综述 PRP在女性生殖领域中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
（5）FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 FGF2在不同程度腰椎退行性变患者软骨终板组织标本中的表达 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 外源性FGF2对正常软骨终板细胞的代谢调控影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 体外诱导软骨终板细胞变性中的代谢调控及Caspase-3、bcl-2表达的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 外源性FGF2联合FGFR1阻断剂对于延迟软骨终板细胞变性的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3结果 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 生长因子治疗椎间盘退行性变的分子机制及应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（6）去白细胞富血小板血浆治疗出血性关节炎的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1. 全血和P-PRP的样本检测结果 |
| 2. 新西兰兔膝关节磁共振结果 |
| 3. 膝关节大体观察 |
| 4. 组织学评估 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 富血小板血浆及其衍生物治疗骨科相关疾病上的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词对照表 |
| 攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人脐带干细胞定向诱导分化软骨细胞的实验研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 过表达Bcl-x L基因慢病毒载体对人脐带血干细胞的调控机理研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 海藻酸钠支架负载人脐带血干细胞复合物移植治疗兔关节软骨损伤 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的论文与成果 |
| 致谢 |
| 综述一 Bcl-x L 基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 干细胞定向诱导分化成软骨细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）棕榈酸促进大鼠骨髓间充质干细胞体外迁移及成骨、成软骨分化的基础实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 骨折愈合的过程 |
| 一、骨折愈合的概述 |
| 二、血肿机化期(肉芽组织修复期) |
| 三、骨痂形成期(原始骨痂形成期) |
| 四、骨性愈合期(成熟骨板期) |
| 五、骨折改造塑形期(塑形期) |
| 第二节 骨折愈合影响因素的研究进展 |
| 一、抑制骨折愈合的药物的研究进展 |
| 二、低氧张力对骨折愈合的影响作用 |
| 三、电频治疗对骨折愈合的影响作用 |
| 四、高糖环境对骨折愈合的影响作用 |
| 第三节 影响骨折愈合的细胞因子 |
| 一、骨形态生成蛋白(Bone Morphogenic Protein,BMP) |
| 二、骨源性生长因子(Bone- Derived Growth Factor,BDGF) |
| 三、骨骼生长因子(Skeletal Growth Factor,SGF) |
| 四、软骨源性因子(Cartilage-Derived Factor,CDF) |
| 五、血小板源性生长因子(Platelet-Derived Growth Factor.PDGF) |
| 六、转化生长因子-β (Transforming Growth Factor -β,TGF-β) |
| 第四节 骨髓间充质干细胞的研究进展 |
| 一、骨髓间充质干细胞的概述 |
| 二、骨髓间充质干细胞的归巢性 |
| 三、促进迁移的趋化因子 |
| 四、骨髓间充质干细胞定向迁移的分子生物学机制 |
| 五、其他促进骨折愈合相关的分子生物学机制 |
| 第五节 中医学对骨折愈合过程的认识 |
| 一、活血化瘀法促进骨折愈合的研究进展 |
| 二、补肾活血汤促进骨折愈合的研究进展 |
| 三、红花挥发油促进骨折愈合的研究进展 |
| 四、棕榈酸单体的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 研究思路 |
| 一、骨髓间充质干细胞的培养及鉴定 |
| 二、棕榈酸对细胞增殖影响的研究 |
| 三、棕榈酸对细胞迁移影响的研究 |
| 四、棕榈酸对细胞分化影响的研究 |
| 第二节 SD大鼠骨髓间充质干细胞取材、原代培养及鉴定 |
| 一、实验材料 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验耗材 |
| (四) 实验仪器 |
| (五) 实验试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| (一) 骨髓间充质干细胞取材 |
| (二) 骨髓间充质干细胞的传代培养 |
| (三) 骨髓间充质干细胞的计数 |
| (四) 骨髓间充质干细胞的流式细胞仪鉴定 |
| (五) 骨髓间充质干细胞的成骨分化 |
| (六) 骨髓间充质干细胞的成软骨分化 |
| (七) 骨髓l间充质干细胞的成脂分化 |
| (八) 统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| (一) 骨髓间充质干细胞的活性检测 |
| (二) 骨髓间充质干细胞的形态观察 |
| (三) 骨髓间充质干细胞的流式细胞鉴定 |
| (四) 骨髓间充质干细胞三向分化鉴定 |
| 第三节 棕榈酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响 |
| 一、实验材料 |
| (一) 实验细胞 |
| (二) 实验药物单体 |
| (三) 实验试剂 |
| (四) 实验耗材 |
| (五) 实验仪器 |
| (六) 实验试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| (一) 种板 |
| (二) 药物干预 |
| (三) 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖 |
| (四) 统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| 第四节 棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移的影响 |
| 一、实验材料 |
| (一) 实验细胞 |
| (二) 实验药物单体 |
| (三) 实验引物及抗体 |
| (四) 实验试剂 |
| (五) 实验耗材 |
| (六) 实验仪器 |
| (七) 实验试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| (一) Transwell细胞迁移实验 |
| (二) 提取骨髓间充质干细胞RNA |
| (三) RNA逆转录及RT-PCR测定骨髓间充质干细胞目标基因表达 |
| (四) 构建质粒转染骨髓间充质干细胞沉默目标基因 |
| (五) 免疫蛋白印迹法检测骨髓间充质干细胞的目标蛋白表达 |
| (六) 统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| (一) 骨髓间充质干细胞Transwell迁移实验的结果 |
| (二) 骨髓间充质干细胞RT-PCR目标基因表达量的结果 |
| (三) 骨髓间充质干细胞质粒沉默目标基因表达的结果 |
| (四) 沉默后骨髓间充质干细胞RT-PCR目标基因表达量的结果 |
| (五) 沉默后骨髓间充质干细胞Transwell迁移实验的结果 |
| (六) 骨髓间充质干细胞免疫蛋白印迹法目标蛋白表达量的结果 |
| 第五节 棕榈酸对骨髓间充质干细胞分化的影响 |
| 一、实验材料 |
| (一) 实验细胞 |
| (二) 实验药物单体 |
| (三) 实验引物 |
| (四) 实验试剂 |
| (五) 实验耗材 |
| (六) 实验仪器 |
| (七) 实验试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| (一) 诱导骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化 |
| (二) 提取干预后骨髓间充质干细胞RNA |
| (三) RNA逆转录及RT-PCR测定骨髓间充质干细胞成骨相关基因表达 |
| (四) RNA逆转录及RT-PCR测定骨髓间充质干细胞成软骨相关基因表达 |
| (五) 统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| (一) 骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| (二) 骨髓间充质干细胞RT-PCR成骨分化相关基因表达量的结果 |
| (三) 骨髓间充质干细胞RT-PCR成软骨分化相关基因表达量的结果 |
| 第六节 实验讨论 |
| 一、中医活血化瘀法促进骨折愈合的理论依据 |
| 二、骨髓间充质干细胞在骨折愈合过程中扮演的角色 |
| 三、棕榈酸促进骨髓间充质干细胞增殖 |
| 四、棕榈酸促进骨髓间充质干细胞迁移 |
| 五、棕榈酸促进骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化 |
| 六、总结 |
| 结语 |
| 一、研究结论 |
| 二、意义和创新点 |
| 三、存在的问题 |
| 四、研究前景 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写附录 |
| 在校期间发表论文及获奖情况 |
| 发表论文 |
| 参与课题项目 |
| 国家实用新型专利 |
| 临床学术竞赛 |
| 国家高新技术产业 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（10）半月板后根部撕裂发病特点、治疗进展及疗效总结（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言(绪论) |
| 1.半月板根部解剖 |
| 1.1.内侧半月板根部解剖 |
| 1.2.外侧半月板根部解剖 |
| 2.半月板后根生物力学 |
| 2.1 内侧半月板后根(Medial meniscus posterior root/MMPR)生物力学 |
| 2.2 外侧半月板后根(Lateral meniscus posterior root/LMPR)生物力学 |
| 3.半月板根部损伤的临床特点 |
| 3.1 内侧半月板根部损伤临床特点 |
| 3.2 外侧半月板根部损伤临床特点 |
| 4.半月板后根部撕裂的分型 |
| 4.1 内侧半月板后根撕裂分型 |
| 4.2 外侧半月板后根撕裂分型 |
| 5.半月板后根部损伤的影像诊断 |
| 5.1 内侧半月板后根部撕裂的影像诊断 |
| 6.半月板后根部撕裂的治疗方法 |
| 6.1 半月板根部撕裂的手术指征 |
| 6.2 半月板根部撕裂的术前准备 |
| 6.3 半月板根部撕裂的手术方法 |
| 6.4 半月板根部撕裂缝合术后康复锻炼 |
| 7.半月板后根撕裂临床随访结果总结 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 研究质量评价 |
| 7.3 统计分析 |
| 7.4 Meta分析结果 |
| 8.结论 |
| 9.半月板后根撕裂的治疗难点与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者筒历及在学期间所取得的科研成果 |
四、软骨源性生长因子研究进展（论文参考文献）
- [1]补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床研究及对人髓核细胞活性与功能的影响[D]. 李凯明. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]基于Wnt通路探讨经筋针刺调控KOA大鼠股四头肌再生修复的机制研究[D]. 富昱. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [4]富血小板血浆（Platelet-rich Plasma,PRP）治疗薄型子宫内膜的研究[D]. 王晓寒. 山东大学, 2021(11)
- [5]FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究[D]. 宋华. 山东大学, 2021(11)
- [6]去白细胞富血小板血浆治疗出血性关节炎的实验研究[D]. 薛禹伦. 苏州大学, 2020(02)
- [7]Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究[D]. 潘政军. 安徽医科大学, 2019(07)
- [8]生长因子在软骨组织工程中的研究进展[J]. 孙东东,孙明林,高丽兰. 中华骨科杂志, 2019(10)
- [9]棕榈酸促进大鼠骨髓间充质干细胞体外迁移及成骨、成软骨分化的基础实验研究[D]. 陈鸿泰. 广州中医药大学, 2019
- [10]半月板后根部撕裂发病特点、治疗进展及疗效总结[D]. 刘肖男. 浙江大学, 2019(03)