一、弓形虫灭活苗通过成果鉴定（论文文献综述）
张海生[1]（2021）在《弓形虫HAD磷酸酶家族基因缺失株的构建及其免疫保护性评价》文中研究说明弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种寄生于除红细胞以外的所有有核细胞内的顶复门原虫。它的特点是中间宿主广泛、形态复杂多变、猫及猫科动物是它的唯一终末宿主。它的形态包括速殖子、缓殖子、卵囊等,孢子化后的卵囊具有很强的感染力。它感染宿主后会引起严重的弓形虫病症状,可导致怀孕宿主流产或产生死胎,对免疫功能低下或者有缺陷的宿主可能造成死亡等。目前全世界范围内约有三分之一的人感染弓形虫,被弓形虫感染的牛、羊、猪等动物更是不计其数。弓形虫对畜牧业发展和人类生命和健康造成严重威胁,而弓形虫弱毒疫苗的研制是目前最有可能防控弓形虫感染的突破口,所以研制一种有效预防弓形虫感染的弱毒疫苗迫在眉睫。卤代酸脱卤酶（haloacid dehalogenase,HAD）磷酸酶结构域在弓形虫顶质体复合物萌芽过程中发挥重要作用,主要与弓形虫的出芽增殖有关。本实验通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,对HAD磷酸酶家族基因中的HAD2a、HAD2b、HAD2c、HAD2d基因进行了敲除,并研究了这四种基因缺失后对弓形虫逸出能力、体外增殖和毒力的影响。研究发现,分别敲除HAD2b、HAD2c、HAD2d基因后,对弓形虫RH株的逸出能力、体外增殖速度和在小鼠的毒力没有影响。但是敲除HAD2a后所构建的RHΔHAD2a株,其体外增殖速度相比野生RH株明显减慢,形成噬斑的数量明显减少;其毒力丧失,分别用102、103、104、105、106不同剂量的RHΔHAD2a敲除株攻击小鼠,小鼠存活率均为100%。所以HAD2a是弓形虫的毒力基因,RHΔHAD2a敲除株具备成为弓形虫弱毒疫苗株的潜力。为了评价RHΔHAD2a敲除株是否可能作为弓形虫弱毒疫苗候选虫株,我们对其在小鼠的免疫保护力进行了研究。用50,000个RHΔHAD2a速殖子对小鼠进行免疫,在免疫后的第30 d采集小鼠血清,对血清中特异性的抗弓形虫Ig G进行了检测,发现免疫组小鼠体内的Ig G抗体明显高于空白对照组。免疫组小鼠的Ig G1和Ig G2a水平也明显高于空白组,Ig G2a抗体的含量高于Ig G1,说明RHΔHAD2a敲除株免疫小鼠所引起的免疫反应主要是Th1型反应。在急性感染实验中,用500个弓形虫RH株和Toxo DB#9 PYS株速殖子感染免疫小鼠,结果显示RHΔHAD2a敲除株免疫小鼠所引起的免疫反应不能抵抗弓形虫的急性感染,但可明显延长小鼠的存活时间。在慢性感染实验中,用20个弓形虫PRU包囊和50个PRU卵囊感染免疫过的小鼠,被包囊感染的10只免疫小鼠存活了8只,在其中三只小鼠的脑组织中检测到包囊;被卵囊感染的10只免疫小鼠全部存活,在其中三只小鼠脑组织内检测到包囊。综上所述,HAD2b、HAD2c、HAD2d基因不是弓形虫的毒力基因,分别敲除后不影响弓形虫的逸出能力、体外增殖速度和对小鼠的毒力。HAD2a是弓形虫的毒力基因,敲除后弓形虫毒力丧失,体外生长速度变慢,不形成“玫瑰花环”。给小鼠免疫RHΔHAD2a敲除株能引起较强的保护性免疫应答,虽不能抵抗弓形虫的急性感染,但对弓形虫的慢性感染具有较好的免疫保护作用,值得进一步研究。
田润博[2]（2021）在《PCV2d ORF2基因和猪IL-18基因重组PRV活载体毒株的构建及其免疫原性初步探究》文中提出尽管我国为猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus2,PCV2）和猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）的防控及净化付出了重大努力,但PCV2和PRV仍在我国猪场普遍存在。PCV2感染后可导致猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus-associated disease,PCVAD）的发生,而PRV感染可造成仔猪的高死亡率以及种猪的繁殖障碍,严重影响养猪业的发展。PCV2和PRV的混感事件已被多次报道,并被证实能引起更严重的肺和脑组织损伤。此外,近年来,我国PCV2流行毒株已由PCV2b转变为PCV2d,给PCV2的防控带来了新的挑战。对PCV2和PRV的防控主要是通过疫苗接种,但是,目前上市的疫苗存在成本高、操作繁琐和存在安全隐患等问题。因此,开发安全、有效的二联疫苗对于预防PCV2和PRV的感染、简化免疫程序、降低生产成本具有重要意义。本研究中,我们构建了表达PCV2d Cap蛋白的重组病毒rPRV-2d以及共表达PCV2d Cap蛋白和猪IL-18蛋白的重组病毒rPRV-2d-18,并对其生物学特性和免疫原性进行研究,以筛选安全、稳定,并具有良好免疫原性的重组病毒活载体疫苗候选株,为我国PCV2和PRV的防控及净化提供助力。本研究将PCV2d ORF2基因插入PRV通用转移质粒pG,构建重组质粒pG-2d-EGFP。再将gE-/gI-/TK PRV NY亲本株和重组质粒pG-2d-EGFP转染ST细胞,利用同源重组将PCV2d ORF2基因和EGFP表达盒插入gE-/gI-/TK-PRV NY亲本株的gG糖蛋白中,挑选带绿色荧光的病变灶,蚀斑纯化获得重组病毒rPRV-2d-EGFP。将EGFP基因双敲除质粒PX459-gRNA1-EZ-gRNA2和重组病毒rPRV-2d-EGFP转染ST细胞,利用CRISPR/Cas9技术,将EGFP基因敲除约1.2 kb,挑选不带绿色荧光的病变灶,蚀斑纯化后获得重组病毒rPRV-2d。RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光试验表明重组病毒rPRV-2d在ST细胞中可以成功表达PCV2d Cap蛋白。将猪IL-18基因插入真核表达载体pBApo-EF1αPurDNA中,构建真核表达质粒pBA-18。再将包含EF1α启动子、猪IL-18基因和HSV TK polyA的整个表达盒通过无缝克隆技术整合到重组质粒pG-2d-EGFP中,构建重组质粒pG-2d-18-EGFP,经过转染与蚀斑纯化获得带绿色荧光的重组病毒rPRV-2d-18-EGFP。利用CRISPR/Cas9技术,将EGFP基因敲除,通过蚀斑纯化获得不带绿色荧光的重组病毒rPRV-2d-18,并对其进行转录和表达水平的鉴定。结果表明,猪IL-18蛋白在ST细胞中被成功表达,并被切割成有生物活性的成熟IL-18蛋白。利用ST、PK-15、IPEC-J2和Vero细胞研究重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的培养增殖特性,并对重组病毒的理化特性、遗传稳定性、对小鼠的安全性和免疫原性等进行了研究。结果表明,重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18与gE-/gI-/TK-PRV NY亲本株具有相似的培养增殖特性,在ST细胞中的滴度最高（分别为106.25TCID50/0.1 mL和106.00 TCID50/0.1 mL）;重组病毒具有PRV的一般理化特性,具有良好的遗传稳定性和安全性,并能刺激小鼠机体产生与PCV2商品化灭活苗或gE-/gI-/TK-PRVNY亲本株同等水平的免疫应答,保护小鼠抵御PCV2 DF强毒株和PRV NY强毒株的攻击。但是,重组病毒rPRV-2d-18未表现出比重组病毒rPRV-2d更强的免疫效果,需要进一步的试验来对其进行优化。综上,本研究构建的重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18能正确地表达PCV2d Cap蛋白和猪IL-18蛋白,外源基因的插入对重组病毒的生物学特性没有显着影响。重组病毒能成功诱导小鼠产生PCV2和PRV特异性免疫应答,能在PRV强毒株的致死性攻击下为小鼠提供完全的保护力,并有效抑制各脏器中PCV2的增殖。本研究构建的重组病毒有望成为防控PCV2和PRV的疫苗候选株,为PCV2和PRV的防控和净化提供有力工具,并为重组病毒活载体疫苗的开发提供一定的理论依据。
孙颖[3]（2021）在《抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的研制》文中研究说明猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的一种急性、接触性传染病。TGEV对仔猪的危害尤为严重,导致小肠黏膜上皮细胞发生变性、坏死,造成水和电解质代谢紊乱、营养吸收障碍,引起仔猪严重腹泻、脱水和营养流失,患猪死亡率极高。疫苗免疫接种是目前防控TGE的主要手段,通过对怀孕母猪进行免疫接种,初生仔猪吸吮初乳而获得被动保护,但在生产中的实际效果并不十分理想;加上毒株的不断变异,造成疫苗免疫抗体不能给仔猪提供完全的免疫保护等,生产中对TGE的防控变得更加困难,使得本病在一些地区的猪场呈现暴发,造成的损失巨大。对TGE的防控实践中,通过注射或服用抗TGEV特异性抗体,获得了较好效果,其中卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）是一种重要的抗体产品。IgY具有来源方便、制备较为简单、价格相对低廉和效果良好的优点,在动物疫病防治中得到广泛使用。本研究对TGEV分离株进行增殖后制备灭活疫苗,免疫产蛋鹌鹑,提取抗TGEV IgY,通过对获得的特异性IgY的抗TGEV作用、特异性效价、稳定性等进行研究,获得了一种抗TGEV流行毒株的鹌鹑源卵黄抗体,为进一步临床应用提供了基础材料。本研究获得了以下结果:1.TGEV分离株在PK-15细胞中24 h病毒滴度最高。将TGEV分离株接种PK-15细胞,测定接毒后96 h内TGEV增殖曲线。结果显示,细胞在接毒后16 h出现典型细胞病变作用（Cytopathic effect,CPE）,24 h病毒滴度达到峰值(TCID50为10-7.3/m L),能满足制备疫苗的需要。2.TGEV分离株属流行毒株。克隆获得了TGEV分离株的N和S基因并进行序列分析,结果显示TGEV分离株属于Purdue like group分支,与国内雅安和哈尔滨的分离株SY-C和HE-1株亲缘关系最近,属于流行毒株。3.建立了TGEV抗体间接ELISA检测方法。TGEV S蛋白C抗原位点蛋白最佳包被浓度1.5μg/m L,样品最佳稀释度1:200,酶标抗体稀释度1:2000,孵育时间为20 min。当OD450值≥0.15时,判定结果为阳性。4.制备灭活免疫原接种鹌鹑获得高免蛋。制备了弗氏佐剂TGEV油包水型灭活苗。接种80只产蛋鹌鹑,收集血清及高免蛋。利用SDS-PAGE电泳分离抗体蛋白,结果显示IgY重链约为70 k Da,轻链约为28 k Da。分离纯化了特异性的抗TGEV流行毒株IgY。5.获得了纯度及效价高、制备简单、适于大量生产的抗TGEV流行毒株鹌鹑IgY。检测TGEV IgY的效价及特异性,结果显示第3次免疫后1周,抗体水平达到峰值(OD450为2.219)。商品苗对照组抗体的消长趋势与试验组一致,至免疫后第7周达到峰值(OD450为2.100)。说明制备的TGEV流行毒株灭活疫苗具有良好的免疫原性。IgY中和效价为1:109,比血清IgG抗体效价峰值（1:120）的出现滞后5～7 d。Western blot阳性条带的最大抗体稀释度为1:16000。IgY在70℃下及p H位于4.0～10.0区间时效价稳定;IgY在6 h内对胃蛋白酶具有一定抵抗力。
谢丽玲[4]（2020）在《江苏某种猪场伪狂犬病的防控与净化研究》文中研究表明猪伪狂犬病（pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）引起的传染病。该病可导致妊娠母猪流产、死胎,公猪不育,新生仔猪死亡,育肥猪呼吸困难、生长停滞。隐性感染猪和康复猪可以终身带毒,在应激或免疫力低下时发病并排毒,病毒经呼吸道或消化道感染同群猪。伪狂犬病在猪群中广泛存在,较难根除,给养猪业造成巨大的经济损失。美国和欧洲的一些国家依靠基因缺失苗和与之相配套的鉴别诊断方法,实施PR根除计划并已取得显着成效。我国借鉴国外成功的净化方案,部分猪场也实现了阳性场转阴。本研究于2015年～2018年间,在江苏某种猪场通过实施疫苗免疫、淘汰PRV野毒感染猪的净化方案,逐步降低PRV阳性率,最终达到PR净化。具体措施如下:首先,后备母猪在配种前3次接种勃林格公司Bartha K-61 gE基因缺失苗,种公猪和生产母猪一年4次接种同种疫苗;然后,采用IDEXX公司伪狂犬病毒gpI抗体（gE抗体）检测试剂盒一年4次检测,对检出gE抗体阳性的猪予以淘汰。为了评价该PR净化方案的效果,进一步分析了种猪场近4年的抗体检测数据以及生产数据,每年PRV gE抗体阳性率、PRV gB抗体水平以及种猪生产性能的变化。2015年～2018年间,共检测样品3255份（公猪416份、母猪2839份）,检出PRV gE抗体阳性170份（公猪30份、母猪140份）,阳性样品数呈现逐年下降趋势,整个种猪群2015年PRV阳性率从18.5%下降至10.29%,2016年阳性率降至3%,2017年阳性率降至0,2018年全年阳性率为0,达到净化预期。其中公猪样品2015年的PRV gE抗体阳性率从21.88%下降至16.67%,2016年降至7.41%,2017年第二季度阳性率下降至0;母猪样品2015年PRV gE抗体阳性率从17.86%下降至9.44%,2016年下降至2.31%,2017年第三季度下降至0。同时为了评价种猪群接种伪狂犬病疫苗后产生的免疫效果,从2017开始检测种猪群PRV gB抗体,结果显示合格率在95%以上,表明接种疫苗对种猪群有较好的免疫保护水平。对2015年～2018年生产数据分析后发现,母猪分娩率从2015年的83.87%到2018年的90.36%,上升7.73%;产活仔率从2015年的89.59%到2018年的95.56%,上升6.66%;断奶前仔猪成活率从2015年的88.40%到2018年的94.79%,上升7.23%。研究表明,种猪场实施伪狂犬病的净化,可以显着提高生产性能以及仔猪成活率。
方旭[5]（2020）在《新孢子虫AMA1与RON2蛋白互作的鉴定及其免疫保护性研究》文中研究指明犬新孢子虫（Neospora caninum,N.caninum）是一种胞内寄生性原虫,属于顶复门原虫。新孢子虫病呈全球性分布,给养牛业造成巨大的经济损失,世界范围内针对新孢子虫病尚无特效药物或疫苗。新孢子虫入侵宿主细胞是虫体突破机体防线的关键节点,其入侵过程主要为识别并黏附宿主细胞形成滑动连接体MJ侵入细胞后定殖。入侵过程取决于多种蛋白质在寄生虫和宿主细胞之间的相互作用,因此,研究新孢子虫入侵机理有助于发现与入侵相关的基因和宿主靶标。近年来的研究表明弓形虫RON2/4/5/8与顶膜抗原-1（AMA1）组成的复合体是MJ的关键结构,新孢子虫顶膜抗原-1可与多种蛋白相互作用,但同RON2之间是否存在相互作用还尚未得到证实。因此本研究拟利用GST-Pull down和双分子荧光互补技术确定新孢子虫AMA1与RON2之间是否存在相互作用,利用免疫荧光技术（IFA）对新孢子虫AMA1与RON2进行亚细胞定位,并进行新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠和山羊的免疫保护性研究,为新型抗新孢子虫药物及疫苗靶标的开发提供参考。Nc AMA1与Nc RON2互作的GST-Pull down鉴定:GST-Pull down实验发现通过纯化后的p GEX-4T-Nc RON2载体蛋白与p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白共孵育后,Western blot实验确定洗脱液中发现存在含His标签的p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白条带,GST标签蛋白与p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白共孵育得到的洗脱液中没有发现存在含His标签的p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白条带,证明了新孢子虫Nc AMA1与Nc RON2存在体外互作现象。Nc AMA1与Nc RON2互作的双分子荧光互补鉴定:构建双分子荧光互补载体p Nc AMA1-HA-KN151与p Nc RON2-Myc-LC151,激光共聚焦观察Nc AMA1和Nc RON2共转染试验组可以发出红色荧光,两个蛋白在细胞内的相互作用被进一步证明。Nc AMA1与Nc RON2蛋白的亚细胞定位:Nc AMA1蛋白在激光共聚焦显微镜下定位表达于虫体顶部显现绿色荧光,Nc RON2蛋白在激光共聚焦显微镜下定位于虫体与VERO细胞膜交界处显现橙红色荧光,且与Nc AMA1有共定位情况。证明了Nc AMA1与Nc RON2蛋白在新孢子虫黏附入侵阶段存在共定位情况和互作关系。通过免疫荧光亚细胞定位研究,新孢子虫AMA1与RON2蛋白作为新孢子虫入侵的指示抗原,研究新孢子虫AMA1与RON2蛋白在新孢子虫入侵时蛋白互作的位置,这有助于了解其生物学功能及相互之间存在的作用关系。Nc AMA1与Nc RON2黏附入侵阻断试验:利用抗体中和阻断技术进行试验,发现了新孢子虫AMA1与RON2蛋白多抗有效的降低了新孢子虫速殖子的入侵率,在多抗稀释比例为1:50时效果最佳,分别为AMA1多抗组降低36%、RON2多抗组降低39%和AMA1+RON2多抗组降低41%（p<0.001）,其中AMA1+RON2混合组阻断效果最好。但对新孢子虫速殖子的胞内增殖速度影响不大。Nc AMA1与Nc RON2对小鼠的免疫保护性研究:通过对小鼠免疫攻虫后发现,Nc AMA1和Nc RON2蛋白免疫小鼠后,小鼠的血清抗体效价和细胞因子水平显着提升（p<0.001）,且AMA1+RON2蛋白免疫组免疫效果最好;AMA1+RON2蛋白免疫攻虫组的小鼠生存率最高为25%,其他组小鼠均为0,同时AMA1+RON2蛋白免疫攻虫组的小鼠的脑组织荷虫量和组织损伤程度最低,说明了混合免疫效果优于单独免疫。显示了新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠具有较好的免疫保护性。Nc AMA1与Nc RON2混合免疫对山羊的保护性研究:通过对山羊免疫攻虫后发现Nc AMA1和Nc RON2蛋白免疫山羊后,山羊的血清抗体效价和细胞因子水平显着提升（p<0.001）,山羊的脑组织荷虫量显着降低其减虫率为56%（p<0.01）,心、肝、脾、肺、肾、脑组织病理变化有明显的减轻,说明Nc AMA1+Nc RON2蛋白混合免疫后对于山羊具有一定免疫保护作用。综上所述,本研究利用GST-Pull down技术、双分子荧光互补技术和亚细胞定位技术鉴定了新孢子虫AMA1与RON2蛋白之间存在相互作用,且通过黏附入侵阻断试验证明了新孢子虫AMA1和RON2蛋白参与了新孢子虫入侵细胞过程,最后通过小鼠和山羊的免疫保护性研究试验证明了新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠和山羊具有较好的免疫保护性,为防控新孢子虫感染提供了理论依据。
王璐瑶[6]（2020）在《弓形虫中腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸激酶的生物学功能的研究》文中研究指明弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫,在世界范围内广泛分布,不但危害人类的健康,也会对畜牧业造成巨大的经济损失。通常缓殖子和速殖子是弓形虫的两种表现形式,在中间宿主体内速殖子的快速繁殖会造成宿主的急性感染,严重时会表现为弓形虫眼病或者脑病。但在免疫系统正常的宿主中,弓形虫会以缓殖子的形式分化成为组织包囊,从而对所寄生的宿主造成长期的慢性感染。核苷酸的合成对于弓形虫的生存至关重要,核苷酸代谢相关的大多数酶在弓形虫生长发育的各个阶段均有表达,其中参与弓形虫嘌呤核苷酸合成过程中的次黄嘌呤黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HXGPRT）因为与腺苷酸激酶（adenosine kinase,AK）存在功能的冗余而被作为药物靶标广泛应用于弓形虫的遗传操作中。除此之外在弓形虫嘌呤核苷酸代谢过程中还有许多的酶参与其中,且大部分的功能并不清楚。本研究选择了目前发现的在弓形虫中合成腺嘌呤核苷酸的两个酶:腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosucccinate lyase,ADSL）和腺苷酸激酶（AK）进行遗传学和生物学功能的研究,以解析弓形虫核酸前体物质合成的分子机制。具体的工作包括以下几方面:（1）ADSL、AK敲除株的构建及功能研究利用CRISPR/CAS9基因编辑技术对弓形虫合成腺苷酸途径中的ADSL和AK两个基因分别进行单敲除和双敲除,对获得的敲除株进行一系列的表型实验,首先通过复制和空斑实验,证明了单敲除ADSL和AK后弓形虫的生长速度有所减慢,且双缺失虫株体外培养的生长缺陷更为明显。通过小鼠毒力实验证明了单敲除ADSL后弓形虫的毒力减弱和包囊形成数量减少,但高剂量的ΔADSL虫株感染ICR小鼠后其毒力与野生型无明显差异。相同条件下提高ΔADSLΔAK虫株的感染剂量至105,被感染的小鼠无明显的临床症状且存活率为100%。荷虫量试验结果证明相比于ΔADSL和野生型ME49虫株,ΔADSLΔAK虫株在体内存在繁殖缺陷。综上所述,ADSL、AK的缺失影响了弓形虫的生长发育。（2）腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）缺失虫株可作为弓形虫的候选减毒活疫苗提供良好的免疫保护100个Me49ΔADSL速殖子感染ICR小鼠,结果显示弓形虫毒力减弱和包囊形成数量减少。本研究评估了Me49ΔADSL的免疫保护性,免疫ΔADSL的小鼠可以抵抗弓形虫Ⅰ（RH）、Ⅱ（ME49）、Ⅲ（VEG）型虫株的再次感染,并在感染的短期（30d）和长期（70d）均提供100%的免疫保护力。在免疫ΔADSL虫株的小鼠血清中可以检测到高水平的特异性Ig G抗体。进一步的研究发现,免疫接种Me49ΔADSL后的小鼠分别在30d和70d收集血清,进行细胞因子的检测,结果证明免疫后的宿主会产生高水平的细胞因子INF-γ和IL-12。采集免疫150d的小鼠脾细胞体外培养后用弓形虫全虫抗原进行刺激后,产生了高水平的INF-γ和IL-12,细胞因子IL-12-INF-γ轴对于控制弓形虫的感染过程中起关键的作用。这些结果表明,Me49ΔADSL虫株诱导的免疫保护中,细胞免疫可能占主导作用。综上所述,本研究通过对嘌呤核苷酸合成过程中ADSL和AK的研究,发现其对弓形虫体外和体内的生长都非常关键。敲除株（Me49ΔADSL）能够提供良好的免疫保护,可以作为减毒活疫苗的候选。
宋世斌[7]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中认为干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
吴保义[8]（2020）在《新孢子虫NcAMA1蛋白与Vero细胞互作蛋白的筛选与初步鉴定》文中认为新孢子虫病（Neosporosis）呈世界性分布,目前全球犬类中感染率为17.14%,因新孢子虫病造成的流产对全球畜牧经济造成了巨大损失。该病对牛的危害最为严重,主要临床症状为流产,胎儿出生体重低于平均体重,运动障碍等。新孢子虫（Neospora caninum）为顶复门寄生虫,感染宿主非常广泛,包括牛,马,绵羊,山羊等多种家畜,其特有的棒状体细胞器分泌的棒状体颈部蛋白和NcAMA1蛋白形成的运动结合体（MJ）在虫体入侵过程中起到非常关键的作用,本次研究以新孢子虫NcAMA1蛋白作为研究对象,探究与NcAMA1蛋白发生相互作用的宿主细胞蛋白。为筛选出Vero细胞与NcAMA1蛋白相互作用的蛋白,本次试验根据GenBank中公布的NcAMA1基因,设计引物,从新孢子虫cDNA中扩增NcAMA1基因,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcAMA1,通过自转录活性检测,毒性检测验证诱饵载体的可行性,并验证了诱饵载体在酵母菌株中表达情况。通过酵母双杂交技术,对Vero细胞cDNA文库进行筛选。构建NcAMA1基因的原核表达载体和筛选到的宿主细胞蛋白Tmed2的原核表达载体,在体外进行原核表达,得到两种蛋白后经过pull-down进行再次验证NcAMA1蛋白和Tmed2蛋白在体外可发生相互作用。最终利用RNA干扰技术和抗体封闭试验,检测Tmed2对新孢子虫的入侵产生的影响。结果表明,本次试验成功从新孢子虫cDNA中扩增出NcAMA1基因,经过验证构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcAMA1无自转录活性,且对酵母菌株无细胞毒性,可以在酵母菌株中成功表达出NcAMA1蛋白。通过酵母双杂交技术成功从Vero细胞cDNA文库中筛选出与NcAMA 1蛋白相互作用的宿主蛋白细丝蛋白A（FLNA）和跨膜emp24域转运蛋白2（Tmed2）。成功构建了原核表达载体pGEX-4T1-Tmed2和pET28a-NcAMA1,在体外表达出Tmed2蛋白和NcAMA1蛋白,并通过pull-down技术验证了宿主细胞蛋白Tmed2和新孢子虫NcAMA1蛋白可以在体外发生相互作用。利用RNA干扰和抗体封闭试验,对Vero细胞进行处理后,检测虫体的入侵率均有所上升,表明本次实验筛选到的宿主细胞蛋白Tmed2在新孢子虫入侵过程中可能起到抑制作用,为探究新孢子虫的入侵过程提供了一定的科学依据。
艾康[9]（2020）在《弓形虫紫外线致弱株免疫小鼠过程中血清蛋白质组学研究》文中指出弓形虫是一种专性寄生于细胞内的原虫,几乎能感染所有的温血动物,包括人类。尽管抗弓形虫疫苗种类繁多,但是疫苗效用评价都缺乏对动物免疫应答过程进行系统生物学监控。针对此问题,本研究首先构建及评价了多种疫苗免疫模型,接下来利用非标记定量蛋白质组学技术对小鼠免疫过程中的血清蛋白质组进行了检测及分析。动物模型构建:我们首先利用CRISPR-Cas9技术成功构建了TGME49276860基因敲除虫株,通过体外噬斑实验及体内攻虫实验发现该基因敲除株毒力并未明显降低。接下来,我们成功构建了 TGME49276860和TgSPATR双基因DNA核酸疫苗。动物攻虫实验表明TGME49276860和TgSPATR双基因组的DNA疫苗能够显着延长小鼠存活时间,但是免疫小鼠并不能得到充分保护。最后我们利用紫外线照射成功制备了弓形虫RH强毒株减毒活苗。噬斑实验、流式细胞仪检测、电镜和动物实验表明弓形虫减毒活疫苗的最佳紫外照射时间为14min。攻虫实验表明免疫小鼠在感染100个野生型RH速殖子后存活率达到百分之百。蛋白质组学分析及评价:根据紫外减毒疫苗动物模型,我们通过内眦采血法分别采集了对照组及免疫攻虫后28天组的小鼠血液,并利用TMT（tandem mass tags）蛋白质组学对血清样品进行了分析。结果表明不同组别呈现了明显不同的蛋白图谱。免疫小鼠在攻虫后28天明显拮抗了急性期时出现的蛋白紊乱。通过和正常对照组比较,我们发现免疫攻虫后28天组小鼠出现的差异表达蛋白显着富集于免疫及拮抗病原的相关的信号通路。综上所述,本课题首次利用TMT蛋白质组学对紫外减毒疫苗免疫过程中的小鼠血清进行了分析,不仅成功绘制了免疫过程中血清蛋白图谱,还从蛋白质组学的角度解释了疫苗发挥效用的系统生物学机制。本研究为深入阐明弓形虫疫苗的作用机制奠定基础,也为新型疫苗的研发及体外干预治疗提供了数据参考。
杜博亚[10]（2020）在《新孢子虫原癌基因调控蛋白MYR基因敲除株的构建及其功能研究》文中指出犬新孢子虫（Neospora caninum）属于顶复门原虫,主要引起犬的神经系统机能障碍,牛的流产、死胎和新生犊牛的运动神经系统疾病,给畜牧业造成巨大损失。近年来对新孢子虫基因功能研究发现,虫体棒状体蛋白、微线体蛋白和致密颗粒蛋白等参与新孢子虫入侵、增殖等致病过程,但仍有许多新孢子虫基因功能尤其是致病相关基因的功能尚不清楚。原癌基因调控蛋白（MYRs）可调控宿主细胞原癌基因（c-Myc）表达。近来研究报道疟原虫、弓形虫、锥虫可显着提高宿主细胞原癌基因表达量。弓形虫MYR与宿主细胞原癌基因、纳虫空泡及虫体致病相关,但新孢子虫MYR基因功能尚不清楚。因此,本研究通过免疫荧光观察NcMYR1和NcMYR2蛋白亚细胞定位;运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株（△NcMYR1）和NcMYR2基因敲除虫株（△NcMYR2）,对△NcMYR1和△NcMYR2虫株在入侵、增殖、虫体毒力和致病性等方面的功能进行研究,并研究重组NcMYR1蛋白和△NcMYR1虫株对小鼠抗新孢子虫野生株感染的保护作用,以期明确NcMYR1和NcMYR2的功能,为研究新孢子虫对宿主的致病性和研究新孢子虫病的防治提供理论基础。1、NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体中的亚细胞定位通过生物信息学分析获得NcMYR1和NcMYR2基因序列,原核表达技术制备和纯化重组NcMYR1和NcMYR2蛋白,制备抗NcMYR1和NcMYR2蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光对新孢子虫NcMYR1和NcMYR2蛋白进行亚细胞定位。首先,成功构建pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2基因表达载体,并成功诱导表达pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2重组蛋白,发现pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2重组蛋白均为上清表达,随后纯化蛋白并免疫小鼠。三次免疫后将小鼠眼球采血并离心收取血清作为多克隆抗体,通过细胞内和细胞外免疫荧光观察新孢子虫NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体中的亚细胞定位。结果显示,NcMYR1和NcMYR2蛋白定位于虫体速殖子细胞质。2、NcMYR1基因敲除虫株和NcMYR2基因敲除虫株的构建运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株（△NcMYR1）和NcMYR2基因敲除虫株（△NcMYR2）,通过PCR、Western blot和免疫荧光对敲除虫株鉴定。首先成功合成Nc-pSAG1-Cas9:U6-SgUPRT-NcMYR1和Nc-pSAG1-Cas9:U6-SgUPRT-NcMYR2载体并扩增DHFR同源重组基因片段。随后通过电转,培养和筛选单克隆,并通过PCR、Western blot和免疫荧光鉴定是否构建成功。结果表明△NcMYR1和△NcMYR2虫株在gRNA位点成功插入DHFR同源重组基因片段,△NcMYR1和△NcMYR2虫株不再表达NcMYR1、NcMYR2蛋白,证明成功构建△NcMYR1和△NcMYR2虫株。3、NcMYR1和NcMYR2基因功能研究通过噬斑试验、入侵、增殖、逸出试验与虫体毒力试验,以探究NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果表明,与野生虫株相比,△NcMYR1虫株的噬斑面积减小（P<0.001）;入侵率降低（P<0.001）;增殖率降低（P<0.001）;逸出率下降（P<0.05）。△NcMYR2虫株在噬斑面积、入侵、增殖和逸出方面与野生虫株相比差异不显着（P>0.05）。将△NcMYR1、△NcMYR2虫株和野生虫株分别感染BALB/c小鼠观察小鼠生存状况,检测细胞因子、虫体数量和观察病理变化。结果表明,与感染野生虫株小鼠相比,感染△NcMYR1虫株的小鼠生存率达到100%,接种△NcMYR2虫株的小鼠生存率为0%,说明敲除NcMYR1的新孢子虫毒力降低,而敲除NcMYR2的新孢子虫毒力并没有受到影响。感染△NcMYR1虫株的小鼠血清中IL-6、IL-12、IFN-γ分泌下降且差异显着（P<0.01）,而感染△NcMYR2虫株小鼠的血清中IL-6分泌下降且差异显着（P<0.05）,IL-12和IFN-γ分泌均升高但差异不显着（P>0.05）。qPCR结果显示,感染△NcMYR1虫株小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑荷虫量降低（P<0.05）;感染△NcMYR2虫株小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑荷虫量与感染野生虫株小鼠相比均差异不显着（P>0.05）。感染△NcMYR1虫株小鼠与感染野生虫株小鼠相比心、肝、脾、肺、肾和脑病理变化减轻,而感染△NcMYR2虫株小鼠上述器官病理变化与感染野生虫株小鼠相比无明显差异。说明△NcMYR1虫株对小鼠致病性减弱。以上研究表明,NcMYR1是新孢子虫入侵和毒力基因,敲除NcMYR1蛋白后虫株生长、增殖、致病性等方面明显减弱,毒力显着降低,可作为疫苗候选分子。而敲除NcMYR2基因后虫株在生长、增殖、致病性和毒力等方面都没有显着变化。4、△NcMYR1虫株对小鼠抗野生株感染的保护作用将上述试验中毒力减弱的△NcMYR1虫株作为弱毒虫苗免疫小鼠,分别在第1、10、20、30、40d后进行尾静脉采血进行细胞因子检测,以及感染新孢子虫Nc-1虫株观察小鼠生存状态。免疫△NcMYR1虫株40天时IFN-γ达到峰值,IL-12在免疫△NcMYR1虫株10d时达到峰值。5组小鼠免疫△NcMYR1虫株后第10、20、30、40d分别感染新孢子虫野生虫株,另外一组作为阴性对照组。10d组生存率达到30%,20d组生存率达到20%,30d组生存率达到10%,40d组生存率达到80%,表明利用△NcMYR1虫株免疫的小鼠对新孢子虫野生虫株感染产生免疫保护力。将上述的重组NcMYR1蛋白做为疫苗抗原免疫小鼠,随后接种新孢子虫,观察小鼠生存状态以对NcMYR1蛋白的免疫效果进行评价。结果显示,免疫NcMYR1蛋白的小鼠,IL-12与IFN-γ分泌量与对照组相比显着升高（P<0.001）,且免疫NcMYR1蛋白后感染新孢子虫,小鼠生存率达到20%。综上所述,NcMYR1和NcMYR2蛋白亚细胞定位于虫体细胞质;运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株（△NcMYR1）和NcMYR2基因敲除虫株（△NcMYR2）,△NcMYR1虫株在虫体生长、增殖、虫体毒力和虫体致病力等方面显着减弱。以△NcMYR1虫株作为弱毒虫苗的免疫保护效力最高达到80%。为新孢子虫抗原疫苗的研究奠定基础。
二、弓形虫灭活苗通过成果鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、弓形虫灭活苗通过成果鉴定（论文提纲范文）
（1）弓形虫HAD磷酸酶家族基因缺失株的构建及其免疫保护性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 弓形虫概述 |
| 1.1.1 病原体简介 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史及传播 |
| 1.1.3 弓形虫的危害及其流行 |
| 1.2 弓形虫的预防和治疗 |
| 1.2.1 弓形虫传统疫苗的研究 |
| 1.2.2 弓形虫传统弱毒疫苗 |
| 1.3 CRISPR-Cas9 系统简介 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9 技术在弓形虫疫苗研制中的应用 |
| 1.4 弓形虫传统基因编辑疫苗 |
| 1.5 利用 CRISPR-Cas9 基因编辑疫苗 |
| 1.6 关于弓形虫HAD基因的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 弓形虫 HAD2a/b/c/d 基因缺失株的构建及表型研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物虫株、细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 HAD2a/b/c/d四种基因敲除质粒的构建 |
| 2.2.2 HAD2a/b/c/d四种基因同源DHFR抗性片段的构建与回收 |
| 2.2.3 RHΔHAD2a/b/c/d缺失株的构建和筛选 |
| 2.2.4 间接免疫荧光鉴定 |
| 2.2.5 噬斑实验 |
| 2.2.6 逸出实验 |
| 2.2.7 小鼠毒力实验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RHΔHAD2a/b/c/d敲除株的DNA鉴定结果 |
| 2.3.2 间接免疫荧光结果 |
| 2.3.3 噬斑试验结果 |
| 2.3.4 逸出试验结果 |
| 2.3.5 小鼠毒力试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 弓形虫RHΔHAD2A敲除株的免疫保护性评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 包囊 |
| 3.1.3 主要溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RHΔHAD2a敲除株速殖子的收集 |
| 3.2.2 小鼠的免疫 |
| 3.2.3 小鼠血清的制取 |
| 3.2.4 血清中Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体的检测 |
| 3.2.5 急性感染实验 |
| 3.2.6 慢性感染 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清中Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体水平 |
| 3.3.2 免疫小鼠用RH和PYS的急性感染 |
| 3.3.3 PRU虫株的包囊和卵囊的慢性感染 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）PCV2d ORF2基因和猪IL-18基因重组PRV活载体毒株的构建及其免疫原性初步探究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 猪圆环病毒研究进展 |
| 2 猪伪狂犬病病毒的研究进展 |
| 3 白细胞介素18的研究进展 |
| 引言 |
| 试验一 表达PCV2d Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒rPRV-2d株的拯救及纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、毒株和细胞等 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组病毒rPRV-2d的构建技术路线图 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 PCV2d ORF2基因的扩增与纯化 |
| 1.2.4 重组质粒pG-2d-EGFP的构建 |
| 1.2.5 重组质粒pG-2d-EGFP的鉴定 |
| 1.2.6 gE~-/gI~-/TK~- PRV NY株在ST细胞上的增殖 |
| 1.2.7 重组病毒rPRV-2d-EGFP的拯救 |
| 1.2.8 重组病毒rPRV-2d-EGFP的蚀斑纯化 |
| 1.2.9 重组病毒rPRV-2d的拯救 |
| 1.2.10 重组病毒rPRV-2d的蚀斑纯化 |
| 1.2.11 重组病毒rPRV-2d的ORF2基因在ST细胞中的转录及表达鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCV2d ORF2基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒pG-2d-EGFP的鉴定 |
| 2.3 重组病毒rPRV-2d-EGFP的拯救与蚀斑纯化 |
| 2.4 重组病毒rPRV-2d的拯救与蚀斑纯化 |
| 2.5 重组病毒rPRV-2d的转录鉴定 |
| 2.6 重组病毒rPRV-2d的表达鉴定 |
| 3 讨论 |
| 试验二 表达PCV2d Cap蛋白和猪IL-18蛋白的重组猪伪狂犬病病毒rPRV-2d-18株的拯救及纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、毒株和细胞等 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒pG-2d-18-EGFP的构建技术路线图 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 质粒pMD-IL18的鉴定 |
| 1.2.4 猪IL-18基因的PCR扩增与纯化 |
| 1.2.5 真核表达质粒pBA-18的构建 |
| 1.2.6 真核表达质粒pBA-18的鉴定 |
| 1.2.7 重组质粒pG-2d-18-EGFP的构建 |
| 1.2.8 重组质粒pG-2d-18-EGFP的鉴定 |
| 1.2.9 重组病毒rPRV-2d-1 8-EGFP的拯救 |
| 1.2.10 重组病毒rPRV-2d-18-EGFP的蚀斑纯化 |
| 1.2.11 重组病毒rPRV-2d-18的拯救 |
| 1.2.12 重组病毒rPRV-2d-18的蚀斑纯化 |
| 1.2.13 重组病毒rPRV-2d-18的猪IL-18基因在ST细胞中的转录及表达鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 质粒pMD-IL18的PCR与酶切鉴定结果 |
| 2.2 真核表达质粒pBA-18的鉴定结果 |
| 2.3 重组质粒pG-2d-18-EGFP的鉴定结果 |
| 2.4 重组病毒rPRV-2d-18-EGFP的拯救与蚀斑纯化 |
| 2.5 重组病毒rPRV-2d-18的拯救与蚀斑纯化 |
| 2.6 重组病毒rPRV-2d-18的转录鉴定 |
| 2.7 重组病毒rPRV-2d-18的表达鉴定 |
| 3 讨论 |
| 试验三 重组病毒株rPRV-2d和rPRV-2d-18的部分生物学特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在不同细胞上的培养特性 |
| 1.2.2 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在不同细胞上的TCID_(50)测定 |
| 1.2.3 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的一步生长曲线分析 |
| 1.2.4 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的理化特性研究 |
| 1.2.5 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的遗传稳定性 |
| 1.2.6 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的安全性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在不同细胞上的培养特性分析 |
| 2.1.1 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在ST细胞上的培养特性 |
| 2.1.2 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在PK-15细胞上的培养特性 |
| 2.1.3 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在IPEC-J2细胞上的培养特性 |
| 2.1.4 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在Vero细胞上的培养特性 |
| 2.2 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18在不同细胞上的TCID_(50)测定结果 |
| 2.3 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的一步生长曲线分析 |
| 2.4 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的理化特性研究 |
| 2.5 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的遗传稳定性 |
| 2.6 重组病毒rPRV-2d和rPRV-2d-18的安全性试验 |
| 3 讨论 |
| 试验四 重组病毒株rPRV-2d和rPRV-2d-18的免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 疫苗和毒株 |
| 1.1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小鼠免疫试验 |
| 1.2.2 PCV2DF强毒株的增殖与病毒滴度测定 |
| 1.2.3 PCV2特异性抗体的间接ELISA检测 |
| 1.2.4 PRV特异性抗体的间接ELISA检测 |
| 1.2.5 PCV2的血清中和试验 |
| 1.2.6 PRV的血清中和试验 |
| 1.2.7 攻毒保护试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCV2特异性抗体的间接ELISA检测结果 |
| 2.2 PRV特异性抗体的间接ELISA检测结果 |
| 2.3 PCV2的血清中和试验结果 |
| 2.4 PRV的血清中和试验结果 |
| 2.5 PCV2的攻毒保护试验 |
| 2.6 PRV的攻毒保护试验 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（3）抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪传染性胃肠炎防控及卵黄抗体研究进展 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎的研究概况 |
| 1.1.1 猪传染性胃肠炎及猪传染性胃肠炎病毒 |
| 1.1.2 传染性胃肠炎的流行病学 |
| 1.1.3 猪传染性胃肠炎的防控 |
| 1.2 卵黄抗体及其应用 |
| 1.2.1 卵黄抗体的结构和功能 |
| 1.2.2 卵黄抗体的提取和制备方法 |
| 1.2.3 卵黄抗体的应用 |
| 1.2.4 鹌鹑用于生产卵黄抗体的可行性 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪传染性胃肠炎病毒分离株的分析及抗体检测ELISA方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及血清 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TGEV分离株生长曲线和病毒滴度测定 |
| 2.2.2 TGEV分离株遗传变异分析 |
| 2.2.3 检测 TGEV 抗体 ELISA 方法的建立 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 TGEV分离株的鉴定与滴度测定 |
| 2.3.2 TGEV分离株的基因变异分析 |
| 2.3.3 建立TGEV抗体检测ELISA方法 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的提取和抗病毒活性检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒和动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 猪传染性胃肠炎病毒流行毒株灭活疫苗的制备及检验 |
| 3.2.2 产蛋鹌鹑免疫及高免蛋黄的初步收集 |
| 3.2.3 卵黄抗体的提取及纯化 |
| 3.2.4 卵黄抗体的理化特性及纯度检验 |
| 3.2.5 抗猪传染性胃肠炎卵黄抗体的效价测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TGEV分离株灭活疫苗检验 |
| 3.3.2 卵黄抗体提取方法的优化 |
| 3.3.3 卵黄抗体抗TGEV效价的检测 |
| 3.3.4 卵黄抗体对TGEV的中和效价 |
| 3.3.5 卵黄抗体的理化特性及安全性检验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 本文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A 缩略词及中英文对照表 （Abbreviation Index） |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）江苏某种猪场伪狂犬病的防控与净化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 猪伪狂犬病的研究进展 |
| 1 伪狂犬病 |
| 2 伪狂犬病毒 |
| 2.1 PRV基因组结构和基因表达 |
| 2.2 PRV的复制 |
| 2.3 PRV的变异毒株 |
| 3 PRV的致病机制 |
| 4 PRV的流行病学 |
| 4.1 宿主范围 |
| 4.2 传播方式 |
| 4.3 临床症状 |
| 4.4 病理变化 |
| 5 PRV的诊断与检测 |
| 5.1 PRV的ELISA检测 |
| 5.2 病毒的分离与鉴定 |
| 5.2.1 人工感染家兔实验 |
| 5.2.2 细胞培养PRV试验 |
| 5.3 中和试验(SNT) |
| 5.4 免疫荧光法 |
| 5.5 PCR技术 |
| 6 防制 |
| 6.1 规范引种 |
| 6.2 疫苗免疫 |
| 6.3 生物安全防控 |
| 6.4 监测抗体水平动态 |
| 第二章 试验研究江苏某种猪场伪狂犬病的防控与净化研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 器材 |
| 1.2 猪伪狂犬病疫苗 |
| 1.3 试剂 |
| 1.3.1 PRV gpI(gE)抗体检测试剂盒 |
| 1.3.2 PRV gB抗体检测试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验猪场 |
| 2.2 猪场PR净化方案 |
| 2.2.1 猪场PR净化的评定标准 |
| 2.2.2 PR的免疫净化路线 |
| 2.2.3 猪场PR感染程度 |
| 2.2.4 猪场PR净化实施方案 |
| 2.3 猪场PRV免疫和感染情况监测 |
| 2.3.1 样本的采集 |
| 2.3.2 检测方法 |
| 2.4 PR净化后阴性场的维持 |
| 3 结果 |
| 3.1 2015年～2018年种猪PRV-gE抗体检测情况 |
| 3.1.1 2015年种猪PRV-gE抗体检测情况 |
| 3.1.2 2016年种猪PRV-gE抗体检测情况 |
| 3.1.3 2017年种猪PRV-gE抗体检测情况 |
| 3.1.4 2018年种猪PRV-gE抗体检测情况 |
| 3.2 2015年～2018年种猪PRV-gE抗体阳性率趋势变化 |
| 3.3 2017年～2018年期间检测种猪PRV-gB抗体情况 |
| 3.4 PR对猪场生产水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）新孢子虫AMA1与RON2蛋白互作的鉴定及其免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新孢子虫病研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状和病理变化 |
| 4 诊断 |
| 5 防治 |
| 第二章 新孢子虫入侵机制 |
| 1 入侵过程 |
| 2 入侵相关蛋白 |
| 2.1 微线蛋白 |
| 2.2 棒状体蛋白 |
| 2.3 致密颗粒蛋白 |
| 2.4 顶膜抗原-1 |
| 2.5 棒状体颈部蛋白-2 |
| 3 入侵机制的验证 |
| 3.1 黏附入侵阻断的应用 |
| 3.2 入侵相关蛋白的免疫保护作用 |
| 第三章 蛋白质相互作用研究技术进展 |
| 1 GST-Pull down |
| 2 双分子荧光互补 |
| 3 亚细胞共定位 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新孢子虫NcAMA1与NcRON2 相互作用的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 NcAMA1与NcRON2 相互作用的GST-Pull down鉴定 |
| 1.2 NcAMA1与NcRON2 相互作用的双分子荧光互补鉴定 |
| 1.3 新孢子虫AMA1与RON2 蛋白的亚细胞定位 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nc AMA1与Nc RON2 相互作用的GST-Pull down鉴定 |
| 2.2 Nc AMA1与Nc RON2 相互作用的双分子荧光互补鉴定 |
| 2.3 新孢子虫AMA1与RON2 蛋白的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 Nc AMA1与Nc RON2 黏附入侵阻断试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫株与细胞 |
| 1.2 主要试剂和材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 入侵试验 |
| 1.5 胞内增殖试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 入侵试验 |
| 2.2 增殖试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Nc AMA1与Nc RON2 对小鼠的免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫株与细胞 |
| 1.2 实验动物与实验动物伦理 |
| 1.3 主要试剂和材料 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 小鼠的抗体和细胞因子水平分析 |
| 1.6 小鼠存活率分析 |
| 1.7 小鼠组织病理变化分析 |
| 1.8 荧光定量检测 |
| 1.9 ELISA检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠的抗体和细胞因子水平 |
| 2.2 小鼠存活率试验 |
| 2.3 小鼠病理组织变化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 NcAMA1与NcRON2 混合免疫对山羊的保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 虫株与细胞 |
| 1.2 实验动物与实验动物伦理 |
| 1.3 主要试剂和材料 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 山羊的抗体和细胞因子水平分析 |
| 1.6 山羊组织病理变化分析 |
| 1.7 荧光定量检测 |
| 1.8 ELISA检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 山羊的抗体和细胞因子水平 |
| 2.2 山羊病理组织变化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）弓形虫中腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸激酶的生物学功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 弓形虫综述 |
| 1.1.1 弓形虫 |
| 1.1.2 弓形虫的基因型与毒力 |
| 1.1.3 弓形虫与宿主的免疫反应 |
| 1.2 弓形虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 灭活疫苗及弱毒活疫苗 |
| 1.2.2 基因缺失减毒活疫苗 |
| 1.2.3 DNA疫苗 |
| 1.2.4 亚单位疫苗 |
| 1.3 弓形虫嘌呤核苷酸代谢的研究进展 |
| 2.研究目的与意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验菌株、虫株与细胞 |
| 3.1.3 载体与质粒 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂盒 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 弓形虫的体外培养 |
| 3.3.2 弓形虫基因组DNA的提取 |
| 3.3.3 弓形虫RNA的提取 |
| 3.3.4 弓形虫cDNA的制备 |
| 3.3.5 相关质粒的构建 |
| 3.3.6 His-ADSL重组蛋白的原核表达 |
| 3.3.7 His融合蛋白的纯化 |
| 3.3.8 纯化蛋白的透析与保存 |
| 3.3.9 BCA法测蛋白质浓度 |
| 3.3.10 ADSL原核表达蛋白\免疫血清样品Western-blot鉴定 |
| 3.3.11 免疫兔制备多克隆抗体 |
| 3.3.12 ADSL及 AK敲除株的构建及鉴定 |
| 3.3.13 复制试验 |
| 3.3.14 弓形虫虫株毒力试验以及毒力梯度实验 |
| 3.3.15 ELASE检测小鼠血清/Ig G抗体 |
| 3.3.16 小鼠脑包囊计数 |
| 3.3.17 空斑试验 |
| 3.3.18 小鼠体内荷虫量实验 |
| 3.3.19 荧光定量PCR(qPCR)实验 |
| 3.3.20 小鼠免疫保护实验 |
| 3.3.21 免疫小鼠脾细胞悬液的制备 |
| 3.3.22 小鼠血清和脾细胞培养上清细胞因子的检测 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 ADSL和AK基因的缺失株和ADSL回补虫株的获得以及功能鉴定 |
| 4.1.1 ADSL和 AK基因CRISPR质粒的构建 |
| 4.1.2 ADSL和 AK基因同源模板质粒的构建 |
| 4.1.3 构建ADSL和 AK敲除株 |
| 4.1.4 ADSL敲除株体外生长实验 |
| 4.1.5 ADSL缺失导致弓形虫毒力减弱和脑包囊数量减少 |
| 4.1.6 Com-ADSL虫株的构建以及鉴定 |
| 4.2 ADSL、AK双敲除虫株的构建及功能研究 |
| 4.2.1 ADSL、AK双缺失虫株的构建 |
| 4.2.2 ADSL、AK双缺失虫株的功能研究 |
| 4.3 ADSL蛋白的表达与纯化 |
| 4.3.1 ADSL原核表达质粒的构建 |
| 4.3.2 ADSL重组蛋白原核表达 |
| 4.3.3 ADSL重组蛋白的纯化及鉴定 |
| 4.3.4 鉴定ADSL蛋白与其制备的多克隆抗体的相互作用 |
| 4.4 腺苷酸琥珀酸裂解酶敲除株的免疫保护评估与机制研究 |
| 4.4.1 ME49△ADSL免疫接种引起对速殖子感染的强免疫保护性 |
| 4.4.2 免疫ME49△ADSL后弓形虫细胞因子和Ig G抗体的水平显着增加 |
| 4.4.3 全虫抗原刺激△ADSL免疫小鼠的脾细胞产生高水平的细胞因子 |
| 5.讨论 |
| 5.1 弓形虫ADSL基因的功能研究 |
| 5.2 ADSL、AK双缺失对弓形虫的影响 |
| 5.3 腺苷酸琥珀酸裂解酶的免疫保护实验 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（8）新孢子虫NcAMA1蛋白与Vero细胞互作蛋白的筛选与初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 新孢子虫病研究进展 |
| 1.1 生活史 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 入侵机制 |
| 1.5 疫苗的进展 |
| 1.6 诊断及预防 |
| 2. 酵母双杂交技术 |
| 2.1 酵母双杂交技术原理 |
| 2.2 酵母双杂交技术的应用 |
| 3. 研究目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌种及载体 |
| 1.2 主要试剂及培养基 |
| 1.3 主要试剂的配置 |
| 2. 方法 |
| 2.1 虫株的培养及纯化 |
| 2.1.1 细胞的复苏与培养 |
| 2.1.2 新孢子虫的复苏与纯化 |
| 2.2 酵母双杂交诱饵载体的构建 |
| 2.2.1 新孢子虫cDNA的提取 |
| 2.2.2 NcAMA1片段的获取 |
| 2.2.3 pGBKT7-NcAMA1诱饵载体构建 |
| 2.3 酵母双杂交诱饵载体的鉴定 |
| 2.3.1 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 诱饵载体转化酵母感受态细胞 |
| 2.3.3 诱饵载体自转录活性检测 |
| 2.3.4 诱饵载体毒性检测 |
| 2.3.5 验证诱饵载体的表达 |
| 2.4 用诱饵载体筛选宿主蛋白 |
| 2.4.1 诱饵载体靶菌株与Vero细胞cDNA文库杂交 |
| 2.4.2 杂交效率及筛选到的克隆数计算 |
| 2.4.3 宿主蛋白的筛选 |
| 2.4.4 获取筛选到的插入片段 |
| 2.4.5 回复杂交 |
| 2.5 Tmed2蛋白的获取 |
| 2.5.1 引物合成 |
| 2.5.2 Tmed2片段的获取 |
| 2.5.3 pGEX-4T-1-Tmed2载体构建 |
| 2.5.4 Tmed2原核表达 |
| 2.6 NcAMA1蛋白的获取 |
| 2.6.1 NcAMA1片段的获取 |
| 2.6.2 pET28a-NcAMA1载体构建 |
| 2.6.3 NcAMA1原核表达 |
| 2.7 pull down实验验证 |
| 2.8 Tmed2 siRNA鉴定 |
| 2.8.1 细胞培养 |
| 2.8.2 细胞转染 |
| 2.8.3 荧光定量PCR鉴定沉默效果 |
| 2.8.4 蛋白印迹鉴定沉默效果 |
| 2.9 针对Tmed2对Vero细胞进行处理 |
| 2.9.1 MTT法检测抗TMED2抗体对细胞影响 |
| 2.9.2 入侵实验 |
| 结果 |
| 3.1 酵母双杂交诱饵载体的构建 |
| 3.2 诱饵载体自转录活性检测和毒性检测 |
| 3.3 诱饵载体的表达检测 |
| 3.4 杂交效率计算及杂交克隆数计算 |
| 3.5 诱饵载体对Vreo细胞cDNA文库的筛选 |
| 3.6 回复杂交 |
| 3.7 Tmed2原核表达载体构建及表达 |
| 3.8 NcAMA1原核表达载体构建及表达 |
| 3.9 pull down验证 |
| 3.10 Tmed2 siRNA沉默效率鉴定 |
| 3.11 MTT实验检测抗Tmed2抗体对细胞毒性 |
| 3.12 入侵实验 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B (在研期间发表的论文) |
（9）弓形虫紫外线致弱株免疫小鼠过程中血清蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 TGME49_276860基因的敲除疫苗研究及核酸疫苗的制备 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 弓形虫紫外线致弱株制备及其转录组学研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 弓形虫紫外线致弱株免疫小鼠过程中血清蛋白质组学研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文、参与课题及获得奖励 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）新孢子虫原癌基因调控蛋白MYR基因敲除株的构建及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩词对照表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新孢子虫病概述 |
| 1.1 病原及生活史 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.2 新孢子虫流行病学 |
| 1.2.1 流行病学调查 |
| 1.2.2 新孢子虫传播方式 |
| 1.3 致病机制与临床症状 |
| 1.3.1 致病机制 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.4 免疫反应 |
| 1.4.1 天然免疫 |
| 1.4.2 体液免疫 |
| 1.4.3 细胞免疫 |
| 1.5 诊断及防治 |
| 1.5.1 新孢子虫病诊断 |
| 1.5.2 新孢子虫病防治 |
| 1.6 新孢子虫防治过程存在的问题与展望 |
| 第二章 新孢子虫基因功能研究进展 |
| 2.1 新孢子虫基因功能研究技术 |
| 2.1.1 基因组测序 |
| 2.1.2 转染技术 |
| 2.1.3 CRISPR-Cas9 |
| 2.2 新孢子虫基因功能研究进展 |
| 2.3 新孢子虫基因功能研究中的问题与展望 |
| 第三章 原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.1 原癌基因概述 |
| 3.1.1 原癌基因简介 |
| 3.1.2 原癌基因功能概述 |
| 3.2 原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.2.1 原癌基因相关通路研究进展 |
| 3.2.2 原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.2.3 寄生虫调控宿主原癌基因表达研究进展 |
| 3.2.4 寄生虫原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.2.5 原癌基因调控蛋白研究中的问题与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 NcMYR1和NcMYR2 蛋白在虫体中的亚细胞定位 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫体与细胞 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 新孢子虫MYR基因序列分析 |
| 1.2.2 新孢子虫速殖子及细胞的培养 |
| 1.2.3 新孢子虫c DNA提取 |
| 1.2.4 PCR扩增Nc MYR1和NcMYR2 基因 |
| 1.2.5 pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2 基因表达载体的构建 |
| 1.2.6 重组NcMYR1和Nc MYR2 蛋白的表达 |
| 1.2.7 重组NcMYR1和Nc MYR2 蛋白的纯化 |
| 1.2.8 制备抗NcMYR1和NcMYR2 蛋白多克隆抗体 |
| 1.2.9 Nc MYR1和NcMYR2 蛋白细胞内虫体免疫荧光定位 |
| 1.2.10 Nc MYR1和NcMYR2 蛋白细胞外虫体免疫荧光定位 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Nc MYR1和NcMYR2 基因序列分析 |
| 1.3.2 pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2 基因表达载体的构建 |
| 1.3.3 pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 1.3.4 Nc MYR1和NcMYR2 蛋白在虫体中的亚细胞定位 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 Nc MYR1 基因敲除虫株和Nc MYR2 基因敲除虫株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫体与细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂与材料 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞及新孢子虫速殖子的培养 |
| 2.2.2 基因敲除质粒的构建和DHFR同源重组基因片段制备 |
| 2.2.3 △Nc MYR1 和△NcMYR2 的构建及鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因敲除质粒的构建和DHFR同源重组基因片段制备 |
| 2.3.2 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株PCR鉴定 |
| 2.3.3 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株Western blot鉴定 |
| 2.3.4 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株免疫荧光鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Nc MYR1和NcMYR2 基因功能研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 虫体与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 试剂与材料 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 噬斑试验、入侵及增殖试验、逸出试验 |
| 3.2.2 毒力试验 |
| 3.2.3 ELISA检测细胞因子 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株生长、入侵、增殖和逸出 |
| 3.3.2 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株毒力检测 |
| 3.3.3 △Nc MYR1 和△NcMYR2 诱导小鼠细胞因子检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 △Nc MYR1 虫株和Nc MYR1 重组蛋白对小鼠抗野生株的保护作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 虫体与细胞 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组NcMYR1 蛋白免疫小鼠和攻虫试验 |
| 4.2.2 △Nc MYR1 虫株感染小鼠和攻虫试验 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组NcMYR1 蛋白免疫小鼠细胞因子的检测 |
| 4.3.2 重组NcMYR1 蛋白对小鼠抗野生株感染的保护作用 |
| 4.3.3 △Nc MYR1 虫株免疫小鼠细胞因子检测 |
| 4.3.4 △Nc MYR1 虫株对小鼠抗野生株感染的保护作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
四、弓形虫灭活苗通过成果鉴定（论文参考文献）
- [1]弓形虫HAD磷酸酶家族基因缺失株的构建及其免疫保护性评价[D]. 张海生. 中国农业科学院, 2021
- [2]PCV2d ORF2基因和猪IL-18基因重组PRV活载体毒株的构建及其免疫原性初步探究[D]. 田润博. 河南农业大学, 2021
- [3]抗猪传染性胃肠炎病毒流行毒株鹌鹑卵黄抗体的研制[D]. 孙颖. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]江苏某种猪场伪狂犬病的防控与净化研究[D]. 谢丽玲. 扬州大学, 2020(04)
- [5]新孢子虫AMA1与RON2蛋白互作的鉴定及其免疫保护性研究[D]. 方旭. 吉林大学, 2020
- [6]弓形虫中腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸激酶的生物学功能的研究[D]. 王璐瑶. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [8]新孢子虫NcAMA1蛋白与Vero细胞互作蛋白的筛选与初步鉴定[D]. 吴保义. 延边大学, 2020(05)
- [9]弓形虫紫外线致弱株免疫小鼠过程中血清蛋白质组学研究[D]. 艾康. 山东大学, 2020(02)
- [10]新孢子虫原癌基因调控蛋白MYR基因敲除株的构建及其功能研究[D]. 杜博亚. 吉林大学, 2020(08)