一、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因及其调控（论文文献综述）
刘慧敏[1]（2021）在《γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶学性质及其应用研究》文中认为γ-谷氨酰半胱氨酸是一种同时具有γ-谷氨酰基和活泼羟基的二肽,有抗氧化、解毒、维持胞内巯基平衡、传递信号和保护细胞等重要生理功能。因此γ-谷氨酰半胱氨酸在食品,保健品,化妆品,医药领域有广泛的应用前景。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是一种细菌酶,在合成γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱苷肽中起着不可替代的作用。本文对大肠杆菌BL21（DE3）来源的基因工程菌p ET-28a-Gsh1诱导表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶,并以谷氨酸钠和半胱氨酸为底物合成γ-谷氨酰半胱氨酸。主要研究内容与结果:1.优化大肠杆菌BL21（DE3）来源的重组基因工程菌p ET-28a-Gsh1的诱导表达与纯化并进行SDS-PAGE分析。结果表明在26℃,220 r/min,使用10 g/L天达一号诱导剂（实验室自制）对大肠杆菌BL21（DE3）来源的重组基因工程菌p ET-28a-Gsh1诱导12 h,纯化后最终得到γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶高达8.5 mg/L,约为IPTG诱导剂的1.3倍。2.对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶进行酶学性质分析。结果表明γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶最适催化温度为40℃;最适p H=7.5;最适表面活性剂为0.09%的SDS;最适金属离子为12 mmol/L Fe2++19 mmol/L Na+;添加Fe2+后不仅能够解除谷胱苷肽对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的抑制还能将酶的活性提高12%。3.对合成的产物进行初步分离纯化,利用HPLC对合成的γ-谷氨酰半胱氨酸进行定性定量分析。结果表明在最佳酶学性质和ATP供能的条件下,得到γ-谷氨酰半胱氨酸产量为33.5 g/L,底物转化率达68.3%。4.建立酶法结合酵母偶联体系使ATP再生并对反应体系进行了优化。结果表明使用酵母与西曲溴铵最适比值为15:1,西曲溴铵对酵母通透最适时间为4 h。反应体系中原料谷氨酸钠与半胱氨酸最适比例为4:5;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶粗酶液的最适浓度为70 mg/L;最适磷酸盐浓度为40 mmol/L;最适碳源为葡萄糖,初始葡萄糖最适浓度为220 mmol/L,最适补加方式和补加量为每隔5 h补加55mmol/L葡萄糖,最终在酶法结合酵母偶联体系中得到γ-谷氨酰半胱氨酸较好的产量为12.16 g/L,底物转化率达40%左右。
郭田田[2]（2020）在《胶质瘤细胞有氧糖酵解与谷氨酸代谢协调效应研究》文中研究指明有氧糖酵解作为肿瘤细胞特有的一种代谢模式,成为抗肿瘤治疗研究的热点。但是,许多研究发现,肿瘤细胞能够在有氧糖酵解受损时存活下来。除了有氧糖酵解之外,“谷氨酰胺成瘾”是肿瘤细胞代谢的第二大特点。在肿瘤细胞中谷氨酰胺产生的谷氨酸具有多种代谢途径,包括被肿瘤细胞排出胞外以换取胱氨酸,参与生成抗氧化剂谷胱甘肽（glutathione,GSH）以及转化为α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）进入三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle,TCA）供能。研究表明,胶质瘤细胞的有氧糖酵解与谷氨酰胺代谢具有协同效应以满足肿瘤细胞对生物能和生物合成的需求。因此,更好地理解肿瘤细胞有氧糖酵解与谷氨酰胺代谢之间的关系可能会找到新的治疗方案。在本研究中,我们发现抑制神经胶质瘤细胞糖酵解或剥夺葡萄糖,谷氨酸外排异常增加。我们进一步发现,抑制糖酵解或葡萄糖饥饿会诱导谷氨酸/胱氨酸反向转运蛋白xCT（glutamate/cystine antiporter xCT或SLC7A11）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamate cysteine synthase,γ-GCS）过表达,产生更多的还原型GSH,以调节氧化还原平衡。最后,我们的研究表明抑制糖酵解的同时抑制xCT或γ-GCS可以有效地阻断GSH的产生,并引起活性氧（reactive oxygen species,ROS）上调,从而更好地抑制神经胶质瘤细胞的增殖。总之,我们的结果表明葡萄糖代谢受损时谷氨酸代谢通过氧化还原调节促进神经胶质瘤细胞的存活,并且证实阻断谷氨酸参与的氧化还原途径可以改善靶向糖酵解的治疗效果。主要结果如下:1.采用邻苯二甲醛（Ophthalaldehyde,OPA）柱前衍生化法,利用紫外分光光度计全波长扫描确定了谷氨酰胺、谷氨酸的最佳检测波长为335nm。然后利用HPLC检测了谷氨酰胺、谷氨酸的标准品,发现谷氨酰胺和谷氨酸的出峰时间分别是7.3 min和5.5 min,且浓度和峰面积成正相关;2.利用2-脱氧葡萄糖（2-deoxyglucose,2-DG）或草氨酸钠（Oxamate,Oxa）抑制糖酵解或葡萄糖剥夺处理胶质瘤U251,U87细胞,通过检测胞外的乳酸分泌和葡萄糖消耗发现2-DG,Oxa处理胶质瘤细胞24小时的半抑制浓度均为15mM。HPLC检测胞外谷氨酸的含量,结果显示抑制糖酵解或剥夺葡萄糖之后,U251,U87细胞的谷氨酸外排显着增加;3.qPCR和Western blot技术检测谷氨酸代谢途径中关键分子的变化,结果显示糖酵解阻断条件下调节谷氨酸参与氧化还原平衡的xCT和γ-GCS转录水平和蛋白水平均高表达,分解谷氨酸参与三羧酸循环的谷氨酸脱氢酶转录水平没有显着变化且活性相对降低;4.通过检测胶质瘤细胞中GSH和ROS的含量证实抑制糖酵解或剥夺葡萄糖时,谷氨酸参与胞内的GSH合成从而降低ROS水平保证细胞存活。糖酵解抑制剂联合xCT的抑制剂柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine,SSZ）在450μM或γ-GCS的抑制剂丁硫氨酸亚砜亚胺（Buthionine sulfoximine,BSO）在1mM,相比各抑制剂单独作用时显着抑制了胶质瘤细胞活力。
郑男[3]（2020）在《洛氏鱥（Rhynchocypris lagowskii （Dybowski,1869））核转录因子Nrf2基因特性及功能分析》文中进行了进一步梳理洛氏鱥（Rhynchocypris lagowskii（Dybowski,1869））是特有的杂食性名特优经济小型鱼类,具有极高的经济价值和市场潜力,但目前洛氏鱥的养殖相对粗放,正处于大面积推广阶段,其营养需要、配套饵料、苗种繁育等人工养殖技术仍不成熟,在养殖实践过程中常常受到氧化应激的损害而生长受阻,甚至患病,进而给养殖户带来巨大经济损失。核转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factorery throid 2-related factor 2,Nrf2）作为调节机体抗氧化应激中最主要的关键蛋白,当机体受到外界刺激因而处于氧化应激的状态时,Nrf2入核启动Nrf2-Keap1-ARE抗氧化信号通路,促进下游效应基因的表达,因而增强了抗氧化能力,从而保护细胞免受氧化应激的损伤。但目前该鱼在这方面的研究未见相关报道,这对该鱼的推广养殖不利。因此,解析洛氏鱥抵抗氧化应激的内在机制,加强洛氏鱥非特异性免疫研究,增强鱼体自身的免疫能力是目前解决上述产业瓶颈问题的关键。本文以洛氏鱥幼鱼（13.25±0.21）g作为该研究的试验材料,进行其Pld-Nrf2基因相关研究。首先利用RACE-PCR技术,克隆获得洛氏鱥Pld-Nrf2基因c DNA全长。其次用RT-q PCR技术手段检测洛氏鱥Pld-Nrf2基因的组织分布情况,并对所克隆的洛氏鱥Pld-Nrf2基因系统进化树、蛋白质的等电点、编码蛋白的疏水性位点、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构以及跨膜区等进行生物信息学分析。最后通过腹腔注射Nrf2的激动剂叔丁基对苯二酚（t BHQ）以及Nrf2的抑制剂二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷（DRB）,通过检测相关抗氧化酶活和抗氧化物质,并采用相对q PCR技术手段,检测洛氏鱥抗氧化系统的响应,旨在验证洛氏鱥Pld-Nrf2基因的抗氧化调节功能;探索其抵抗氧化应激的生理代谢机制。本研究共包括四部分试验,结果及结论如下:1.洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2基因克隆本研究利用RACE-PCR技术首次克隆获得洛氏鱥Nrf2基因的全长序列。长度为2613 bp,从134-1900为该基因的编码区,CDS区为1767 bp。2.洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2组织表达分布及生物信息学分析通过对洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2全长进行了生物信息学分析,Pld-Nrf2蛋白的氨基酸数为588,ATG为起始密码子,AAC是该序列的最后一个密码子,TAG为终止密码子,开放阅读框（ORF）为1323 bp,加尾信号（AATAAA）以及Poly-A尾。蛋白质理论分子质量和等电点分别为66157.09 Da和4.60。无信号肽,SMART和CDD预测显示该蛋白含有一个BZIP结构域。Pld-Nrf2基因编码蛋白无跨膜区域,所以氨基酸都位于细胞膜表面。Pld-Nrf2基因编码的蛋白具有一定疏水性,最小疏水指数为-4.1,最大疏水指数为2.86。通过NJ法构建系统进化树进行1000子集分析,与同属的胖头鱥亲缘关系最近。实时q PCR结果表明Pld-Nrf2基因在洛氏鱥多种组织中均有表达,尤其在肝胰脏组织中表达量最高（P<0.05）。3.t BHQ对洛氏鱥肝胰脏抗氧化酶及抗氧化基因m RNA相对表达量的影响通过腹腔注射0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg和75 mg/kg 4个不同浓度的t BHQ溶液,在12 h、24 h、36 h、48 h分别测定抗氧化酶活和基因。结果表明,t BHQ可以显着提高血清和肝胰脏中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性以及总谷胱甘肽（T-GSH）含量及总抗氧化（T-AOC）水平（P<0.05）,但降低丙二醛（MDA）的含量（P<0.05）。通过RT-q PCR检测技术我们检测到腹腔注射t BHQ能增加肝胰脏的Pld-Nrf2、CAT以及Cuzn-SOD m RNA的表达量（P<0.05）,降低抑制蛋白Keap1 m RNA的表达量（P<0.05）。4.DRB对洛氏鱥肝胰脏抗氧化酶及抗氧化基因m RNA相对表达量的影响通过腹腔注射0 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg 4个不同浓度的DRB溶液,在12 h、24 h、48 h、72 h分别测定抗氧化酶活和基因。结果表明,随着注射浓度的逐渐增大以及反应时间的积累,血清和肝胰脏中的MDA水平显着上升（P<0.05）,抗氧化酶（CAT、T-SOD、及γ-GCS）活力以及抗氧化物质T-GSH含量相应下降（P<0.05）,总抗氧化能力显着下降（P<0.05）。通过RT-q PCR检测技术我们检测到腹腔注射DRB能减少肝胰脏中Pld-Nrf2、Cuzn-SOD以及CAT m RNA的表达量（P<0.05）,增加抑制蛋白Keap1 m RNA的表达量（P<0.05）。综上试验结果可知,通过进化树等生物信息学分析初步证明本研究所克隆得到的未知基因为洛氏鱥Pld-Nrf2;注射Nrf2促进剂t BHQ和抑制剂DRB明显的干扰了洛氏鱥的抗氧化能力,说明洛氏鱥Pld-Nrf2基因能够调节机体的抗氧化功能,从而保护洛氏鱥免受氧化损伤。
唐润梅[4]（2020）在《γ-[Glu](n（1-5）-Gln的酶法合成及其应用研究》文中提出γ-谷氨酰肽广泛分布于自然界中,参与生命体的多种生理活动。谷氨酰胺酶（EC3.5.1.2）是一种水解酶,同时具有转肽作用。本论文筛选出利于催化γ-谷氨酰转肽反应的谷氨酰胺酶,酶促合成一种未被报道的γ-谷氨酰肽(γ-[Glu]n（1-5）-Gln),进一步探究外部条件对其合成的影响及其钙离子螯合能力和抗冻性。实验结果如下:首先研究两种解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶（E1和E2）的酶学特性。结果表明,E1和E2均能催化水解和转肽反应;在p H值10.0、37.0℃下,E1的水解活性优于E2,转肽活性二者无明显差别（P<0.05）;在p H值4.0-10.0、4.0-45.0℃,E1的耐受性优于E2;色氨酸、脯氨酸、精氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺均可作为E1催化γ-谷氨酰转肽反应时的最佳γ-谷氨酰受体。因此,选用E1作为后续实验用酶。其次利用E1酶促合成γ-[Glu]n（1-5）-Gln,并探究底物浓度和初始p H值对其合成的影响。结果表明,E1具有催化合成γ-[Glu]n（1-5）-Gln的能力;UPLC-MS/MS鉴定出酶促反应产物:γ-Glu-Gln、γ-Glu-Glu-Gln、γ-Glu-Glu-Glu-Gln、γ-Glu-Glu-Glu-Glu-Gln和γ-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gln;高底物浓度或高初始p H值,均有利于γ-[Glu]n（1-5）-Gln的酶促合成。然后采用水体系合成法用γ-[Glu]n（1-5）-Gln螯合钙离子,通过单因素实验和正交实验优化工艺,并对产物进行结构表征和细胞毒性实验。结果表明,γ-[Glu]n（1-5）-Gln具有钙离子螯合能力;螯合反应最优条件为:反应时间30.0 min,反应温度70.0℃,反应液肽浓度0.10 g/m L,反应液肽钙比20:1（w:w）;此条件下螯合率为91.84%,螯合物钙含量为4.39%;γ-[Glu]n（1-5）-Gln的氨基和羧基均参与了螯合反应;γ-[Glu]n（1-5）-Gln和γ-[Glu]n（1-5）-Gln螯合钙的浓度为0.3125-10 mg/m L时对LO2细胞无细胞毒性。最后利用降温曲线实验和DSC实验研究γ-[Glu]n（1-5）-Gln的抗冻活性,并探究其对酵母的低温保护作用以及对冷冻面团中巯基含量的影响。结果表明,γ-[Glu]n（1-5）-Gln具有抗冻性;初始p H值12.0下反应6.0 h制得的γ-[Glu]n（1-5）-Gln的抗冻活性为2.38;γ-[Glu]n（1-5）-Gln对酵母具有低温保护作用,对冷冻面团的二硫键具有保护作用。
陈小冰[5]（2020）在《氧化还原蛋白DJ-1负性调控铁死亡的作用及其机制研究》文中研究指明研究目的铁死亡是一种由铁离子依赖的,以脂质活性氧簇（Lipid ROS）累积、线粒体皱缩为主要标志的全新程序性细胞死亡方式。近年来的研究表明,诱导肿瘤细胞发生铁死亡是一种全新的肿瘤治疗策略,但目前铁死亡的调控机制尚未完全阐明,更缺乏基于铁死亡的抗肿瘤药物靶点发现的研究。作为细胞内重要的氧化还原蛋白,DJ-1在肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中高表达,且与不良预后高度正相关,提示其与肿瘤的发生发展密切相关。虽然目前的研究已经揭示DJ-1可通过直接或间接的多种方式清除细胞内水溶性活性氧簇（ROS）,保护细胞免受氧化损伤,但DJ-1能否以及如何清除脂溶性的ROS并不清楚,更缺乏DJ-1调控铁死亡的作用研究。因此,本研究以铁死亡这一新细胞死亡方式作为切入点,明确DJ-1负性调控铁死亡的作用及其对抗肿瘤药物活性的影响,深入阐明DJ-1调控铁死亡的分子机制,并在此基础上开展抗肿瘤策略研究,力求为基于铁死亡的抗肿瘤治疗药物研发提供潜在靶点。研究方法:（1）DJ-1蛋白负性调控铁死亡的作用研究:采用慢病毒沉默体系、CRISPR/Cas9敲除体系和慢病毒过表达体系,分别构建DJ-1敲低、敲除和过表达的细胞株;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术,考察敲低、敲除及过表达DJ-1后对铁死亡应激下Lipid ROS累积的影响;采用CCK8（Cell counting kit-8）法考察敲低、敲除及过表达DJ-1后对铁死亡应激下细胞活力的影响;采用透射电镜考察敲低DJ-1对铁死亡应激下线粒体形态的影响;裸小鼠移植瘤模型考察敲低DJ-1对铁死亡诱导剂抗肿瘤作用的影响;采用免疫组化、TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）染色考察敲低DJ-1对肿瘤组织中细胞增殖、细胞凋亡的影响;采用实时荧光定量多聚酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）和酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）考察敲低DJ-1对肿瘤组织中铁死亡的作用;采用RT-PCR考察敲低DJ-1对肿瘤细胞内铁代谢、脂质过氧化相关蛋白以及核因子E2相关因子NRF2（Nuclear factor E2 related factor 2）下游蛋白的转录水平影响;采用Western blot考察敲低DJ-1对肿瘤细胞内谷氨酸胱氨酸转运蛋白SLC7A11（Solute carrier family 7 member 11）和NRF2蛋白表达的影响;采用谷氨酸释放检测试剂盒考察敲低DJ-1对SLC7A11蛋白功能的影响;采用CCK8法考察敲低DJ-1对NRF2沉默加剧铁死亡的影响。（2）DJ-1蛋白负性调控铁死亡的分子机制研究:采用谷胱甘肽（Glutathione,GSH）试剂盒考察敲低DJ-1对铁死亡应激下肿瘤细胞内GSH含量的影响;采用Western blot考察DJ-1对GSH生物合成中γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶（γ-Glutamate-cysteine ligase,γ-GCS）和谷胱甘肽合成酶（Glutathione synthetase,GSS）蛋白表达的影响;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和CCK8法考察外源性补入GSH、N乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine,NAC）、甲硫氨酸（Methionine,Met）、S腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine,SAM）、S腺苷同型半胱氨酸（S-Adenosylhomocysteine,SAH）、同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）对敲低DJ-1加剧铁死亡的影响;甲硫氨酸代谢流研究DJ-1调控铁死亡过程中关键中间代谢产物含量的变化;采用ELISA法检测敲低、敲除或过表达DJ-1对细胞内Hcy含量的影响;采用酶活检测试剂盒检测敲低或过表达DJ-1对S腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH）酶活的影响;采用邻近蛋白标记技术研究DJ-1调控SAHH的潜在接头蛋白;采用免疫沉淀考察DJ-1对SAHH与S腺苷同型半胱氨酸水解酶样蛋白（Adenosylhomocysteinase like 1,AHCYL1）异源二聚体形成的影响;采用凝胶过滤层析技术和双琥珀酰亚胺辛二酸酯（Disuccinimidyl suberate,DSS）交联技术考察DJ-1对SAHH四聚体形成的影响;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和CCK8法考察SAHH和AHCYL1在敲低DJ-1加剧铁死亡中的作用。（3）基于DJ-1蛋白二聚结构的抗肿瘤干预策略研究:采用免疫沉淀考察DJ-1蛋白同源二聚体形成情况;采用点突变结合DSS交联实验和排阻色谱法考察DJ-1的C端氨基酸对其二聚形成的影响;应用重组纯化蛋白研究二聚缺失型DJ-1的去糖化酶活情况;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和磺酰罗丹明B（SRB）比色法考察二聚缺失型DJ-1对铁死亡的作用;设计合成二聚型DJ-1抑制剂并应用重组纯化蛋白研究其对DJ-1去糖化酶活的作用;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和SRB法考察二聚型DJ-1抑制剂对铁死亡的作用。研究结果:（1）DJ-1蛋白负性调控铁死亡的作用研究:在多种肿瘤细胞株中,敲低DJ-1可显着加剧铁死亡诱导剂Erastin产生的Lipid ROS,并可显着增加Erastin引起的细胞死亡;在DJ-1敲除的小鼠成纤维细胞中,过表达野生型DJ-1可显着抑制铁死亡诱导剂Erastin产生的Lipid ROS,并可显着抑制铁死亡诱导剂Erastin引起的细胞死亡;敲低DJ-1显着增加铁死亡应激下,肿瘤细胞内皱缩线粒体的数目;裸小鼠移植瘤模型发现敲低DJ-1能显着增强铁死亡诱导剂哌嗪Erastin（Piperazine,PE）对肿瘤生长的抑制作用;敲低DJ-1显着增加肿瘤组织中铁死亡诱导剂PE产生的铁死亡诱导效应,但不会产生细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导作用;肿瘤细胞中敲低DJ-1不影响铁代谢相关蛋白二价金属离子转运体蛋白（Ferrous ion membrane transport protein,DMT1）,铁重链蛋白（Ferritin heavy chain 1,FTH1）和铁轻链蛋白（Ferritin light chain,FTL）的m RNA水平,也不影响脂质过氧化相关蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员（Acyl-Co A synthetase long chain family member 4,ACSL4）,溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（Acyl-Co A synthetase long chain family member 4,LPCTA3）和脂氧合酶（15-lipoxygenase,15-LOX）的m RNA水平;敲低肿瘤细胞中的DJ-1不影响SLC7A11的蛋白表达和功能;敲低肿瘤细胞中的DJ-1能进一步增加铁死亡诱导剂Erastin引起的NRF2蛋白的上调及其下游蛋白血红素氧化酶1（Heme oxygenase 1,HMOX1）m RNA水平的上调;敲低DJ-1能进一步增加NRF2沉默后Erastin引起的细胞死亡。（2）DJ-1蛋白负性调控铁死亡的分子机制研究:DJ-1通过抑制SAHH/AHCYL1异源二聚的形成,从而影响SAHH四聚和酶活,进而维持从甲硫氨酸到同型半胱氨酸的转硫途径,防止肿瘤细胞发生铁死亡;敲低或敲除DJ-1可显着抑制铁死亡应激下肿瘤细胞内GSH的含量;敲低DJ-1不影响GSH生物合成中γ-GCS和GSS蛋白含量的变化;外源性补入GSH、NAC和Hcy可完全逆转敲低DJ-1所加剧的铁死亡效应;代谢流组学发现敲低DJ-1可显着降低肿瘤细胞内Hcy的含量;敲低DJ-1可明显抑制SAHH酶活;过表达DJ-1可明显促进SAHH酶活;邻近蛋白标记技术发现AHCYL1等123个DJ-1新的结合蛋白;过表达DJ-1可明显减弱SAHH与AHCYL1异源二聚体的形成,而敲低细胞内的DJ-1可增强SAHH与AHCYL1的相互结合;敲低DJ-1可抑制SAHH四聚体的形成,而过表达DJ-1可促进SAHH四聚体的形成;在肿瘤细胞中过表达SAHH或敲低AHCYL1均能抑制敲低DJ-1所加剧的铁死亡效应。（3）基于DJ-1蛋白二聚结构的抗肿瘤干预策略研究:DJ-1存在同源二聚体,且C末端的3个氨基酸缺失后DJ-1蛋白的同源二聚化消失;二聚缺失型的DJ-1蛋白丧失了去糖化酶活;基于DJ-1二聚结构设计合成了6个DM系列化合物,发现DM系列化合物可不同程度地抑制DJ-1酶活,其中DM10的抑制作用最强;DM10特异性靶向同源二聚化的DJ-1蛋白;二聚型DJ-1抑制剂DM10可显着促进细胞发生铁死亡。研究结论:本研究发现了氧化还原蛋白DJ-1在负性调控铁死亡中的重要作用。机制上,DJ-1可以与AHCYL1发生相互作用,抑制SAHH-AHCYL1异源二聚体的形成,维持四聚体SAHH的酶活,促进转硫途径中同型半胱胺酸的合成。干预DJ-1调控的转硫代谢途径可在体内外显着促进铁死亡应激条件下的抗肿瘤作用。同源二聚化是DJ-1蛋白发挥负性调控铁死亡的结构基础,通过设计合成DM10等系列化合物,可特异性靶向同源二聚化DJ-1,抑制DJ-1去糖化酶活并显着增强铁死亡诱导剂的抗肿瘤疗效。
钱霄晨[6]（2020）在《半胱氨酸对采后金针菇品质、抗氧化能力及麦角硫因合成代谢的影响》文中认为白色金针菇（Flammulina velutipes）具有丰富的营养和药用价值,且含有稀有氨基酸麦角硫因。麦角硫因虽广泛存在着生物体内,但仅由微生物、真菌合成。采后的白色金针菇易发生褐变,品质劣变,且其中的麦角硫因合成途径鲜有研究。因此,本文以白色金针菇为实验对象,以探究麦角硫因合成途径为主要目的,将采后金针菇随机均分为二组,分别用清水、15 mmol/L的半胱氨酸溶液浸泡处理20 min,自然晾干,再于2-3℃低温下贮藏。研究半胱氨酸处理对金针菇品质、抗氧化能力及麦角硫因合成代谢途径的影响。结果如下:（1）半胱氨酸处理显着抑制了金针菇贮藏后期呼吸强度的升高,延缓了可溶性固形物（SSC）、可溶性蛋白含量的降低,维持其营养价值。降低了相对电导率,保持了细胞膜结构与功能的完整性,延缓了金针菇子实体衰老进程。另外,半胱氨酸处理显着抑制了金针菇褐变度、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性,控制了褐变进程,但对失重率无显着影响。（2）半胱氨酸处理可显着维持采后金针菇中超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽还原酶（GR）活性,提高麦角硫因含量,其中在贮藏末期,半胱氨酸处理组中的麦角硫因含量是对照组的1.14倍。同时,半胱氨酸处理延缓了总酚、抗坏血酸含量的降低,降低了过氧化氢酶（CAT）活性、超氧阴离子（O2-）的生成速率和过氧化氢（H2O2）含量。进一步研究表明,半胱氨酸处理维持了金针菇中较高DPPH自由基清除率和总抗氧化能力。综合评价,半胱氨酸处理能够有效提高金针菇的抗氧化能力,从而减轻自由基损伤。（3）半胱氨酸处理显着降低了采后金针菇中甲硫氨酸（Met）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）含量;同时,显着提高了腺苷三磷酸（ATP）、半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）、麦角硫因（EGT）含量。在麦角硫因代谢途径中,半胱氨酸处理显着增强了相关基因egtB和egt-2的相对表达量,最高可分别达对照组的7.51倍和2.72倍。但半胱氨酸处理对egtA-1和egtA-2基因相对表达量无明显规律性影响。
王丹[7]（2019）在《外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜硫代葡萄糖苷生物合成的影响》文中提出硫是植物生长发育过程中所必需的营养元素,是维生素、多肽、含硫氨基酸以及许多次级代谢产物的组成成分。硫代葡萄糖苷（glucosinolates,GS）,简称硫苷,是一类广泛存在于十字花科植物中的重要含氮和硫的次生代谢产物,缺硫胁迫很大程度上阻碍了植物的生长发育,使植物体内半胱氨酸、谷胱甘肽、甲硫氨酸、3’磷酸腺苷5’磷酸酰胺等硫还原同化产物不能有效合成,导致硫苷合成受阻。谷胱甘肽（Glutathione,GSH）是一种具有重要生理功能的生物活性物质,不仅为硫苷合成提供原料,也可能参与硫苷合成调控。本研究以小白菜为试验材料,缺硫胁迫（S0.02mM）17d后,用25mg/L的还原型谷胱甘肽（GSH）和25mg/L的氧化型谷胱甘肽（GSSG）分别喷施小白菜叶片,通过研究外源谷胱甘肽处理对缺硫胁迫下小白菜生长量、谷胱甘肽代谢、硫苷合成以及初生硫代谢的变化情况,综合分析外源谷胱甘肽处理对缺硫胁迫下小白菜硫苷生物合成的影响以及可能的调控途径,主要有以下结论:（1）短期缺硫胁迫对小白菜地上部生长影响不显着,显着促进了小白菜地下部生长;缺硫胁迫显着减少了小白菜地上部多数单个硫苷组分含量以及硫苷合成关键基因表达量,对总脂肪族和总吲哚族硫苷含量影响不显着,减少了芳香族硫苷含量,因此,总硫苷含量下降;显着降低了小白菜BcGSH1基因表达量、Cys和GSH含量、γ-ECs、GR和GST活性,但初生硫代谢基因表达上调,Bc APK基因表达量下降。（2）外源喷施25 mg/L的GSH对缺硫胁迫下小白菜地上部生长影响不显着,但地下部鲜重和干重的增长有一定的延缓,大部分硫苷合成关键基因呈现不同程度的先上调后下降的趋势,促进了芳香族和部分脂肪族以及吲哚族硫苷合成,但也抑制了部分脂肪族和吲哚族硫苷合成,因此总硫苷含量下降;显着增加了缺硫胁迫下小白菜Cys和GSH含量,GR、GPx和GST活性增强,BcGSH1和初生硫代谢基因表达量短暂上升后下降。（3）外源GSSG处理与GSH处理结果类似,对缺硫胁迫小白菜地上部生长影响不显着,但地下部鲜重和干重的增长有一定的延缓,上调了缺硫胁迫下小白菜大部分硫苷主要合成基因表达量,芳香族和部分脂肪族硫苷含量有所上升,但没有达到显着水平,促进了芳香族硫苷合成,显着降低了总吲哚族硫苷和总硫苷含量;Cys和GSH含量上升,GR和GST活性增强,对初生硫代谢没有显着影响,BcAPK基因表达量短暂上升后下调。（4）外源GSH和GSSG处理可以作为硫的来源通过调节初生硫代谢基因表达,增加小白菜体内Cys和GSH含量,增加GR、GPx和GST活性,缓解缺硫胁迫,外源喷施GSH比喷施GSSG效果更佳。
高双双[8]（2019）在《香菇挥发性硫化物和滋味物质代谢相关基因的筛选及候选基因的功能研究》文中提出伴随国民生活水平的提高,消费者对香菇品质的要求越来越高。目前对香菇风味品质的研究主要涉及加工方式和栽培基质等对风味物质含量的影响,但对香菇关键风味成分的形成机理报道较少。解析香菇关键风味物质形成机理对香菇品质改良及相关产品加工具有重要意义。本研究以香菇为研究对象,分析香菇干燥过程中挥发性含硫化合物代谢相关酶和产物的变化以及基因转录表达水平的差异,挖掘香菇挥发性含硫化合物代谢相关基因;采用不同比例稻草替代木屑栽培香菇,测定香菇子实体可溶性糖及糖醇、有机酸、5’-核苷酸、游离氨基酸等滋味成分的差异,基于香菇基因组和转录组分析了谷氨酸合成相关的关键基因。主要研究结果如下:1.香菇热风干燥过程中转录组分析。用50℃热风干燥香菇子实体0-6 h,监测烘干前期含水量、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,GGT）比酶活、半胱氨酰亚砜裂解酶（Cysteine sulfoxide lyase,C-S lyase）比酶活和甲醛含量的变化。结果表明,含水量由Oh的86.83%下降到6h的48.63%,呈现线性趋势,模拟回归方程为Y=-0.0637x+0.9009,其中回归系数R2=0.9561。GGT 比酶活的变化趋势呈现先升高后降低的趋势,在2h时比酶活达到最大值。C-S lyase 比酶活呈M型变化,在3 h时比酶活达到最大。甲醛的变化趋势呈M型,在4 h达到最高值。为了解鲜香菇在热风干制过程中风味化合物变化的分子机制,选取O h、2 h、4 h和6 h共4组样品进行转录组测序,分别命名为control组、treatl组、treat2组和treat3组。4组样品比对香菇W1-26基因组的平均比对率为77.89%,共检测到20443个表达的基因,样本相关性和主成分分析均显示control组和3个处理组具有明显的差异。control组与treat l、treat2和treat3之间的差异表达基因（DEGs）分别为5934个、6830个、6527个,DEGs共富集到22条KEGG代谢通路。C-S lyase家族在香菇基因组中共有5个家族基因,分别命名为Lecsl1、Lecsl2、Lecsl3、Lecsl4、Lecsl5,共检测到12种转录本形式。其中,Lecsl2和Lecsl3不仅在干燥过程中表达上调且在此期间保持高水平表达,推测Lecsl2和Lecsl3极有可能是C-S lyase家族中参与含硫化合物产生的关键基因。2.候选基因Lecsl3的生物学功能分析。Lecsl3基因在香菇W1-26基因组中的ID是Le01Gene03297,T-A克隆结果表明编码区序列长966 bp。经生物信息学分析,Lecs13蛋白编码321个氨基酸,分子质量为36.28 kDa,理论等电点为6.71;稳定的亲水性蛋白;不存在信号肽,属于非分泌型蛋白;亚细胞定位推测Lecs13蛋白在过氧化物酶体中发挥作用;含有29个潜在的磷酸化位点。在Lecsl3基因转录起始位点上游-30 bp处,预测到一个核心启动子元件TATA框,在-74 bp处预测到一个处于反义链的CAAT框,这两点都符合真核基因启动子的显着特性。利用酿酒酵母启动子数据库,发现基因上游240 bp存在2个响应热击的顺式作用元件,1个转录因子ATF的结合位点、1个转录激活蛋白BAS2的结合位点、1个转录激活蛋白ABF1的结合位点、2个转录激活因子GCN4的结合位点和7个TATA框结合位点。构建了表达载体pGEX-6P-2-Lecsl3,成功诱导大肠杆菌BL21（DE3）合成重组Lecs13蛋白,SDS-PAGE谱图显示约为36 kDa的单一条带,与香菇C-S lyase的理论分子量一致。酶活测定显示具备C-S lyase活性,且验证了 Lecs13蛋白参与香菇内源性甲醛产生的生成路径。3.不同栽培基质香菇的滋味成分分析。利用不同比例的稻草（80%、60%、40%、20%、0%）替代常规栽培配方中的木屑成功栽培香菇,五组配方分别命名为 RS80、RS60、RS40、RS20 和 Control,但四组稻草配方的产量（155.08-190.42 g/kg底物）均低于常规栽培配方（202.03 g/kg底物）。平板菌丝长速实验显示稻草对香菇菌丝菌落形态无影响,但稻草含量越高,菌丝长速越慢。五组香菇样品的蛋白质含量为13.24-16.05 g/100 g干重,灰分含量为5.79-7.49 g/100 g干重,脂肪含量为0.79-0.98 g/100 g干重之间。栽培基质中稻草含量越高,则香菇子实体蛋白质含量越低、灰分含量越高。海藻糖、甘露醇和阿拉伯糖醇是香菇中主要的可溶性糖,且栽培基质中增加稻草含量导致海藻糖含量降低,甘露醇和阿拉伯糖醇含量增加。五种香菇均检测到19种游离氨基酸,总游离氨基酸含量在16.29-24.59 mg/g,苏氨酸（4.82-8.08 mg/g）含量最高、谷氨酸（2.00-3.90 mg/g）含量次之。RS80、RS60、RS40、RS20、和 Control 组的鲜味氨基酸含量分别为 5.12 mg/g、6.17mg/g、3.62 mg/g、2.87 mg/g和2.09 mg/g。五种香菇样品的总核苷酸含量在1.66-4.48 mg/g之间,其中RS20组含量最低,RS80组含量最高。五种香菇子实体样品均检测到酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乙酸、柠檬酸、富马酸和丁二酸。香菇子实体等鲜浓度（Equivalent umami concentration,EUC）在 10.42-84.49 g/100 g 干物质范围内,且 EUC 值随栽培配方中稻草含量的增加而逐渐增加。稻草含量与滋味成分相关性分析结果表明,栽培基质中的稻草含量与谷氨酸、天冬氨酸、EUC值、总呈味核苷酸、风味5’-核苷酸、阿拉伯糖醇、甘露醇等呈极显着正相关（P<0.01）。4.谷氨酸代谢相关酶的全基因组鉴定。在香菇W1-26基因组中鉴定到4个与谷氨酸代谢途径直接相关的关键酶,分别是谷氨酸合成酶基因（ID:Le01Gene05615）,NAD 依赖型谷氨酸脱氢酶基因（ID:Le01Gene10227）,NADP依赖型谷氨酸脱氢酶基因（ID:Le01Gene13517）和Δ1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶基因（ID:Le01Gene06992）。经生物信息学预测,4种酶性质较为稳定,均为亲水性的非分泌型蛋白,亚细胞定位推测在细胞质中起作用。不同物种间的同源性分析结果表明,4种酶均高度保守。
卢慧茵[9]（2019）在《谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽及其抗氧化性的研究》文中指出γ-谷氨酰肽是由谷氨酰胺或谷氨酸的γ-羧基和氨基酸或肽分子的α-氨基发生脱水缩合反应所得的一类小分子肽,广泛存在于自然界的动植物和微生物中。γ-谷氨酰肽可从天然物质中提取得到,也可通过化学合成法制备得到,但酶法合成法是应用更为广泛的制备γ-谷氨酰肽的方法,γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase,γ-GGT）是最为常用、研究最为深入的一种酶制剂。已有研究证明,部分微生物来源的谷氨酰胺酶也能催化γ-谷氨酰基转移反应,但关于将其应用于合成γ-谷氨酰肽的研究则是近年来才有所进展,对谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽的研究可扩大谷氨酰胺酶的应用范围,同时也可为合成γ-谷氨酰肽提供新的酶制剂来源,在实际的生产应用中具有重要意义。在此基础上,本论文利用解淀粉芽孢杆菌来源的谷氨酰胺酶,分别以半胱氨酸和色氨酸为γ-谷氨酰基受体,谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体,合成γ-谷氨酰肽并对合成条件进行了优化,探究了γ-谷氨酰肽的抗氧化活性。本论文首先探究了两种商用的解淀粉芽孢杆菌来源谷氨酰胺酶的酶学特性。结果表明,酶A和酶B均能催化水解和转肽反应,在pH 10.0、温度37℃的条件下,其水解酶活分别为66.21 U/g和5.27 U/g,酶A的转肽酶活为101.28 U/g,在该条件下酶B未检出转肽活性,因此酶A具有更优的转肽活性和水解活性,选择酶A作为合成γ-谷氨酰肽的酶制剂。在此基础上,采用LX-1000EP环氧基树脂对酶A进行吸附,探究了将谷氨酰胺酶固定于树脂的可能性。探究了pH、吸附时间和相对加酶量对固定化率的影响,并通过响应面法得到最优的固定化条件:在pH 10.50,吸附时间1 h,相对加酶量为3.92%的条件下,酶A的固定化率为76.77%。通过UPLC-MS/MS对两种酶促反应液进行定性研究,在半胱氨酸-谷氨酰胺酶促反应液中鉴定出γ-EC、γ-EEC、γ-EEEC和γ-EEEEC四种γ-谷氨酰肽;在色氨酸-谷氨酰胺酶促反应液中鉴定出γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW和γ-EEEEW四种γ-谷氨酰肽。利用HPLC对两种酶促反应液体系进行定量研究并对反应条件进行优化,得到合成γ-谷氨酰肽的最优条件为:pH 10.0、反应温度37℃、酶添加量为0.1%（m/v）、谷氨酰胺和半胱氨酸（或色氨酸）的浓度为0.1 mol/L,反应产物的产率为:40.92%（γ-EC）、22.79%（γ-EEC）、1.75%（γ-EEEC）、0.64%（γ-EEEEC）;51.02%（γ-EW）、26.12%（γ-EEW）、1.91%（γ-EEEW）,半胱氨酸和色氨酸的转化率分别为66.10%和79.05%。以DPPH自由基清除率、还原力、Fe2+螯合率、超氧阴离子自由基清除率、ABTS自由基清除为指标,还原型谷胱甘肽为阳性对照,评价了γ-谷氨酰肽及酶促反应液的抗氧化活性,证实了γ-谷氨酰化可增强游离氨基酸的抗氧化活性。γ-EC具有非常强的自由基清除能力和还原力,其DPPH自由基清除率、还原力、超氧阴离子自由基清除率、ABT S自由基清除率的EC50值分别为0.0525 mg/mL、0.0309 mg/mL、0.0196 mg/mL、3.1858μg/mL,其抗氧化活性甚至高于作为阳性对照的GSH,其后依次为S-1、γ-EEC、γ-E W、S-2、γ-EEW。由于作用机理不同,Fe2+螯合率呈现出不同的规律,各样品螯合Fe2+能力大小排序为γ-EEC>γ-EEW>S-1>γ-EC>S-2>γ-EW。
南洁[10]（2019）在《马铃薯谷胱甘肽合成相关酶StGSH1和StGSH2的活性鉴定和蛋白结晶》文中进行了进一步梳理马铃薯是重要的主粮作之一。生物胁迫和非生物胁迫所产生的活性氧簇（ROS）严重危害马铃薯植株的生长发育。谷胱甘肽（GSH）在植物抗ROS的应激反应中发挥着重要的作用。谷氨酰半胱氨酸连接酶（GSH1）和谷胱甘肽合成酶（GSH2）是催化植物体内GSH合成的关键酶。基于本实验室前期研究基础,本论文对马铃薯StGSH1和StGSH2蛋白进行了理化性质及结构预测;通过原核表达系统对StGSH1和StGSH2蛋白进行大量诱导表达;使用离子交换、尺寸排阻色谱技术纯化StGSH1和StGSH2蛋白,并对其底物特异性、最适p H和最适温度进行了测定;进而进行StGSH1和StGSH2蛋白晶体条件的初筛,并开展了StGSH1晶体初筛条件的优化及晶体结构初步分析工作。这些为深入研究StGSH1和StGSH2生物学功能及其晶体结构解析工作奠定了基础。主要结果如下:1)优化StGSH1基因的密码子,构建蛋白原核表达系统,通过柱亲和层析、阴离子交换层析及尺寸排阻色谱分离得到StGSH1蛋白。鉴定该蛋白是以单体和二聚体两种形式存在;相同工作也在StGSH2上进行,得到纯化的StGSH2重组蛋白,鉴定该蛋白是以单体形式存在,不能形成二聚体或多聚体。2)StGSH1酶与半胱氨酸的底物亲和力最高,其次为ATP和谷氨酸盐,结果表明StGSH1具有谷氨酰半胱氨酸连接酶的活性。进一步实验证明StGSH1的体外最适酶反应温度为37℃,最适酶反应p H值为8。3)StGSH2酶与γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-EC）的底物亲和力最高,其次为ATP和甘氨酸,结果表明StGSH2蛋白具有谷胱甘肽合成酶活性。进而证明StGSH2的体外最适酶反应温度为37℃,最适反应p H值为8。4)进行StGSH1蛋白结晶研究,表明该蛋白的单体形式易于结晶,而二聚体形式较难形成蛋白晶体;进而对单体结晶条件进行了初筛,结果表明结晶的最优条件为0.17 M醋酸铵,附加22%（w/v）PEG3350和0.1 M Bis-Tris（p H=5.5）。同时也对StGSH2蛋白进行初步结晶条件的筛选,相关研究工作仍在进行中。5)完成了StGSH1蛋白晶体结构的初步解析工作。
二、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因及其调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因及其调控（论文提纲范文）
（1）γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶学性质及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 γ-谷氨酰半胱氨酸的简介 |
| 1.2 γ-谷氨酰半胱氨酸的生理功能 |
| 1.2.1 抗氧化功能 |
| 1.2.2 维持巯基平衡 |
| 1.2.3 补充细胞内谷胱苷肽 |
| 1.2.4 转运氨基酸 |
| 1.2.5 传递信号 |
| 1.3 γ-谷氨酰半胱氨酸的应用 |
| 1.3.1 医药领域 |
| 1.3.2 食品领域 |
| 1.3.3 化妆品领域 |
| 1.4 γ-谷氨酰半胱氨酸的合成方法 |
| 1.4.1 化学合成法 |
| 1.4.2 微生物发酵法 |
| 1.4.3 生物酶合成法 |
| 1.5 γ-谷氨酰半胱氨酸的检测方法 |
| 1.5.1 薄层色谱法 |
| 1.5.2 分光光度法 |
| 1.5.3 高效液相色谱法 |
| 1.5.4 亚销基铁氰化钠法 |
| 1.6 课题的立题依据与意义 |
| 1.7 课题的研究内容与实验方案路线 |
| 1.7.1 主要研究内容 |
| 1.7.2 实验方案路线 |
| 第二章 酶的诱导表达纯化与酶学性质研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组基因工程菌的诱导表达 |
| 2.3.1.1 重组菌株的筛选 |
| 2.3.1.2 诱导重组基因工程菌表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 |
| 2.3.1.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶粗酶液的制备 |
| 2.3.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的纯化 |
| 2.3.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的检测 |
| 2.3.4 pH对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影响 |
| 2.3.4.1 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的最适p H |
| 2.3.4.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的p H稳定性 |
| 2.3.5 温度对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影响 |
| 2.3.5.1 酶的最适温度 |
| 2.3.5.2 酶的热稳定性 |
| 2.3.6 表面活性剂对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影响 |
| 2.3.6.1 最适表面活性剂 |
| 2.3.6.2 表面活性剂最适添加量 |
| 2.3.7 金属离子对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影响 |
| 2.3.7.1 最适金属离子 |
| 2.3.7.2 金属离子的最适添加量 |
| 2.3.8 谷胱苷肽对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影响 |
| 2.3.9 Fe对谷胱苷肽抑制的解除 |
| 2.3.10 双倒数作图法动力常数 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 重组基因工程菌的诱导表达 |
| 2.4.1.1 重组菌株的筛选 |
| 2.4.1.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达 |
| 2.4.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的纯化 |
| 2.4.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的检测 |
| 2.4.4 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的最适p H与及p H稳定性 |
| 2.4.4.1 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的最适p H |
| 2.4.4.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的p H稳定性 |
| 2.4.5 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的最适温度及热稳定性 |
| 2.4.5.1 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的最适温度 |
| 2.4.5.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的热稳定性 |
| 2.4.6 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的最适表面活性剂及添加量 |
| 2.4.6.1 表面活性剂种类 |
| 2.4.6.2 表面活性剂添加量 |
| 2.4.7 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的最适金属离子及添加量 |
| 2.4.7.1 最适金属离子种类 |
| 2.4.7.2 最适金属离子添加量 |
| 2.4.8 谷胱苷肽对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影响 |
| 2.4.9 Fe对谷胱苷肽抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的解除 |
| 2.4.10 双倒数作图法动力常数 |
| 2.5 产物检测 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 酶法结合酵母偶联体系和反应体系的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 建立酵母偶联体系 |
| 3.3.1.1 通透剂种类 |
| 3.3.1.2 通透剂最适添加量 |
| 3.3.1.3 最适通透时间 |
| 3.3.2 反应体系的优化 |
| 3.3.2.1 时间的优化 |
| 3.3.2.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶粗酶液浓度的优化 |
| 3.3.2.3 原料浓度比的优化 |
| 3.3.2.4 磷酸盐的优化 |
| 3.3.2.5 碳源的优化 |
| 3.3.3 产物检测 |
| 3.3.3.1 薄层层析 |
| 3.3.3.2 Ellman试剂 |
| 3.3.3.3 HPLC色谱检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 建立酶法结合酵母偶联体系 |
| 3.4.1.1 通透剂种类 |
| 3.4.1.2 酵母与通透剂的比例 |
| 3.4.1.3 酵母通透时间 |
| 3.4.2 反应体系条件的优化 |
| 3.4.2.1 时间的优化 |
| 3.4.2.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶粗酶液的优化 |
| 3.4.2.3 原料浓度比的优化 |
| 3.4.2.4 磷酸盐浓度的优化 |
| 3.4.2.5 碳源的优化 |
| 3.4.3 产物检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 本文主要工作及结论 |
| 4.2 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）胶质瘤细胞有氧糖酵解与谷氨酸代谢协调效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 神经胶质瘤研究现状 |
| 1.1.1 神经胶质瘤概述 |
| 1.1.2 神经胶质瘤的临床表现 |
| 1.1.3 神经胶质瘤治疗现状和进展 |
| 1.2 肿瘤细胞的代谢重编程 |
| 1.2.1 代谢重编程概述 |
| 1.2.2 有氧糖酵解与肿瘤细胞的关系 |
| 1.2.3 谷氨酸代谢与肿瘤细胞的关系 |
| 1.3 肿瘤细胞氧化还原平衡 |
| 1.3.1 肿瘤细胞氧化还原平衡概述 |
| 1.3.2 谷氨酸胱氨酸转运系统与肿瘤细胞的关系 |
| 1.3.3 还原型谷胱甘肽与肿瘤细胞的关系 |
| 1.4 论文的设计思路 |
| 1.4.1 研究内容与意义 |
| 1.4.2 实验流程图 |
| 1.4.3 研究的创新点 |
| 第二章 OPA衍生化检测胶质瘤胞外谷氨酰胺和谷氨酸 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 相关试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 OPA衍生化谷氨酰胺和谷氨酸 |
| 2.3.2 HPLC检测OPA衍生化谷氨酰胺和谷氨酸的标准品 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 OPA衍生化谷氨酰胺和谷氨酸最佳波长的确定 |
| 2.4.2 HPLC检测OPA衍生化谷氨酰胺和谷氨酸的标准品 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 糖酵解阻断时谷氨酸代谢回补维持氧化还原平衡 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 相关试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 葡萄糖和乳酸含量的检测 |
| 3.3.3 谷氨酸含量的检测 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测mRNA水平 |
| 3.3.5 蛋白质免疫印迹分析 |
| 3.3.6 谷氨酸脱氢酶(GLUD1)活性的检测 |
| 3.3.7 还原型谷胱甘肽(GSH)含量的检测 |
| 3.3.8 活性氧(ROS)含量的检测 |
| 3.3.9 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 抑制糖酵解降低葡萄糖消耗并减少乳酸分泌 |
| 3.4.2 糖酵解阻断时谷氨酸外排增多 |
| 3.4.3 抑制糖酵解促进xCT和γ-GCS的转录水平升高 |
| 3.4.4 抑制糖酵解上调xCT和γ-GCS的蛋白表达并降低GLUD1 活性 |
| 3.4.5 糖酵解阻断时谷氨酸代谢回补维持氧化还原平衡 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 阻断谷氨酸的氧化还原途径增强糖酵解抑制剂敏感性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞株 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 相关试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 MTT检测细胞增殖 |
| 4.3.3 还原型谷胱甘肽(GSH)含量的检测 |
| 4.3.4 活性氧(ROS)含量的检测 |
| 4.3.5 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 糖酵解抑制剂联合xCT或γ-GCS的抑制剂降低谷胱甘肽水平 |
| 4.4.2 糖酵解抑制剂联合xCT或γ-GCS的抑制剂降低细胞活力 |
| 4.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略语 |
| 附录2 实验仪器 |
| 附录3 相关溶液的配制 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）洛氏鱥（Rhynchocypris lagowskii （Dybowski,1869））核转录因子Nrf2基因特性及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 氧化应激 |
| 1.2 Nrf2-Keap1-ARE信号通路 |
| 1.3 Nrf2的激动剂与抑制剂 |
| 1.4 洛氏鱥 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2基因克隆 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2组织表达分布及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 tBHQ对洛氏鱥肝胰脏抗氧化酶及抗氧化基因mRNA相对表达量的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 DRB对洛氏鱥肝胰脏抗氧化酶及抗氧化基因mRNA相对表达量的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）γ-[Glu](n（1-5）-Gln的酶法合成及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 谷氨酰胺酶的概述 |
| 1.2 γ-谷氨酰肽的概述 |
| 1.2.1 天然存在的γ-谷氨酰肽 |
| 1.2.2 γ-谷氨酰肽的制备方法 |
| 1.2.3 γ-谷氨酰肽的分析检测 |
| 1.2.4 γ-谷氨酰肽的功能特性 |
| 1.3 肽螯合钙的研究现状 |
| 1.3.1 肽螯合钙的由来 |
| 1.3.2 肽螯合钙的制备方法 |
| 1.3.3 肽螯合钙的表征方法 |
| 1.3.4 肽螯合钙的功能性质 |
| 1.4 抗冻多肽的研究现状 |
| 1.4.1 抗冻蛋白和抗冻多肽的由来 |
| 1.4.2 抗冻蛋白和抗冻多肽在食品中的应用 |
| 1.4.3 抗冻多肽的应用前景 |
| 1.5 本课题的立题依据和研究内容 |
| 1.5.1 本课题的立题依据 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 第二章 两种谷氨酰胺酶的酶学特性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 数据处理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 两种谷氨酰胺酶的酶活测定 |
| 2.3.2 pH值对谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响 |
| 2.3.3 温度对谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响 |
| 2.3.4 氯化钠和氯化铵对谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响 |
| 2.3.5 金属离子对谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响 |
| 2.3.6 谷氨酰胺酶催化γ-谷氨酰转肽反应的底物选择性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 底物浓度和初始p H值对酶促合成γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 数据处理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 底物浓度对酶促合成γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln的影响 |
| 3.3.2 初始p H值对酶促合成γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln的钙离子螯合能力研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 数据处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 螯合反应单因素实验结果 |
| 4.3.2 螯合反应正交实验结果 |
| 4.3.3 Gln、CPP、γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln螯合钙离子的比较 |
| 4.3.4 紫外吸收测试 |
| 4.3.5 红外光谱分析 |
| 4.3.6 LO2细胞毒性实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln的抗冻性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料与仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 数据处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 降温曲线实验结果 |
| 5.3.2 DSC实验结果 |
| 5.3.3 γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln对酵母的低温保护作用 |
| 5.3.4 γ-[Glu]_(n(1-5)-Gln对冷冻面团巯基含量的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）氧化还原蛋白DJ-1负性调控铁死亡的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1 第一部分 DJ-1蛋白负性调控铁死亡的作用研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.2.1 细胞株与质粒 |
| 1.2.2 实验动物 |
| 1.2.3 药物与主要试剂 |
| 1.2.4 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 质粒扩增 |
| 1.3.3 分子克隆 |
| 1.3.4 慢病毒包装及细胞感染 |
| 1.3.5 基于CRISPR/Cas9 体系构建DJ-1 KO细胞 |
| 1.3.6 Western blot方法检测蛋白表达水平 |
| 1.3.7 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测基因mRNA水平 |
| 1.3.8 流式细胞术检测Lipid ROS |
| 1.3.9 透射电镜观察线粒体 |
| 1.3.10 细胞活力检测 |
| 1.3.11 裸小鼠腋下移植瘤模型构建 |
| 1.3.12 免疫组化 |
| 1.3.13 TUNEL凋亡检测 |
| 1.3.14 胱氨酸摄取功能检测 |
| 1.3.15 半胱氨酸含量检测 |
| 1.3.16 数据分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 DJ-1 蛋白负性调控肿瘤细胞发生铁死亡(慢病毒沉默体系) |
| 1.4.2 DJ-1 蛋白负性调控肿瘤细胞发生铁死亡(CRISPR/Cas9 体系) |
| 1.4.3 DJ-1 蛋白负性调控铁死亡(慢病毒过表达体系) |
| 1.4.4 DJ-1 蛋白负性调控铁死亡(裸小鼠移植瘤体系) |
| 1.4.5 DJ-1 蛋白负性调控铁死亡的初步机制研究 |
| 1.5 讨论 |
| 2 第二部分 DJ-1蛋白负性调控铁死亡的分子机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株与质粒 |
| 2.2.2 药物与主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 质粒扩增 |
| 2.3.3 分子克隆 |
| 2.3.4 慢病毒包装及细胞感染 |
| 2.3.5 Western blot方法检测蛋白表达水平 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测基因mRNA水平 |
| 2.3.7 流式细胞术检测Lipid ROS |
| 2.3.8 细胞活力检测 |
| 2.3.9 Hcy和 SAH含量检测 |
| 2.3.10 免疫沉淀 |
| 2.3.11 蛋白纯化 |
| 2.3.12 SAHH酶活检测 |
| 2.3.13 代谢流组学 |
| 2.3.14 邻近蛋白标记实验(BioID) |
| 2.3.15 凝胶过滤层析实验 |
| 2.3.16 DSS交联实验 |
| 2.3.17 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 DJ-1 蛋白维持铁死亡应激下的GSH水平 |
| 2.4.2 敲低DJ-1 蛋白不影响GSH生物合成通路中催化酶的蛋白水平 |
| 2.4.3 DJ-1 蛋白维持转硫途径中的Hcy水平 |
| 2.4.4 DJ-1 蛋白维持转硫途径中SAHH的酶活和功能 |
| 2.4.5 SAHH介导了DJ-1 蛋白负性调控铁死亡的作用 |
| 2.4.6 DJ-1 蛋白抑制AHCYL1与SAHH的结合 |
| 2.4.7 AHCYL1 负性调控SAHH的作用参与DJ-1 调控的铁死亡 |
| 2.4.8 DJ-1 蛋白促进SAHH的四聚化形成 |
| 2.5 讨论 |
| 3 第三部分 基于DJ-1蛋白二聚结构的抗肿瘤干预策略研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 细胞株与质粒 |
| 3.2.2 药物与主要试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 质粒扩增 |
| 3.3.3 分子克隆 |
| 3.3.4 慢病毒包装及细胞感染 |
| 3.3.5 Western blot方法检测蛋白表达水平 |
| 3.3.6 免疫沉淀 |
| 3.3.7 蛋白纯化 |
| 3.3.8 DSS交联实验 |
| 3.3.9 分子排阻色谱实验 |
| 3.3.10 DJ-1 去糖化酶酶活检测 |
| 3.3.11 流式细胞术检测Lipid ROS |
| 3.3.12 磺酰罗丹明B比色法(SRB) |
| 3.3.13 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 DJ-1 蛋白C末端的三个氨基酸决定了其同源二聚化结构 |
| 3.4.2 DJ-1 蛋白二聚化可能是其去糖化酶活的结构基础 |
| 3.4.3 DJ-1 蛋白二聚化可能是其调控铁死亡的结构基础 |
| 3.4.4 基于DJ-1 二聚结构的抑制剂的设计与合成 |
| 3.4.5 DM10 可靶向二聚型DJ-1 并抑制其酶活 |
| 3.4.6 二聚型DJ-1 抑制剂DM10 促进铁死亡 |
| 3.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 靶向谷胱甘肽代谢途径治疗恶性肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）半胱氨酸对采后金针菇品质、抗氧化能力及麦角硫因合成代谢的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 采后金针菇的品质变化概述 |
| 1.2.1 金针菇的综合价值 |
| 1.2.2 金针菇采后常见问题 |
| 1.2.3 食用菌常见的保鲜方法 |
| 1.3 半胱氨酸应用研究现状 |
| 1.3.1 半胱氨酸概况 |
| 1.3.2 半胱氨酸对果蔬生理生化的影响 |
| 1.3.3 半胱氨酸对麦角硫因含量的影响 |
| 1.4 麦角硫因的研究进展 |
| 1.4.1 麦角硫因简介 |
| 1.4.2 麦角硫因的生理特性 |
| 1.4.3 麦角硫因在食品中的应用 |
| 1.4.4 麦角硫因生物合成代谢途径 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 半胱氨酸处理对金针菇采后品质的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 材料与处理 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 呼吸强度的测定 |
| 2.3.2 失重率的测定 |
| 2.3.3 可溶性固形物的测定 |
| 2.3.4 可溶性蛋白含量的测定 |
| 2.3.5 相对电导率的测定 |
| 2.3.6 PPO活性的测定 |
| 2.3.7 POD活性的测定 |
| 2.3.8 褐变度的测定 |
| 2.3.9 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 半胱氨酸处理对金针菇呼吸强度的影响 |
| 2.4.2 半胱氨酸处理对金针菇失重率的影响 |
| 2.4.3 半胱氨酸处理对金针菇可溶性固形物的影响 |
| 2.4.4 半胱氨酸处理对金针菇可溶性蛋白含量的影响 |
| 2.4.5 半胱氨酸处理对金针菇相对电导率的影响 |
| 2.4.6 半胱氨酸处理对金针菇PPO活性的影响 |
| 2.4.7 半胱氨酸处理对金针菇POD活性的影响 |
| 2.4.8 半胱氨酸处理对金针菇褐变度的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 半胱氨酸处理对金针菇抗氧化能力的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 材料与处理 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SOD活性的测定 |
| 3.3.2 GR活性的测定 |
| 3.3.3 CAT活性的测定 |
| 3.3.4 O_2~-产生速率的测定 |
| 3.3.5 H_2O_2 含量的测定 |
| 3.3.6 总酚含量的测定 |
| 3.3.7 抗坏血酸含量的测定 |
| 3.3.8 麦角硫因含量的测定 |
| 3.3.9 DPPH自由基清除率 |
| 3.3.10 总抗氧化能力的测定 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 半胱氨酸处理对金针菇SOD活性的影响 |
| 3.4.2 半胱氨酸处理对金针菇GR活性的影响 |
| 3.4.3 半胱氨酸处理对金针菇CAT活性的影响 |
| 3.4.4 半胱氨酸处理对金针菇O2-生成速率的影响 |
| 3.4.5 半胱氨酸处理对金针菇H2O2 含量的影响 |
| 3.4.6 半胱氨酸处理对金针菇总酚含量的影响 |
| 3.4.7 半胱氨酸处理对金针菇抗坏血酸含量的影响 |
| 3.4.8 半胱氨酸处理对金针菇麦角硫因含量的影响 |
| 3.4.9 半胱氨酸处理对金针菇DPPH自由基清除率的影响 |
| 3.4.10 半胱氨酸处理对金针菇总抗氧化能力的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 半胱氨酸处理对金针菇采后麦角硫因合成代谢的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 材料及处理 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 主要实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 ATP含量的测定 |
| 4.3.2 Glu、Gly、Met和 His含量测定 |
| 4.3.3 Cys和 GSH含量测定 |
| 4.3.4 麦角硫因含量测定 |
| 4.3.5 金针菇子实体总RNA提取 |
| 4.3.6 RNA逆转录实验 |
| 4.3.7 基因引物设计 |
| 4.3.8 Real-Time PCR扩增体系和反应条件 |
| 4.3.9 Real-Time PCR基因表达差异统计分析 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 半胱氨酸处理对金针菇ATP含量的影响 |
| 4.4.2 半胱氨酸处理对金针菇Glu、Gly、Met和 His含量的影响 |
| 4.4.3 半胱氨酸处理对金针菇Cys和 GSH含量的影响 |
| 4.4.4 半胱氨酸处理对金针菇麦角硫因含量的影响 |
| 4.4.5 金针菇总RNA纯度、完整性检验 |
| 4.4.6 金针菇麦角硫因代谢途径中关键酶基因的选择及验证 |
| 4.4.7 半胱氨酸处理对金针菇关键酶基因表达水平的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜硫代葡萄糖苷生物合成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物硫营养研究进展 |
| 1.1.1 植物硫营养的作用与功能 |
| 1.1.2 植物硫营养的转运和代谢 |
| 1.1.3 缺硫胁迫对植物的影响 |
| 1.2 谷胱甘肽的研究进展 |
| 1.2.1 谷胱甘肽的理化性质 |
| 1.2.2 谷胱甘肽的合成与代谢 |
| 1.2.3 谷胱甘肽的生物学功能 |
| 1.3 硫代葡萄糖苷的研究进展 |
| 1.3.1 硫代葡萄糖苷的结构与分类 |
| 1.3.2 硫代葡萄糖苷的生物合成与调控基因 |
| 1.3.3 硫代葡萄糖苷的降解 |
| 1.3.4 硫代葡萄糖苷的功能 |
| 1.4 硫营养与硫代葡萄糖苷的合成 |
| 1.4.1 初生硫代谢为硫苷合成提供原料 |
| 1.4.2 初生硫代谢与硫苷合成调控 |
| 2 外源谷胱甘肽处理对缺硫胁迫下小白菜生长的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验设计 |
| 2.2.3 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 外源谷胱甘肽处理对缺硫胁迫下小白菜地上部生长的影响 |
| 2.3.2 外源谷胱甘肽处理对缺硫胁迫下小白菜地下部生长的影响 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜谷胱甘肽代谢的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验设计 |
| 3.2.3 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜谷胱甘肽合成的影响 |
| 3.3.2 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜谷胱甘肽代谢的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜硫代葡萄糖苷合成的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验设计 |
| 4.2.3 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜硫代葡萄糖苷含量的影响 |
| 4.3.2 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜硫苷基因表达量的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜初生硫代谢的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验设计 |
| 5.2.3 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜初生硫代谢关键基因表达量的影响 |
| 5.3.2 外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜Cys含量的影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）香菇挥发性硫化物和滋味物质代谢相关基因的筛选及候选基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 香菇概述 |
| 1.1.1 香菇简介 |
| 1.1.2 营养成分 |
| 1.1.3 活性成分 |
| 1.2 香菇挥发性风味物质的研究进展 |
| 1.2.1 香菇主要的挥发性风味物质 |
| 1.2.2 鲜香菇与干香菇挥发性风味成分差异 |
| 1.2.3 香菇风味物质形成机理 |
| 1.3 香菇非挥发性呈味物质的研究进展 |
| 1.3.1 食用菌中游离氨基酸的研究 |
| 1.3.2 食用菌中5'-核苷酸的研究 |
| 1.3.3 食用菌中可溶性糖的研究 |
| 1.3.4 食用菌中有机酸的研究 |
| 1.3.5 鲜味评价 |
| 1.3.6 香菇非挥发性呈味物质的研究进展 |
| 1.4 香菇转录组学研究概况 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 转录组学在香菇中的应用 |
| 1.4.3 转录组学揭示风味物质的产生策略 |
| 1.5 本课题的研究内容与意义 |
| 第2章 转录组测序筛选香菇干燥过程中挥发性含硫化合物代谢相关基因 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 香菇挥发性含硫化合物代谢产物的测定 |
| 2.2.2 γ-谷氨酰转肽酶酶活力测定 |
| 2.2.3 半胱氨酰亚砜裂解酶酶活力测定 |
| 2.2.4 实时定量内参基因的筛选 |
| 2.2.5 热风干燥前期转录组分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 香菇热风干燥前期挥发性风味物质的变化 |
| 2.3.2 香菇热风干燥前期实时定量内参基因的筛选 |
| 2.3.3 香菇热风干燥前期转录组学研究 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 候选基因Lecsl3的外源表达及生物学功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 工具酶和试剂 |
| 3.1.3 试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 香菇Lecsl3基因的cds序列扩增 |
| 3.2.2 香菇Lecsl3基因的生物信息学分析 |
| 3.2.3 大肠杆菌重组表达载体的构建 |
| 3.2.4 大肠杆菌工程菌的构建 |
| 3.2.5 重组C-S lyase的诱导表达 |
| 3.2.6 重组Lecs13蛋白的亲和层析 |
| 3.2.7 香菇半胱氨酰亚砜裂解酶酶活测定 |
| 3.2.8 香菇挥发性含硫化合物代谢产物的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Lecsl3基因的cds序列扩增 |
| 3.3.2 香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因Lecsl3的生物信息学分析 |
| 3.3.3 大肠杆菌工程菌的构建 |
| 3.3.4 重组C-S lyase的纯化 |
| 3.3.5 重组C-S lyase在挥发性含硫化合物代谢途径中的作用分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 稻草替代木屑对香菇滋味物质的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与栽培配方 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌丝在不同培养基上菌丝长速测定 |
| 4.2.2 香菇栽培出菇管理 |
| 4.2.3 栽培过程生物学指标统计 |
| 4.2.4 样品处理 |
| 4.2.5 香菇营养成分测定 |
| 4.2.6 可溶性糖的测定 |
| 4.2.7 游离氨基酸的测定 |
| 4.2.8 呈味核苷酸的测定 |
| 4.2.9 有机酸的测定 |
| 4.2.10 等鲜浓度评价体系 |
| 4.2.11 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 稻草和木屑对香菇菌丝生长的影响 |
| 4.3.2 稻草添加量对香菇产量的影响 |
| 4.3.3 不同配方香菇营养成分分析 |
| 4.3.4 可溶性糖检测结果与分析 |
| 4.3.5 游离氨基酸检测结果与分析 |
| 4.3.6 呈味核苷酸检测结果与分析 |
| 4.3.7 有机酸检测结果与分析 |
| 4.3.8 等鲜浓度分析结果 |
| 4.3.9 香菇化学成分与栽培配方中稻草含量的相关性分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 香菇谷氨酸代谢相关基因的分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 候选基因确定过程 |
| 5.1.2 序列分析工具 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 香菇谷氨酸代谢相关酶编码基因注释 |
| 5.2.2 香菇谷氨酸代谢途径中的相关基因的结构分析 |
| 5.2.3 香菇谷氨酸合成途径中相关基因编码的酶分析 |
| 5.2.4 氨基酸序列同源性分析 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 候选内参基因引物信息 |
| 附录2 香菇半胱氨酰亚砜裂解酶基因Lecsl3的cds序列 |
| 附录3 香菇谷氨酸合成酶基因cds序列 |
| 附录4 香菇谷氨酸脱氢酶基因cds序列 |
| 附录5 香菇NADP依赖型谷氨酸脱氢酶基因cds序列 |
| 附录6 香菇Δ~1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶基因cds序列 |
| 致谢 |
（9）谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽及其抗氧化性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 谷氨酰胺酶的概述 |
| 1.2 γ-谷氨酰肽的概述 |
| 1.3 天然的γ-谷氨酰肽 |
| 1.4 γ-谷氨酰肽的分析检测 |
| 1.5 γ-谷氨酰肽的生理活性 |
| 1.5.1 γ-谷氨酰肽与病理学指标 |
| 1.5.2 γ-谷氨酰肽与神经系统 |
| 1.5.3 γ-谷氨酰肽与炎症反应 |
| 1.5.4 γ-谷氨酰肽与肝肾功能 |
| 1.5.5 γ-谷氨酰肽与钙离子敏感受体的变构调节作用 |
| 1.5.6 其他生理活性 |
| 1.6 γ-谷氨酰肽的制备方法 |
| 1.6.1 自然提取法 |
| 1.6.2 化学合成法 |
| 1.6.3 微生物发酵法 |
| 1.6.4 酶合成法 |
| 1.7 氧化应激与抗氧化肽 |
| 1.7.1 活性氧簇的概述 |
| 1.7.2 氧化应激与疾病 |
| 1.7.3 抗氧化肽的研究现状 |
| 1.8 本论文的立题依据和研究内容 |
| 1.8.1 本论文的立题依据 |
| 1.8.2 本论文的研究内容 |
| 第二章 两种谷氨酰胺酶的酶学特性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 谷氨酰胺酶的水解及转肽酶活力 |
| 2.3.2 pH对谷氨酰胺酶催化活性的影响 |
| 2.3.3 pH对谷氨酰胺酶稳定性的影响 |
| 2.3.4 温度对谷氨酰胺酶催化活性的影响 |
| 2.3.5 温度对谷氨酰胺酶稳定性的影响 |
| 2.3.6 盐含量对谷氨酰胺酶催化活性的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 LX-1000EP环氧基树脂固定化谷氨酰胺酶的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 溶剂pH对固定化效果的影响 |
| 3.3.2 吸附时间对固定化效果的影响 |
| 3.3.3 相对加酶量对固定化效果的影响 |
| 3.3.4 响应面试验结果与分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 γ-谷氨酰基受体的筛选结果 |
| 4.3.2 UPLC-MS/MS分离鉴定反应液体系中的γ-谷氨酰肽 |
| 4.3.3 HPLC检测反应液体系中的γ-谷氨酰肽 |
| 4.3.4 pH对产物种类及产率的影响 |
| 4.3.5 温度对产物种类及产率的影响 |
| 4.3.6 酶添加量对产物种类及产率的影响 |
| 4.3.7 反应时间对产物种类及产率的影响 |
| 4.3.8 底物浓度对产物种类及产率的影响 |
| 4.3.9 底物比例对产物种类及产率的影响 |
| 4.3.10 降低产物浓度对γ-谷氨酰肽产率的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 γ-谷氨酰肽及其酶促反应液的抗氧化性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 γ-谷氨酰肽清除DPPH自由基的能力 |
| 5.3.2 γ-谷氨酰肽的还原力 |
| 5.3.3 γ-谷氨酰肽螯合Fe2+的能力 |
| 5.3.4 γ-谷氨酰肽清除ABTS自由基的能力 |
| 5.3.5 γ-谷氨酰肽清除超氧阴离子自由基(O2?-)的能力 |
| 5.3.6 γ-谷氨酰化对氨基酸抗氧化活性的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）马铃薯谷胱甘肽合成相关酶StGSH1和StGSH2的活性鉴定和蛋白结晶（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词及英汉对照 |
| 1 前言 |
| 1.1 马铃薯抗高浓度活性氧簇研究进展 |
| 1.2 谷胱甘肽及生物合成相关蛋白 |
| 1.2.1 谷胱甘肽的生物合成 |
| 1.2.1.1 谷胱甘肽的结构 |
| 1.2.1.2 谷胱甘肽生物合成的两步反应 |
| 1.2.1.3 谷胱甘肽两种形式的动态变化 |
| 1.2.1.4 谷胱甘肽的前体氨基酸 |
| 1.2.2 谷胱甘肽的降解 |
| 1.2.3 谷胱甘肽的重要作用 |
| 1.2.3.1 谷胱甘肽的抗氧化作用 |
| 1.2.3.2 谷胱甘肽参与氧化还原信号转导 |
| 1.2.3.3 谷胱甘肽的解毒作用 |
| 1.2.4 谷氨酰半胱氨酸连接酶(GSH1) |
| 1.2.5 谷胱甘肽合成酶(GSH2) |
| 1.3 蛋白质纯化技术 |
| 1.3.1 亲和层析 |
| 1.3.2 离子交换层析 |
| 1.3.3 尺寸排阻色谱 |
| 1.4 蛋白质晶体学 |
| 1.5 蛋白质空间结构解析 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂及配方 |
| 2.1.2.1 主要药品和试剂 |
| 2.1.2.2 主要样品配方 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 StGSH1和StGSH2 蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.2 StGSH1和StGSH2 核酸序列的密码子优化 |
| 2.2.3 构建原核表达载体 |
| 2.2.3.1 目的片段的扩增 |
| 2.2.3.2 载体酶切 |
| 2.2.3.3 目的片段与线性化质粒pET32a的连接 |
| 2.2.3.4 制备大肠杆菌DH5α感受态 |
| 2.2.3.5 转入大肠杆菌感受态 |
| 2.2.3.6 转化子筛选 |
| 2.2.4 TEV蛋白酶的纯化 |
| 2.2.5 目的蛋白的小量表达纯化 |
| 2.2.5.1 小量诱导 |
| 2.2.5.2 样品制备 |
| 2.2.6 目的蛋白的大量表达纯化 |
| 2.2.6.1 大量诱导 |
| 2.2.6.2 Ni亲和层析 |
| 2.2.6.3 离子交换层析 |
| 2.2.6.4 尺寸排阻色谱 |
| 2.2.7 酶活测定 |
| 2.2.8 蛋白质结晶 |
| 2.2.8.1 条件初筛 |
| 2.2.8.2 条件优化 |
| 3 结果 |
| 3.1 StGSH1蛋白 |
| 3.1.1 StGSH1蛋白生物信息学分析 |
| 3.1.1.1 一级结构、理化参数预测 |
| 3.1.1.2 氨基酸序列保守性、信号肽的预测 |
| 3.1.1.3 跨膜结构域分析 |
| 3.1.1.4 二级结构和三级结构预测 |
| 3.1.1.5 同源性分析与进化树分析 |
| 3.1.1.6 密码子优化结果 |
| 3.1.2 StGSH1原核表达载体构建 |
| 3.1.2.1 目的基因扩增 |
| 3.1.2.2 菌落PCR结果 |
| 3.1.3 TEV蛋白酶的纯化 |
| 3.1.4 StGSH1蛋白小量表达纯化 |
| 3.1.4.1 SDS-PAGE |
| 3.1.4.2 Western blot |
| 3.1.5 StGSH1蛋白大量表达纯化 |
| 3.1.5.1 Ni亲和层析 |
| 3.1.5.2 尺寸排阻色谱 |
| 3.1.5.3 离子交换层析 |
| 3.1.5.4 StGSH1 蛋白peak1与peak2 的尺寸排阻色谱 |
| 3.1.5.5 酶切StGSH1蛋白 |
| 3.1.5.6 酶切后的尺寸排阻色谱 |
| 3.1.6 StGSH1蛋白单体酶活 |
| 3.1.7 StGSH1蛋白的结晶 |
| 3.1.7.1 二聚体结晶 |
| 3.1.7.2 单体结晶 |
| 3.1.8 StGSH1蛋白单体结构 |
| 3.2 StGSH2蛋白 |
| 3.2.1 StGSH2蛋白生物信息学分析 |
| 3.2.1.1 一级结构、理化参数预测 |
| 3.2.1.2 氨基酸序列保守性、信号肽的预测 |
| 3.2.1.3 跨膜结构域分析 |
| 3.2.1.4 二级结构和三级结构预测 |
| 3.2.1.5 同源性分析与进化树分析 |
| 3.2.1.6 密码子优化结果 |
| 3.2.2 StGSH2原核表达载体构建 |
| 3.2.2.1 目的基因扩增 |
| 3.2.2.2 菌落PCR结果 |
| 3.2.3 StGSH2蛋白小量表达纯化 |
| 3.2.3.1 SDS-PAGE |
| 3.2.3.2 Western blot |
| 3.2.4 StGSH2蛋白大量表达纯化 |
| 3.2.4.1 Ni亲和层析 |
| 3.2.4.2 尺寸排阻色谱 |
| 3.2.5 StGSH2酶活 |
| 4 讨论和结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 StGSH1 蛋白和StGSH2 蛋白 |
| 4.1.2 蛋白诱导纯化 |
| 4.1.2.1 StGSH1蛋白的纯化 |
| 4.1.2.2 StGSH2蛋白的纯化 |
| 4.1.3 晶体条件的获得 |
| 4.1.3.1 StGSH1和StGSH2 蛋白的结晶 |
| 4.2 结论 |
| 4.2.1 原核表达载体构建 |
| 4.2.2 转化大肠杆菌表达菌株 |
| 4.2.3 纯化目的蛋白 |
| 4.2.4 酶活测定 |
| 4.2.5 结晶条件的获得 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因及其调控（论文参考文献）
- [1]γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶学性质及其应用研究[D]. 刘慧敏. 南京师范大学, 2021
- [2]胶质瘤细胞有氧糖酵解与谷氨酸代谢协调效应研究[D]. 郭田田. 山西大学, 2020(01)
- [3]洛氏鱥（Rhynchocypris lagowskii （Dybowski,1869））核转录因子Nrf2基因特性及功能分析[D]. 郑男. 吉林农业大学, 2020(03)
- [4]γ-[Glu](n（1-5）-Gln的酶法合成及其应用研究[D]. 唐润梅. 华南理工大学, 2020(02)
- [5]氧化还原蛋白DJ-1负性调控铁死亡的作用及其机制研究[D]. 陈小冰. 浙江大学, 2020(08)
- [6]半胱氨酸对采后金针菇品质、抗氧化能力及麦角硫因合成代谢的影响[D]. 钱霄晨. 浙江工商大学, 2020(02)
- [7]外源谷胱甘肽对缺硫胁迫下小白菜硫代葡萄糖苷生物合成的影响[D]. 王丹. 浙江农林大学, 2019(01)
- [8]香菇挥发性硫化物和滋味物质代谢相关基因的筛选及候选基因的功能研究[D]. 高双双. 华中农业大学, 2019
- [9]谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽及其抗氧化性的研究[D]. 卢慧茵. 华南理工大学, 2019(01)
- [10]马铃薯谷胱甘肽合成相关酶StGSH1和StGSH2的活性鉴定和蛋白结晶[D]. 南洁. 华南农业大学, 2019(02)