一、含绿色荧光蛋白及小鼠IFN-γ基因的高效真核表达载体的构建与鉴定（论文文献综述）
高明春[1]（2021）在《IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制》文中认为牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一,世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50%到90%之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞,发生组织损伤和免疫抑制,随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10,IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子,上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答,IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type 2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用,BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征,证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究,证实牛IL10与IL10受体结合转导信号,激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3,在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖My D88、p38 MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10,负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查,结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3,其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析,感染鼠肺脏发生病理变化,并且肺内病毒在12 d内不能够被完全清除,感染肺脏发生了多种炎性因子的表达,检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12 d之内,大多数检测时间点的转录均显着高于对照。通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析,在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后,在感染早期显着上调了IL10与SOCS3表达,SOCS3几乎在所有分组中都得到了显着的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显着下调,IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用,克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化,并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区,然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达,这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能,即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究,而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制,研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的m RNA并大量分泌IL10蛋白,同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显着的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞,外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在My D88（Myeloid differentiation factor,MYD88）缺失与My D88抑制剂处理的BMDM细胞上,IL10/SOCS3的表达大幅降低,表明依赖My D88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外,应用通路抑制剂证实NF-κB和p38 MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。综上所述,BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一,感染后可显着上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制,主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答,这种由IL10介导的负调控依赖于My D88、NF-κB和p38 MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。
岳涛涛[2]（2021）在《旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究》文中研究指明肺癌是当前死亡率最高的癌症,发病率、死亡率持续上升,发病年龄逐渐年轻化。目前,肺癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗和生物免疫疗法。生物免疫疗法主要包括抗体疗法、细胞疗法和肿瘤疫苗。研究发现细菌活载体疫苗具有明显的抗肿瘤效应,其中乳酸菌是益生菌,具有免疫调节能力和一定的抗肿瘤活性,已有研究表明乳酸菌可作为疫苗载体用于宫颈癌的防治。近年来,人们发现旋毛虫可抑制骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的生长。本实验室前期发现旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原sHSPs抗血清具有良好的抗肺癌作用。因此,本试验构建相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌,研究其对Lewis肺癌的作用,以期为肿瘤防治提供新思路,并为肿瘤疫苗的研发及应用提供实验数据。旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建扩增出sHSPs基因,连接真核质粒pValac,转染293T细胞验证表达,将验证后的重组质粒转化重组侵入型植物乳杆菌NC8/FnBPA,筛选出阳性克隆命名为NC8-sHSPs。对重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的生长特性、黏附、侵袭、定植能力及安全性进行检测。结果表明成功扩增出相关抗原基因sHSPs,构建的重组质粒pValac-sHSPs在真核细胞内可以表达。生长特性分析表明重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的生长特性无明显改变,能以活菌的形式通过人工胃液,并可在人工肠液中繁殖。定植试验表明NC8-sHSPs在体外可黏附、侵入小鼠mode-k细胞,在小肠内也可定植。安全性检测表明NC8-sHSPs对mode-k细胞增殖无明显影响,体内、外均未引起IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ和TNF-α等促炎细胞因子的过量释放,也未引起小鼠体重的明显改变和组织器官的明显损伤。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防作用首先经口免疫1×109 cfu NC8-sHSPs,二免后7 d皮下注射2×106个Lewis肺癌细胞荷瘤,荷瘤后14 d,处死小鼠,剥离肿瘤,计算抑瘤率。通过ELISA和流式细胞术检测免疫学指标。CCK-8、LDH试验研究体外重组sHSPs对脾淋巴细胞增殖的影响及诱导CTL杀伤Lewis肺癌细胞的能力。最后对病理组织学损伤进行观察。结果表明重组植物乳杆菌NC8-sHSPs可明显抑制Lewis肺癌生长,平均肿瘤体积和重量抑制率分别为62.36%和68.37%。免疫学检测发现重组植物乳杆菌可诱导sHSPs特异性IgG,提高血清中TNF-α、IFN-γ、总sIgA以及肠道灌洗液中总sIgA的水平,增加CD8+T淋巴细胞的数量,表明免疫NC8-sHSPs可激活宿主的体液免疫,增强细胞免疫和黏膜免疫抑制Lewis肺癌的生长。淋巴细胞增殖试验表明重组sHSPs可促进小鼠脾淋巴细胞增殖,联合IL-2可诱导产生直接杀伤Lewis肺癌细胞的CTL。免疫组化表明肿瘤内PCNA的表达降低,病理组织学观察未见明显损伤。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的治疗作用首先皮下注射2×106 Lewis肺癌细胞建立荷瘤小鼠模型,然后用1×109 cfu NC8-sHSPs连续治疗15 d,治疗结束剥离肿瘤,计算抑瘤率。使用ELISA检测免疫学指标,最后对组织器官进行HE染色观察病理组织学损伤。结果表明重组植物乳杆菌NC 8-sHSPs治疗可抑制Lewis肺癌生长,延长荷瘤小鼠生存时间,平均肿瘤体积和重量抑制率分别为40.76%和44.22%。免疫学检测结果表明重组植物乳杆菌可诱导sHSPs特异性IgG,提高血清中IL-12、TNF-α、IFN-γ、总sIgA以及肠道灌洗液中总sIgA的水平,表明重组植物乳杆菌治疗可诱导体液免疫,增强黏膜免疫和细胞免疫杀伤Lewis肺癌。组织器官HE染色表明重组植物乳杆菌NC 8-sHSPs治疗后未出现明显的病理损伤。
乔连江[3]（2021）在《布鲁菌UGPase调控宿主分子ACOD1表达进而抑制NF-κB活化的分子机制研究》文中提出布鲁菌病（简称“布病”）是由布鲁菌属引起的一种严重人畜共患传染病,被列为我国法定传染病中乙类传染病之首。该病在全球范围内流行,严重影响了畜牧业健康发展和公共卫生安全。然而,由于布鲁菌一些重要的毒力分子功能以及感染宿主后逃逸免疫反应的机制还不完全清楚,严重阻碍了布病的防控和净化。为此,我们以布鲁菌新毒力因子UGPase调控RAW264.7细胞差异表达的蛋白为研究对象,以期从宿主分子角度解释UGPase的毒力功能。首先,在实验室前期利用Label-free技术对布鲁菌UGPase缺失前后感染RAW264.7细胞进行了比较蛋白组学分析的基础上,使用PRM蛋白定量和WB技术对Label-free结果进行验证分析。PRM蛋白定量技术显示UGPase上调了8个蛋白分子表达,而下调了13个蛋白分子表达,与Label-free结果完全一致。在PRM蛋白定量结果的基础上,再次选取差异宿主分子Rhoa、Cox2、S100a4和ACOD1进行WB技术验证。结果显示,UGPase上调了S100a4表达,而下调了Rhoa、Cox2和ACOD1表达,与PRM蛋白定量和Label-free结果完全一致。说明比较蛋白组学和PRM蛋白定量结果可靠。其次,我们选取上述验证的差异表达的宿主分子ACOD1,使用慢病毒包装技术构建过表达ACOD1细胞系。以RAW264.7细胞总RNA反转录c DNA为模板,通过PCR扩增技术得到ACO D1片段后,利用NEBuilder无缝连接酶连接至空慢病毒表达载体p LV-CMV-EGFP/Puro上。用磷酸钙沉淀法将上述重组载体转导至293T进行慢病毒包装制备,得到病毒滴度1.00×108 TU/m L。选取活力良好的RAW264.7细胞,以MOI=10进行感染实验,在48h后,以预先实验确定的嘌呤霉素对RAW264.7细胞的最适筛选浓度3μg/m L,进行连续筛选培养约1周。对筛选存活的细胞进行有限稀释法后并扩大培养,将得到的单细胞系命名为RAW264.7-EGFP/Puro-ACOD1。使用荧光显微镜、流式细胞仪和WB对RAW264.7-EGFP/Puro-ACOD1细胞系进行鉴定。荧光显微镜检测到了稳定荧光信号,且细胞形态和活性没出现明显变化。流式细胞仪显示RAW264.7-EGFP/Puro-ACOD1荧光率高达97.17%。WB技术检测显示RAW264.7-EGFP/Puro-ACOD1细胞系的A COD1蛋白表达极显着的高于RAW264.7细胞。说明成功建立了过表达ACOD1蛋白RAW264.7细胞系。最后,以上述构建过表达ACOD1蛋白的RAW264.7细胞系为工具,利用LPS进行刺激实验并分12 h和24 h 2个时间点。分别以WB和q PCR技术检测NF-κB活化和细胞因子表达情况。WB结果显示,ACOD1能够促进宿主细胞NF-κB信号通路的活化,但随着时间增加促进强度明显减弱。q PCR结果显示,ACOD1可上调IFN-γ表达,下调IL-1β,IL-2和IL-10等因子。综上所述,我们证明了UGPase可通过下调宿主分子ACOD1表达,进而抑制宿主NF-κB通路活化,进而调控细胞因子表达,以发挥毒力作用帮助布鲁菌逃避宿主免疫监视得以胞内生存。
郭丽莹[4]（2021）在《塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选与鉴定》文中研究指明塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）属于小RNA病毒科,是塞内卡病毒属的唯一成员。猪感染SVA后,主要表现为厌食、发烧、流涎、口鼻和蹄部出现水疱、溃疡等,严重者出现跛行,其临床症状与口蹄疫、猪水泡病和水疱性口炎等疾病难以区分。2002年SVA在美国被发现,2014年之后加拿大、巴西、中国、泰国和哥伦比亚也相继报道,病毒感染呈现世界蔓延的趋势。2015年我国广州首次发生SVA疫情,随后疫情陆续扩展至湖北、黑龙江、河南和福建等地,严重影响了我国养猪业的发展,给畜牧养殖业造成了巨大的损失。目前,关于SVA细胞免疫方面的研究较少,但细胞免疫不仅可以刺激机体产生T细胞免疫应答,还有辅助体液免疫应答的作用,而抗原表位作为激活免疫应答最有效的氨基酸短肽,其筛选和鉴定显得尤为重要。生物信息学的飞速发展使得人们利用免疫表位数据库进行抗原表位的筛选成为可能,这种从预测到鉴定的技术极大地节约了研究经费和人力物力成本,有利于抗原表位的快速鉴定。开展抗原表位的研究对于研究病原学、免疫监测、疾病诊断及设计基于表位的疫苗等具有重要意义。有研究表明,SVA的病毒粒子免疫可以刺激T淋巴细胞增殖,刺激后能够检测到IFN-γ特异性T细胞。在此前提下,本课题通过预测并鉴定SVA的T细胞抗原表位,希望有助于研发SVA的T细胞疫苗,进而为研究T细胞免疫应答做铺垫。首先利用生物信息学网站对SVA结构蛋白进行抗原表位的预测,选择得分优且重复率较高的多肽合成,然后构建SVA结构蛋白的真核表达载体质粒（p CDNA3.1-P1）,经蛋白质免疫印迹、间接免疫荧光及间接ELISA实验证实它可以在体外表达,然后将其作为DNA疫苗免疫小鼠,通过病毒中和实验,酶联免疫吸附实验来检测DNA疫苗刺激小鼠产生抗体的能力。之后通过流式细胞术检测质粒免疫小鼠促进淋巴细胞增殖的能力,通过酶联免疫斑点技术检测多肽刺激脾细胞产生IFN-?的数量。最终选择重复率高且效果较好的多肽检测多肽刺激脾细胞产生IFN-?的能力,该多肽可能为SVA的T细胞抗原表位。实验表明虽然DNA疫苗刺激小鼠产生抗体的能力较弱,但小鼠体内仍有抗体产生,再用合成的多肽来进行体外刺激,利用IFN-γELISPOT试剂盒对以上多肽来进行筛选,共筛选出4个效果较好的多肽,分别为1（SFDTASGTF）、9（MPFQSLGTY）、11（ITLTFCGPM）、21（TSVDISVPYI）号多肽,可为SVA候选肽疫苗做铺垫。
纪立凯[5]（2020）在《猪丁型冠状病毒N蛋白抑制猪RLR信号通路的分子机制研究》文中进行了进一步梳理冠状病毒（Cornavirus,CoV）在自然界中具有广泛的感染宿主,给人类和动物健康造成严重威胁。CoV属于套式病毒目（Nidovirales）,冠状病毒科（Coronaviridae）,冠状病毒亚科（Coronavirinae）,主要分为甲型、乙型、丙型和丁型冠状病毒属。猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新发现的冠状病毒,其基因组为单股正链RNA,大小约25 kb,可编码4种结构蛋白:刺突蛋白（spike,S）、小包膜蛋白（small membrane,E）、膜蛋白（membrane,M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）,分别参与病毒入侵、病毒组装和宿主先天免疫调控的过程。先天性免疫是动物抵御病毒入侵的第一道防线,而PDCoV可抑制猪的先天性免疫。2014年以来PDCoV在世界范围内大规模猪群中暴发,导致大量仔猪因水样腹泻而脱水死亡。鉴于PDCoV感染导致免疫抑制的分子机制尚不清楚,且迄今尚无防控该病毒的安全高效疫苗。因此,本文以PDCoV为对象,聚焦该病毒编码的N蛋白,解析其在病毒感染中拮抗宿主先天性免疫的分子机制及其在VLP（virus-like particle,VLP）组装中的作用,为深入揭示PDCoV致病机理、研制VLP疫苗提供理论依据。主要研究内容与结果如下:本文对上海及周边地区腹泻猪的粪便及小肠内容物样本进行PDCoV核酸检测,对阳性样本利用猪肾细胞系LLC-PK1分离病毒,成功获得一株PDCoV上海毒株,命名为PDCoV-CHSH-2016。通过全基因组测序及序列分析发现,基因组全长25,412bp,与参考毒株（HKU-44）相比,上海毒株的ORF1a和S基因分别存在6个和3个碱基序列的缺失。基于全基因组和S基因的进化分析显示,上海毒株与中国其它地区的分离株属于同一进化分支,提示本文的研究结果对于国内其它PDCoV毒株的研究具有普遍参考价值。病毒的细胞嗜性研究结果显示,PDCoV能感染猪源细胞（LLC-PK1、PK-15、IPEC-J2、3D4/21）、鸡源细胞DF-1和人源细胞HEK-293T,提示PDCoV具有适应感染多物种细胞的潜力潜力。为了阐明PDCoV拮抗猪先天性免疫的机制,本文成功构建了猪IFN-α（porcine IFN-α,p IFN-α）和p IFN-β的双荧光素酶报告基因系统,基于该系统分析发现,PDCoV感染LLC-PK1细胞能显着抑制水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）诱导p IFN-α和p IFN-β的表达。通过对PDCoV结构蛋白研究发现,PDCoV N蛋白能够显着抑制poly（I:C）及VSV诱导的p IFN-β启动子活性,而M和E蛋白对其影响不显着。进一步研究发现,PDCoV N蛋白在PK-15细胞中过表达时,不仅能够显着抑制poly（I:C）诱导的猪IFNB1、OAS1和ISG15m RNA的转录,而且能够恢复VSV-GFP病毒在poly（I:C）预处理的PK-15细胞中的复制能力。表明PDCoV N蛋白是一种重要的抑制p IFN-β产生的拮抗蛋白。为了进一步揭示PDCoV N蛋白拮抗p IFN-β产生的信号通路激活机制,通过共表达PDCoV N蛋白和猪RLR（RIG-I-like receptor）信号通路中的关键信号分子,利用双荧光素酶报告基因检测发现,N蛋白能够显着抑制猪RIG-I、RIG-IN（RIG-I的激活突变体）、MDA5、MAVS、TBK1和IRF3诱导的p IFN-β产生,表明N蛋白具有抑制猪RLR信号通路激活的功能。为了阐明其分子机制,本文利用Co-IP和激光共聚焦技术筛选PDCoV N蛋白的潜在互作蛋白,结果显示PDCoV N蛋白与猪RIG-I具有明显的共沉淀现象,且在PK15细胞中呈现明确的共定位特征,表明猪RIG-I是N蛋白的重要互作蛋白。通过构建删减突变体进行Co-IP试验,确定了PDCoV N蛋白的N端区域（1-268aa）是结合猪RIG-I的关键区域。同时发现,N蛋白仅与猪RIG-I识别ds RNA的关键结构域HEL和CTD结合,而该结构域是猪RIG-I识别病毒ds RNA和早期泛素化修饰激活的关键区域。为此,本文进一步探究了PDCoV N蛋白对猪RIG-I功能的影响。体外ds RNA结合试验表明,猪RIG-I和PDCoV N蛋白均能够结合poly（I:C）-breads,且PDCoV N蛋白能显着抑制猪RIG-I与ploy（I:C）-breads的结合,且存在剂量依赖效应。此外,PDCoV N蛋白与猪RIG-I的互作能够显着抑制猪RIG-I K63多聚泛素化修饰激活。深入研究发现,猪Riplet是促进猪RIG-I激活的关键E3泛素连接酶,但由于PDCoV N蛋白与猪Riplet拥有相同的结合猪RIG-I的结构域,通过竞争结合,干扰了猪Riplet对猪RIG-I的泛素化修饰激活。这一发现揭示了PDCoV N蛋白抑制猪RLR上游信号通路早期激活的新机制。为了深入探究PDCoV N蛋白抑制猪RLR下游信号通路激活的机制,经LC-MS/MS、Co-IP以及激光共聚焦分析发现,猪IRF7（po IRF7）是PDCoV N蛋白的另一个重要互作蛋白。虽然IRF7是各物种保守的功能蛋白,但Co-IP、双荧光素酶报告基因以及q RT-PCR的结果表明,PDCoV N蛋白可与po IRF7发生特异性相互作用,并抑制po IRF7诱导的I型IFN产生,但不与人源或鸡源IRF7相互,也不影响它们的功能。进一步研究发现,PDCoV N蛋白通过促进po IRF7发生K6、K11和K29连接的多聚泛素化修饰,诱导po IRF7经泛素-蛋白酶体途径降解。通过点突变发现,po IRF7第359位赖氨酸是PDCoV N蛋白诱导po IRF7发生多聚泛素化修饰并导致其降解的关键位点。尽管该位点在人源和鸡源IRF7中保守,但PDCoV N蛋白不能促进这两种动物的IRF7降解,表明PDCoV N蛋白对猪IRF7的降解作用具有物种特异性。PDCoV结构蛋白具有潜在组装形成VLP的能力,而N蛋白具有显着抑制猪I型IFN的表达的作用,若N蛋白参与VLP的组装,可能会影响VLP作为疫苗的免疫效果。因此,本文进一步探究了PDCoV N蛋白在病毒VLP组装中的作用,利用昆虫杆状病毒系统,成功构建可分别独立表达PDCoV结构蛋白（S/M/E/N）的重组杆状病毒:r Bacmid-PDCoV-S、r Bacmid-PDCoV-N和r Bacmid-PDCoV-E/M。利用免疫斑点试验和电镜观察发现,r Bacmid-PDCoV-S、r Bacmid-PDCoV-N和r Bacmid-PDCoV-E/M共感染Sf9细胞后能组装形成PDCoV VLP（S/M/E/N）。而r Bacmid-PDCoV-S和r Bacmid-PDCoV-E/M共感染Sf9细胞后,同样也能组装形成PDCoV VLP（S/M/E）,且两者形态和大小均与PDCoV一致。基于小鼠免疫和病毒中和试验表明,制备的VLP（S/M/E/N）和VLP（S/M/E）均具有较好抗原性,免疫小鼠的血清具有中和病毒在LLC-PK1细胞中复制的能力,且两者差异不显着,表明PDCoV VLP的组装可以不依赖N蛋白,从而可以规避VLP应用中因N蛋白导致免疫抑制对动物产生的风险。综上所述,本文以分离、鉴定的PDCoV-CHSH-2016为研究对象,解析了病毒的基因组特征,明确了病毒具有感染多物种细胞的能力,首次揭示了PDCoV依赖其N蛋白干扰猪RLR信号通路中RIG-I的激活,并通过N蛋白诱导胞质中猪IRF7经泛素-蛋白酶体途径降解,进而抑制猪RLR信号通路诱导I型IFN产生的分子机制。此外,PDCoV结构蛋白（S/M/E）可不依赖N蛋白,通过自组装形成具有良好抗原性的VLP。研究结果将为深入解析PDCoV的致病机制、研制安全高效VLP疫苗提供理论依据。
石昂[6]（2018）在《共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价》文中研究表明伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV）是影响世界养猪业发展的两大重要传染病病原,分别引起猪的伪狂犬病（PR）和猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）。PR和PRRS是引起母猪发生繁殖障碍、育肥猪发生呼吸道疾病及初生仔猪出现神经症状和高死亡率的主要病毒性传染病。这两种传染病在我国各种类型猪场中广泛存在,给我国养殖业造成巨大的经济损失,严重制约我国养殖业的发展。PRRS在世界上多个国家和地区都存在流行或暴发,由此造成经济损失的同时也带来了严重的生物安全问题。世界各国为了控制PRRS在世界上的流行和暴发,每年都投入大量的资金和资源并采取了积极的防控措施。针对传染病控制“防重于治”的原则对于PRRS疫苗的研发从其暴发时就已开始。在中国,各种类型的疫苗有很多,但仍以灭活疫苗和减毒活疫苗为主。从目前应用的效果看,目前PRRS疫苗的免疫效果不好,保护率不高,对PRRSV的感染只能起到部分保护作用。为弥补目前PRRS疫苗的缺点,开发新型PRRS疫苗则势在必行。近年来,随着基因工程技术的发展,PRRS基因工程疫苗的研发成为目前研究的热点。与灭活疫苗和减毒活疫苗相比,PRRS基因工程疫苗作为一种新型疫苗有更多优势,对PRRS基因工程疫苗的研发主要是重组活载体疫苗和核酸疫苗。2011年底以来,很多免疫猪伪狂犬病基因缺失活疫苗的猪场再次出现了疑似猪伪狂犬病的暴发,通过毒株分离和测序分析表明PRV在多个基因位点出现了不同程度的变异从而引起其毒力发生改变。结合临床调查结果发现,市场存在的猪伪狂犬病基因缺失活疫苗不能对目前PRV变异毒株提供100%保护。因此开发一种以目前流行毒株为亲本毒株的新型伪狂犬病基因缺失活疫苗对于目前PR的防治显得尤为重要。基于伪狂犬病基因缺失活疫苗的成功应用,使以PRV流行毒株为载体构建表达外源免疫原性基因的重组PRV成为目前猪伪狂犬病基因工程疫苗研究的热点。本研究选择与PRRSV中和抗体产生相关的膜蛋白GP5和M作为插入的外源免疫原基因,将GP5、M、修饰型GP5（GP5m）及猪白细胞介素18基因（IL-18）以不同的组合方式克隆至真核表达载体pTK,构建了五种重组转移载体:（1）pTK-GP5-M（2）pTK-GP5-M-IL-18（3）pTK-GP5m（4）pTK-GP5m-IL-18（5）pTK-IL-18。将重组转移载体pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18免疫家兔,进行初步免疫原性试验。在此基础上以本试验室分离到的PRV流行毒株构建的基因缺失株rPRV-gE-/TK-/GFP+为载体在293T细胞中通过同源重组的方式构建了五种重组伪狂犬病病毒（1）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+（2）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+（3）PRV-gE-/TK-/GP5m+（4）rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+（5）rPRV-gE-/TK-/IL-18+并进行免疫原性研究。为了测定五种重组病毒的免疫原性,将45只雌性试验小鼠随机分成9组,每组5只,将已获得的5种不同的重组病毒按105.5TCID50/只的免疫剂量免疫小白鼠。第1组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+;第2组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+;第3组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+;第4组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+;第五组:rPRV-gE-/TK-/IL-18+;第六组:105.5TCID50rPRV-TK-/gE-;第七组:免疫104.6TCID500 PRRSV VR2332疫苗株;第八组:免疫105.5TCID50PRV HB-98疫苗株;第九组:DMEM。免疫途径均为皮下注射+滴鼻免疫,4周后加强免疫一次。首次免疫当天开始采血,每周小鼠尾静脉采血一次,间接ELISA检测特异性抗PRRSV ELISA抗体水平;每两周采血中和试验检测特异性抗PRRSV、PRV中和抗体水平;以此评价重组病毒对小白鼠的体液免疫水平;在2免后4周无菌分离小鼠脾脏T淋巴细胞,进行体外T淋巴细胞增殖试验及T淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10表达检测试验以此评价免疫小白鼠的细胞免疫水平。抗PRRSV特异性中和抗体试验结果表明:首次免疫28d,VR2332疫苗株对照组抗PRRSV中和抗体水平达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+组中和抗体水平较高,最高达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+组未检测到抗PRRSV中和抗体。抗PRRSV特异性ELISA试验结果表明:试验组rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+抗PRRSV ELISA IgG抗体水平在第二次免疫后一周达到高峰并持续2-3周且ELISA IgG抗体水平无太大差异。相比而言,抗PRRSV ELISA IgA抗体水平则较低。抗PRV特异性中和抗体试验结果表明:PRV HB-98株商品疫苗组中和抗体达到4log2;rPRV-TK-/gE-试验组中和抗体达到5log2;rPRV-gE-/TK-/IL-18+试验组抗PRV中和抗体水平较高,中和抗体水平最高达6log2。该试验结果表明临床所分离到的PRV流行毒株基因缺失株rPRV-TK-/gE-可以产生较高的抗PRV流行毒中和抗体且IL-18可以有效增强机体的特异性体液免疫。通过T淋巴细胞细胞因子表达检测试验可知,共表达IL-18试验组CD4+、CD8+T淋巴细胞比例增多且细胞因子表达水平更高,引起机体体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应更强烈。本研究为研发通过黏膜免疫途径接种的预防PRRS和PR有效的重组活载体疫苗奠定了坚实基础。
李岩[7]（2016）在《人源IFN-γ、IL-12串联共表达载体构建与体外联合诱导CIK细胞的作用》文中指出目的本课题以人源细胞因子干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白细胞介素-12（Interleukin-12,IL-12）为基础,经由IRES功能元件串联,构建IFN-γ、IL-12单独表达真核载体及IFN-γ-IRES-IL-12串联共表达真核载体,并转染人源胚胎肾上皮细胞HEK293,并通过反转录PCR（RT-PCR）、蛋白质印迹法（Western Blot）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等检测方式在目的基因的转录水平和翻译水平上进行确证,使目的基因在HEK293细胞中得以成功表达,通过载体抗性基因neo基因,利用G418对成功转染目的基因的阳性克隆细胞进行筛选,以得到能够稳定表达IFN-γ和IL-12细胞因子的HEK293细胞系,并初步探索联合两种细胞因子诱导人外周血单个核细胞分化为细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）的能力,为进一步探讨人源细胞因子诱导的CIK细胞在体内外的抗肿瘤活性奠定基础。研究方法1.目的基因片段的获取及引物合成根据GenBank数据库中已经公布了的人源性细胞因子IFN-γ和IL-12（含IL-12A和IL-12B两个亚单位）基因的参考序列,分别对三个目的片段及串联元件IRES设计引物,并于引物5’端附加相应酶切位点,供目的片段与真核表达载体连接使用,目的片段及引物由上海铂尚生物公司合成。2.重组真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12的构建PCR扩增目的片段IFN-γ、IL-12A及IL-12B,经2%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化、并将回收后的目的片段与pMD18-T载体连接,对目的片段T载体及真核表达载体pΔSGB-X使用相同的限制性内切酶进行双酶切,分别回收目的片段及线性真核表达载体,经T4 DNA连接酶16℃连接过夜,取连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,转化产物接种于含卡纳霉素抗性固体LB平板上,37℃温箱培养12小时后挑取优势抗性菌落于LB液体培养基扩增,提取质粒后PCR反应、酶切反应及测序鉴定重组质粒正确与否。3.重组真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12转染HEK293细胞重组质粒pIFN-γ、pIL-12和pIFN-γ-IRES-IL-12在脂质体Lipofectamine2000的介导下转染人源细胞HEK293,24小时后检测转染效率,以确定目的基因是否成功导入细胞。4.G418筛选转染后阳性细胞克隆及稳定表达细胞系的建立复苏HEK293细胞,并传至96孔板,设置选择培养液中G418浓度梯度,终浓度从0μg/ml-1000μg/ml共11组,分别加入各组HEK293细胞,隔天换液,以2周内细胞全部死亡的G418浓度为筛选转染后阳性克隆的最佳浓度。HEK293细胞转染重组质粒24h后,分别将转染不同质粒组细胞传至细胞瓶中,并添加含G418的选择培养基,隔天换液培养至14天左右,筛选稳定表达目的蛋白IFN-γ和IL-12的HEK293细胞系。5.目的基因IFN-γ和IL-12转录及翻译水平的鉴定提取筛选后HEK293细胞总RNA,经RT-PCR、PCR检测目的基因在HEK293细胞中的转录水平;提取细胞总蛋白,经Western Blot检测HEK293细胞中目的蛋白IFN-γ及IL-12在细胞内翻译水平;取HEK293细胞培养上清液,通过ELISA检测目的蛋白IFN-γ及IL-12在HEK293细胞中的表达及外分泌水平。6.IFN-γ和IL-12联合诱导CIK细胞能力的鉴定淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞,并于体外培养,隔天加入含IFN-γ和IL-12细胞因子的细胞培养上清液,对细胞进行诱导分化,体外培养一周后,收集细胞后CD3和CD56抗体染色,流式细胞仪鉴定细胞表型变化。结果1.真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12的构建成功构建的三种真核表达载体pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12。经质粒PCR和双酶切反应,2%琼脂糖凝胶电泳后显示目的条带与预期大小一致,测序鉴定目的基因序列完全正确,无错配、缺失及移码等。2.重组质粒转染HEK293细胞结果转染重组质粒24小时后,荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率,荧光图片显示含增强绿色荧光蛋白（EGFP）的阴性对照组在荧光显微镜下约有20%的细胞发绿色荧光,与流式细胞仪检测结果基本一致,表明重组质粒已经成功转染至HEK293细胞。3.稳定表达目的蛋白HEK293细胞系的建立经G418敏感性实验证实当选择培养液G418终浓度在600μg/ml以上时,未转染的HEK293细胞在2周内全部死亡,故对成功转染重组质粒的细胞进行稳定筛选时G418终浓度为600μg/ml。转染24小时后,更换G418终浓度为600μg/ml的选择培养基,7天后见大量细胞死亡,换液后去除死亡细胞继续G418加压筛选至14天,见成片细胞形成,即为阳性细胞克隆而来,传至新的细胞瓶继续培养后冻存备用。4.目的基因IFN-γ和IL-12转录水平及翻译水平的鉴定RT-PCR检测结果证实转染重组质粒组中IFN-γ、IL-12A和IL-12B三个目的片段mRNA的转录明显高于阴性对照组,表明目的片段在HEK293细胞中转录成功。Western Blot检测证实转染共表达质粒组分别在17kDa和70kDa左右检测到目的蛋白表达,与预期蛋白分子量大小一致。转染共表达质粒组IFN-γ的表达量明显高于IL-12的表达量。ELISA检测证实目的蛋白在HEK293细胞内实现可分泌性表达,转染共表达质粒组细胞上清中同时检测到细胞因子IFN-γ及IL-12,且细胞因子IFN-γ的表达量高于IL-12,与Western Blot检测结果一致。5.IFN-γ和IL-12联合诱导CIK细胞能力的鉴定流式细胞仪检测培养后的单个核细胞CD3+CD56+双阳性的细胞为10.6%±2.1%,明显高于阴性对照组1.8%±0.3%,经统计学分析,P<0.05,可认为两种细胞因子具有联合诱导外周血单个核细胞分化为CIK细胞的能力。结论1.成功构建pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12真核重组质粒。2.重组质粒pIFN-γ、pIL-12、pIFN-γ-IRES-IL-12在人源细胞HEK293中成功表达,并能成功分泌到细胞外。3.研究证实转染重组质粒的HEK293细胞表达的细胞因子IFN-γ和IL-12可以联合诱导人外周血单个核细胞分化为CIK细胞,为下一步CIK细胞的体内外抗肿瘤活性的测定奠定了基础。
刘玉秀[8]（2014）在《犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究》文中研究说明犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）感染引起食肉科动物死亡的急性、高度接触性传染病。近年来，随着全球环境变化、动物栖息地的人为频繁干预及病毒的进化，CDV的自然宿主已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩大到猫科、灵猫科等所有陆地食肉科动物，此外也有偶蹄目、海豹和非人灵长类自然感染CDV的报道。CDV给全球动物养殖业和生物多样性带来极大损失和危害的同时，其社会公共危害性越来越受到人们重视。传代细胞系上缺少CDV病毒受体，人工分离培养病毒十分困难，导致人们对病毒的病原学与免疫研究认知较其它病毒而言发展相对缓慢，特别是在免疫预防方面一直沿用上世纪50年代研制的CDV。因此，当前构建高效分离CDV的敏感细胞系，建立病毒的反向遗传操作平台，分离研究当前流行犬瘟热野毒株的特性，分析野毒株与商业疫苗毒株抗原蛋白分子特性及抗原蛋白差异，开展有效安全成本低廉犬用疫苗或佐剂的研制具有重大意义，对预防控制国内犬瘟热疫情蔓延具有重要现实意义。I表达犬瘟热病毒SLAM受体的敏感细胞系构建及其病毒的分离与鉴定鉴于传统的CDV分离培养方法有分离率低、耗时长、成本高等缺陷，因此尽快建立方便、快捷分离培养CDV的方法显得尤为重要。本试验成功构建了表达犬瘟热病毒受体SLAM的Vero/DogSLAM细胞系，并用该细胞系分离到猴源（Monkey-BJ01-DV）和犬源（SC-CDV）CDV野毒各一株，探索了不同动物来源CDV对不同种属动物SLAM利用情况，比较了同时期猴源和犬源流行犬瘟热毒株的重要蛋白基因序列。结果显示本试验构建的Vero/DogSLAM敏感细胞系在接种病料36-48h后就能出现典型CPE，缩短病毒分离时间，提高CDV分离率，将有力地推动对犬瘟热病毒分子特征的研究。此外，我们还比较了不同种属来源CDV受体病毒病毒分离的敏感性，研究发现猴源和犬源CDV都能高效利用猴和犬SLAM受体，但是猴源CDV更倾向于利用猴SLAM，犬源CDV对犬SLAM亲和力比对猴SLAM高；Monkey-BJ01-DV病毒H蛋白基因与国内同期流行的犬源和狐狸源CDV病毒的同源性最高达98.4％；且与同期流行食肉科源CDV相比，三株猴源CDV-H蛋白有E276V、Q392R、D435Y和I542F4个特异性突变位点。II现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其H蛋白基因特性分析研究虽然减毒活疫苗早已用于犬瘟热的防控，近年来国内家养动物和养殖场的犬科、鼬属经济动物经常暴发犬瘟热疫情。有学者认为是目前疫苗所用毒株与流行野毒株抗原性有所差异，野毒株能逃避现行所用疫苗产生的免疫保护而致病。本实验为了解目前常用犬用疫苗中CDV毒株与国内流行野毒株H基因的差异性，对分别来自法国、俄罗斯、荷兰、韩国及国产的5种犬用疫苗在犬和狐狸上对以上疫苗进行了免疫效果评价；同时对其CDV-H基因进行序列测定，与传统疫苗株和国内野毒株的H基因进行比较。结果显示证实韩国疫苗使用毒株的免疫原性最好。法国疫苗使用Onderstepoort株；荷兰疫苗使用Vaccine strain JP株；国产疫苗使用的毒株与Snyder Hill同源性最高；俄罗斯疫苗使用的毒株也同属于北美疫苗株，但是于传统的疫苗株亲缘性低，自成一个分支；韩国疫苗使用毒株与野毒株同源性最高。序列分析表明国内流行野毒株与现行使用疫苗毒株H蛋白的同源性只有87－90％，疫苗株H蛋白一般有4－7个糖基化位点，而国内流行野毒株已经进化出9个糖基化位点。韩国疫苗使用毒株H蛋白含有野生株特有的g3（309）糖基化位点。H基因序列的多样性可能对不同毒株H蛋白的中和表位产生重要的影响。为近一步明确犬瘟热病毒强毒株与弱毒株间的抗原性差异，我们分析了决定CDV病毒抗原性的H糖蛋白。本试验利用2株对疫苗株和野生株H蛋白表现不同亲和力的单抗：d-7和JD-7，通过点突变和基因重组方法探索野生株和疫苗株H蛋白抗原性差异位点。最后通过Phyre2软件构建了CDV-H蛋白3D结构模型，比较分析了疫苗株和野生株H蛋白空间结构，发现H蛋白的234－246aa、302－313aa及415-418aa之间野生株和疫苗株存在3处空间构象差异域，初步推断这三处差异导致疫苗株和野生株抗原性差异区域。本试验揭示国内常用疫苗毒株背景，发现其与国内流行野毒株H蛋白同源性较低，对今后CD防治措施制定提供一定指导作用，及对今后犬用疫苗毒株筛选工作提供一定的借鉴意义。III表达IL-18重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用研究犬瘟热疫苗株和野毒株之间抗原性差异，使进化野毒株可能逃避疫苗株产生的免疫保护。因此有必要在增强犬用疫苗刺激机体产生更多细胞免疫反应着手拓展开发新型犬用疫苗或佐剂研究。白细胞介素18（Interleukin-18, IL-18）在诱导机体TH1型细胞产生IFN-γ对抗胞内寄生虫、细菌和病毒感染及抗肿瘤生长中具有重要作用，其作为一种疫苗佐剂或抗癌制剂被广泛研究应用。但IL-18缺乏自身信号肽，借助Caspases-1裂解形成成熟性IL-18发挥其生物学功能。研究显示粘附犬IL-12p40信号肽（cIL12ss）的成熟型IL-18能非依赖caspases-1裂解形成成熟型IL-18。本试验中构建了粘附人IL-2信号肽（hIL2ss）的犬IL-18表达系统，研究发现该表达系统也能非依赖caspases-1裂解形成成熟型犬IL-18，且粘附hIL2ss表达系统表达的IL-18刺激犬免疫细胞分泌IFN-γ量为863pg/ml，而cIL-12ss表达系统为424pg/ml，说明本试验构建IL-18表达系统更成功有效。随后我们构建了粘附hIL2ss的犬/鼠IL-18的重组犬瘟热病毒感染性克隆，成功拯救2株重组病毒rCDV-hIL2ss-cIL18和rCDV-hIL2ss-mIL18。结果显示rCDV-hIL2ss-cIL18感染细胞中即能检测到IL-18前体proIL-18（22kDa）蛋白又能检测到成熟型IL-18（18kDa），而rCDV-hIL2ss-mIL18感染细胞中只能检测到成熟型IL-18。这2株重组病毒保持与母本病毒相似的生长动力学特性；重组病毒感染细胞后能向细胞上清释放有生物学活性的IL-18，能刺激犬或鼠免疫细胞分泌IFN-γ。本实验构建的表达IL-18重组犬瘟热病毒可能是一种新的犬或鼠用疫苗佐剂和抗癌候选制剂。
杜寿文[9]（2012）在《HIV复合表位核酸和痘苗病毒载体疫苗构建及免疫原性研究》文中研究说明鉴于当前获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）的流行态势和预防治疗现状，研发安全有效的艾滋病预防/治疗性疫苗刻不容缓。近些年来，很多科学家利用不同的疫苗载体和形式、不同的人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）免疫原、不同的接种或免疫途径进行了大量的有益的尝试。本研究选择DNA质粒和痘苗病毒天坛株作为免疫原递送系统，开展艾滋病疫苗的免疫原性研究。本研究在本研究室多年来筛选获得的HIV复合多表位基因（MEGNp24）的基础上，在其上游引入CpG基序和CTB基因作为佐剂，构建了一种重组核酸疫苗pVL-CCMp24，将重组DNA质粒转染293T细胞，从RT-PCR和间接免疫荧光检测结果可知，重组质粒编码的目的基因CCMp24在哺乳动物细胞内得到正确转录和表达。肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠，分析重组DNA疫苗的免疫原性，由对HIV特异性抗体、Th1型和Th2型细胞因子、T细胞亚型、淋巴细胞增殖等免疫指标的检测结果表明，重组DNA候选疫苗pVL-CCMp24可以诱导机体产生一定程度的细胞和体液免疫应答。基于多价疫苗的设计理念，本研究首先构建了一种含三个表达盒的痘苗病毒穿梭载体pSTKE，含有三个独立的外源基因表达盒，分别以VTT及其基因缺失突变株作为原始病毒，以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、红色荧光蛋白（RFP）和蓝色荧光蛋白（BFP）作为报告基因，分别对三个表达盒的功能进行验证。通过噬斑筛选，获得两株重组痘苗病毒（rVTT-EGFP、rdVTT-EGFP），利用PCR、实时荧光定量PCR、Western blot方法对重组病毒以及对外源基因的表达量和遗传稳定性进行分析。结果表明，成功构建了三基因表达盒痘苗病毒穿梭载体，成功筛选出两株重组痘苗病毒，EGFP基因在痘苗病毒内得到高水平表达，三个表达盒之间没有相互影响，而且重组病毒具有良好的遗传稳定性。将重组核酸疫苗pVL-CCMp24上的目的免疫原基因CCMp24连接到痘苗病毒穿梭载体pSTKE的第一个表达盒内即MCS1，由特异性引物扩增获得的含Loxp基因序列的EGFP基因（EGFP基因两端的Loxp基因方向相同）克隆到pSTKE的第三个表达盒MCS3中，重组质粒pCCMp24-LEL鉴定正确后，转染dVTT感染的BHK-21细胞，通过同源重组、病毒蚀斑筛选获得重组CCMp24和EGFP的E3L及TK基因缺失的痘苗病毒rddVTT-CCMp24G，然后利用Cre/Loxp重组系统将EGFP基因敲除，获得仅表达目的免疫原基因的双基因缺失重组痘苗病毒rddVTT-CCMp24。RT-PCR、间接免疫荧光、Western Blot检测结果表明，CCMp24融合基因在痘苗病毒感染的BHK-21细胞中得到高效转录和表达。痘苗病毒在长期的实践应用中具有毒副作用，存在安全隐患。本研究在缺失病毒毒力相关基因的痘苗病毒的基础上，通过痘苗病毒穿梭载体pSTKE携带的目的免疫原基因将TK基因缺失，筛选的基因缺失型重组痘苗病毒通过鼻腔感染和颅内注射感染途径感染BALB/c小鼠，通过监测感染小鼠的体征变化、体重变化、病毒感染后的死亡率等方面评价E3L基因和TK基因缺失的重组痘苗病毒在小鼠体内的毒性。监测结果表明，重组病毒rddVTT-CCMp24的毒力较野生型VTT有很大程度的减弱，提高了进一步研究或应用的安全性。说明缺失E3L基因和TK基因可以使痘苗病毒致弱，且外源基因的引入对病毒的毒力没有显着影响。在了解其毒力的基础上，以BALB/c小鼠为模型开展了重组病毒rddVTT-CCMp24的免疫原性分析。按照既定的免疫程序免疫后，通过对抗体、细胞因子及T细胞亚型等各项指标的检测，结果显示，rddVTT-CCMp24可诱导机体产生分泌IFN-γ的T细胞数量显着增加，CD4+和CD8+T细胞数增加，脾细胞体外接受HIV特异性抗原刺激下增殖能力显着提高。HIV特异性抗体检测结果显示，可诱导较高的HIV特异性抗体水平，且诱导IL-2和IL-4细胞因子的分泌。综合结果可知，重组病毒可激发机体细胞和体液免疫应答。同时，采用DNA/rddVTT-CCMp24prime-boost免疫策略在小鼠模型上检测免疫效果，结果相对于DNA疫苗或rddVTT-CCMp24疫苗分别单独免疫，可更好的刺激分泌IFN-γ产生T细胞的分化和增殖，IFN-γ ELISPOT检测结果显示，HIV特异性的分泌IFN-γ的记忆性T细胞数量显着高于单独免疫组。表明，prime-boost免疫策略诱导较强的免疫应答和免疫记忆形成，为下一步的实验研究提供了数据支持。
张亚宁[10]（2012）在《绵羊肺炎支原体（Y-98标准株）P30基因真核表达载体构建与P30-IFNγ融合蛋白疫苗研制》文中研究表明绵羊肺炎支原体（Mycoplasma oumvipneonia， MO）是绵羊养殖过程中的常见病原菌，可以引发绵羊支原体肺炎。该病流行范围广，发病期长，给养羊业造成了巨大的经济损失。本文选择P30外膜蛋白为抗原蛋白，同时以细胞因子IFNγ为疫苗佐剂，将两者串联融合表达。以绵羊肺炎支原体（MO）标准株Y98基因组为模板，设计一对特异性引物，PCR扩增得到795bp的P30目的基因，与文献报道的P30基因序列一致；提取小鼠总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增IFNγ目的基因。将两者定向克隆到原核表达载体pET-22b（+）中，得到pET-P30、pET-IFNγ和pET-P30-IFNγ重组质粒，转化大肠杆菌感受态BL21（DE3）。重组菌株分别命名为BL21（DE3）（pET-P30）、BL21（DE3）（pET-IFNγ）和BL21（DE3）（pET-P30-IFNγ）。由IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE及Western blot分析，得到30.0KD、20.1KD和47.2KD的特异条带，与预期的P30外膜蛋白、IFNγ以及P30-IFNγ融合蛋白大小一致，且均具有良好的反应原性。对3种重组菌株进行诱导表达，纯化得到可溶性目的蛋白，制备P30基因工程疫苗、IFNγ佐剂疫苗以及P30-IFNγ融合蛋白疫苗。小鼠免疫保护实验结果显示，P30基因工程疫苗的免疫保护率为60%，IFNγ佐剂疫苗的免疫保护率为20%，P30-IFNγ融合蛋白疫苗的免疫保护率达到80%。间接ELISA实验证实，经100μL与200μL剂量P30-IFNγ融合蛋白疫苗免疫的小鼠血清中，P30抗体效价分别为1:32000与1:64000。经IFNγ佐剂疫苗免疫的小鼠血清中，未检测出阳性P30抗体效价。以上结果证实，所制备的疫苗安全有效，且融合蛋白疫苗中的细胞因子IFNγ组分可以调节机体免疫机能，增强疫苗的免疫保护效果。结合近年来疫苗研制领域的发展动态，本研究还对转基因植物疫苗的研制进行了探究。设计特异性引物，扩增了P30目的基因，将其定向克隆到含黄色荧光蛋白（yellowfluorescent protein， YFP）标签的真核表达载体pCAMBIA1300-YFP中，构建了重组表达质粒pCAMBIA1300-P30-YFP并转化农杆菌（Agrobacterium）感受态细胞，侵染烟草（tobacco）叶片。通过激光共聚焦成像显微镜（cofocal imaging microscope）观察到融合表达的黄色荧光蛋白P30-YFP，Western blot实验得到57KD的特异条带，RT-PCR检测到P30基因在烟草叶片中转录。以上结果证实P30基因在烟草叶片中成功进行了瞬时表达。
二、含绿色荧光蛋白及小鼠IFN-γ基因的高效真核表达载体的构建与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、含绿色荧光蛋白及小鼠IFN-γ基因的高效真核表达载体的构建与鉴定（论文提纲范文）
（1）IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛呼吸道疾病病原及其固有免疫应答 |
| 1.1 牛呼吸道病原识别病原的分子基础 |
| 1.2 气道和肺上皮细胞对牛呼吸系统疾病的抵抗能力 |
| 1.3 固有免疫系统的效应细胞 |
| 第二章 牛副流感病毒3 型感染及其逃避宿主免疫的研究进展 |
| 2.1 宿主范围与传播特点 |
| 2.2 流行病学与基因型 |
| 2.3 BPIV3 编码基因与蛋白特征 |
| 2.4 牛副流感的临床症状与病理变化 |
| 2.5 病原分离与鉴定 |
| 2.6 BPIV3 造成的经济损失 |
| 2.7 BPIV3 的治疗与预防 |
| 2.8 副黏病毒拮抗Ⅰ型干扰素的研究概况 |
| 第三章 IL10 的信号转导与其在病毒致病中的作用 |
| 3.1 白细胞介素-10 的来源细胞与基本作用 |
| 3.2 IL10 的受体与信号转导 |
| 3.3 IL10 的相关家族与病毒编码的IL10 |
| 3.4 IL10 在病毒致病中的作用 |
| 3.5 IL10 重要产物SOCS3 在病毒感染中的作用 |
| 3.6 病毒诱导IL10 产生的信号通路 |
| 3.7 阻断IL10 清除病毒感染的新策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犊牛BPIV3 血清抗体调查与BPIV3 A的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 血清与病料采集 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 2.2 鼻棉拭子中的BPIV3 鉴定与分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定与纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 3.2 BPIV3 分离培养 |
| 3.3 BPIV3 的特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BPIV3 感染C57BL/6 小鼠与巨噬细胞的转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要动物、细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 2.2 转录样本的制备 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 qPCR验证转录组测序结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 3.2 BPIV3 感染鼠巨噬细胞后细胞因子的变化 |
| 3.3 BPIV3 感染C57 小鼠后肺组织的转录组分析 |
| 3.4 BPIV3 感染原代巨噬细胞转录组测序与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的重组表达及特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆与生物信息学分析 |
| 2.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 2.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 2.4 牛IL10、IL10R1 腺病毒制备及蛋白表达 |
| 2.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建 |
| 2.6 构建牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体 |
| 2.7 牛IL10 的生物学活性及信号通路研究 |
| 2.8 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆 |
| 3.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 3.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 3.4 牛IL10、IL10R1 胞外区的腺病毒感染细胞与表达蛋白鉴定 |
| 3.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建与活性分析 |
| 3.6 牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体的构建 |
| 3.7 牛IL10 和IL10R的生物学活性 |
| 3.8 牛IL10 的信号通路 |
| 3.9 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 IL10 在牛副流感病毒3 型感染中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染细胞表达IL10 并发挥其活性 |
| 2.2 IL10/IL10R1对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 感染细胞诱导IL10 的转录与表达 |
| 3.2 BPIV3 感染对STAT3 表达的影响 |
| 3.3 BPIV3 感染对SOCS3 转录的影响 |
| 3.4 BPIV3 感染对其他细胞因子表达的影响 |
| 3.5 IL10对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3.6 IL10 受体阻断对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 IL10 与牛副流感病毒3 型感染的相互调控 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染诱导IL10 产生的信号通路 |
| 2.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 诱导IL10 产生所依赖的信号通路 |
| 3.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫抗肿瘤研究进展 |
| 1.1 旋毛虫虫体抗肿瘤 |
| 1.2 旋毛虫可溶性粗抗原抗肿瘤 |
| 1.3 旋毛虫与肿瘤相关抗原抗肿瘤 |
| 1.4 旋毛虫排泄分泌抗原抗肿瘤 |
| 第二章 细菌作为活疫苗载体研究现状 |
| 2.1 单增李斯特菌 |
| 2.2 沙门氏菌 |
| 2.3 牛结核分枝杆菌卡介苗 |
| 2.4 乳酸菌 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 旋毛虫肌幼虫的富集与纯化 |
| 1.2.2 旋毛虫sHSPs基因的扩增 |
| 1.2.3 表达载体pValac-sHSPs的构建 |
| 1.2.4 蛋白sHSPs的表达及鉴定 |
| 1.2.5 NC8-sHSPs的生长特性 |
| 1.2.6 黏附、侵袭能力检测 |
| 1.2.7 质粒递送及表达能力检测 |
| 1.2.8 小肠内定植能力检测 |
| 1.2.9 安全性评价 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 sHSPs基因的选择 |
| 1.3.2 真核质粒pValac-sHSPs表达鉴定 |
| 1.3.3 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的转化与构建 |
| 1.3.4 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs生长特性分析 |
| 1.3.5 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs侵袭、定植能力 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 抑瘤率检测 |
| 2.2.2 重组sHSPs的诱导、纯化 |
| 2.2.3 血清sHSPs特异性IgG的检测 |
| 2.2.4 肠道灌洗液和血清总sIgA水平的检测 |
| 2.2.5 细胞因子检测 |
| 2.2.6 脾淋巴细胞亚群及数量检测 |
| 2.2.7 sHSPs对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.2.8 sHSPs诱导的特异性CTL的功能检测 |
| 2.2.9 免疫组化检测肿瘤内PCNA的表达 |
| 2.2.10 小鼠体重和病理组织学变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NC8-sHSPs处理对黏膜免疫的影响 |
| 2.3.2 NC8-sHSPs处理对体液免疫的影响 |
| 2.3.3 NC8-sHSPs处理对细胞免疫的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对 Lewis肺癌的治疗作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠Lewis肺癌模型的建立 |
| 3.2.2 NC8-sHSPs治疗对LLC生长的影响 |
| 3.2.3 NC8-sHSPs治疗对LLC小鼠生存率的影响 |
| 3.2.4 血清sHSPs特异性IgG的检测 |
| 3.2.5 血清、肠道灌洗液总sIgA水平的检测 |
| 3.2.6 血清细胞因子的检测 |
| 3.2.7 小鼠体重和组织病理学检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 NC8-sHSPs治疗对黏膜免疫的影响 |
| 3.3.2 NC8-sHSPs治疗对体液免疫的影响 |
| 3.3.3 NC8-sHSPs治疗对细胞免疫的影响 |
| 3.3.4 NC8-sHSPs疗效分析 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）布鲁菌UGPase调控宿主分子ACOD1表达进而抑制NF-κB活化的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 布鲁菌概述 |
| 1.2 布鲁菌的毒力因子研究进展 |
| 1.2.1 脂多糖 |
| 1.2.2 Ⅳ型分泌系统 |
| 1.2.3 BvrS/BvrR双组分调节系统 |
| 1.2.4 环状β-1-2-葡聚糖 |
| 1.2.5 超氧化物歧化酶和过氧化氢酶 |
| 1.2.6 omp25/omp31 膜蛋白 |
| 1.2.7 布鲁菌毒力因子A |
| 1.2.8 布鲁菌其它重要的毒力因子 |
| 1.3 ACOD1 分子在调节免疫反应的研究进展 |
| 1.3.1 ACOD1 分子概述 |
| 1.3.2 ACOD1 分子在免疫应答中的研究 |
| 1.4 慢病毒载体研究进展 |
| 1.4.1 慢病毒载体的来源 |
| 1.4.2 慢病毒载体系统的发展 |
| 1.4.3 慢病毒载体系统的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 布鲁菌UGPase缺失前后感染RAW264.7 细胞的蛋白组学验证 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 相对蛋白组学验证蛋白样品制备 |
| 2.2.2 PRM蛋白定量技术验证 |
| 2.2.3 Western Blot验证分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PRM蛋白定量技术分析结果 |
| 2.3.2 差异蛋白的Western blot验证结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 过表达ACOD1 蛋白RAW264.7 细胞系的建立及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组慢病毒表达载体pLV-EGFP/Puro-ACOD1 的构建及鉴定 |
| 3.2.2 重组慢病毒的包装制备 |
| 3.2.3 过表达ACOD1 蛋白的RAW264.7 细胞系构建 |
| 3.2.4 过表达ACOD1 细胞系的鉴定 |
| 3.2.5 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的基因ACOD1 的克隆及鉴定 |
| 3.3.2 重组慢病毒表达载体pLV-CMV-EGFP/Puro-ACOD1的PCR及酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组慢病毒转染293T细胞及滴度测定 |
| 3.3.4 嘌呤霉素最适浓度的测定结果 |
| 3.3.5 荧光显微镜检测EGFP蛋白表达情况 |
| 3.3.6 流式细胞仪检测EGFP荧光表达率 |
| 3.3.7 Western blot检测ACOD1 蛋白表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ACOD1 分子调控NF-κB通路和细胞因子表达的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂和耗材 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 LPS刺激及各组细胞系样品的收集 |
| 4.2.2 Western blot检测NF-κB信号通路活化 |
| 4.2.3 qPCR技术检测细胞因子转录水平的变化 |
| 4.2.4 数据统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 ACOD1 调控RAW264.7 细胞NF-κB信号通路的活化 |
| 4.3.2 ACOD1 调控RAW264.7 细胞炎性因子的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 塞内卡病毒病的流行病学 |
| 1.1.1 塞内卡病毒病的发现 |
| 1.1.2 塞内卡病毒病的流行情况 |
| 1.2 塞内卡病毒病的临床症状与病理变化 |
| 1.2.1 塞内卡病毒病的临床症状 |
| 1.2.2 塞内卡病毒病的病理变化 |
| 1.3 塞内卡病毒A的形态与结构 |
| 1.4 塞内卡病毒A的实验室培养 |
| 1.5 塞内卡病毒A的诊断方法 |
| 1.6 塞内卡病毒A感染诱导的免疫应答 |
| 1.6.1 塞内卡病毒A感染诱导的体液免疫应答 |
| 1.6.2 塞内卡病毒A感染引起的细胞免疫应答 |
| 1.7 抗原表位 |
| 1.7.1 抗原表位的概念 |
| 1.7.2 抗原表位的分类 |
| 1.7.3 内源性抗原递呈途径 |
| 1.7.4 外源性抗原递呈途径 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 塞内卡病毒A灭活抗原及动物抗血清的制备 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要生物学试剂和仪器 |
| 2.1.2 细胞的培养、传代及冻存 |
| 2.1.3 塞内卡病毒A培养 |
| 2.1.4 塞内卡病毒A毒价测定 |
| 2.1.5 塞内卡病毒A浓缩纯化 |
| 2.1.6 动物的免疫 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 塞内卡病毒A毒价测定 |
| 2.2.2 塞内卡病毒A浓缩纯化 |
| 2.2.3 塞内卡病毒A特异性血清的制备 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 真核表达载体质粒的构建及体外表达验证 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要生物学试剂和仪器 |
| 3.1.2 引物的设计与合成 |
| 3.1.3 质粒的构建 |
| 3.1.4 质粒的提取 |
| 3.1.5 验证质粒在细胞内的表达情况 |
| 3.1.6 动物的免疫 |
| 3.1.7 流式细胞术检测淋巴细胞增殖 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 塞内卡病毒 A 真核表达质粒的构建 |
| 3.2.2 验证质粒在细胞内的表达情况 |
| 3.2.3 流式细胞术检测淋巴细胞增殖 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 抗塞内卡病毒A抗体的血清学检测 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 血清的检测 |
| 4.2.1 小鼠血清的检测 |
| 4.2.2 塞内卡病毒A微量细胞中和实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 小鼠血清的检测 |
| 4.3.2 塞内卡病毒A微量细胞中和实验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.2 肽段的设计及合成 |
| 5.1.3 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 5.1.4 塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选 |
| 5.1.5 多肽刺激脾细胞IFN-γ的分泌 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选 |
| 5.2.2 多肽刺激脾细胞IFN-γ的分泌 |
| 5.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）猪丁型冠状病毒N蛋白抑制猪RLR信号通路的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 冠状病毒简介 |
| 1.1.1 冠状病毒的分类 |
| 1.1.2 冠状病毒的危害 |
| 1.1.3 冠状病毒的基因组结构与复制 |
| 1.2 猪丁型冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 PDCoV的发现及流行特征 |
| 1.2.2 PDCoV基因组结构及遗传多样性 |
| 1.2.3 PDCoV防控概述 |
| 1.3 先天免疫系统概述 |
| 1.3.1 模式识别受体 |
| 1.3.2 RIG-I样受体及其信号通路 |
| 1.3.3 TLRs信号通路 |
| 1.3.4 NLRs信号通路 |
| 1.3.5 DNA受体信号通路 |
| 1.3.6 IFN信号通路 |
| 1.4 冠状病毒调控宿主先天免疫应答 |
| 1.4.1 病毒逃逸宿主先天免疫应答的机制 |
| 1.4.2 冠状病毒非结构蛋白干扰先天免疫应答的机制 |
| 1.4.3 冠状病毒结构蛋白干扰宿主先天免疫应答 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 PDCoV上海毒株的分离与鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.0 细胞、毒株、菌株及临床腹泻样品 |
| 2.2.1 主要试剂及抗体 |
| 2.2.2 主要试剂及缓冲液的配制 |
| 2.2.3 主要仪器及设备 |
| 2.2.4 细胞、病毒总RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.5 PDCoV结构蛋白原核表达质粒的构建 |
| 2.2.6 PDCoV分离及培养 |
| 2.2.7 PDCoV细胞嗜性试验 |
| 2.2.8 PDCoV病毒滴度测定 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR检测试验 |
| 2.2.10 Western blot检测PDCoV复制水平 |
| 2.2.11 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.12 PDCoV病毒颗粒的透射电镜观察 |
| 2.2.13 PDCoV结构蛋白免疫小鼠及ELISA试验 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 PDCoV上海毒株的分离 |
| 2.3.2 PDCoV上海毒株的全基因组测序及分析 |
| 2.3.3 PDCoV上海毒株的进化树构建及分析 |
| 2.3.4 PDCoV上海毒株的变异及重组分析 |
| 2.3.5 PDCoV结构蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.3.6 PDCoV细胞嗜性的探究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PDCoV分离株存在地区差异性 |
| 2.4.2 PDCoV具有感染多物种细胞的潜力 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 PDCoV N蛋白抑制猪RIG-I激活的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 细胞、毒株及菌株 |
| 3.2.2 主要试剂及抗体 |
| 3.2.3 主要仪器及设备 |
| 3.2.4 主要生物学分析软件 |
| 3.2.5 PCR引物设计及载体构建 |
| 3.2.6 PDCoV、VSV-GFP培养 |
| 3.2.7 细胞转染 |
| 3.2.8 VSV-GFP感染恢复试验 |
| 3.2.9 q RT-PCR检测猪基因转录水平 |
| 3.2.10 Western blot及 Co-IP试验 |
| 3.2.11 激光共聚焦检测 |
| 3.2.12 RNA结合实验 |
| 3.2.13 统计学方法 |
| 3.3 试验结果与分析 |
| 3.3.1 PDCoV感染抑制猪I型干扰素的表达 |
| 3.3.2 PDCoV结构蛋白对猪IFN-β和 NF-κB启动子活性的影响 |
| 3.3.3 PDCoV M/E/N蛋白对猪RLR信号通路激活的影响 |
| 3.3.4 PDCoV N蛋白互作蛋白的筛选 |
| 3.3.5 PDCoV N蛋白N端区域是结合猪RIG-I的关键区域 |
| 3.3.6 PDCoV N蛋白影响猪RIG-I与 ds RNA的结合 |
| 3.3.7 PDCoV N蛋白抑制猪RIG-I的泛素化修饰 |
| 3.3.8 PDCoV N蛋白不与猪TRIM25和Riplet相互作用 |
| 3.3.9 PDCoV N蛋白抑制猪 Riplet诱导的猪 RIG-I K63 连接的多聚泛素化 |
| 3.3.10 PDCoV N蛋白与猪 Riplet竞争性结合猪 RIG-I |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 PDCoV N蛋白物种特异性降解猪IRF7 的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞、毒株及菌株 |
| 4.2.2 主要仪器及设备 |
| 4.2.3 主要生物学分析软件 |
| 4.2.4 主要试剂及缓冲液的配制 |
| 4.2.5 PCR引物设计及载体构建 |
| 4.2.6 点突变的引物设计及载体构建 |
| 4.2.7 细胞转染试验 |
| 4.2.8 qRT-PCR检测试验 |
| 4.2.9 细胞病毒感染试验 |
| 4.2.10 Western blot及 Co-IP实验 |
| 4.2.11 激光共聚焦试验 |
| 4.2.12 统计学方法 |
| 4.3 试验结果与分析 |
| 4.3.1 PDCoV N蛋白与poIRF7 相互作用 |
| 4.3.2 PDCoV N蛋白与IRF7 相互作用具有物种特异性 |
| 4.3.3 PDCoV N蛋白抑制poIRF7 诱导的猪I型干扰素的表达 |
| 4.3.4 PDCoV N蛋白表达促进poIRF7 的降解 |
| 4.3.5 PDCoV N蛋白促进猪IRF7 的泛素化修饰 |
| 4.3.6 猪IRF7 K359 位是PDCoV N蛋白影响的关键位点 |
| 4.3.7 筛选调控猪IRF7 泛素化降解的E3 泛素化连接酶 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 PDCoV结构蛋白组装VLP的策略 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞、毒株和菌株 |
| 5.2.2 PCR引物设计及载体构建 |
| 5.2.3 主要仪器及设备 |
| 5.2.4 PCR引物设计及重组载体构建 |
| 5.2.5 重组杆状质粒的提取 |
| 5.2.6 重组杆状病毒质粒的细胞转染试验 |
| 5.2.7 重组杆状病毒的复制 |
| 5.2.8 Western blot及免疫斑点试验 |
| 5.2.9 间接免疫荧光 |
| 5.2.10 PDCoV病毒样颗粒的透射电镜观察 |
| 5.2.11 PDCoV VLP免疫小鼠及ELISA试验 |
| 5.2.12 荧光抗体病毒中和试验 |
| 5.3 试验结果与分析 |
| 5.3.1 重组杆状病毒质粒的构建 |
| 5.3.2 重组杆状病毒的制备 |
| 5.3.3 PDCoV VLP的组装 |
| 5.3.4 PDCoV VLP免疫小鼠诱导产生特异性抗体 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 全文讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间取得的主要学术成果 |
（6）共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中英文缩写表 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病原 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒生物学特征 |
| 1.3 PRRSV编码蛋白及其功能研究 |
| 1.4 PRRS疫苗的研究进展及未来的发展趋势 |
| 2 猪伪狂犬病病毒及作为载体的研究进展 |
| 3 黏膜免疫疫苗 |
| 3.1 黏膜免疫系统及黏膜免疫 |
| 3.2 IL-18 作为黏膜免疫佐剂的研究进展 |
| 4 本研究的目的 |
| 实验一 猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织材料 |
| 1.2 试剂与菌种 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 猪脾脏、肺脏和淋巴结组织样品总RNA的提取 |
| 1.5 猪IL-18 全基因RT-PCR反应 |
| 1.6 猪IL-18 基因的克隆及鉴定 |
| 1.7 猪IL-18 基因真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1.8 阳性重组质粒转染 293T细胞 |
| 1.9 RT-PCR检测 293T细胞中IL-18 基因 |
| 1.10 Western-blot检测IL-18 的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪IL-18 基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 猪IL-18 基因的克隆与鉴定 |
| 2.3 猪IL-18 基因真核表达质粒p ZJ-18 的构建和鉴定 |
| 2.4 RT-PCR检测 293T细胞中IL-18 基因 |
| 2.5 Western-blot检测IL-18 基因在蛋白水平上的表达 |
| 3 讨论 |
| 实验二、共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜相关蛋白GP5(GP5m)、M与猪IL-18 重组质粒的构建及免疫原性评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 GP5、M和IL-18 蛋白基因的RT-PCR扩增 |
| 1.4 重组载体PZJ-GP5-2A-M、PZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、PZJ-GP5m、PZJ-GP5m-2A-IL-18 及PZJ-IL-18 的构建 |
| 1.5 重组质粒pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18 的构建与鉴定 |
| 1.6 Western-blot检测重组质粒目的基因的表达 |
| 1.7 重组质粒对家兔免疫原性研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因GP5、GP5m、M、IL-18 的扩增 |
| 2.2 重组质粒PZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、PZJ-GP5-2A-M、PZJ-GP5m、PZJ-GP5m-2A-IL-18、PZJ-IL-18 的构建及鉴定 |
| 2.3 重组质粒pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18 的构建及鉴定 |
| 2.4 Western-blot检测目的基因GP5、GP5m、M及IL-18 蛋白水平的表达 |
| 2.5 重组质粒免疫原性试验 |
| 3 讨论 |
| 实验三、共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5(GP5m)、M与猪IL-18 重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rPRV-gE~-/TK~-/GFP~+基因组的提取 |
| 2.2 同源重组质粒基因片段的扩增 |
| 2.3 重组病毒的构建与蚀斑纯化 |
| 2.4 Western-blot鉴定重组病毒GP5、GP5m、M、IL-18 基因蛋白水平表达 |
| 2.5 重组病毒在Vero细胞中的一步生长曲线测定 |
| 2.6 重组病毒对小白鼠免疫原性研究 |
| 2.7 重组病毒免疫小白鼠后血清中和抗体效价测定 |
| 2.8 间接ELISA法检测抗PRRSV IgG和IgA抗体水平 |
| 2.9 小白鼠血液T淋巴细胞转化试验及小白鼠T淋巴细胞细胞因子的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组病毒的鉴定 |
| 3.2 重组病毒的Western-blot鉴定 |
| 3.3 重组病毒一步生长曲线的测定 |
| 3.4 小白鼠血清中和抗体试验 |
| 3.5 PRRSV间接ELISA IgG和IgA抗体水平检测 |
| 3.6 小白鼠脾脏T淋巴细胞转化试验及小白鼠T淋巴细胞细胞因子的表达检测 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附:作者读研期间发表文章 |
（7）人源IFN-γ、IL-12串联共表达载体构建与体外联合诱导CIK细胞的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 重组表达质粒pIFN-γ、pIL-12 和 pIFN-γ-IRES-IL-12的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二部分 重组表达质粒在 HEK293细胞中的表达及体外联合诱导CIK细胞的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一篇 绪论 |
| 1.1 犬瘟热概述 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒 |
| 1.1.2 病毒分离培养 |
| 1.1.3 病毒蛋白 |
| 1.1.4 致病机理和临床特征 |
| 1.1.5 流行病学 |
| 1.1.6 犬瘟热疫苗研究现状 |
| 1.1.7 犬瘟热病毒感染性克隆研究现状 |
| 1.2 犬瘟热病毒受体研究进展 |
| 1.2.1 信号淋巴细胞激活分子 |
| 1.2.2 Nectin-4 |
| 1.2.3 其他受体 |
| 1.2.4 总结 |
| 1.3 白细胞介素 18 研究进展 |
| 1.3.1 IL-18 的发现 |
| 1.3.2 IL-18 分子结构 |
| 1.3.3 IL-18 基因及基因调节 |
| 1.3.4 IL-18 产生和递呈 |
| 1.3.5 IL-18 的生物学功能 |
| 1.3.6 IL-18 对宿主免疫保护作用 |
| 1.3.7 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 表达犬瘟热病毒 SLAM 受体的敏感细胞系构建及病毒分离与鉴定 |
| 1.1 材料方法 |
| 1.1.1 病料、质粒和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 引物的设计与合成 |
| 1.1.4 真核表达载体构建 |
| 1.1.5 表达 SLAM 蛋白 Vero 细胞系的构建 |
| 1.1.6 RT-PCR 方法鉴定 SLAM/Vero 细胞系 |
| 1.1.7 间接免疫荧光方法鉴定 |
| 1.1.8 流式细胞检测 SLAM/Vero 细胞系 |
| 1.1.9 猴源和犬源 CDV 的分离与鉴定 |
| 1.1.10 病毒在 SLAM／Vero 细胞生长特性研究 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 真核表达载体的构建 |
| 1.2.2 SLAM/Vero 细胞系的构建与鉴定 |
| 1.2.3 利用 Vero/DogSLAM 细胞系分离犬瘟热病毒 |
| 1.2.4 犬源 CDV 和猴源 CDV 对不同动物 SLAM 受体利用比较分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其 H 蛋白基因特性分析研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 疫苗毒株、细胞和动物细胞、质粒与单克隆抗体 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评价 |
| 2.1.4 引物的设计与合成 |
| 2.1.5 RT-PCR 克隆 4 株疫苗株 CDV 的 H 基因 |
| 2.1.6 CDV H 基因序列分析 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 间接免疫荧光检测 |
| 2.1.10 犬瘟热病毒 H 蛋白三维构象建立 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评估 |
| 2.2.2 PCR 扩增结果 |
| 2.2.3 不同毒株 H 基因核苷酸及其对应的氨基酸同源性比较 |
| 2.2.4 H 基因系统发生进化树分析 |
| 2.2.5 H 基因氨基酸序列分析结果 |
| 2.2.6 犬瘟热病毒 H 蛋白糖基化位点分析 |
| 2.2.7 野生株和疫苗株犬瘟热病毒 H 蛋白同源模型构建及比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达白细胞介素 18 的重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 病毒株，质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 引物的设计与合成 |
| 3.1.4 感染性克隆载体的构建 |
| 3.1.5 病毒的拯救 |
| 3.1.6 RT-PCR 及测序鉴定 |
| 3.1.7 Western blotting 鉴定 |
| 3.1.8 重组病毒的培养与滴定 |
| 3.1.9 重组病毒生长动力学研究 |
| 3.1.10 IL-18 的生物活性评估 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 表达犬 IL-18 基因的重组真核表达载体构建 |
| 3.2.2 不同载体体系表达的 IL-18 活性评定 |
| 3.2.3 粘附人 IL-2 信号肽的犬或鼠 IL-18 的重组犬瘟热病毒载体构建 |
| 3.2.4 重组病毒的拯救及其鉴定 |
| 3.2.5 Western blotting 鉴定重组病毒 |
| 3.2.6 重组病毒生长动力学研究 |
| 3.2.7 重组病毒分泌 IL-18 的生物活性能力检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间所得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）HIV复合表位核酸和痘苗病毒载体疫苗构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 HIV 疫苗及研究新策略 |
| 1.1 抗 HIV-1 的适应性免疫 |
| 1.2 基于激发有效的中和抗体的抗 HIV-1 疫苗的设计 |
| 1.3 抗 HIV-1 的保护作用中 T 细胞活性的重要性 |
| 1.4 抗 HIV-1 的 DNA 疫苗及活病毒载体疫苗策略 |
| 2 痘苗病毒作为载体在疫苗研究领域的应用 |
| 2.1 痘苗病毒载体的发展历史 |
| 2.2 痘苗病毒作为载体的特点 |
| 2.3 重组痘苗病毒构建和筛选策略 |
| 2.4 痘苗病毒载体的应用 |
| 2.5 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 新型痘苗病毒穿梭载体的构建及功能验证 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 HIV 复合表位重组基因缺失型痘苗病毒的构建及筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 HIV 复合表位重组基因缺失型痘苗病毒的免疫原性及安全性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 含 CPGODN 及 CTB 的 HIV 复合表位 DNA 疫苗的构建及免疫原性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 HIV 复合多表位 DNA 疫苗和重组痘苗病毒疫苗的联合免疫研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（10）绵羊肺炎支原体（Y-98标准株）P30基因真核表达载体构建与P30-IFNγ融合蛋白疫苗研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 绪论 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 绵羊肺炎支原体的分类地位与生物学特性 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 形态结构 |
| 1.1.3 培养特性 |
| 1.2 肺炎支原体的流行病学调查 |
| 1.3 绵羊肺炎支原体的感染症状 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 组织学变化 |
| 1.4 绵羊肺炎支原体致病机理 |
| 1.4.1 基因分型研究 |
| 1.4.2 致病机理研究 |
| 1.5 绵羊肺炎支原体诊断技术 |
| 1.5.1 病原学培养诊断 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 抗原检测 |
| 1.5.4 基因诊断技术 |
| 1.6 防治措施 |
| 1.6.1 化学药物治疗 |
| 1.6.2 疫苗防治 |
| 1.6.3 微生态制剂防治 |
| 第2章 绵羊肺炎支原体 P30 基因与 IFNγ基因融合表达质粒构建及其在大肠杆菌中的表达 |
| 摘要 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 载体及引物 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 绵羊肺炎支原体 P30 目的基因扩增 |
| 2.2.3 IFNγ目的基因扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 PCR 产物回收 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 2.2.7 P30 和 IFNγ基因与克隆载体连接 |
| 2.2.8 转化及筛选 |
| 2.2.9 重组质粒的小量提取 |
| 2.2.10 重组克隆质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.11 P30 与 IFNγ基因测序与同源性比对 |
| 2.2.12 P30 和 IFNγ目的基因以及表达载体的双酶切 |
| 2.2.13 酶切后目的片段及载体的回收和连接 |
| 2.2.14 阳性重组子的筛选和鉴定 |
| 2.2.15 融合质粒 pET-P30-IFNγ的构建 |
| 2.2.16 重组菌株的诱导表达与超声破碎 |
| 2.2.17 蛋白样制备 |
| 2.2.18 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 2.2.19 表达产物的 Western blot 分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 小鼠总 RNA 检测 |
| 2.3.2 P30 与 IFNγ目的基因扩增 |
| 2.3.3 重组克隆质粒双酶切鉴定 |
| 2.3.4 P30 与 IFNγ基因序列分析 |
| 2.3.5 重组表达质粒双酶切鉴定 |
| 2.3.6 表达产物的在大肠杆菌中的分布 |
| 2.3.7 表达产物的 Western blot 分析 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 融合蛋白疫苗的免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 供试动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 基因工程疫苗的制备 |
| 3.2.2 疫苗安全性检测 |
| 3.2.3 小鼠攻毒剂量的测定 |
| 3.2.4 动物免疫试验 |
| 3.2.5 P30 抗体的间接 ELISA 检测 |
| 3.2.6 P30 抗体的 Western blot 分析 |
| 3.2.7 肺组织冰冻切片制作 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 疫苗安全性检测 |
| 3.3.2 小鼠攻毒剂量测定 |
| 3.3.3 疫苗保护效果 |
| 3.3.4 P30 抗体的间接 ELISA 检测 |
| 3.3.5 P30 抗体的 Western blot 分析 |
| 3.3.6 肺组织冰冻切片 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 绵羊肺炎支原体 P30 基因真核表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达 |
| 摘要 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 载体及引物 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 烟草植株 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 P30 目的基因的 PCR 扩增 |
| 4.2.2 P30 基因真核表达质粒 pCAMBIA1300-P30-YFP 的构建 |
| 4.2.3 农杆菌感受态细胞制备 |
| 4.2.4 重组表达载体转化农杆菌受体细胞 |
| 4.2.5 侵染烟草叶片 |
| 4.2.6 P30 目的蛋白亚细胞定位 |
| 4.2.7 表达产物的 Western blot 分析 |
| 4.2.8 目的基因的 RT-PCR 检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 P30 目的基因的 PCR 扩增 |
| 4.3.2 重组克隆质粒 pMD-P30 双酶切鉴定 |
| 4.3.3 P30 基因序列分析 |
| 4.3.4 重组表达质粒 pCAMBIA1300-P30-YFP 的双酶切鉴定 |
| 4.3.5 P30-YFP 融合蛋白亚细胞定位 |
| 4.3.6 表达产物的 Western blot 分析 |
| 4.3.7 P30 基因的 RT-PCR 检测 |
| 4.4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 |
四、含绿色荧光蛋白及小鼠IFN-γ基因的高效真核表达载体的构建与鉴定（论文参考文献）
- [1]IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制[D]. 高明春. 吉林大学, 2021
- [2]旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究[D]. 岳涛涛. 吉林大学, 2021(01)
- [3]布鲁菌UGPase调控宿主分子ACOD1表达进而抑制NF-κB活化的分子机制研究[D]. 乔连江. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]塞内卡病毒A结构蛋白T细胞表位的筛选与鉴定[D]. 郭丽莹. 中国农业科学院, 2021
- [5]猪丁型冠状病毒N蛋白抑制猪RLR信号通路的分子机制研究[D]. 纪立凯. 上海交通大学, 2020
- [6]共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价[D]. 石昂. 河南农业大学, 2018(05)
- [7]人源IFN-γ、IL-12串联共表达载体构建与体外联合诱导CIK细胞的作用[D]. 李岩. 泰山医学院, 2016(06)
- [8]犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究[D]. 刘玉秀. 吉林大学, 2014(01)
- [9]HIV复合表位核酸和痘苗病毒载体疫苗构建及免疫原性研究[D]. 杜寿文. 吉林大学, 2012(10)
- [10]绵羊肺炎支原体（Y-98标准株）P30基因真核表达载体构建与P30-IFNγ融合蛋白疫苗研制[D]. 张亚宁. 河北师范大学, 2012(04)