一、抗原激活的T淋巴细胞凋亡的分子机制（论文文献综述）
李兰洲[1]（2021）在《基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究》文中认为胸腺肽类药物在恶性肿瘤的临床治疗常作为免疫调节剂与化疗药物联合使用。临床数据显示,胸腺肽类药物的使用提升了恶性肿瘤患者存活率和生活质量。胸腺肽注射制剂在使用中容易引起严重的过敏等副作用,而胸腺肽肠溶片虽然安全性更高,但也存在药品标准简单,质量控制项少等问题,且其相关研究较少,临床定位模糊,作用机制不明确。本研究以胸腺肽肠溶片原料药小牛胸腺肽（CTP）作为研究对象,对其物质基础进行测定,并通过免疫低下小鼠模型,B6/JGpt-Apcem1Cin（Min C）/Gpt基因型（APC）原发性结直肠癌小鼠模型,造血体外细胞模型和造血功能障碍小鼠模型,对CTP的免疫调节活性,基于免疫调节活性的抗结直肠癌活性和促造血活性及其作用机制进行研究。首先测定了CTP的分子量及分子量范围,17种氨基酸及5种核苷酸含量。结果显示CTP中分子量在100-800道尔顿（Da）之间有69.15%的组分,CTP的数均分子量为222 Da,重均分子量为998 Da。同时发现CTP中既含有大量的必须氨基酸,如:60.24 g/kg的赖氨酸和49.46 g/kg的亮氨酸,又含有大量的非必需氨基酸,如:86.82 g/kg的谷氨酸和55.67 g/kg的天冬氨酸。5种核苷酸中CMP以49763.19 mg/kg的含量占据绝对优势地位。其次,通过75 mg/kg环磷酰胺（CTX）建立免疫低下小鼠模型,通过测定小鼠自然杀伤（NK）细胞杀伤活性,淋巴细胞转化活性,免疫球蛋白（Ig）及细胞因子含量,对CTP免疫调节活性进行研究。结果显示CTP有效地缓解了免疫低下小鼠体重的降低,提高了小鼠NK细胞杀伤活性和淋巴细胞转化活性,提高了Ig A,Ig G,Ig M,白细胞介素（IL）-2,IL-6,肿瘤坏死因子α（TNF-α）,干扰素（IFN）-α和IFN-γ的含量,并降低了IL-10的含量。再次,在APC小鼠模型中,通过比较肿瘤形态变化及组织病理学,流式细胞术,肠道菌群测定,ELISA测定及western blot分析等技术,对CTP基于免疫调节的抗结直肠癌活性及作用机制进行研究。结果显示CTP作用有效地抑制了APC小鼠结直肠肿瘤的发展,限制了肿瘤组织中血管网络的建立,并有力地保持肠道细胞正常形态,说明在APC小鼠体内,CTP确实发挥了抑制结直肠癌的作用。CTP提高了APC小鼠外周血中NK细胞（CD3e-NK1.1+）和活化T淋巴细胞（CD3e+CD28+）的数量,提高了小鼠脾脏和肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞数量和辅助性T细胞（T helper cells,Th）1/Th2细胞比例。此外CTP作用显着提高了IL-2,IL-12,Toll样受体（TLR）4,TLR5含量,降低了IL-4,IL-10,转化生长因子β（TGF-β）含量,有效地提升了APC小鼠肠道菌群物种组成数量、种群丰度及均匀度,有效地降低了APC小鼠肿瘤及脾脏组织中细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）,程序性细胞死亡蛋白1（PD1）和程序性细胞死亡蛋白配体（PD-L）1含量,升高了小鼠脾脏中IL-2含量及Calcineurin A/活化T细胞核因子1（NFAT1）通路蛋白和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB抑制剂激酶（IKK）/核因子κB（NF-κB）p65通路蛋白的活化水平。最后选用K562细胞和CHRF细胞作为体外模型,通过XTT测定,流式细胞术凋亡测定,联苯胺染色,western blot分析等,在体外模型中初步确定CTP促造血活性。并通过100 mg/kg CTX建立造血功能障碍小鼠模型,模拟化疗引起的骨髓损伤相关的造血功能障碍。通过外周血细胞分析,组织病理学分析,骨髓细胞流式细胞术分析,蛋白质组学联合ELISA测定技术对造血相关细胞因子进行分析,western blot分析等,在体内水平对CTP促造血活性及作用机制进行研究。体外细胞实验显示,CTP作用在增强K562细胞和CHRF细胞增殖活性的同时,也促进了细胞分化,增加了K562和CHRF细胞中磷酸化（P）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、P-核糖体蛋白S6激酶（RSK）1 p90、c-Myc和ETS转录因子ELK1（ELK1）等增殖分化相关蛋白的表达,证实CTP可通过调节增殖分化实现体外促造血作用。在造血功能障碍小鼠中,CTP促进了小鼠外周血中白细胞（WBC）,嗜酸性粒细胞（EO）,中性粒细胞（NE）等血细胞数量及血红蛋白含量的增多,并促进小鼠骨髓形态结构的重建及骨髓中B淋巴细胞,造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）的增多,同时增加了小鼠体内IL-2,IL-4,粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）等细胞因子水平,限制了IL-17,CCL1,单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）,TNF-α,IFN-γ等细胞因子的释放,显着升高了ERK1/2,PI3K,AKT和信号转导与转录激活因子3（STAT3）的磷酸化水平及G-CSF,粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）,M-CSF,NFAT1和IL-2的蛋白水平。以上结果表明:（1）CTP作为小分子多肽类物质,可以提高免疫低下小鼠体内免疫相关细胞因子水平,并提高了小鼠杀伤性免疫细胞的活性;（2）CTP通过调节肠道菌群,调控IL-2相关通路蛋白活化,降低免疫检查点作用,增加T淋巴细胞和NK细胞介导的免疫杀伤反应实现抗结直肠癌活性。（3）CTP能够通过调节G-CSF、M-CSF和IL-2水平及其相关通路蛋白变化,促进骨髓完整性重建和造血功能细胞增多,从而发挥促造血作用。本文研究内容将为CTP药物质量标准提升提供科学数据支持,并有助于确定CTP药物作用机制,明确其临床适用症,为基于CTP开发抗肿瘤或促造血药物提供科学的数据支持。
杨景[2]（2021）在《老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究》文中进行了进一步梳理季节性流感病毒（Seasonal Influenza Viruses）感染引起的患病和死亡,极其容易发生在老年人群和慢性肺部疾病患者。60岁及以上老年流感患者具有较高并发症风险,譬如脑炎、肺炎甚至恶化慢性心肺疾病相关的基础疾病。世界范围流行的季节性人流感是由A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒引起的。流感病毒基因组包含八个RNA片段,其中两个RNA片段编码两个包膜蛋白,分别为血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。国内目前上市的常用抗流感病毒药物如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦,均属于神经氨酸酶抑制剂。然而,最为安全长效、公共卫生获益最大的抗病毒防御,需要各年龄人群按时接种季节性流感病毒疫苗,特别是具有高感染风险的老年人群。流感病毒疫苗的免疫原性和有效性评价采用血清学检测血凝素抑制实验（Hemagglutinin Inhibition Test,HAI）,特异性抗体的评价标准低估了流感病毒疫苗在老年人群中的获益情况。老年人群接种流感病毒疫苗将流感发病率降低,同时降低了住院率、减少了并发症和死亡率。然而,季节性流感疫苗虽然每年更新和接种,疫苗保护效果不如预期。一方面,流行季循环野毒株和疫苗株的不匹配;同时,老年人群疫苗接种率低;另一方,老年人群因免疫衰老出现免疫系统对流感疫苗的免疫反应下降。目前,国家人口统计局数据显示中国在迅速老龄化,截止2020年1月,有2.5388亿名60岁及以上老年人占国家总人口数的18.1%,预计在2030年老龄人口占比将达到26%。这将使流感病毒感染在老年人中造成极其沉重的疾病负担,但可以通过接种疫苗来减轻或防控。然而,在国内老年人群流感病毒疫苗接种率远低于2010年世界卫生大会提出的75%的疫苗接种覆盖率目标,仅有4%。较多因素造成老年人群疫苗接种率较低,包括政策、个人经济水平、受教育程度和健康意识等。此外,老年人群疫苗免疫后产生的流感病毒特异性抗体水平较18～60岁的成年人低,记忆B细胞和长寿浆细胞也出现显着减少。免疫衰老（Immunosenescent）,成为针对60岁及以上老年人群开发新的或更有效的流感病毒疫苗的主要挑战。免疫衰老表现出免疫功能的下降和各种传染性疾病的风险增加。因此,了解免疫衰老的老年人群免疫灭活四价季节性流感病毒裂解疫苗（QIVs）免疫机制,涉及外周血转录组、T淋巴细胞、主要细胞因子和免疫球蛋白在QIVs免疫前后动态特征,有助于发现老年人群免疫中与年龄、性别相关的变化是如何导致这种风险以及出现针对流感疫苗的弱体液免疫反应。事实上,现在人们普遍认为,疫苗接种后测定HAI滴度并不能全面反映老年人群的疫苗保护效果。此外,抗体反应弱或无的老年受试者每年接种疫苗,对流感的保护效果也出现提高,这表明细胞免疫机制可能对老年人的保护也很重要。最早的,2009年Querec等研究人员将系统生物学的方法应用于黄热病毒疫苗的机制研究中,并由此衍生出系统疫苗学的概念。鉴于传统疫苗研究基于体液免疫反应,缺乏对疫苗细胞免疫的认识。此外,QIVs疫苗免疫机制是网络化、多维度的,本研究采用系统生物学研究的方法,将从多个维度,借助高通量检测手段和计算机生物信息学分析关联传统疫苗学研究的特征指标,鉴定QIVs疫苗接种后在老年人群中建立有效免疫保护的重要生物分子和信号途径,筛选出与疫苗有效性、免疫反应性和持久性相关的枢纽基因,以期寻找疫苗有效性评价的替代生物标志物,加速疫苗临床研究进展。因机体免疫机制的复杂性,将从多个维度剖析老年人群QIVs免疫机制。本研究首先采用高通量测序RNA-Seq手段获取16名人口学和免疫特征具有显着差异老年受试者的转录组数据,随后进行整合关联分析。并采用不同生物信息学分析手段,首先通过基于生物学特征驱动（Biology-Driven）的配对比较聚类分析,老年女性和老年男性在QIVs免疫过程中因性别差异化表达基因和信号通路。随后,通过基于数据驱动（Data-Driven）的权重基因共表达网络分析（WGCNA）,将差异化表达基因按表达模式聚类,并将聚类的基因集关联性状特征（受试者人口学及免疫反应特征）分析,最终鉴定出影响性状特征的关键核心基因（Hub Gene）。此外,通过荧光定量qRT-PCR验证枢纽基因的表达特征与转录组结果一致。鉴于转录组RNA-Seq仅是从RNA分子水平阐明老年人群免疫QIVs的机制,为了解细胞介导QIVs免疫的动力学特征,本研究接着采用高通量多色流式细胞术分析了人口学性状及QIVs免疫反应特征明显的17名60周岁以上老年受试者的外周血PBMC标本详细的T细胞亚群免疫表型,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVsrelated reactogenicity）。最后,我们使用高通量多重细胞因子检测技术分析了以上老年受试者的外周血血浆样本中具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig,同样将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。确定了不同性状特征老年受试者QIVs免疫前后细胞因子网络及主要免疫球蛋白Ig的动力学特征,以期了解细胞因子在细胞免疫中发挥的作用。第一部分:通过RNA-Seq获得老年人群QIVs免疫前后转录组数据进行生物信息学分析1.性别因素对老年人群QIVs免疫效果的影响临床数据显示,流感疫苗免疫应答存在性别差异,该研究旨在鉴定出差异表达基因（DEGs）造成老年人群接种四价灭活流感疫苗出现免疫相关的性别偏倚。以60～80岁的健康成年人为对象,对接种前后的基因表达情况进行分析。受试者体液免疫水平采用血凝抑制实验检测特异性抗体滴度HAI,并分析两个性别群体差异基因表达谱与体液免疫的相关性。在老年女性中,参与I型干扰素信号通路和经典通路补体激活的DEGs在流感疫苗接种3天内出现上调。在第28天,显示老年男性偏倚模式的免疫反应与调控蛋白质加工处理以及补体活化的经典途径相关。通过生物特征驱动聚类方法确定了与老年女性和男性对QIVs接种不同反应相关的一系列DEGs。老年女性对QIVs具有更强的免疫反应,但抗体半年后出现迅速下降,而老年男性具有维持持久反应的优势。此外,我们还发现了可能导致老年人接种流感疫苗性别变异的基因。我们的研究结果强调了开发个性化季节性流感疫苗的重要性。2.枢纽基因MCEMP1和SPARC分别驱动QIVs免疫不良反应事件发生与维持有效抗体深入了解潜在的候选中心基因可能有助于产生安全有效的季节性流感免疫,以及开发针对流感病毒感染高危老年人群的个性化流感疫苗。本研究旨在通过加权基因共表达网络分析,确定与2018/19季节四价灭活流感病毒疫苗免疫诱导过程相关的潜在中枢基因。从16名老年人的63份全血样本中,共获得13345个基因,分为8个共表达模块,其中两个模块与疫苗诱导的免疫应答显着相关。功能富集分析后,利用GO条件下的疫苗相关免疫基因构建hub基因的子网络,进行hub基因的鉴定和功能验证。MCEMP1和SPARC被证实是影响QIVs诱导免疫的中心基因。在接种后7天内,MCEMP1的表达量与QIVs相关的反应性呈负相关,CXCL8/IL-8可抑制MCEMP1的表达,颗粒酶-B细胞毒介质可加剧MCEMP1的表达量。同时,SPARC的表达增加了对QIVs的免疫应答,并有助于持续的保护性体液抗体滴度。这两个基因可用于预测QIVs诱导的不良反应、免疫反应的强度以及体液抗流感抗体的持续时间。这项工作为进一步研究开发个性化的QIVs提供了线索,这些QIVs具有适当的免疫反应和对即将到来的季节性流感的持久免疫。第二部分:老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征衰老产生的细胞免疫损伤,表现为胸腺退化及T淋巴细胞输出减少为主的免疫系统随年龄变化特征。然而,缺乏老年人群接种QIVs前后外周血T淋巴细胞亚群的详细分布特征研究。本研究旨在确认老年人群T淋巴细胞分布特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的T细胞亚群动力学特征差异。本研究随机筛选的60名老年受试者中,分析受试者性状涉及人口学基线特征和免疫前预存流感病毒抗体水平,其中17名受试者具有显着性状差异被选取用于鉴定老年人群外周血T淋巴细胞衰老表型的特征。通过10色高通量流式细胞术检测分析外周血T细胞亚群的详细分布特征。计算各T细胞亚群占亲本比例,并进行不同性状和免疫状态分组比较,包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应。受试者人口学特征和基线特征基本一致,血常规检测淋巴细胞数量在正常范围。按照年龄分组比较T细胞亚群分布差异,CD8+PD1-CD57-T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高,而CD8+PD1+CD57+T细胞亚群显着低于低龄组。CD8+CD27-CD28+T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高但频数在免后两年龄组均出现显着降低,而两年龄组中CD27+CD28+/-T细胞在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着增加。两年龄组中TCMs在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着减少,而TNs则在QIVs免后显着增加。按照性别分组比较T细胞亚群分布差异,总T（CD3+）和CD4+T细胞的比例在老年女性受试者中较老年男性高,其中CD4+在免后Day180具有显着性别差异免后Day180,CD27+CD28+T细胞比例在老年女性受试者中显着高于老年男性。在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中,不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间差异较小。然而,更详细的通过耗竭表型分子（PD-1）、衰老表型分子（CD57）、共刺激分子（CD27和CD28）以及T细胞效应记忆表型分子（CD45RA和CCR7）,发现QIVs免疫前后不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间存在显着差异。第三部分:老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征细胞因子（Cytokines）和趋化因子（Chemokines）是具有生长、分化和激活功能的冗余分泌型蛋白,调节并决定免疫反应的性质,控制免疫细胞的迁移以及免疫器官中细胞的排列。最初针对免疫损伤产生的细胞因子种类,便决定了免疫反应的发生,甚至随后的免疫反应发展结局特征是细胞毒性的、体液免疫、细胞介导的免疫还是过敏性的。因此,本研究旨在确认老年人群免疫反应相关主要细胞因子、免疫球蛋白Ig的水平特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的主要细胞因子、免疫球蛋白Ig动力学特征差异。在本研究中,我们使用高通量多重细胞因子检测技术,针对人口学特征及QIVs免疫反应特征明显的18名60周岁以上老年受试者的血浆样本,定量检测具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig浓度,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。受试者人口学特征和基线特征基本一致,常规体检显示身体状况良好。按照年龄分组比较,IL-5在免前高龄组M65yrs Group中显着高于低龄NM65yrs Group,并在免后出现显着减少。Granzyme-B在免后低龄NM65yrs Group中显着高于高龄组M65yrs Group,免后两年龄组均出现显着增加。按照性别分组比较,IL-6在免后Day3,Female Group组中显着高于Male Group,随后Day28显着减少。IL-2在免后Day180,老年女性Female Group中显着高于老年男性组Male Group。按照免疫QIVs有无不良反应分组比较,免前,IL-12分泌在GR Group显着高于NGR Group。IL-18和IFN-alpha在QIVs免疫后Day 28,均在GR Group具有显着更高的表达。此外,Granzyme-B在免后Day 03,GR Group表达显着高于NGR Group。许多细胞因子同时具有促炎和抗炎潜能,观察到哪种活性取决于存在的免疫细胞及其对细胞因子的反应状态。体液免疫相关细胞因子IL-5和细胞毒作用相关Granzyme-B具有明显的年龄差异。同时,在QIVs免疫后,显着高表达的细胞因子IL-6和IL-2,证明了老年女性组具有更高的流感病毒特异性的细胞毒性CD8+T细胞以及CD4+记忆T细胞。
张颖[3]（2021）在《力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析》文中研究指明癌症仍然被认为是全球范围内主要的死亡原因。癌症的发展与进化涉及到多种细胞群和细胞外环境之间跨越多个空间和时间尺度的复杂过程。免疫系统是肿瘤生物学的关键调节剂,是免疫应答以及免疫反应的重要系统,具有支持或抑制肿瘤发展,生长,侵袭和转移的能力。然而,由于肿瘤细胞具有较低的免疫特性,可以让肿瘤细胞能够有效的逃避免疫系统的识别以及清除。因此,通过研究影响肿瘤-免疫系统间相互作用的因素,了解肿瘤免疫系统的三种状态:肿瘤被免疫系统清除、肿瘤与免疫系统间达到平衡状态以及肿瘤细胞发生逃逸。至今,已有许多研究设计了数学计算模型以及实验来描述影响肿瘤生长和肿瘤免疫系统的生物学机制。研究结果表明肿瘤生长及进展与细胞和肿瘤微环境中的力学特性有着密不可分的关系。细胞外基质硬度,细胞间粘附力大小以及免疫检查点的变化往往与肿瘤的发展及扩散情况相关联。本文基于Cellular Potts Model的理论建立数学模型,通过数学建模方式分析研究了细胞间的力学特性对于肿瘤自身进展以及肿瘤和适应性免疫系统之间交互作用的影响。第二章中,通过建立细胞刚度以及细胞-ECM间黏附力对迁移影响的模型,研究了细胞外基质的动态变化对肿瘤细胞与基质间黏附力大小的影响,模拟结果表明肿瘤细胞的迁移速度与ECM刚度存在双相依赖性,ECM刚度的增加促进肿瘤细胞在较低刚度下的迁移。但在刚度较大的ECM上,肿瘤细胞需要聚集足够数量的整合素,增加的整联蛋白的表达会增加表面张力和细胞-ECM的黏附能。所以ECM刚度的进一步增加抑制了肿瘤细胞的迁移。在第三章中,我们加入了肿瘤免疫反应模型,通过结合肿瘤细胞进展以及免疫发展,建立肿瘤细胞与免疫细胞间的交互作用,利用该模型研究了免疫检查点如何影响细胞间的相互作用以及细胞间的粘附力变化对于肿瘤在免疫反应过程中的影响。结果表明,免疫检查点CTLA-4会通过作用T细胞的下游信号通路,影响细胞间粘附力的大小,有利于肿瘤细胞免疫逃逸的发生。
徐清浪[4]（2021）在《慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化特征及临床意义》文中进行了进一步梳理目的:通过分析外周血T淋巴细胞亚群在慢性HBV感染患者不同临床阶段的水平特征与各临床指标之间的关系,同时对免疫耐受期、e抗原阳性患者进行随访,评估T淋巴细胞亚群对免疫状态、打破免疫耐受及发生e抗原转换的诊断效能,探讨T淋巴细胞亚群在慢性HBV感染患者中的分布特征及其临床意义。方法:入组2018年12月～2020年12月在南昌大学第一附属医院感染科就诊及住院慢性HBV感染患者共231例,收集基本资料及各临床指标值,分别根据免疫状态、HBV-DNA载量、HBs Ag定量水平进行分组,观察T淋巴细胞亚群与各临床指标间的关系及评估免疫状态的诊断效能;同时对55例免疫耐受期慢性HBV感染患者及132例HBe Ag（+）阳性患者进行随访,观察T淋巴细胞亚群对打破免疫耐受、发生e抗原血清学转换的诊断效能及抗病毒前后慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化。结果:1、HBV感染后免疫耐受组与非免疫耐受组CD3+、CD4+、CD8+细胞绝对值及CD4/CD8比值均低于健康体检组,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫耐受组CD3+、CD4+细胞绝对值、CD4+细胞比例及CD4/CD8比值均低于非免疫耐受组,差异有统计学意义（P<0.05）。2、慢性HBV感染患者外周血CD3+、CD4+细胞绝对值及比例、CD4/CD8比例随着HBV载量升高呈逐渐下降趋势,CD8+细胞绝对值及比例逐渐明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。3、慢性HBV感染患者HBs Ag定量高载量组CD3+、CD4+细胞绝对值均低于低、中HBs Ag载量组,差异有统计学意义（P<0.05）。低载量组CD4/CD8比值大于中载量组,差异有统计学意义（P<0.05）。4、HBV-DNA与CD3+细胞绝对值及比例、CD4+细胞比例、CD4/CD8比值存在负相关关系,相关系数分别为-0.407、-0.438、-0.516、-0.703,与CD8+细胞比例存在正相关关系,相关系数为0.511。HBs Ag与CD3+细胞绝对值、CD4+细胞绝对值存在负相关关系,相关系数分别为-0.431、-0.429。ALT与CD8+细胞绝对值及比例存在负相关关系,相关系数分别为-0.418、-0.439。TBi L与CD3+细胞绝对值及比例、CD4+细胞绝对值及比例、CD8+细胞绝对值及比例存在负相关关系,相关系数分别为-0.443、-0.531、-0.572、-0.515、-0.453、-0.412。WBC计数与CD3+细胞绝对值、CD4+细胞绝对值、CD8+细胞绝对值存在正相关关系,相关系数分别为0.486、0.438、0.409。5、抗病毒治疗后,慢性HBV感染患者CD3+细胞绝对值与比例、CD4+细胞绝对值与比例、CD8+细胞绝对值较抗病毒前明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。6、CD4+细胞绝对值、CD4+细胞比例、CD4/CD8比值对评估免疫状态的检验效能曲线下面积分别为0.774、0.827、0.721。7、CD3+、CD4+、CD8+细胞数量与CD4/CD8比值对打破免疫耐受状态的检验效能曲线下面积分别为0.831、0.892、0.802、0.837。8、CD3+、CD4+、CD8+细胞数量对发生e抗原转换的检效能曲线下面积分别为0.858、0.872、0.735。结论:1、HBV感染后,普遍存在细胞免疫功能下降及免疫紊乱现象,这一现象在免疫耐受期患者当中表现得更为明显,且随着慢乙肝疾病重症化,机体细胞免疫功能可能出现下降甚至衰竭现象。2、HBV-DNA载量、HBs Ag定量水平与外周血T淋巴细胞亚群之间存在密切关系,HBV-DNA、HBs Ag载量越高,对患者细胞免疫功能的抑制作用越强,而抗病毒治疗可显着改善HBV-DNA对患者细胞免疫功能的抑制作用。3、CD4+细胞绝对值数量、比例及CD4/CD8比值对HBV感染患者免疫状态有较好的评估效应,CD3+、CD4+、CD8+细胞数量与CD4/CD8比值对预测免疫耐受期患者打破免疫耐受状态有一定的参考价值,临床上可动态检测外周血T淋巴细胞辅助评估患者免疫状态及打破免疫耐受可能性。4、检测CD3+、CD4+、CD8+细胞数量对预测发生e抗原血清学转换有一定的参考意义。
李青[5]（2021）在《ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸》文中指出肺癌是全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。据文献报道,过去的40年里,肺癌的5年生存率小于21%。肺腺癌（Lungadenocarcinoma,LUAD）作为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）最重要的亚型,发病率逐渐增多,成为备受关注的NSCLC亚型。伴随着靶向治疗的出现,晚期LUAD患者的5年总生存有所改善,但仍面临靶向药物耐药、获益人群受限、缓解率不高等问题。以PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点阻断（Immunecheckpointblockade,ICB）及以抗原嵌合受体T细胞（CAR-T）治疗为代表的过继性T细胞转移（ACT）治疗的出现为晚期肺癌患者带来了新的希望。而目前PD-I/PD-L1抑制剂在实体瘤的临床有效率及瘤种反应率不尽相同。单纯抗PD-1/PD-L1免疫治疗在晚期NSCLC的客观有效率仅为20%,除了患者选择不足和肿瘤自身免疫原性低外,复杂的免疫抑制微环境,包括抑制性免疫细胞、细胞因子和代谢物,以及肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）数量和功能下降,是T细胞免疫和有效ICB治疗的主要障碍。因此,寻找新的免疫检查点分子作为替代或补充,以突破肿瘤免疫抑制性屏障,逆转肿瘤免疫抑制微环境是目前肿瘤免疫治疗亟需解决的问题。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,而肿瘤浸润T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境中参与抗肿瘤免疫应答的最重要的免疫细胞,如何提高肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的浸润水平及功能是当下免疫治疗的研究热点。成熟T淋巴细胞膜表面可表达CD3分子,根据T细胞表面分化抗原的不同,T细胞可分为CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞二个亚群。CD4+T淋巴细胞,通过与外源性抗原肽-MHCII分子结合发挥辅助作用;CD8+T淋巴细胞,主要与内源性抗原肽-MHC-I分子结合、活化,借助于颗粒酶、穿孔素等发挥特异性杀伤功能,是机体免疫系统中最重要的效应细胞。目前研究表明肿瘤浸润淋巴细胞,特别是CD4+Th1和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）的存在与肿瘤患者较好的预后及肿瘤免疫治疗的疗效相关。FOXP3是Tregs的特异性转录因子。它不仅控制其表型,而且维持其免疫抑制功能,是应用最广泛的Treg标记。Treg通常通过接触依赖方式抑制Teffertor、NK或APC的激活,或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制因子介导免疫抑制功能。目前大部分研究表明,在绝大多数肿瘤类型中,细胞毒性抗肿瘤免疫应答的主要细胞(如细胞毒CD8+T细胞、Th1导向的CD4+T细胞、三级淋巴结构（TLSs,tertiary lymphoid structures）的存在与良好的临床结果相关。相反,Tregs表达者预后较差。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中Tregs和抑制性检查点分子等复杂的免疫抑制因子可以限制T细胞的浸润和杀伤能力,而这对于肿瘤的根除至关重要。因此,开展肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的研究对肿瘤的免疫治疗尤为重要。ILT4作为免疫球蛋白样转录子抑制性受体的一种,主要在髓系固有细胞（DC细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞）中表达,通过与经典或非经典组织相容复合体I类分子（MHC-I）结合,在维持母婴免疫耐受、器官移植耐受及炎症反应中发挥重大作用。研究表明,免疫细胞中ILT4的表达可有效抑制CD4+T细胞、CD8+细胞毒T细胞、NK细胞及树突状细胞的免疫活性,同时亦能诱导不同类型Treg细胞发挥免疫抑制作用。其虽在免疫学研究中取得十足的进展,但在肿瘤领域的研究相对较少。近年来,研究发现ILT4在NSCLC、白血病、乳腺癌、食管癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞中存在表达,且与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等多种恶性生物学行为息息相关。此外,ILT4在髓系抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）中高表达,可促进肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAM）的M2极化,在创造肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。但肿瘤源性ILT4对实体肿瘤免疫抑制性微环境中T淋巴细胞亚群的调控作用及相关机制尚无报道。研究目的1.通过免疫组化染色方法和大数据统计分析ILT4在肺腺癌中的表达及其与T细胞浸润与亚群分布的相关性,以及二者与患者预后的相关性,明确ILT4对免疫抑制微环境的调控作用。以此为基础构建肺腺癌患者预后Nomogram列线图模型,为患者预后的预测提供量化工具。2.体外利用CD3+、CD4+和CD8+T细胞及敲低/过表达ILT4的肺腺癌细胞株构建T细胞-肿瘤细胞共培养体系,应用CCK-8和流式细胞术检测T细胞的增殖和凋亡情况。旨在探讨肿瘤源性ILT4抑制T细胞浸润的可能机制。方法1.收集216例经烟台市烟台山医院病理科诊断明确的原发性肺腺癌患者的病理组织标本及临床病理资料,并通过电话随访的方式获得入组患者的生存资料。应用免疫组织化学染色法检测其ILT4及CD3、CD4、CD8、FOXP3在肿瘤癌巢及间质的表达情况;结合免疫组化结果和GEO公共数据库统计分析ILT4与肺腺癌预后的关系。其次,分别统计ILT4的表达与上述T淋巴细胞亚群在癌巢及间质的分布密度关系,探讨ILT4与T淋巴细胞两者共表达对肺腺癌患者生存预后的影响。2.利用KM-plotter在线工具（http://kmplot.com/）数据库分析肺腺癌患者ILT4的生存情况。对基因表达综合数据库（GEO）中的720例和461例LUAD患者分别进行无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分析。自动选择每个队列的最佳截止值,其他所有参数均为默认设置。从GEO数据库下载LUAD患者的基因表达谱（GSE50081;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50081）,GSE50081的基因注释基于微阵列平台GPL570,对127个L UAD样本进行了进一步的研究。对于癌症基因组图谱（TCGA）队列,泛癌的RNASeq数据从UCSC xena下载（https://xenabrowser.net/datapages/）,共纳入515个样本。用ssGSEA函数对R package GSVA中的Treg浸润评分进行量化。采用Spearman相关系数评价ILT4表达与Treg浸润的相关性。3.利用患者临床病理资料、ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据创建可评估患者预后生存的诺谟图。其中,利用Lasso回归,基于Lambda.1se筛选有意义的指标,将能够反应免疫微环境状态（即ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据）的这些自变量与其回归系数组成一个计算评分,即为lasso系数。将lasso回归筛选得到的指标联合临床病理参数制作诺谟图,以估算NSCLC患者2年和3年的生存率。其中模型的构建采用R语言3.0.1（R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria）和glmnet package进行LASSO Cox回归模型分析,并运用图形校准法检验模型的一致性/标定度（Calibration）及C-Index值评价模型的区分度。4.利用基因转染技术,分别敲低/过表达LUAD细胞系-H1975中ILT4的表达,应用Western blot、RT-PCR方法分别检测ILT4的转染效率。然后,运用Ficoll-Paque分离液分离健康志愿者全血中的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采用相应T细胞亚群磁珠分选试剂盒分选并利用CD3单抗活化人CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群。将敲低/过表达ILT4的LUAD H1975细胞系（H1975-shILT4与H1975-ILT4）分别与活化的CD3+、CD4+及CD8+T细胞按2:1比例共培养48h。然后,分离共培养之后的T细胞。分别利用CCK-8法和流式细胞术检测共培养体系中T淋巴细胞亚群增殖和凋亡情况。结果1.ILT4在LUAD高表达,正常邻近组织低表达,其表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及较差的PFS、OS相关。此外,ILT4的表达与肿瘤浸润T淋巴细胞的减少有关。进一步行T细胞亚群分析显示,ILT4高表达肿瘤中癌巢和间质中浸润的CD8+T淋巴细胞的减少,Treg浸润增加,而与CD4+T淋巴细胞亚群的浸润密度无关。同时ILT4highCD8low/ILT4highTreghigh肺腺癌患者的OS更差。因此,ILT4与CD8/Treg联合相比任何单一标记具有更好的生存预测价值。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可以有效的预测患者2年及3年的生存率,为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者的2年、3年生存概率。3.应用RT-PCR及Western blot方法分别检测敲低/过表达肺腺癌细胞H1975中ILT4的转染效率满意。敲低H1975细胞中ILT4表达后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性增加,而凋亡比例明显减少。而过表达H1975细胞中ILT4后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性受到抑制,凋亡比例明显增加。但两组中均未观察到CD4+T淋巴细胞亚群的浸润变化。结论1.肿瘤源性ILT4的表达与肺腺癌免疫抑制T淋巴细胞亚群的浸润和不良的临床预后相关。提示ILT4可能成为LUAD患者潜在的免疫治疗靶点和预后生物标记物。同时,ILT4与CD8/Treg联合可作为评估LUAD患者预后的更佳指标。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者生存概率。3.肿瘤源性ILT4通过调控T细胞亚群增殖、凋亡诱导肺腺癌的免疫逃逸。
张丽[6]（2021）在《小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究》文中研究表明研究背景免疫衰老指随着年龄的增长,因免疫器官结构破坏和免疫反应功能障碍,造成先天性和适应性免疫受损,导致老年人免疫功能的改变,伴随以慢性炎症为特征的全身炎症状态,与感染、自身免疫性疾病以及肿瘤等的发生发展密切相关。目前免疫衰老的确切机制尚未完全明确。初级和次级淋巴器官结构和功能的破坏可导致免疫功能减退,因此免疫器官增龄性变化可能与免疫衰老的发生有关。胸腺和脾脏作为机体最大的中枢和外周免疫器官,随着年龄增加,结构和功能发生改变,正常微环境的破坏以及T淋巴细胞数目的减少引起机体免疫功能的减退,影响外周免疫的稳态,可能促进与年龄有关的机体炎症状态以及免疫衰老的发生。衰老引起的胸腺及脾脏结构和功能的变化可能与免疫衰老存在关联。目的胸腺和脾脏增龄性分子变化以及机制目前尚未明确。本实验通过基于整合转录组和蛋白质组学方法,揭示不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的增龄性分子变化,探讨胸腺、脾脏的增龄性变化在免疫衰老中潜在作用,为免疫衰老导致的相关疾病的诊治提供可能的候选靶标。方法本实验首先通过HE染色、免疫组化以及透射电镜超微观察等方法研究不同年龄组（6周龄,6月龄,20月龄）小鼠胸腺和脾脏免疫器官组织学变化。随后通过整合RNA-seq转录组学方法以及串联质谱标签（TMT）相对定量蛋白质组学技术,研究不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的表达差异变化,结合生物信息学方法分析其所富集的通路,筛选出增龄相关的差异基因和蛋白,并进一步验证筛选出的差异基因与蛋白。结果1.小鼠增龄性免疫器官重量及指数变化小鼠鼠体重随着年龄增长而增加。小鼠胸腺重量随年龄增加而减少,20月龄组和6月龄组小鼠胸腺重量均显着低于6周龄组,且具有统计学意义。小鼠脾脏重量随着年龄增加变化不显着,20月龄和6月龄组小鼠脾脏重量高于6周龄组,均无统计学差异。小鼠胸腺指数和脾脏指数均随年龄增加而显着减少。2.免疫器官组织学变化（1）胸腺HE染色:6周龄组小鼠胸腺皮髓质界限清晰,皮质着色深,淋巴细胞致密、染色较深;髓质着色较浅,结构稍疏松,淋巴细胞数目较皮质少,有大量TECs。6月龄组小鼠胸腺组织皮质成分变薄,皮髓质内胸腺细胞间隙增大,皮/髓比显着降低;髓质内TECs数目较少。20月龄组小鼠胸腺组织较6周龄、6月龄组明显萎缩、面积显着减少,周围可见结缔组织包绕、替代,皮髓质界限不清;胸腺细胞、TECs数量均较少,胸腺细胞深染、不规则,成纤维细胞数目增加。免疫组化:随着年龄增加,小鼠胸腺皮、髓质中CD3阳性T淋巴细胞、Ep CAM阳性TECs数目显着减少。20月龄组皮质TECs较6周龄与6月龄组显着减少,20月龄与6月龄组髓质TECs较6周龄组显着减少;20月龄与6月龄组皮质淋巴细胞较6周龄组显着减少,20月龄组髓质淋巴细胞较6周龄与6月龄组显着减少;20月龄与6月龄组巨噬细胞较6周龄组显着增加。超微结构:小鼠胸腺随年龄增长,细胞数目减少、结构疏松,淋巴细胞核趋于不规则,核质比小;可见坏死胸腺的上皮细胞。20月龄组可见凋亡现象增加,上皮细胞线粒体呈空泡变。（2）脾脏HE染色:6周龄组小鼠脾脏红、白髓、边缘区结构清晰,脾脏小体结构规则,淋巴滤泡深染,淋巴细胞致密。6月龄组小鼠脾脏红、白髓界限模糊,边缘区较6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,淋巴细胞较6周龄组稍疏松。20月龄组小鼠皮髓质界限模糊,脾脏小体结构不规则,白髓萎缩、面积减少,红髓面积相应增大,红/白髓比显着升高;边缘区较6月龄组与6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,实质内成纤维细胞、纤维结缔组织增生。免疫组化:随着年龄增加,小鼠脾脏白髓内淋巴细胞数目显着下降,白髓边缘区与生发中心内B淋巴细胞数目增加,边缘区巨噬细胞数目增龄性显着增加。超微结构:6周龄小鼠脾脏内淋巴细胞较致密,核规则呈圆形,核质比大,异染色质较多,胞浆线粒体、内质网、有力的核糖体较丰富;局部散在中性粒细胞、浆细胞、巨噬细胞等。6月龄小鼠脾脏内淋巴细胞部分核稍不规则,异染色质边聚,部分胞浆内可见线粒体空泡变;凋亡细胞增加。20月龄小鼠脾脏内淋巴细胞疏松,数目明显减少,核不规则,异染色质边聚,呈块状,凋亡细胞明显增加。3.ELISA检测细胞因子结果显示,小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6等有增龄性升高趋势,20月龄组中IL-10、TNF-α和IL-6水平高于6周龄组、6月龄组,20月龄、6月龄组中IFN-γ水平高于6周龄组,均无显着性统计学差异。4.胸腺转录组和蛋白组学结果分析RNA-Seq方法筛选出524个胸腺增龄相关差异表达基因,主要参与信号转导过程（PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路）、信号分子和相互作用过程（ECM-受体相互作用）、免疫系统（B细胞受体信号通路、补体和凝血级联、趋化因子信号通路）等信号通路;TMT技术确定113个胸腺增龄相关差异表达蛋白,主要参与能量代谢过程如柠檬酸盐循环（TCA循环）、细胞生长与死亡过程（细胞周期、凋亡过程）、遗传信息处理过程（剪接体）、内分泌系统（脂肪细胞因子信号通路）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与胸腺增龄相关的Fgf2、Flt1、BMP4、v WF、Lamc1、CD19、Cxcr5等重要差异基因以及CKS1、SRSF2、CASP-3、FGF2、CPT1B、PTMA、NASP等重要差异蛋白。5.脾脏转录组和蛋白组学结果分析基于RNA-Seq方法筛选出28个脾脏增龄相关差异表达基因,主要参与炎症反应、免疫相关通路,包括趋化因子信号转导途径,MAPK信号通路、Rap1信号通路等信号通路。TMT技术确定133个组织脾脏增龄相关差异表达蛋白,参与细胞生长与死亡过程（细胞周期）、遗传信息处理过程（翻译、核糖体）、细胞运动性过程（肌动蛋白细胞骨架调节）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与脾脏增龄相关的、vsig4、cfh、c7、cx3cl1、penk、ccl8、prkcz等重要差异基因以及CCNA2、ATOX1、CCR6、CXCL5、EIF3L、GZMA、RABL3、SLAMF1、RSL24D1等重要差异蛋白。结论随着年龄增长,小鼠免疫器官胸腺和脾脏在组织结构和免疫细胞分布上发生了变化,主要表现为微环境破坏、T淋巴细胞减少。衰老个体中炎症因子水平高于幼年组。不同年龄段小鼠胸腺和脾脏组织在基因和蛋白水平上表达存在明显差异性。增龄过程中,胸腺在基因水平上的变化表现为胸腺微环境受影响,脂肪生成活动增强,胸腺上皮细胞分化、生成以及胸腺细胞迁移、增殖或分化受影响,促炎作用增强等;在蛋白水平上表现为能量代谢增加,细胞生长、遗传物质传递相关过程受损,细胞凋亡活动增强、凋亡抑制作用减弱,脂质代谢增强,胸腺微环境受影响、促炎细胞因子分泌增加等。增龄过程中,脾脏在基因水平上的变化表现为T细胞增殖的抑制活动增强,促进细胞死亡活动增加,细胞凋亡的信号转导途径激活,促炎活动增强等。在蛋白水平上表现为细胞周期、蛋白质合成受损,细胞增殖活性减退、迁移过程受影响,抗氧化作用增强,T、B细胞激活作用增强、促炎反应增强等。衰老对胸腺和脾脏的影响主要包括影响其组织正常结构及其正常的生长、发育过程,此外促炎反应的增强可能与免疫衰老的炎症状态相关。本研究结果为阐明胸腺、脾脏增龄性分子变化以及探讨其在免疫衰老中可能存在的作用提供理论依据。
李玲[7]（2021）在《基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响》文中研究指明研究目的:前期研究证实归芪白术方辅助治疗胃癌（Gastric Cancer,GC）有效改善机体不良反应,提高患者的生存质量,但发挥作用的物质基础和分子机制尚不清楚。本研究运用化学信息学-分子对接-分子动力学结合蛋白检测方法及细胞生物学方法,揭示归芪白术方通过健脾扶正促进免疫活性（靶向免疫检查点PD-L1（程序性死亡受体配体1,Programmed cell death ligand 1）调节免疫细胞功能）同时兼备化瘀祛邪抑制肿瘤增殖（靶向HER2（人表皮生长因子受体2,Human epidermal growth factor receptor 2）抑制肿瘤细胞增殖）的药效物质基础,以及探讨该复方“多点显效,协同增效”的功效特点。研究方法:1.结合临床治疗靶向及数据库筛选归芪白术方治疗GC的作用靶点。使用化学信息学方法构建归芪白术方小分子成分结构库,筛选促进肿瘤细胞增殖的HER2和抑制淋巴细胞活性的PD-L1作为研究靶蛋白;确定靶蛋白（HER2/PD-L1）晶体结构及活性位点,应用分子对接技术,筛选能够与靶蛋白有效结合的代表性靶向成分,并进行分子动力学模拟、结合自由能计算和微量热泳动实验（Microscale thermophoresis,MST）,验证其与靶蛋白结合的亲和力,酶活实验检测中药（Traditional Chinese Medicine,TCM）小分子对HER2的作用。2.检测靶向HER2的中药小分子在不同GC细胞株的抗肿瘤效果;使用靶向HER2的中药小分子干预EGF（表皮细胞生长因子,Epidermal growth factor）刺激的胃癌MKN-45细胞,检测其对GC细胞增殖、克隆形成能力以及对PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT））通路相关蛋白及基因表达的影响;使用抑制PD-L1的中药小分子干预可溶性PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,检测其对T细胞增殖、细胞因子IFN-γ/IL-2（干扰素γ（Interferon-gamma,IFN-γ）/白介素2（Interleukin-2,IL-2））表达量、PD-1+（程序性死亡受体1,Programmed cell death protein 1）T细胞数量及T细胞功能相关蛋白、基因表达的影响。3.构建人胃癌MKN-45细胞和人外周血T淋巴细胞共培养体系;使用抑制PD-L1的中药小分子formononetin,靶向HER2的中药小分子quercetin,以及quercetin和formononetin配伍干预共培养体系,检测中药小分子干预对T细胞增殖、细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、T细胞凋亡的影响,观察中药小分子对共培养体系中T细胞功能抑制的干预作用;同时检测中药小分子对GC细胞增殖、凋亡的影响,研究其对GC细胞增殖的抑制作用。研究结果:1.筛选得到HER2和PD-L1作为研究归芪白术方治疗GC物质基础及作用机制的有效靶点。2.归芪白术方中有385个中药小分子与HER2蛋白对接得分值≤-4,189个中药小分子与PD-L1蛋白对接得分值≤-4。选择对接得分较高的中药小分子进行MST,黄芪中的daidzein（大豆苷元）、黄芪/甘草中的quercetin（槲皮素）与HER2具有较高结合亲和力,Kd值分别为3.7μM/490 n M;黄芪/甘草中的isorhamnetin（异鼠李素）/formononetin（刺芒柄花素）与PD-L1具有较高结合亲和力,Kd值分别为667 n M/355 n M。50 ns分子动力学模拟结果显示quercetin与HER2结合模式较稳定,结合自由能为-26.55 Kcal/mol,formononetin与PD-L1结合模式较稳定,结合自由能为-19.41 Kcal/mol。酶活性检测结果显示quercetin能够明显抑制HER2激酶活性,IC50为570.7 n M,daidzein对HER2没有明显的抑制作用。3.通过单独干预EGF刺激的胃癌MKN-45细胞和PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,发现quercetin能够抑制EGF诱导的GC细胞增殖和克隆形成（P<0.05）,同时抑制HER2、PI3K、AKT蛋白及基因的表达（P<0.05）。Quercetin可通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制GC细胞增殖;formononetin能够一定程度降低PD-1在T淋巴细胞的表达,提高细胞上清液中细胞因子（IFN-γ/IL-2）的表达量,提高PI3K、AKT、p-zap70（T细胞受体相关蛋白激酶70,Zeta chain of T cell receptor associated protein kinase 70）等蛋白的表达（P<0.05）,解除PD-L1导致的T淋巴细胞功能抑制,是通过阻断PD-1/PD-L1信号通路及活化下游PI3K/AKT信号通路实现的。4.靶向HER2和PD-L1的中药小分子配伍干预GC细胞与T淋巴细胞共培养体系,结果显示formononetin、quercetin以及formononetin和quercetin配伍干预能够解除T淋巴细胞增殖抑制、减少T淋巴细胞凋亡、提高细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、降低PD-1在T淋巴细胞的表达（P<0.05）,并抑制GC细胞增殖（P<0.05）、促进GC细胞凋亡、降低靶蛋白（HER2/PD-L1）在GC细胞的表达,且中药小分子配伍干预效果更好,表明中药小分子配伍干预可以提高共培养体系中的T淋巴细胞活性并且抑制胃癌MKN-45细胞增殖。研究结论:1.分子对接结果从大数据角度初步表明归芪白术方的药效物质基础中既具有可以与促进肿瘤细胞增殖靶蛋白HER2结合的小分子成分,也具有与抑制淋巴细胞活性靶蛋白PD-L1结合的小分子成分,通过“多点显效,协同增效”的功效特点,在阻断HER2抑制肿瘤细胞增殖的同时干预PD-L1通路促进免疫细胞活性;2.细胞生物学研究揭示了归芪白术方“多点显效,协同增效”促进免疫活性并抑制肿瘤的物质基础及健脾化瘀法治疗GC的作用机制;3.揭示中药归芪白术方通过健脾化瘀法治疗胃癌的科学内涵,为归芪白术方的有效性提供更具体的化学、生物信息学支撑,为归芪白术方的开发与转化提供依据,同时为中药复方的现代化研究提供方法学参考。
张明霞[8]（2021）在《辐射肝癌细胞的外泌体诱导肿瘤细胞DNA损伤，增强树突状细胞介导的抗肿瘤免疫》文中提出研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）位列全球第四大癌症死亡病因,每年死亡人数约80万。肝癌的治疗策略包括手术、消融、动脉导向、放射治疗、靶向药物治疗等,但总体治疗疗效欠佳,5年总生存率仅为18%,复发率可以达到70%。因此,寻找新的肝癌治疗方法极为必要。随着放射治疗及免疫治疗的迅速进展,放射治疗联合免疫治疗有可能进一步提高HCC的治疗效果。放疗作为肿瘤经典治疗手段之一,在肝细胞癌的适用范围越来越大,临床广泛应用于早期肝细胞癌的根治性放疗及晚期肝细胞癌姑息性放疗。肿瘤放射治疗的临床疗效主要归因于电离辐射的直接或间接诱导DNA损伤而诱导辐射野内细胞死亡。越来越多的证据表明,辐射野附近或远离辐射野的未辐射细胞也发生了与辐射细胞相同的生物学反应,随后发现受辐射的肿瘤细胞可以释放信号分子,影响未辐射细胞的生物学效应。辐射诱导的旁观者效应（Radiation-induced bystander effect,RIBE）是一种辐射生物效应,它从受辐射的细胞传播到邻近未受辐射的细胞,导致未辐射肿瘤细胞增殖改变以及亚细胞结构DNA损伤等生物学变化。RIBE研究大多集中在未辐射的正常细胞的遗传毒性事件,随着靶向部分体积肿瘤的新型非常规放射治疗方法的使用,局部非靶向肿瘤细胞的放射生物学反应作为RIBE的一种形式越来越受到关注。辐射诱导的远端效应（Radiation-induced bystander effect,RIAE）是一种局部辐射诱导的全身效应,局部辐射后能够驱动未辐射的、辐射野之外的远处的肿瘤病变的退缩。RIAE是辐射野外远距离的转移部位通过免疫原性反应介导的全身效应。目前的研究观点普遍接受放疗具有免疫刺激作用,但肿瘤细胞接受放疗后,如何诱发肿瘤细胞的免疫原性增加,如何与免疫效应细胞作用引发有效的抗肿瘤免疫反应仍需进一步阐明。而放疗的剂量和不同的分割方案也是影响辐射肿瘤细胞与未辐射肿瘤细胞之间旁观者效应以及辐射肿瘤细胞免疫刺激效应的可变因素,也需要在未来的研究中不断优化。外泌体（exosomes）是由各种细胞分泌的内体来源的膜外囊泡,包含DNA,RNA（信使RNA（messenger RNAs,mRNAs）,微小RNA（micro RNAs,miRNAs）,和长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNAs））,蛋白及脂质成分。其在细胞间通讯的媒介作用对于肿瘤细胞尤其重要。一些研究证实辐射肿瘤细胞来源外泌体可以通过多种机制免疫刺激发挥抗肿瘤作用。其中辐射影响外泌体的分泌及组成,包括外泌体中差异表达的蛋白质参与的转录、翻译、细胞分裂和细胞信号转导,及辐射细胞来源的外泌体中miRNA、脂质代谢等的变化可能是其发挥抑癌作用的因素。辐射肿瘤细胞来源的外泌体有可能直接影响未辐射肿瘤细胞生物学效应。研究表明DCs功能受损可能是肝癌免疫逃逸的重要原因,基于DCs的治疗旨在提高针对肝肿瘤细胞的特异性免疫。肿瘤DCs疫苗是基于增加特异性细胞毒性T淋巴细胞或NK细胞等免疫细胞,增强肿瘤特异性抗肿瘤免疫反应而设计的一种免疫治疗。DCs疫苗的抗原负载方式多种多样,对于能否诱导有效的抗肿瘤作用起着关键作用。随着基础和临床研究的不断深入,DCs疫苗的设计和制备也在进一步优化,以期最大限度地发挥其免疫诱导和调节抗肿瘤作用。常见的有包含完整的HCC抗原的肿瘤细胞裂解物或肝肿瘤细胞来源的外泌体与DCs共孵育获得的DCs疫苗,转染特异性肿瘤抗原腺病毒的DCs疫苗等。肿瘤细胞来源的外泌体比肿瘤细胞裂解物更好的激活DCs,诱导有效的抗肿瘤作用。辐射改变了肿瘤细胞外泌体的分泌及组成,辐射肿瘤细胞来源的外泌体可能比未辐射肿瘤细胞来源的外泌体具有更好的激活作用,诱导更有效的抗肿瘤作用。目的本研究的目的是确定特定分割剂量模式辐射肝癌细胞的外泌体对未辐射肝癌细胞的直接作用,以及特定分割剂量模式辐射肝癌细胞的外泌体对DCs的影响,然后是否能够在体外刺激T淋巴细胞生长、体内激活适应性抗肿瘤免疫,进而增强抗肿瘤效应。方法选择ExoQuick试剂盒提取外泌体,并通过透射电子显微镜观察外泌体形态和大小及Western blotting检测外泌体表面生物标志蛋白CD63,TSG101来鉴定外泌体。探讨特定分割剂量模式辐射肝癌细胞的外泌体对未辐射肝癌细胞的直接作用:CCK8法和实时无标记动态细胞分析技术（real-time cell assay,RTCA）检测辐射细胞外泌体对肝癌细胞的增殖作用;免疫荧光法检测辐射细胞外泌体诱导肝癌细胞DNA损伤标记P53结合蛋白1（p53-binding protein 1,53BP1）。探讨特定分割剂量模式辐射肝癌细胞的外泌体介导的抗肿瘤免疫:特定分割剂量辐射肝癌细胞的外泌体与DC2.4共培养,流式细胞仪分析DC2.4表型。并用辐射肝癌细胞的外泌体与骨髓诱导来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）共培养分析BMDCs表型进一步验证辐射肝癌细胞的外泌体对DCs的影响。活化的DC2.4与小鼠脾脏T淋巴细胞共培养,CFSE染色,体外检测T淋巴细胞增殖。使用hepa1-6细胞系,荷瘤瘤块和荷瘤传代细胞皮下接种同源C57BL/6小鼠荷瘤,检测荷瘤小鼠肿瘤生长情况,建立hepa1-6细胞株C57BL/6小鼠皮下荷瘤模型。经皮下荷瘤C57BL/6小鼠尾静脉按分组注射PBS,未成熟DC（i DC）,与未辐射Hepa1-6细胞外泌体共孵育的DC（DCexo-con）,与辐射Hepa1-6细胞外泌体共孵育的DC（DCexo-ir）,每周1次,每次3×106DCs,共3次,及同等体积的PBS,检测荷瘤鼠肿瘤生长情况,末次干预后5-7天采集小鼠眼球血,处死小鼠,摘取脾脏,淋巴结,肿瘤组织,分别进行外周血,脾脏,淋巴结及肿瘤组织的免疫细胞分离,流式细胞检测T淋巴细胞亚型,了解各处理组小鼠体内免疫情况。结果8Gy×3f辐射Hepa1-6细胞后继续培养48h细胞增殖明显减慢;典型的外泌体形态:杯碟状双层膜结构,颗粒大小（40-160 nm）,外泌体蛋白标志物证明了外泌体的存在;辐射增加肿瘤细胞外泌体的分泌,且外泌体蛋白定量与辐射剂量相关。辐射肝癌细胞来源外泌体对未辐射肝癌细胞的旁观者效应,单次常规分割剂量2Gy辐射HepG2细胞分泌的外泌体未促进或延缓旁观者未辐照HepG2细胞的增殖,辐射HepG2细胞的外泌体诱导未辐照HepG2细胞的旁观者DNA损伤。辐射肝癌细胞来源的外泌体通过促进DCs成熟增强T淋巴细胞免疫及抗肿瘤反应。大分割剂量8Gy×3f辐射Hepa1-6细胞的外泌体促进DCs成熟时表面共刺激分子的表达,并增强DC2.4促进T淋巴细胞增殖的能力;建立了C57BL/6小鼠Hepa1-6皮下荷瘤模型,辐射Hepa1-6细胞外泌体刺激的DC2.4经尾静脉注射Hepa1-6皮下荷瘤C57BL/6小鼠体内,增加了小鼠血液,脾脏,腹股沟淋巴结及肿瘤内CD8+T淋巴细胞数量,增强了小鼠抗肿瘤免疫反应,抑制了肿瘤生长。结论上述研究显示辐射肝癌细胞的外泌体具有生物学活性,参与了辐射肝肿瘤细胞向未辐射肝肿瘤细胞传递DNA损伤,并通过抗原递呈细胞和T淋巴细胞抑制了体内未辐射肝肿瘤细胞的生长,这一结果为肝肿瘤辐射非靶效应提供了可能的机制,有助于寻找安全有效的肝癌治疗方法。
尹良伟[9]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中研究指明自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
买为丽旦·衣明江[10]（2021）在《纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究》文中研究指明目的:肝细胞肝癌（HCC）是目前严重危害人类生命健康的重大疾病,是全球最常见的恶性肿瘤之一。新型纳秒脉冲消融（ns PEF）在激活抗肿瘤免疫方面的特色优势逐渐成为肿瘤免疫治疗的研究热点,但其作用机制不明确。目前PD-1抗体治疗是公认的抗肿瘤免疫治疗方法。由此,本研究探讨ns PEF消融在肝细胞肝癌免疫激活效应中的作用机制,并与PD-1抗体治疗作对比,为ns PEF免疫疗法的临床应用提供理论基础。方法:（1）培养及传代用荧光素酶标记的Hepa1-6肝癌细胞株;通过C57BL/6J小鼠肝脏注射Hepa1-6肝癌细胞株建立肝癌移植瘤模型;将24只原位移植瘤模型小鼠分为三组:ns PEF组、PD-1抗体治疗组和对照组,对ns PEF组小鼠进行一次ns PEF消融处理,消融仪物理参数为:脉冲宽度300ns、电压20kv/cm、频率4Hz、脉冲1000次;对PD-1抗体治疗组小鼠腹腔注射PD-1抗体,间隔3天,共3次给药;治疗结束后处死小鼠,取血分离血清、制备肿瘤组织单细胞悬液,通过流式细胞术检测肿瘤组织中CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B、NK细胞比例;采用CBA技术检测外周血Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-α）和Th2（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）类细胞因子浓度;通过统计学方法分析肿瘤局部免疫细胞比例和外周血细胞因子浓度的差异。（2）通过DIA定量蛋白质组学技术筛选ns PEF组和PD-1抗体治疗组差异表达的蛋白质;采用生物信息学方法鉴定出与免疫相关的重要差异蛋白。（3）通过基于多重免疫组化的PE Vectra全光谱采集技术,同时标记肿瘤局部T、B、NK细胞和差异蛋白,通过Inform定量分析软件计算各指标表达密度及差异蛋白与T、B、NK细胞特异性指标的共定位关系;通过统计学方法分析免疫细胞和差异蛋白表达密度在各组间的差异及相关性。结果:（1）ns PEF组和PD-1抗体治疗组CD3+T、CD4+T、B、NK细胞比例均明显高于对照组;ns PEF组CD4+/CD8+比值明显高于对照组,PD-1抗体治疗组CD8+T细胞比例明显高于对照组;ns PEF组Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度均明显高于对照组,PD-1抗体治疗组IL-2浓度明显高于对照组;ns PEF组Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10浓度均明显高于对照组,PD-1抗体治疗组IL-4、IL-5、IL-10浓度明显高于对照组。（2）DIA质谱分析筛选出ns PEF组和PD-1抗体治疗组差异表达蛋白分别共有181和763个,其中与免疫病理改变相关者分别为21和35个;结合文献报道和本研究研究方向,ns PEF组差异蛋白LXN、GRN、TGF-β1、ELNE选为进一步研究对象,其中TGF-β1、ELNE是ns PEF组和PD-1抗体治疗组共同差异蛋白。（3）LXN、GRN、TGF-β1、ELNE与T、B、NK细胞特异性指标均有不同程度的共定位,其中LXN在B细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性;GRN在NK细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性;TGF-β1在T细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性,ELNE在T细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性。结论:ns PEF消融可引起肿瘤微环境中免疫细胞的大量浸润,及外周血多种细胞因子的改变,表明ns PEF消融治疗具有调节抗肿瘤免疫、增强体液免疫以及免疫杀伤功能的作用;ns PEF消融可以引起肿瘤局部多种蛋白质的差异表达,其中与免疫微环境介导的肿瘤侵袭、转移相关蛋白主要有LXN、GRN、TGF-β1、ELNE,这些差异蛋白作为调节ns PEF消融免疫效应的重要因子,可能通过调控T、B、NK细胞激活抗肿瘤免疫;TGF-β1、ELNE是ns PEF组和PD-1抗体治疗组共同的差异表达蛋白,提示二者可能是肝癌免疫治疗过程中的重要调控因子。
二、抗原激活的T淋巴细胞凋亡的分子机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗原激活的T淋巴细胞凋亡的分子机制（论文提纲范文）
（1）基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胸腺肽的研究进展 |
| 1.1.1 胸腺肽概述 |
| 1.1.2 胸腺肽作用研究 |
| 1.2 免疫系统的研究进展 |
| 1.2.1 免疫系统的组成 |
| 1.2.2 免疫系统的功能 |
| 1.2.3 免疫系统影响因素 |
| 1.2.4 免疫系统与肿瘤发生发展的关系 |
| 1.2.5 造血与免疫系统 |
| 1.3 免疫治疗在结直肠癌治疗中的研究进展 |
| 1.3.1 肿瘤免疫治疗 |
| 1.3.2 免疫治疗在结直肠癌治疗中的应用 |
| 1.4 化疗引起的造血功能障碍研究进展 |
| 1.5 立题背景及意义 |
| 第2章 小牛胸腺肽成分分析研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CTP分子量测定 |
| 2.3.2 CTP中氨基酸含量的测定 |
| 2.3.3 CTP中核苷酸含量的测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 分子量测定结果 |
| 2.4.2 氨基酸含量测定结果 |
| 2.4.3 核苷酸含量测定结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 试剂盒和抗体信息 |
| 3.2.4 实验细胞及动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫低下小鼠模型的构建及分组给药 |
| 3.3.2 小鼠样品采集及脏器指数检测 |
| 3.3.3 NK细胞杀伤活性及淋巴细胞转化活性 |
| 3.3.4 小鼠肝脏、脾脏、肾脏病理学检测 |
| 3.3.5 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.6 APC小鼠分组给药 |
| 3.3.7 小鼠样品采集及脏器指数、肠道指数检测 |
| 3.3.8 小鼠外周血有核细胞制备、染色及流式测定 |
| 3.3.9 小鼠肠道菌群检测及分析 |
| 3.3.10 小鼠结直肠及脏器组织病理学检查 |
| 3.3.11 小鼠脾脏和肿瘤组织中相关蛋白免疫组化检测 |
| 3.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.13 Western blot分析 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CTP对免疫低下小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.2 CTP对免疫低下小鼠NK细胞杀伤活性的影响 |
| 3.4.3 CTP对免疫低下小鼠淋巴细胞转化活性的影响 |
| 3.4.4 CTP对免疫低下小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.5 CTP对免疫低下小鼠免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.6 CTP对 APC小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.7 CTP对 APC小鼠结直肠肿瘤和肠道指数的影响 |
| 3.4.8 CTP对 APC小鼠肿瘤组织病理学的影响 |
| 3.4.9 CTP对 APC小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.10 CTP对 APC小鼠外周血中免疫细胞的影响 |
| 3.4.11 CTP对 APC小鼠脾脏和结直肠肿瘤中免疫相关蛋白的影响 |
| 3.4.12 CTP对 APC小鼠血清和结肠中免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.13 CTP对 APC小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
| 3.4.14 小鼠肠道菌群Alpha多样性分析 |
| 3.4.15 小鼠肠道菌群Beta多样性分析 |
| 3.4.16 小鼠肠道菌群差异性分析 |
| 3.4.17 CTP对 APC小鼠肿瘤组织和脾脏中相关蛋白表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小牛胸腺肽促造血功能活性的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 试剂盒及抗体信息 |
| 4.2.4 实验细胞及动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 K562 细胞和CHRF细胞的铺板及CTP给药 |
| 4.3.2 细胞活性检测 |
| 4.3.3 细胞凋亡检测 |
| 4.3.4 K562 细胞联苯胺染色 |
| 4.3.5 Western blot分析 |
| 4.3.6 造血功能障碍小鼠模型的构建及CTP给药 |
| 4.3.7 样品采集及脏器指数检测 |
| 4.3.8 外周血细胞计数 |
| 4.3.9 小鼠骨髓有核细胞制备,染色及流式细胞术测定 |
| 4.3.10 小鼠骨髓及脏器组织病理学检测 |
| 4.3.11 蛋白质组学分析筛选细胞因子 |
| 4.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 4.3.13 Western blot分析 |
| 4.3.14 小鼠骨髓有核细胞制备及给药 |
| 4.3.15 Western blot分析 |
| 4.3.16 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞活性的影响 |
| 4.4.2 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 CTP对K562 细胞分化能力的影响 |
| 4.4.4 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞增殖分化相关蛋白的影响 |
| 4.4.5 CTP对造血功能障碍小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 4.4.6 CTP对造血功能障碍小鼠外周血细胞的影响 |
| 4.4.7 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓细胞的影响 |
| 4.4.8 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓和脏器组织病理学的影响 |
| 4.4.9 CTP对造血功能障碍小鼠细胞因子的影响 |
| 4.4.10 CTP对造血功能障碍小鼠脾脏中相关通路蛋白的影响 |
| 4.4.11 CTP对小鼠原代骨髓细胞中相关通路蛋白的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究（论文提纲范文）
| 武汉生物制品研究所博士学位论文创新点概述 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1. 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 2. 第一章60周岁及以上老年人群免疫QIVs前后外周全血Total mRNA表达谱研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3. 第二章60周岁及以上老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4. 第三章 老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5. 全文创新性总结 |
| 6. 文献综述--老年人群流感病毒疫苗有效性评价所面临的挑战 |
| 6.1 影响流感病毒疫苗有效性评价的混杂因素 |
| 6.2 流感病毒免疫史对流感病毒疫苗有效性评价的影响 |
| 6.3 流行病学研究提升针对老年人群开发下一代流感病毒疫苗 |
| 6.4 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录a. 受试者入选、排除标准及提前终止实验标准 |
| 附录b. 实验组和对照组QIVs疫苗株 |
| 附录c. 63 份老年人外周全血转录组测序原始数据Raw-Data存储于GEO公共数据库 |
| 附录d. Supplementary Materials (Figure S and Table S) |
| Figure S |
| Table S |
| References |
（3）力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 癌症的免疫特性 |
| 1.1.1 癌症的发展 |
| 1.1.2 免疫系统 |
| 1.1.3 肿瘤免疫系统 |
| 1.1.4 免疫编辑 |
| 1.2 细胞力学特性 |
| 1.2.1 细胞基质的刚度对肿瘤的影响 |
| 1.2.2 细胞间粘附力对肿瘤的影响 |
| 1.3 肿瘤免疫反应建模 |
| 1.3.1 肿瘤的数学模型 |
| 1.3.2 肿瘤与免疫作用的数学模型 |
| 1.4 本章小结及主要研究内容 |
| 第2章 基质刚度调节细胞与基质间的黏附对肿瘤迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细胞-ECM黏附的影响 |
| 2.3.2 细胞外基质刚度变化改变细胞-细胞外基质黏附对肿瘤细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 调节T细胞-DC间黏附对肿瘤杀伤的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 T 细胞的免疫特性 |
| 3.3.2 CTLA-4可调节T细胞-DC粘附力大小 |
| 3.3.3 CTLA-4影响T细胞的增殖 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 肿瘤生长-免疫系统模型代码 |
| 附录1 Main Python Script部分 |
| 附录2 XML Script部分 |
| 附录3 Python部分 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化特征及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象、纳入及排除标准 |
| 2.1.1 纳入标准 |
| 2.1.2 排除标准 |
| 2.1.3 免疫状态分期 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 观察指标 |
| 2.2.2 标本收集 |
| 2.2.3 T淋巴细胞亚群检测方法 |
| 2.2.4 乙肝五项定量检测方法 |
| 2.2.5 生化指标检测方法 |
| 2.2.6 HBV-DNA检测方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 研究对象的基本临床资料 |
| 3.1.1 不同免疫状态下HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群水平特征 |
| 3.1.2 T淋巴细胞亚群对免疫状态的评估效能 |
| 3.2 HBV-DNA载量对外周血T淋巴细胞亚群水平影响 |
| 3.3 不同HBsAg定量水平下HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群分布特点 |
| 3.4 T淋巴细胞亚群与各临床指标之间的相关性分析 |
| 3.5 T淋巴细胞亚群对打破免疫耐受的评估效能 |
| 3.6 T淋巴细胞亚群对发生e抗原血清学转换的评估效能 |
| 3.7 抗病毒治疗对HBV感染患者T淋巴细胞亚群的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 展望与不足 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 CD8+T淋巴细胞与HBV感染关系的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分: 肺腺癌中ILT4过表达与免疫抑制性T细胞亚群浸润及患者的不良预后相关 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 肿瘤源性ILT4通过抑制T细胞增殖及诱导T细胞凋亡介导肿瘤免疫逃逸 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌与免疫抑制细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（6）小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 不同年龄组小鼠免疫器官组织学变化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 样本采集 |
| 1.2.2 石蜡切片制备与HE染色 |
| 1.2.3 免疫组化 |
| 1.2.4 电镜检测 |
| 1.2.5 ELISA检测 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫器官重量及指数变化 |
| 2.2 免疫器官组织学变化 |
| 2.2.1 胸腺 |
| 2.2.1.1 HE染色 |
| 2.2.1.2 免疫组化 |
| 2.2.1.3 超微结构观察 |
| 2.2.2 脾脏 |
| 2.2.2.1 HE染色 |
| 2.2.2.2 免疫组化 |
| 2.2.2.3 超微结构观察 |
| 2.3 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠胸腺组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胸腺转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据分析 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 胸腺蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 差异表达蛋白验证 |
| 2.4 转录组学与蛋白质组学关联性分析 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠脾脏组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年龄组脾脏转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据及质量 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 脾脏蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 物信息学分析 |
| 2.3 验证差异表达蛋白 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 文献综述 胸腺增龄性变化以及与疾病相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间学术成果 |
| 附录 |
（7）基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 缩略词表 |
| 第一章:基于分子对接虚拟筛选归芪白术方中可与胃癌治疗靶点结合的小分子成分 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验软件和数据库 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器 |
| 1.1.3 胃癌靶向治疗靶点筛选 |
| 1.1.4 归芪白术方中药小分子结构库构建及类药性分析 |
| 1.1.5 靶蛋白活性位点 |
| 1.1.6 分子对接 |
| 1.1.7 微量热泳动实验测定虚拟筛选获得成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.1.8 分子动力学模拟和结合自由能计算 |
| 1.1.9 靶向成分的毒性预测 |
| 1.1.10 靶向HER2的小分子成分对HER2激酶活性的检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 胃癌治疗靶点筛选 |
| 1.2.2 归芪白术方小分子成分类药性分析 |
| 1.2.3 靶蛋白晶体结构确定 |
| 1.2.4 分子对接 |
| 1.2.5 MST测定虚拟筛选获得小分子成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.2.6 分子动力学模拟和结合自由能计算结果 |
| 1.2.7 代表性成分quercetin、daidzein、formononetin和 isorhamnetin毒性预测 |
| 1.2.8 Quercetin和daidzein对HER2激酶活性影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 HER2与PD-L1在胃癌表达的相关性分析 |
| 1.3.2 归芪白术方治疗胃癌的物质基础分析 |
| 1.3.3 分子对接-MST-分子动力学模拟-HER2激酶活性检测结果分析 |
| 1.4 小结 |
| 第二章:归芪白术方代表性中药小分子成分对胃癌细胞和T淋巴细胞的作用及机制 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein抗胃癌细胞增殖实验 |
| 2.2.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.2.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌细胞的干预作用 |
| 2.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.2.5 抑制PD-L1的代表性成分formononetin和isorhamnetin对PD-L1干预T细胞的作用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对不同胃癌细胞的抗增殖作用 |
| 2.3.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.3.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌MKN-45细胞干预作用 |
| 2.3.4 T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.3.5 PD-L1刺激T淋巴细胞及干预实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 靶向HER2的代表性成分quercettin、daidzein抑制胃癌细胞增殖结果分析 |
| 2.4.2 代表性成分Formononetin、isorhamnetin对T淋巴细胞活性的恢复作用 |
| 2.4.3 健脾扶正、化瘀祛邪治疗胃癌的中医认识 |
| 2.5 小结 |
| 第三章:归芪白术方体外有效的代表性中药小分子对胃癌细胞和T淋巴细胞共培养体系的调节作用 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌MKN-45和T淋巴细胞共培养体系构建 |
| 3.2.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预T淋巴细胞与胃癌MKN-45 细胞共培养体系 |
| 3.2.3 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞形态学观察和T淋巴细胞、胃癌MKN-45 细胞增殖情况 |
| 3.2.4 流式细胞术检测体外有效的代表性成分quercetin和 formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞凋亡情况 |
| 3.2.5 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞PD-1 表达情况 |
| 3.2.6 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞上清液中细胞因子表达情况 |
| 3.2.7 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞相关蛋白表达情况 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌MKN-45细胞与T淋巴细胞共培养体系的建立 |
| 3.3.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 胃癌MKN-45 细胞与T淋巴细胞共培养体系构建结果分析 |
| 3.4.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 论文综述 HER2、PD-L1生物学特性及在胃癌的相关性和应用研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）辐射肝癌细胞的外泌体诱导肿瘤细胞DNA损伤，增强树突状细胞介导的抗肿瘤免疫（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 辐射旁观者效应和辐射远端效应 |
| 1.2 肝癌的免疫耐受性微环境是肝癌免疫治疗的理论基础 |
| 1.3 辐射在抗肿瘤免疫反应中的作用 |
| 1.4 辐射肿瘤细胞来源的外泌体(Tumor-derivedexosomes,TEXs)在抗肿瘤反应中发挥重要作用 |
| 1.4.1 辐射改变肿瘤细胞来源外泌体的分泌和组成 |
| 1.4.2 辐射肿瘤细胞来源的外泌体诱导未辐射肿瘤细胞的旁观者效应 |
| 1.4.3 辐射肿瘤细胞来源的外泌体在抗肿瘤免疫中的作用 |
| 1.5 辐射射线、辐射剂量及分割模式是影响RIBE、辐射免疫调节作用的关键因素 |
| 1.6 本研究的目的与方案 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究方案 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂及器材 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验细胞系 |
| 2.2.2 实验小鼠 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 PCR检测支原体污染 |
| 2.3.3 超速离心制备无外泌体血清 |
| 2.3.4 X射线深部治疗机辐射细胞 |
| 2.3.5 肿瘤细胞外泌体(试剂盒法)提取 |
| 2.3.6 透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM) |
| 2.3.7 BCA蛋白定量 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.3.9 CCK8检测细胞增殖 |
| 2.3.10 实时无标记动态细胞分析技术(real-time cell assay,RTCA) |
| 2.3.11 免疫荧光法检测53BP1 |
| 2.3.12 BMDCs诱导培养 |
| 2.3.13 DCs表型活化检测 |
| 2.3.14 CFSE染色 |
| 2.3.15 DCs体外抗原提呈实验 |
| 2.3.16 C57BL/6小鼠皮下实体瘤模型的构建 |
| 2.3.17 小鼠尾静脉注射 |
| 2.3.18 小鼠摘眼球采血 |
| 2.3.19 外周血免疫细胞分离 |
| 2.3.20 全自动组织研磨仪 |
| 2.3.21 脾脏淋巴细胞分离 |
| 2.3.22 腹股沟淋巴结免疫细胞分离 |
| 2.3.23 肿瘤浸润免疫细胞分离 |
| 2.3.24 流式检测T淋巴细胞亚型 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肝癌细胞外泌体提取,鉴定及蛋白定量分析 |
| 3.1.1 辐射对肝癌细胞形态影响 |
| 3.1.2 辐射与未辐射肝癌细胞的外泌体鉴定 |
| 3.1.3 外泌体蛋白定量 |
| 3.2 辐射HepG2细胞外泌体对未辐射HepG2细胞的旁观者效应 |
| 3.2.1 辐射HepG2细胞外泌体对未辐射HepG2细胞增殖的影响 |
| 3.2.2 辐射HepG2细胞的外泌体诱导未辐射HepG2细胞的DNA损伤 |
| 3.3 辐射Hepa1-6细胞的外泌体的免疫原性 |
| 3.3.1 Hepa1-6细胞的外泌体促进DCs成熟时表面共刺激分子的表达 |
| 3.3.2 Hepa1-6细胞外泌体增强DCs促进T淋巴细胞增殖的能力 |
| 3.3.3 不同接种方法建立C57BL/6小鼠皮下HCC荷瘤模型 |
| 3.3.4 辐射Hepa1-6细胞外泌体增强DCs介导的C57BL/6小鼠抗肿瘤反应 |
| 4 讨论 |
| 4.1 外泌体分离及鉴定 |
| 4.2 辐射HepG2细胞的外泌体向未辐射HepG2细胞传递DNA损伤 |
| 4.3 C57BL/6小鼠Hepa1-6皮下荷瘤模型的建立 |
| 4.4 辐射Hepa1-6细胞的外泌体的免疫原性 |
| 4.5 进一步研究需要解决的问题 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 外泌体在辐射诱导旁观者效应中的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（10）纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 纳秒脉冲消融小鼠肝癌免疫学效应研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 纳秒脉冲消融小鼠肝癌免疫相关差异表达蛋白的筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 差异蛋白LXN、GRN、TGF-β1、ELNE与免疫细胞的相关性分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 纳秒脉冲消融在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
四、抗原激活的T淋巴细胞凋亡的分子机制（论文参考文献）
- [1]基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究[D]. 李兰洲. 吉林大学, 2021(01)
- [2]老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究[D]. 杨景. 武汉生物制品研究所, 2021(01)
- [3]力学特性对肿瘤免疫响应影响的建模分析[D]. 张颖. 太原理工大学, 2021(01)
- [4]慢性HBV感染患者外周血T淋巴细胞亚群变化特征及临床意义[D]. 徐清浪. 南昌大学, 2021(01)
- [5]ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸[D]. 李青. 山东大学, 2021(10)
- [6]小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究[D]. 张丽. 重庆医科大学, 2021(01)
- [7]基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响[D]. 李玲. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [8]辐射肝癌细胞的外泌体诱导肿瘤细胞DNA损伤，增强树突状细胞介导的抗肿瘤免疫[D]. 张明霞. 安徽医科大学, 2021(01)
- [9]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [10]纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究[D]. 买为丽旦·衣明江. 新疆医科大学, 2021(08)