一、细胞周期蛋白E和p27kip1在膀胱癌中的表达及意义（论文文献综述）
白璐[1]（2021）在《EGCG通过调节P27kip1、PI3K/AKT蛋白抑制前列腺癌PC-3细胞增殖》文中研究表明目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作用于前列腺癌PC-3细胞后,对PC-3细胞增殖及细胞周期的影响,进一步讨论EGCG对前列腺癌PC-3细胞增殖影响下可能存在的作用机制。方法:通过CCK8法选择最佳的药物浓度,了解EGCG对PC-3细胞增殖的抑制情况,之后使用选择出的最佳梯度浓度的EGCG（即0、12.5、25、50、100μg/ml）对前列腺癌PC-3细胞进行干预;通过转录组基因测序汇总EGCG在抑制前列腺癌PC-3细胞中转录组基因的表达及差异表达水平,挑选基因并进一步验证;通过免疫荧光法对P27kip1蛋白和PI3K/AKT蛋白进行半定量测定;通过Westernblot法分析对照组与EGCG实验组对P27kip1、PI3K/AKT等影响因子表达的影响;通过Attune Nx T流式细胞仪检测对照组和EGCG实验组对前列腺癌PC-3细胞细胞周期的影响。结果:（1）CCK8结果显示:EGCG抑制前列腺癌PC-3细胞呈现剂量依赖性,PC-3细胞的抑制率分别为（5.3±0.33）%、（12±1.53）%、（26±2.31）%、（62±0.33）%（如图1所示）,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）转录组基因测序结果分析显示:对照组和EGCG实验组中P27kip1基因表达量FPKM分别为:7.284±0.954、7.520±0.603、7.032±0.0972、8.357±0.801、13.480±0.320,差异具有统计学意义,F=53.936,P<0.05,FC>1.5,其中100μg/ml EGCG实验组与其它各组间差异具有统计学意义（P<0.001）。EGCG100μg/ml与对照组、其余EGCG实验组间的FC值均>1.5。通过对组间PI3K的基因PIK3CD的表达量（FPKM）及差异情况进行分析,得出以下结果:对照组和EGCG实验组的PIK3CD的基因表达量FPKM分别为:1.750±0.060、1.888±0.194、1.817±0.122、1.473±0.099、0.704±0.016,差异具有统计学意义,F=53.366,P<0.05。100或50μg/ml EGCG实验组与其它各组间差异具有统计学意义,P<0.05。EGCG100μg/ml与对照组、其余各浓度EGCG实验组间的FC值均<0.5。（3）免疫荧光的结果显示:PI3K在细胞质内表达而且其表达水平随EGCG浓度增加而降低。AKT在细胞质内表达且表达水平不随EGCG浓度的变化而变化。P27kip1在细胞质及核内均有表达且随EGCG浓度的增加表达水平及核内表达水平均增加。（4）Westernblot结果显示:对照组和EGCG实验组内的PI3K前酶光密度值比值（经β-actin校正）为:2.000±0.324、1.752±0.204、1.728±0.117、1.520±0.070、1.133±0.184（如图7B所示）,F值为7.884,P<0.01,提示不同浓度EGCG对PC-3细胞PI3K蛋白表达的抑制作用有差异。组间两两比较结果可知,除对照组与12.5μg/ml EGCG实验组、25μg/ml和50μg/ml EGCG实验组之间P>0.05,其余各组间P<0.05。对照组和EGCG实验组内的P27kip1前酶光密度值比值（经β-actin校正）为:0.970±0.113、1.152±0.160、1.519±0.141、1.634±0.094、1.713±0.092（如图10C所示）,F值为20.489,P<0.01。AKT的蛋白表达水平不随EGCG浓度变化。（5）流式细胞术结果表明:对照组及EGCG各实验组细胞S期所占比例分别为（27.21±2.43）%、（14.78±1.41）%、（12.04±0.66）%、（10.76±0.74）%、（9.47±0.18）%（如图11B所示）,F=86.84,P<0.01。EGCG可抑制前列腺PC-3细胞停滞在S期,PC-3细胞在不同剂量EGCG溶液干预后,其细胞S期比率明显增加。结论:EGCG抑制PC-3细胞的增殖的作用机制可能与上调P27kip1表达水平及核内表达和下调PI3K/AKT蛋白途径有关,并抑制PC-3细胞周期的S期。
陈晓文[2]（2021）在《Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究》文中研究指明研究背景:慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是临床常见的血液系统恶性肿瘤,主要特征为骨髓造血生成大量未成熟的白细胞,其发病率高达新发成人白血病的20%。BCR-ABL融合基因目前被认为是CML发病的重要原因和基本特征,该融合基因表达可生成具备组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL嵌合蛋白。在CML的临床治疗中,特异性BCR-ABL抑制剂,如酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）可将患者生存率显着提高,已被临床广泛应用。伊马替尼是（IM）一种通过阻断BCR-ABL蛋白的非活性构象的TKI,首次应用于CML的治疗,疗效显着,毒性较低。但仍有大量CML患者对伊马替尼不敏感或通过多种细胞机制产生耐药性。因此,在CML进展过程中筛选出有效的治疗靶点是非常迫切的,这将有助于提高CML在TKI药物治疗中的效果。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是由人Skp2基因编码的E3泛素连接酶。Skp2是一种C-Myc直接靶基因,在细胞周期进程的调控中起重要作用,多种恶性肿瘤中常发现有其表达上调。在血清缺乏的细胞中,Skp2过表达从而诱导细胞周期素A积累和p27磷酸化依赖性的降解从而促进细胞进入S期。Skp2还参与其他细胞周期调节蛋白的泛素化,包括细胞周期蛋白E和转录因子E2F1。目前国内外多项研究证实Skp2与许多实体肿瘤的化疗耐药性有关。如Skp2通过p27-CDKs-E2F1途径正向调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficient 2,MAD2）的表达,通过抑制Skp2可以增强肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但Skp2在CML中的发生和抗肿瘤耐药中的作用尚待明确。研究目的:比较CML患者与正常对照组外周血白细胞中Skp2的蛋白水平与m RNA水平。探究Skp2的异常表达在K562细胞中的作用机制:在K562细胞中稳定敲减和过表达Skp2基因,检测细胞数量变化和细胞的增殖能力变化。在K562细胞中分别敲减和过表达c AMP应答元件结合蛋白（CREB）基因,检测Skp2的m RNA水平。检测抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴后K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。研究方法:1.收集24例新诊断的CML患者（研究组）和7例健康体检者（对照组）外周血,对外周血样本进行白细胞分离。分别通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析两组样本中Skp2的m RNA水平和蛋白水平。2.人CML细胞系K562在37℃,5%的CO2条件下用的RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养。构建基于PLK0.1的sh RNA-Skp2质粒,在K562细胞中稳定敲减Skp2,用Western Blot法检测稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞中Skp2蛋白水平,验证敲减Skp2基因的效果。通过细胞计数分析,比较K562细胞在Skp2稳定敲减和未敲减情况下的细胞增殖率,对稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞用Ed U染色及Hoechst 33342染色法观察细胞核,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞的比值。在K562细胞中转染Flag-Skp2质粒,对过表达Skp2的K562细胞行Western Blot分析,采用细胞计数分析法测定过表达Skp2的K562细胞的细胞数变化,并用Ed U染色及Hoechst33342染色观察细胞形态,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞之比。3.利用Jas PAR软件对编码Skp2基因的上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在保守的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析证实CREB基因和Skp2启动子中CREB结合区（BR）的基因片段之间存在特异性结合。构建一系列含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒。将K562细胞与含有野生型或突变型Skp2启动子区的PGL3荧光素酶报告质粒以及Flag或Flag-CREB质粒共转染K562细胞,转染后取细胞溶解物,使用荧光素酶测定其转录活性,用Western Blot法验证CREB的过表达效果,同时通过q RT-PCR测定Skp2的m RNA水平。K562细胞与含有sh RNA-CREB基因或sh RNA-ctrl基因共转染,转染后行Western Blot法证实基因敲减效果,荧光素酶分析转录活性。用q RT-PCR测定CREB基因敲减前后K562细胞中Skp2 m RNA水平变化。4.用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与sh RNA-ctrl组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用二甲基亚砜或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Ly294002（10μmol/L）预处理K562细胞4 h,伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与对照组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,Western Blot分析caspase-3/7活性和PARP的裂解。K562细胞分别加用和不加Ly294002预处理再加用伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,试剂盒检测caspase-3/7活性并用Western Blot分析PARP的裂解。研究结果:1.和健康对照组相比,Skp2在CML患者中异常表达。收集24例CML患者和7例健康体检者外周血白细胞,CML样本显示Skp2的m RNA水平及蛋白水平均较健康对照组显着上调。数据表明CML患者Skp2表达上调,Skp2蛋白水平与m RNA水平呈一致性改变。2.Skp2是K562细胞增殖的关键。在K562细胞中稳定敲减Skp2基因,与对照组细胞相比,敲减了Skp2的K562细胞的细胞数量显着减少。Ed U分析显示敲减Skp2的K562细胞增殖能力显着低于对照组细胞。3.Skp2过表达影响K562细胞的增殖。与敲减基因结果相反,通过过表达Skp2基因,K562细胞数量增加。与此相关,Skp2过表达导致K562细胞中Ed U阳性细胞百分比显着增加。4.Skp2通过CREB转录调控。利用Jas PAR软件对Skp2编码基因上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析显示,CREB能和Skp2基因中CREB结合区（BR）的基因片段特异性。构建一系列包含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒,将含有WT或MUT的Skp2启动子区以及Flag或Flag-CREB的质粒共转染K562细胞,野生型CREB-BR（WT）转录活性在过表达CREB后明显升高,但突变型质粒（MUT）和p GL3空载体转录活性未见明显升高。相反,野生型CREB-BR（WT）转录活性在稳定敲减CREB基因的K562细胞中降低,同样突变型构建体（MUT）和PGL3空载体均未显示转录活性的改变。5.CREB的稳定敲减导致K562细胞中Skp2 m RNA水平显着降低。鉴于CREB的转录活性是由其第133位丝氨酸磷酸化后被活化的,我们试图评估野生型的Flag-CREB和第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对Skp2表达的影响。野生型的Flag-CREB能够上调Skp2的m RNA水平,但第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对于Skp2的m RNA水平无明显的调控作用。以上结果提示,在K562细胞中Skp2的表达在转录水平受到CREB的调控。6.抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴增加K562细胞对伊马替尼的敏感性。用伊马替尼处理（1μmol/L）CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞并观察其存活率,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后表现出细胞活力的急剧下降。7.CREB或Skp2的敲减导致伊马替尼处理的K562细胞中caspase-3/7活性的显着增加。caspase-3/7的活化是对伊马替尼治疗敏感性的响应,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后与对照组细胞药物处理后相比,caspase-3/7的活化及PARP的裂解更明显。8.PI3K/Akt信号通路在关联CREB的激活及Skp2的表达中起到特定的作用。在K562细胞中稳定敲减Akt或使用LY294002来抑制PI3K/Akt通路,结果导致伊马替尼处理的K562细胞活力显着下降,Skp2蛋白水平降低,caspase-3/7活化及PARP裂解明显增强,说明K562细胞对伊马替尼更加敏感。结论:与健康对照者相比,初治CML患者外周血白细胞中Skp2高表达,并且Skp2高表达对CML细胞增殖至关重要。从机制上讲,在K562细胞中Skp2受PI3K/Akt-CREB信号通路的转录调控。此外,稳定敲减Skp2的表达或阻断PI3K/Akt-CREB通路可显着提高K562细胞对伊马替尼的敏感性。
崔乐[3]（2021）在《PA-MSHA联合紫杉醇对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用研究》文中提出背景:三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的乳腺癌,其治疗以手术和化疗为主。而化疗药物与其他药物联合使用是一种趋势,多药联合选择不同作用机制的药物,从而在降低药物的最低有效剂量同时达到更好的临床效果,并且降低药物的毒副作用和耐药性。目的:探究铜绿假单胞菌注射液（PA-MSHA）联合紫杉醇对TNBC细胞的抑制作用及机制。方法:（1）采用CCK8法评价单药PA-MSHA、紫杉醇及两药联合对TNBC细胞增殖抑制作用。（2）采用细胞划痕实验评价PA-MSHA对TNBC细胞迁移的影响。（3）采用流式细胞分析检测PA-MSHA对TNBC细胞周期和凋亡的影响,同时比较PAMSHA、紫杉醇及两药联合对细胞凋亡的改变。（4）采用q RT-PCR及Western Blot法检测单药PA-MSHA、紫杉醇及两药联合作用TNBC细胞后对BAX、BCL-2、c-Myc、NF-κB、CIP2A表达的影响。结果:（1）CCK8结果表明,与对照组相比,PA-MSHA、紫杉醇及两药联合均可抑制TNBC细胞的增殖,且联合用药效果更强（P<0.05）。（2）划痕实验结果表明与对照组相比,实验组PA-MSHA作用于TNBC细胞24h的划痕愈合率较低（P<0.05）,明显抑制细胞迁移。（3）流式细胞仪检测结果表明在TNBC中,两药联合组细胞凋亡率较单药PA-MSHA和紫杉醇组高（P<0.05）。除此之外,PA-MSHA组TNBC细胞周期阻滞于G0/G1期。（4）q RT-PCR及Western Blot结果显示,与对照组相比,PA-MSHA、紫杉醇及联合用药BAX表达均增高,BCL-2、c-Myc、CIP2A、NF-κB表达降低（P<0.05）,且联合用药组对目标基因的下调作用更显着。结论:研究证实PA-MSHA、紫杉醇及两药联合能够有效抑制TNBC细胞的增殖、迁移,并诱导TNBC细胞的凋亡和周期阻滞,凋亡机制可能与BAX、BCL-2有关,且联合用药有更显着的效果。PA-MSHA联合紫杉醇能够增强化疗药物对肿瘤的抑制作用,其分子机制可能与PA-MSHA下调了癌基因NF-κB、c-Myc、CIP2A的表达有关。
赵同生[4]（2020）在《MiRNA-221在膀胱癌中的检测及诊断意义》文中研究说明膀胱癌（Bladder cancer,BC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤,发病率在所有恶性肿瘤中居第11位,全球每年大约有150000人死于膀胱癌。2014年我国膀胱癌新发病例约7.81万例,是我国发病率最高的泌尿系肿瘤。不同浸润深度膀胱癌治疗方案迥异,目前普遍根据肿瘤浸润深度将膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。彻底切除肿瘤是治疗和降低膀胱癌复发风险的关键。目前主流手术方式包括经尿道膀胱肿瘤切除术、膀胱部分切除,全膀胱切除、介入栓塞等不同治疗方案。约75%患者初发为非肌层浸润性膀胱癌,标准治疗方案为经尿道膀胱肿瘤电切术,但电切术后复发率高,需长期随访复查膀胱镜,病人痛苦费用高昂。因此寻求无创的检测手段成为相关研究热点。我们通过前期实验发现膀胱癌患者尿液中外泌体中miRNA-221表达水平较无泌尿系疾病患者明显提高,miRNA-221有望成为膀胱癌早期诊断以及术后随访的重要指标。目的:进一步通过检测分析膀胱癌组织、癌旁正常组织及膀胱癌患者尿液外泌体中miRNA-221表达水平,结合肿瘤浸润深度。研究膀胱癌组织及尿液外泌体中miRNA-221对膀胱癌的诊断价值。方法:研究2018年06月～2019年06月就诊于江苏省苏北人民医院泌尿外科,并经术后病理确诊为膀胱癌患者20例（非肌层浸润性膀胱癌13例,肌层浸润性7例）,收集术前晨尿。肿瘤组织,癌旁正常组织。差速超速离心法分离尿液中的外泌体,电镜观察确认外泌体提取成功,进一步使用RT-qPCR技术,对尿液外泌体中的miRNA-221-3p进行检测。癌组织及癌旁正常组织样本分别提取出总RNA,应用RT-qPCR方法检测组织中miRNA-221-3p的表达量。使用SPSS22软件结合临床资料,分析对比肿瘤组织、癌旁正常组织中miRNA-221表达差异;肿瘤组织、尿液外泌体中miRNA-221表达水平的相关性。分析评估miRNA-221在膀胱癌诊断中的意义。结果:电镜下观察到,从病人尿液样本中提取的杯状或椭圆状囊泡样结构的外泌体,直径在30～150 nm范围内。RT-qPCR检测发现膀胱癌组织的miRNA-221表达明显高于癌旁正常组织（5.155±2.764.VS 1.000±0.158,P<0.01）,差异有统计学意义。肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织的miRNA-221表达明显高于非肌层浸润性膀胱癌组织（8.030±2.181 VS 3.606±1.530 P<0.01）。尿液外泌体中miRNA-221的表达量和肿瘤组织中的表达量成正相关,相关度r=0.654。不同浸润深度膀胱癌患者尿液外泌体miRNA-221表达量分别为:非肌层浸润1.042±0.193 VS肌层浸润1.295±0.324,差别无统计学意义（P=0.053>0.05）结论:1.膀胱癌组织的miRNA-221表达明显升高,且升高程度与膀胱癌浸润深度正相关。2.膀胱癌组织中的miRNA-221有作为判断膀胱癌浸润深度及恶性程度辅助诊断指标的潜在价值。3.尿液外泌体中miRNA-221的表达量和膀胱癌组织的miRNA-221表达量正相关,但不足以用于判断肿瘤浸润深度。4.尿液外泌体中的miRNA-221有作为膀胱癌的无创诊断及术后随访的生物学指标的潜在价值。
孙雨晴[5]（2020）在《miR-222-3p靶向Ddit4调控小鼠神经管闭合机制的初步研究》文中指出目的:1.验证miR-222-3p和Ddit4基因在小鼠胚胎脑组织正常组和ATRA畸形组miRNA-Seq中的表达情况;验证miR-222-3p的靶基因是Ddit4。2.观察miR-222-3p低表达对HT-22细胞功能的影响,初步确定miR-222-3p对细胞功能的作用。3.通过干扰Ddit4表达观察miR-222-3p对Wnt信号通路及HT-22细胞功能的影响,初步探索miR-222-3p在ATRA诱导的小鼠胚胎NTDs发生过程中的作用机制。方法:1.建立小鼠胚胎NTDs模型:通过灌胃给药的方式,在C57BL/6小鼠怀孕第7.5天（E7.5）,将全反式维甲酸（ATRA）按照28 mg/Kg的剂量注入孕鼠体内,建立胚胎神经管畸形（NTDs）模型,然后继续饲养至E8.5、E9.5和E10.5时分别提取胚胎脑组织。2.验证异常表达的microRNA和基因及两者之间的关系:通过实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测正常和畸形胚胎脑组织E8.5、E9.5和E10.5 miR-222-3p和Ddit4 mRNA水平的表达情况;通过双荧光素酶报告基因技术检测miR-222-3p的靶基因;并通过脂质体分别将化学合成的miR-222-3p模拟物（mim-222）和miR-222-3p抑制剂（Anti-222）转染进HT-22细胞;并通过Real-time PCR、蛋白印迹（Western blotting）技术检测下游靶基因Ddit4的表达。3.检测干扰miR-222-3p表达后的细胞表型变化:通过脂质体将化学合成的Anti-222转染进HT-22细胞,进而检测细胞增殖（CCK-8法、Western blotting）、凋亡（流式细胞术、AO-EB、Western blotting）、细胞周期（流式细胞术）及迁移（细胞划痕实验）水平变化,实验分为三组:Con组（未加处理的HT-22细胞）、Anti-NC组（转染空载体的HT-22细胞）、Anti-222组（miR-222-3p抑制剂转染HT-22细胞）。4.检测miR-222-3p下游基因对细胞表型的影响:通过脂质体将化学合成的Ddit4小干扰RNA（siR-Ddit4）转染进HT-22细胞干扰Ddit4表达,进行细胞增殖、凋亡、周期和划痕实验。实验分为三组:Anti-NC组（转染空载体的HT-22细胞）、Anti-222组（miR-222-3p抑制剂转染HT-22细胞）和Anti-222+siR-Ddit4组（miR-222-3p抑制剂和siRNA-Ddit4共转染HT-22细胞）。5.检测Wnt信号通路相关指标的表达情况:通过Real-time PCR检测Wnt信号通路指标β-catenin、TCF4表达的变化;通过Western blotting检测Wnt信号通路指标标志蛋白β-catenin、TCF4蛋白的表达变化及下游指标C-myc、CycinD1蛋白的表达。6.统计学分析方法:用均数±标准差（X±S）表示数据,SPSS17.0软件进行统计学分析,GraphPad Prism 8软件进行数据作图,Image-J软件进行灰度值分析采用t检验比较两个样本均数间差异。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,当P<0.05差异具有统计学意义。结果:1.通过28 mg/kg全反式维甲酸灌胃,建立C57BL/6小鼠胚胎NTDs模型。采用Real-time PCR技术检测E8.5-E10.5脑组织miR-222-3p mRNA的水平变化,其中miR-222-3p在RA组表达较Con组明显降低（P<0.001）;Ddit4在RA组表达较Con组明显升高（P<0.01）;实验数据与miR-seq结果相一致。2.前期通过Targetscan、PicTar、miRanda生物信息学软件分析发现miR-222-3p的靶基因是Ddit4;双荧光素酶报告基因技术发现野生型Ddit4载体与miR-222-3p结合后双荧光素酶活性下降（P<0.001）,而突变型Ddit4载体与miR-222-3p结合后双荧光素酶活性无变化,说明miR-222-3p的下游靶基因是Ddit4;通过荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率达到80%以上,检测转染后Ddit4的表达水平变化,Ddit4在Anti-222组表达较Con组和Anti-NC组表达显着升高（P<0.001）,在mim-222组表达较Con组和mim-NC组表达显着降低（P<0.01）。3.细胞增殖结果显示:CCK-8法结果表明Anti-NC组、Anti-222组0 h时的吸光度值（OD）与Con组无明显差异,转染后的2-4天,Anti-222组OD值显着低于Con组和Anti-NC组（P<0.01）;Anti-222+siR-Ddit4组OD值显着高于Anti-222组（P<0.01）;Western blotting结果表明Anti-222组PCNA蛋白表达水平降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组PCNA蛋白表达水平较Anti-222升高（P<0.05）。4.细胞凋亡结果显示:流式结果表明Anti-222组细胞的早凋率和晚凋率显着高于Con和Anti-NC组（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组细胞的早凋率和晚凋率显着低于Anti-222组（P<0.001）;AO-EB结果表明:Anti-222中绿色和橘红色并呈固缩状或圆珠状的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞显着多于Con组和Anti-NC组（P<0.001）;Western blotting结果表明Anti-222组Cleaved Caspase-3蛋白表达水平显着升高（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组PCNA蛋白表达水平较Anti-222组显着降低（P<0.001）。5.细胞周期结果显示:流式结果表明Anti-222组处于G1期的细胞数显着高于Con和Anti-NC组,而处于S和G2期的细胞数,显着低于Con和Anti-NC组(PG1<0.001,PS<0.001);Anti-222+siR-Ddit4组处于G1期的细胞数显着低于Anti-222组,处于S和G2期的细胞数显着高于Anti-222组(PG1<0.001,PS<0.001)。6.细胞迁移结果显示:细胞划痕结果表明Anti-222组较Con和Anti-NC组细胞迁移能力显着降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组迁移能力较Anti-222显着增强（P<0.001）。7.Real-time PCR结果显示:Anti-222组与Con组及Anti-NC组相比,β-catenin、TCF4 mRNA表达显着降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组较Anti-222组表达显着升高（P<0.05）。8.Western blotting结果显示:Anti-222组与Con组及Anti-NC组相比,β-catenin、TCF4、C-myc、CycinD1蛋白水平表达显着降低（P<0.01）;Anti-222+siR-Ddit4组较Anti-222组表达显着升高（P<0.001）。结论:1.miR-222-3p低表达可能在ATRA诱导的NTDs发生过程中起重要作用。2.miR-222-3p的靶基因是Ddit4。3.miR-222-3p可能通过影响Ddit4表达参与Wnt信号通路引起细胞增殖和细胞凋亡、细胞迁移的异常而造成NTDs的发生。
吕涛[6]（2020）在《LncRNA PVT1和circRNA EPB41L5调控胶质瘤发生发展的机制研究》文中研究表明研究背景:胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤。近几十年来,原发性恶性中枢神经系统肿瘤的发生率逐渐递增,胶质瘤的发病率也明显升高。目前胶质瘤的发病机制尚不明确,电离辐射,基因变异和信号通路紊乱是促进胶质瘤发生的危险因素。胶质瘤的主要治疗方式包括手术切除和术后同步放化疗,虽然近年来靶向治疗,免疫治疗和生物治疗等取得了长足的进步,但仍未发现有效抑制胶质瘤生长的治疗措施,胶质瘤患者的预后仍然很差,特别是高级别胶质瘤的中位生存期只有15个月左右,5年生存率不足5%。深入研究胶质瘤的基因表达,基因突变,单核苷酸多态性,基因拷贝数变异和表观遗传学修饰等分子特征和生物学行为对于胶质瘤的分子分型和胶质瘤患者的个体化、精准化治疗具有重要的意义。非编码RNAs是指能从基因组上转录而来,但是不翻译为蛋白质的RNA,非编码RNA具有十分重要的生物学功能,参与了多种疾病的发生发展过程。大量研究证实,肿瘤组织中异常表达的mi RNAs,lnc RNAs和circRNAs可以作为肿瘤诊断和预后判断的分子标志物,同时还可以提供新的治疗靶点。LncRNA PVT1是长约1716nt的非编码RNAs,其异常表达与多种肿瘤的发生与进展相关,包括肺癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌和胰腺癌等,本课题组的前期研究结果也证实lnc RNA PVT1在三阴性乳腺癌中发挥了重要作用,但是其在胶质瘤中的表达水平与作用机制尚不清楚。CircRNAs在肿瘤相关的多种表型中如:细胞周期、细胞凋亡、侵袭迁移、免疫、血管生成和转移等生物学过程中都发挥了重要的作用,但是circRNAs调控胶质瘤发生发展的具体机制尚不清楚,本课题组前期通过高通量测序和生物信息学分析构建了胶质母细胞瘤中差异circRNAs的表达谱,发现circRNA EPB41L5在胶质母细胞瘤中显着低表达且与患者的不良预后相关,且干扰circRNA EPB41L5的表达可影响胶质瘤细胞系的生物学行为,但其调控胶质瘤进展的内在机制有待进一步研究。第一部分LncRNA PVT1通过招募COPS5去泛素化稳定TRIM24促进胶质瘤的发生发展研究目的:研究LncRNA PVT1在胶质瘤中的表达水平及其与胶质瘤患者不良预后的相关性,同时探讨lnc RNA PVT1-COPS5-TRIM24-STAT3调控轴影响胶质瘤进展的内在机制。研究方法:1.通过分析GEO和TCGA数据库研究lnc RNA PVT1在胶质瘤中的表达水平及其与胶质瘤患者不良预后的相关性。2.利用RT-q PCR检测我院胶质母细胞瘤临床样本与不同胶质瘤细胞系中lnc RNA PVT1的表达水平。体外在U251和U373胶质瘤细胞系中敲减lnc RNA PVT1,观察其对胶质瘤细胞生长的影响。3.利用RNA pull-down实验和RNA结合蛋白免疫沉淀实验,研究lnc RNA PVT1与TRIM24蛋白的相互作用。利用Western blot技术检测lnc RNA PVT1对TRIM24蛋白稳定性的影响。4.利用免疫共沉淀技术研究TRIM24和COPS5的相互作用。同时观察LncRNA PVT1影响两者相互作用的情况。5.利用原位种植瘤模型,在体内观察干扰lnc RNA PVT1和相关基因后对胶质瘤细胞生长的影响。研究结果:1.LncRNA PVT1在胶质母细胞瘤中表达水平显着升高并与胶质瘤患者的不良预后相关。2.在U251和U373胶质瘤细胞系中敲减lnc RNA PVT1抑制肿瘤细胞的增殖,克隆形成和体内成瘤。体外过表达lnc RNA PVT1,TRIM24蛋白表达水平升高;敲减lnc RNA PVT1,TRIM24蛋白表达水平降低。3.LncRNA PVT1通过EXON5和EXON6与TRIM24蛋白螺旋卷曲结构域相互作用,增强TRIM24蛋白稳定性。体外过表达lnc RNA PVT1 WT,TRIM24蛋白稳定性升高,过表达LncRNA PVT1Δ1则不会影响TRIM24蛋白稳定性。4.高通量筛选去泛素化酶家族发现COPS5与TRIM24相互作用,COPS5表达水平与TRIM24蛋白表达水平呈正相关。COPS5与TRIM24相互作用依赖于lnc RNA PVT1,敲减lnc RNA PVT1后,COPS5与TRIM24相互作用减弱,同时TRIM24泛素化水平升高。5.下调lnc RNA PVT1显着降低p-STAT3表达水平,过表达TRIM24能够逆转下调lnc RNA PVT1对p-STAT3的抑制作用,同时过表达TRIM24能够逆转下调lnc RNA PVT1对肿瘤细胞增殖,克隆形成和体内成瘤的抑制作用。研究结论:LncRNA PVT1在胶质瘤中表达水平显着升高,并与胶质瘤患者的不良预后相关。LncRNA PVT1招募COPS5与TRIM24形成复合物,去泛素化稳定TRIM24,在翻译后水平调控TRIM24蛋白的表达,导致p-STAT3激活,进而促进胶质瘤细胞的生长。LncRNA PVT1-COPS5-TRIM24-STAT3调控轴在胶质瘤的进展中发挥了重要的生物学功能,LncRNA PVT1可作为胶质瘤诊断的生物学标志物和潜在的治疗靶点,具有重要的临床意义和价值。第二部分CircRNA EPB41L5通过吸附mi R-19a调控宿主基因EPB41L5表达抑制胶质瘤的发生发展研究目的:研究CircRNA EPB41L5在胶质瘤中的表达水平及其与胶质瘤患者不良预后的相关性,同时探讨circRNA EPB41L5-mi R-19a-EPB41L5-p-AKT调控轴在胶质瘤发展过程中作用和内在机制研究方法:1.利用RNA-seq测定6例胶质母细胞瘤组织和6例正常脑组织中circRNAs的表达谱。检测我院胶质母细胞瘤患者circRNA EPB41L5表达与临床特征及预后的相关性。2.利用RNA-seq检测受circRNA EPB41L5调控的靶基因和相关通路。3.通过生物学预测寻找与circRNA EPB41L5相互作用的mi RNAs,荧光素酶报告基因实验和RNA pull-down实验检测circRNA EPB41L5、mi R-19a和EPB41L5的相互作用。4.体外干预circRNA EPB41L5或EPB41L5的表达,观察对胶质瘤增殖、克隆形成、迁移侵袭的影响。利用原位种植瘤模型,在体内观察干扰circRNA EPB41L5或EPB41L5的表达后对胶质瘤生长的影响。5.利用Western blot技术检测干扰circRNA EPB41L5的表达水平对AKT信号通路的影响。研究结果:1.与正常脑组织和细胞系相比,胶质母细胞瘤组织和细胞系中circRNA EPB41L5的表达水平下调。CircRNA EPB41L5低表达与胶质母细胞瘤患者不良预后相关。体外过表达circRNA EPB41L5抑制胶质瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,而敲减circRNA EPB41L5则发挥相反的作用。2.RNA-seq结果确定其宿主基因EPB41L5是circRNA EPB41L5的靶基因。3.通过生物信息学预测发现circRNA EPB41L5可作为mi R-19a的吸附海绵,抑制mi R-19a活性上调EPB41L5的表达。RNA pull-down实验证实mi R-19a与circRNA EPB41L5和EPB41L5相互作用。4.CircRNA EPB41L5通过调控宿主基因EPB41L5的表达进而调控Rho C的表达和AKT磷酸化,影响胶质瘤的发生发展。研究结论:CircRNA EPB41L5在胶质母细胞瘤中显着低表达,宿主基因EPB41L5是其调控的靶基因。CircRNA EPB41L5通过吸附mi R-19a调控EPB41L5的表达,并通过调控AKT信号通路影响胶质瘤的发生发展。本研究为深入了解胶质瘤的发病机制提供了新的思路,为胶质瘤的治疗提供了新靶点和新方向。
余波,胡林平,伏晓,张槿,滕尧树,吴稚冰,朱瑾[7]（2019）在《p27蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义》文中研究指明目的评估细胞核p27在鼻咽癌组织中表达与鼻咽癌患者临床病理特征及预后的关系。方法回顾性分析2006年12月～2016年1月在杭州市第一人民医院病理科保存113例鼻咽癌组织和28例慢性鼻咽炎组织标本蜡块,采用免疫组织化学染色法观察p27蛋白在鼻咽癌组织细胞核中的表达情况,并利用统计学方法分析其与鼻咽癌患者临床病理特征参数及预后的关系。结果免疫组织化学染色结果显示,与慢性鼻咽炎组织相比,p27蛋白在鼻咽癌组织细胞核中的表达明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,且细胞核p27蛋白表达水平与鼻咽癌T分级、TNM临床分期呈负相关（P<0.05）。113例鼻咽癌患者5年总生存率为75%,细胞核p27蛋白表达阳性者5年生存率为85.9%,阴性者为61.3%,差异有统计学意义（P <0.05）。单因素Cox回归模型分析显示,细胞核p27蛋白表达水平、年龄、T分级、N分级、M分级和TNM临床分期均影响鼻咽癌患者的生存率（HR均>1,P均<0.05）,多因素Cox回归模型分析亦显示:年龄、M分级、TNM临床分期是影响鼻咽癌患者预后的独立危险因素（HR均>1,P均<0.05）。结论细胞核p27蛋白在鼻咽癌中表达下调可能促进鼻咽癌的发生、发展,并可影响鼻咽癌患者的生存预后。
王璐[8]（2019）在《膀胱癌发生发展中周期调控基因生物信息学筛选及分子机制研究》文中提出第一部分生物信息学方法筛选膀胱癌发生发展中周期调控相关的差异基因目的:通过生物信息学方法对不同基因芯片结果进行富集,筛选与膀胱癌发生发展高度相关的差异表达基因,为膀胱癌诊断提供潜在无创标志物,以及精准医学分子靶向治疗的潜在药物靶点。方法:从GEO数据库网站下载人膀胱尿路上皮移行细胞癌患者的RNA二代测序数据和相应的临床特征信息,并结合课题组前期测序数据,利用R语言对数据进行处理,在4个芯片数据的差异基因中取交集。通过基因功能富集、小分子药物靶点筛选、蛋白互作网络构建、预后和分期相关性分析等对上述差异表达基因进行进一步筛选,最终得到膀胱癌发生发展中起关键作用的差异表达基因。并通过组织荧光定量PCR,免疫组织化学染色进行了验证。结果:4个芯片数据取交集后得到59个表达上调基因以及40个表达下调基因,功能及通路富集表明这些基因与细胞周期调控高度相关。通过蛋白互作网络构建,以及基于GSE13507芯片数据、TCGA数据的预后相关性分析,最终筛选得到5个与预后无病生存率高度相关的差异基因。通过肿瘤分期相关性分析、基因突变分析进一步验证了这些基因在肿瘤中的显着差异性。并以课题组样本库收集到的临床肿瘤组织进行了验证,成功在转录水平及翻译水平验证了这些基因在肿瘤中的显着高表达。结论:我们通过生物信息学方法得到了膀胱癌发生发展中差异表达明显的5个基因,并且这些基因可能是通过细胞周期来调控肿瘤细胞的发生发展,可以推断这5个基因在不同分期分级的膀胱肿瘤患者诊断、预后和精准治疗上是有价值的,可以作为潜在的标志物或者小分子药物作用靶点。第二部分富脯氨酸蛋白11（PRR11）对膀胱癌发生发展的作用及机制研究目的:研究验证富脯氨酸蛋白11（PRR11）在膀胱肿瘤中的高表达,检测其表达与膀胱肿瘤分期、分级、预后之间的相关性,并探索其影响膀胱肿瘤发生发展的分子机制。方法:以生物信息学方法对测序芯片结果进行可视化处理,比较PRR11在膀胱癌组织与对照正常膀胱上皮之间表达的差异;以T检验、方差检验等统计学方法检验PRR11表达与肿瘤分期、病理等临床信息的相关性;以Kaplan-Meier生存分析比较PRR11表达与临床预后生存之间的相关性;以小干扰RNA和质粒载体转染膀胱癌细胞进行体外功能试验;以慢病毒稳转细胞株裸鼠荷瘤模型进行了体内动物实验;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果:通过数据库结果及内部组织实验验证证实了PRR11在膀胱癌中的高表达,且表达水平与肿瘤T分期相关;PRR11的表达水平与肿瘤预后复发、进展、生存高度相关;PRR11能够在体外细胞系水平促进膀胱癌细胞的增殖、迁移、克隆形成能力,在体内动物实验水平同样可以促进膀胱癌发生发展;通过流式细胞仪检测等证实PRR11通过影响细胞周期进程影响膀胱癌发生发展。结论:PRR11通过影响细胞周期进程来调控膀胱癌的发生发展,且表达水平与膀胱癌预后进展、生存相关。
周乃春[9]（2019）在《UBAC2调控P27转录对膀胱癌细胞增殖的影响及机制研究》文中研究说明研究背景和目的膀胱癌（bladder cancer,BC）是泌尿外科临床上常见的恶性肿瘤之一,也是一个在全球范围内危害人类健康的棘手问题。虽然随着医疗水平及肿瘤诊治能力的提升,膀胱癌的治疗也出现新思路,但是目前膀胱癌的治疗仍是以外科手术切除为主,同时辅以放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗及介入治疗等的综合治疗。在我国,膀胱癌的发病率虽远不及西方发达国家,但其发病率及死亡率在近几十年来同样呈上升趋势。因此,对膀胱癌发生、进展、侵袭转移、复发及耐药等相关机制的研究已经成为当前的热点和重点,以期探寻新靶点为其诊治提供理论依据。泛素相关结构域样蛋白2（ubiquitin-associated domain-containing protein 2,UBAC2）是一种存在于多物种的高度保守的蛋白质,其表达水平在不同类型及病理级别的膀胱癌中存在差异,但UBAC2在膀胱癌中的作用及机制仍有待明确。因此,本研究旨在探究UBAC2在人膀胱癌组织中的表达情况并分析其与临床病理相关指标的关系,最后初步探索其在膀胱癌中作用及机制。研究对象和方法1.收集我院46例因膀胱癌而行根治性膀胱切除术后的新鲜手术标本及患者相应临床病理资料,取手术切除下来的膀胱癌组织及其对应正常膀胱黏膜组织,采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测并分析组织标本中UBAC2基因mRNA的表达水平,同时分析UBAC2表达水平和膀胱癌患者临床病理特征间的关系。2.同时采用免疫组织化学染色法（immunohistochemistry,IHC）检测UBAC2蛋白在膀胱癌组织及其对应癌旁正常膀胱组织中的表达水平,并分析其差异。3.采用qRT-PCR和western blot法分别检测并分析人永生化膀胱尿路上皮细胞系SV-HUC-1和膀胱癌细胞系EJ及UMUC3中UBAC2基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平。4.根据蛋白数据库网站The Human Protein Atlas利用癌症和肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中膀胱癌患者相关临床随访数据及UBAC2表达水平制作Kaplan-Meier生存曲线,分析膀胱癌患者肿瘤组织中UBAC2表达水平和患者预后之间的关系。5.构建短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）介导UBAC2沉默的质粒载体,并转染入EJ和UMUC3细胞,转染48h后,更换新鲜完全培养基,加入嘌呤霉素,逐渐加量进行细胞筛选。6.结合荧光倒置显微镜观察筛选细胞荧光情况,分别提取沉默对照组（shNC）和UBAC2沉默组（shUBAC2）稳转细胞总RNA和蛋白,利用qRTPCR及western blot法检测UBAC2 mRNA及蛋白沉默效率。7.利用稳转细胞,应用CCK-8试剂盒及平板克隆形成实验检测UBAC2沉默组及对照组细胞增殖能力的变化。8.采用qRT-PCR及western blot检测UBAC2沉默组（shUBAC2）及对照组（shNC）细胞中与增殖相关蛋白表达水平的变化,明确UBAC2与p27间的可能调控关系。结果1.与正常膀胱组织（1.220±0.797）相比,UBAC2基因mRNA在膀胱癌组织（3.802±2.931）中表达明显上调（P<0.001）。免疫组织化学染色法检测结果发现,相对于其对应癌旁正常膀胱组织,UBAC2蛋白在大部分（31/46）膀胱癌组织中表达升高。对于膀胱癌细胞系,qRT-PCR结果显示:与SV-HUC-1（1.000±0.029）细胞相比,膀胱癌细胞系EJ（2.273±0.040）和UMUC3（3.037±0.115）中UBAC2 mRNA水平均明显上调（P<0.001）。Western blot结果也显示:EJ细胞和UMUC3细胞中UBAC2蛋白相对于SV-HUC-1细胞表达升高（P<0.001）。2.临床病理特征分析表明,UBAC2表达水平与膀胱癌病理分级明显相关（P=0.023）,而与年龄、性别、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小等均无明显相关（P>0.05）。3.生存分析发现,膀胱癌组织中UBAC2表达的高低与膀胱癌患者的生存时间显着相关（P=0.035）。膀胱癌中UBAC2表达水平越高,膀胱癌患者的生存时间越短;相反,UBAC2表达水平越低,患者的生存时间越长。4.转染shRNAs并经筛选后,qRT-PCR及western blot检测显示shUBAC2组细胞UBAC2 mRNA及蛋白的表达水平较shNC组明显降低（P<0.05）,其中以shUBAC2-1及shUBAC2-3沉默效率较高,用于后续实验。5.CCK-8实验显示:EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组较shNC组在相对应时间点450nm波长下的吸光度明显降低（P<0.05）;平板克隆形成实验显示EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组克隆形成数明显少于shNC组（P<0.001）。6.western blot结果显示:EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组细胞p27蛋白表达水平较shNC组都明显升高（P<0.05）,而其他与增殖相关蛋白:p21,CyclinD1,CyclinE,CDK2,CDK4,CDK6无明显差异（P>0.05）。qRT-PCR发现,EJ和UMUC3细胞中,shUBAC2组细胞p27 mRNA表达水平均较shNC组明显升高（P<0.05）。结论1.UBAC2在膀胱癌组织及细胞系中的表达水平明显上调,并且可以作为一个预测膀胱癌患者的预后指标。2.沉默UBAC2能够抑制膀胱癌细胞的增殖。3.UBAC2可能在转录水平上调控p27。
张跃明[10]（2019）在《KIF3B在上皮性卵巢癌中的表达及对卵巢癌细胞生长的调控作用及其机制研究》文中认为第一部分:KIF3B在卵巢癌中的表达及临床意义目的:旨在探讨KIF3B在卵巢癌中的表达及其与预后之间的关系。方法:采用免疫组化、Western blot方法检测KIF3B在卵巢癌组织中的表达;并分析KIF3B与Ki-67水平、临床病理特征及其与卵巢癌患者生存质量之间的关系。结果:KIF3B在卵巢癌组织中的蛋白表达水平明显高于正常卵巢组织中的表达,并且组织学级别越高,KIF3B的蛋白表达越高。KIF3B在卵巢癌细胞中主要定位在细胞质中,与常用的细胞增殖相关的抗原Ki-67一致,随病理分级的增加其表达逐渐增强。KIF3B的表达水平与卵巢癌患者的组织学分级、患者有无腹水、腹水中是否存在肿瘤细胞、其他脏器有无转移,以及Ki-67的表达水平相关;而与患者的年龄、经期状态、FIGO分期、淋巴结分期无关。卵巢癌患者的存活率与KIF3B的表达有相关性,KIF3B高表达的患者,存活率低,差异有统计学意义。KIF3B表达低的患者术后生存时间长,KIF3B表达水平与预后呈负相关。结论:KIF3B在卵巢癌患者中高表达,与组织学分级呈正相关;KIF3B表达量高的患者生存期短,与卵巢癌患者不良预后相关。第二部分:KIF3B促进细胞周期由G0/G1期向S期转换,并促进卵巢癌细胞的生长目的:探讨KIF3B对卵巢癌细胞生长的影响及其机制。方法:Western blot 检测卵巢癌细胞（HO8910、OVCAR-3、SK-OV-3、A2780）中 KIF3B表达水平;慢病毒感染技术建立过表达或敲减KIF3B表达的细胞系;MTT检测过表达KIF3B、敲减KIF3B对卵巢癌细胞生长的影响;流式细胞术检测过表达KIF3B、敲减KIF3B对卵巢癌细胞周期分布的影响;Western blot检测过表达KIF3B、敲减KIF3B对细胞周期相关蛋白表达的影响。体内移植瘤模型检测过表达KIF3B、敲减KIF3B对卵巢癌肿瘤生长的影响。结果:HO8910细胞中KIF3B蛋白表达量最高,A2780细胞中KIF3B蛋白表达量最低;慢病毒载体介导建立过表达/敲减KIF3B表达的细胞系;KIF3B shRNA显着抑制HO8910细胞的生长;过表达KIF3B显着促进A2780细胞的生长;KIF3B shRNA显着上调G0/G1期细胞比例,下调S期细胞比例;过表达KIF3B显着上调S期细胞比例,下调G0/G1期细胞比例;敲减KIF3B抑制HO8910细胞中Cyclin A和CDK2的表达;过表达KIF3B上调A2780细胞中Cyclin A和CDK2的表达。KIF3B shRNA显着抑制HO8910移植瘤的生长;过表达KIF3B显着促进A2780移植瘤的生长。结论:KIF3B可促进细胞周期由G0/G1期向S期转换,并促进卵巢癌的生长。第三部分:KIF3B通过PI3K/AKT通路调控周期相关基因Cyclin A和CDK2的表达目的:探讨KIF3B促进细胞周期由G0/G1期向S期转换的机制。方法:基因芯片检测了敲减KIF3B对HO8910细胞基因表达谱的影响;David软件（https://david.ncifcrf.gov/）对差异基因进行功能富集分析;采用KEGG数据库（https://www.genome.jp/kegg/）分析差异基因影响的信号通路;Western blot检测蛋白表达水平和磷酸化水平;MTT检测卵巢癌细胞生长的影响。结果:基因芯片检测敲减KIF3B对HO8910细胞基因表达谱的影响,选择表达水平改变超过1.8倍的基因为差异基因。敲减KIF3B下调了 2293个基因的表达,上调了 204个基因的表达;敲减KIF3B的差异基因富集在FoxO上游的关键通路PI3K/AKT;采用Western blot检测了 HO8910细胞中PI3K调节亚基PIK3R2 （p85）的表达水平,以及AKT的磷酸化水平,发现敲减KIF3B可抑制p85的表达,并抑制AKT的磷酸化;过表达KIF3B促进p85的表达,并促进AKT的磷酸化;PI3K抑制剂Wortamannin能够削弱过表达KIF3B对AKT的激活,提示KIF3B通过PI3K依赖性机制激活AKT;Wortamannin能够削弱过表达KIF3B对Cyclin A和CDK2表达的上调作用;Wortamannin能够削弱过表达KIF3B对卵巢癌细胞生长的促进作用。结论:KIF3B高表达能够上调PI3K调节亚基PIK3R2 （p85）的表达,激活PI3K/AKT通路,进而上调卵巢癌细胞中周期调控相关蛋白Cyclin A和CDK2的表达,促进细胞周期由G0/G1期向S期的转换,最终促进卵巢癌的生长。
二、细胞周期蛋白E和p27kip1在膀胱癌中的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞周期蛋白E和p27kip1在膀胱癌中的表达及意义（论文提纲范文）
（1）EGCG通过调节P27kip1、PI3K/AKT蛋白抑制前列腺癌PC-3细胞增殖（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与仪器 |
| 1.1.1 主要相关仪器 |
| 1.1.2 实验材料和主要试剂 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 1.2.2 PC-3 细胞的EGCG干预 |
| 1.2.3 细胞增殖-毒性检测各浓度EGCG抑制PC-3 细胞的情况 |
| 1.2.4 转录组基因测序 |
| 1.2.5 Westernblot法进行PC-3 细胞蛋白的检测 |
| 1.2.6 免疫荧光进行PC-3 细胞蛋白的检测 |
| 1.2.7 流式细胞仪的检测法 |
| 1.3 数据的统计学处理 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 EGCG 具有抑制前列腺癌 PC-3 细胞增殖的作用 |
| 2.2 EGCG 处理的前列腺癌 PC-3 细胞的转录组测序 |
| 2.3 EGCG通过抑制PI3K/AKT蛋白质的合成从而抑制前列腺癌PC-3细胞 |
| 2.4 EGCG上调前列腺癌PC-3 细胞P27kip1 合成与核表达 |
| 2.5 EGCG对前列腺癌PC-3 细胞周期的影响 |
| 2.6 测序预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 EGCG抗肿瘤研究的价值 |
| 3.2 EGCG抑制前列腺癌侵袭迁移的抗肿瘤机制可能与S期停滞有关 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 前列腺癌发病机制中信号通路的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（2）Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Skp-2 在恶性肿瘤发生机制中的作用 |
| 参考文献 |
（3）PA-MSHA联合紫杉醇对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌的流行病学 |
| 1.2 乳腺癌的分子分型 |
| 1.3 TNBC的治疗 |
| 1.3.1 TNBC的化学化疗 |
| 1.3.2 TNBC的免疫治疗 |
| 1.4 PA-MSHA在肿瘤中的研究 |
| 1.4.1 PA-MSHA在肝癌中的研究 |
| 1.4.2 PA-MSHA在宫颈癌中的研究 |
| 1.4.3 PA-MSHA在膀胱癌中的研究 |
| 1.4.4 PA-MSHA在肺癌中的研究 |
| 1.4.5 PA-MSHA在乳腺癌中的研究 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系及培养条件 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.3 划痕实验检测PA-MSHA对细胞迁移影响 |
| 2.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.6 qRT-PCR检测mRNA表达 |
| 2.2.7 Western Blot检测蛋白表达 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 细胞增殖改变 |
| 3.1.1 不同浓度的PA-MSHA和紫杉醇作用于TNBC不同时间后对细胞增殖的影响 |
| 3.1.2 PA-MSHA和紫杉醇联合用药对TNBC细胞增殖的影响 |
| 3.2 PA-MSHA对 TNBC细胞迁移能力的影响 |
| 3.3 PA-MSHA、紫杉醇及联合用药对TNBC细胞凋亡的影响 |
| 3.4 PA-MSHA对TNBC细胞周期的影响 |
| 3.5 PA-MSHA、紫杉醇及联合用药对TNBC细胞相关mRNA表达的影响 |
| 3.6 PA-MSHA、紫杉醇及联合用药对TNBC细胞相关蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 5.3 创新点及局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 铜绿假单胞菌注射液抗肿瘤作用机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）MiRNA-221在膀胱癌中的检测及诊断意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 膀胱癌概述 |
| 2 外泌体概述 |
| 3 miRNA概述 |
| 4 研究目的 |
| 材料 |
| 方法 |
| 1 患者资料 |
| 2 样本收集 |
| 3 尿液外泌体中miRNA-221表达量的检测 |
| 4 膀胱组织中miRNA-221表达量的检测 |
| 结果 |
| 分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MiRNA在膀胱癌的诊断中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（5）miR-222-3p靶向Ddit4调控小鼠神经管闭合机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分mi R2223p在神经管畸形脑组织中表达的测序结果及其靶标验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 利用全反式维甲酸建立C57BL/6 鼠胚NTDs模型 |
| 1.6 通过Real-time PCR验证鼠胚脑组织中mi R2223p、Ddit4 m RNA水平的表达情况 |
| 1.7 HT-22 细胞培养及mi R2223p细胞转染 |
| 1.8 双荧光素酶报告基因技术检测mi R2223p靶标 |
| 1.9 转染效率验证 |
| 1.10 mi R2223p转染后Ddit4表达变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C57BL/6 鼠胚NTDs模型建立 |
| 2.2 mi R2223p、Ddit4在鼠胚脑组织中m RNA水平的表达情况 |
| 2.3 HT-22 细胞形态学观察 |
| 2.4 双荧光素酶报告基因技术 |
| 2.5 mi R2223p转染细胞水平验证 |
| 2.6 mi R2223p转染后对Ddit4 m RNA、蛋白水平的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分mi R2223p低表达对HT-22 细胞功能影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验器材 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 HT-22 细胞培养与转染 |
| 1.5 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 1.6 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 1.7 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞周期的影响 |
| 1.8 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 mi R2223p低表达对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 2.2 mi R2223p低表达对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 2.3 mi R2223p低表达对HT-22 细胞周期的影响 |
| 2.4 mi R2223p低表达对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 探索mi R2223p低表达对HT-22 细胞机制的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验器材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 细胞培养与转染 |
| 1.5 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 1.6 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 1.7 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞周期的影响 |
| 1.8 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 1.9 Real-tine PCR检测 β-catenin、TCF4 m RNA水平的表达变化 |
| 1.10 Western blotting检测 β-catenin、TCF、cmyc、cycin D1蛋白水平的表达变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 2.2 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 2.3 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞周期的影响 |
| 2.4 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 2.5 Anti-222+si R-Ddit4对 β-catenin、TCF4 m RNA水平的表达变化 |
| 2.6 Anti-222+si R-Ddit4对 β-catenin、TCF、C-myc、Cycin-D1蛋白水平的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）LncRNA PVT1和circRNA EPB41L5调控胶质瘤发生发展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 LncRNA PVT1 通过招募COPS5 去泛素化稳定TRIM24 促进胶质瘤的发生发展 |
| 一 前言 |
| 1.1 神经胶质瘤的研究现状 |
| 1.2 长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs, Lnc RNAs)与神经胶质瘤 |
| 1.3 LncRNA PVT1 与肿瘤 |
| 1.4 TRIM24 与神经胶质瘤 |
| 二 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织标本与细胞株 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器与耗材 |
| 2.1.6 常用溶液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞增殖检测 |
| 2.2.3 克隆形成实验 |
| 2.2.4 细胞侵袭迁移实验 |
| 2.2.5 总RNA提取 |
| 2.2.6 RNA反转录 |
| 2.2.7 实时定量荧光PCR |
| 2.2.8 质粒构建 |
| 2.2.9 慢病毒包装 |
| 2.2.10 细胞转染 |
| 2.2.11 Western Blot |
| 2.2.12 免疫共沉淀 |
| 2.2.13 核质分离实验提取细胞核和细胞质RNA |
| 2.2.14 裸鼠原位移植瘤模型 |
| 2.2.15 HE染色 |
| 2.2.16 数据统计与分析 |
| 2.2.17 相关引物 |
| 三 结果 |
| 3.1 LncRNA PVT1 在胶质瘤组织中的表达 |
| 3.2 LncRNA PVT1 与胶质瘤临床特征及预后相关性 |
| 3.3 LncRNA PVT1 对胶质瘤细胞生物学行为的影响 |
| 3.4 LncRNA PVT1与TRIM24 结合 |
| 3.5 LncRNA PVT1 调节TRIM24 的稳定性 |
| 3.6 LncRNA PVT1 促进胶质瘤进展依赖TRIM24 |
| 3.7 LncRNA PVT1 通过结合DUB调控TRIM24 蛋白水平 |
| 3.8 COPS5 去泛素化并稳定TRIM24 依赖LncRNA PVT1 |
| 3.9 LncRNA PVT1-COPS5-TRIM24-STAT3轴调控胶质瘤的恶性行为 |
| 四 讨论 |
| 第二部分 CircRNA EPB41L5 通过吸附miR-19a调控宿主基因EPB41L5 表达抑制胶质瘤的发生发展 |
| 一 前言 |
| 1.1 CircRNAs |
| 1.2 CircRNAs与胶质瘤 |
| 1.3 EPB41L5 与肿瘤 |
| 二 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA-seq分析 |
| 2.2.2 数据库试用 |
| 2.2.3 miRNA上游荧光定量检测引物设计 |
| 2.2.4 miRNA提取 |
| 2.2.5 miRNA cDNA第一链合成 |
| 2.2.6 miRNA荧光定量检测 |
| 2.2.7 双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.8 RNA pull down实验 |
| 2.2.9 相关引物 |
| 三 结果 |
| 3.1 CircRNA EPB41L5在胶质母细胞瘤中的表达与临床意义 |
| 3.2 CircRNA EPB41L5 调控其宿主基因EPB41L5 的表达 |
| 3.3 CircRNA EPB41L5 调控胶质瘤生物学行为依赖宿主基因EPB41L5 |
| 3.4 CircRNA EPB41L5通过吸附miR-19a调控EPB41L5的表达 |
| 3.5 CircRNA EPB41L5 通过调控AKT通路抑制胶质瘤成瘤 |
| 四 讨论 |
| 全文总结 |
| Reference |
| 致谢 |
| 攻读博士期间所获得的成果 |
（7）p27蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 1资料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（8）膀胱癌发生发展中周期调控基因生物信息学筛选及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分:生物信息学方法筛选膀胱癌发生发展中周期调控相关的差异基因 |
| 1.材料与方法 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分:富脯氨酸蛋白11(PRR11)对膀胱癌发生发展的作用及机制研究 |
| 4.材料与方法 |
| 5 研究结果 |
| 6 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱癌中细胞周期基因预后标志物作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（9）UBAC2调控P27转录对膀胱癌细胞增殖的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写一览表 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱癌相关蛋白及非编码RNA分子通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、硕士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）KIF3B在上皮性卵巢癌中的表达及对卵巢癌细胞生长的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 KIF3B在卵巢癌中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1. 研究资料及仪器设备 |
| 2. 实验流程与方法 |
| 结果 |
| 1. KIF3B的序列及结构 |
| 2. KIF3B在人类正常卵巢组织和卵巢癌组织中的蛋白表达 |
| 3. KIF3B在上皮性卵巢癌病理切片中的表达与临床意义 |
| 4 KIF3B对上皮性卵巢癌患者生存的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 KIF3B促进细胞周期由G0/G1期向S期转换,并促进卵巢癌细胞的生长 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料、仪器设备 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 各株卵巢癌细胞系中KIF3B表达水平 |
| 2. 建立敲减KIF3B的卵巢癌细胞系 |
| 3. 敲减KIF3B对卵巢癌细胞生长的影响 |
| 4. 建立KIF3B过表达的卵巢癌细胞系 |
| 5. 过表达KIF3B对卵巢癌细胞生长的影响 |
| 6. 敲减KIF3B对卵巢癌移植瘤生长的影响 |
| 7. 过表达KIF3B对卵巢癌移植瘤生长的影响 |
| 8. 敲减KIF3B对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 9. 过表达KIF3B对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 10. 敲减KIF3B抑制Cyclin A和CDK2的表达 |
| 11. 过表达KIF3B上调CyclinA和CDK2的表达 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 KIF3B通过PI3K/AKT通路调控周期相关基因Cyclin A和CDK2的表达 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料、仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 敲减KIF3B对HO8910细胞基因表达谱的影响 |
| 2. 差异基因的功能富集 |
| 3. 敲减KIF3B对FoxO通路的影响 |
| 4. 敲减KIF3B对PI3K/AKT通路的影响 |
| 5. 过表达KIF3B对PI3K/AKT通路的影响 |
| 6. KIF3B通过PI3K依赖性机制激活AKT通路 |
| 7. KIF3B通过PI3K依赖性机制上调Cyclin A和CDK2表达 |
| 8. KIF3B通过PI3K依赖性机制促进卵巢癌细胞生长 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 Kinesin 蛋白家族在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论文 |
| 参与的研究项目 |
| 致谢 |
四、细胞周期蛋白E和p27kip1在膀胱癌中的表达及意义（论文参考文献）
- [1]EGCG通过调节P27kip1、PI3K/AKT蛋白抑制前列腺癌PC-3细胞增殖[D]. 白璐. 桂林医学院, 2021(01)
- [2]Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究[D]. 陈晓文. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]PA-MSHA联合紫杉醇对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用研究[D]. 崔乐. 兰州大学, 2021(12)
- [4]MiRNA-221在膀胱癌中的检测及诊断意义[D]. 赵同生. 扬州大学, 2020(04)
- [5]miR-222-3p靶向Ddit4调控小鼠神经管闭合机制的初步研究[D]. 孙雨晴. 山西医科大学, 2020(11)
- [6]LncRNA PVT1和circRNA EPB41L5调控胶质瘤发生发展的机制研究[D]. 吕涛. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]p27蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义[J]. 余波,胡林平,伏晓,张槿,滕尧树,吴稚冰,朱瑾. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2019(10)
- [8]膀胱癌发生发展中周期调控基因生物信息学筛选及分子机制研究[D]. 王璐. 武汉大学, 2019(06)
- [9]UBAC2调控P27转录对膀胱癌细胞增殖的影响及机制研究[D]. 周乃春. 郑州大学, 2019(08)
- [10]KIF3B在上皮性卵巢癌中的表达及对卵巢癌细胞生长的调控作用及其机制研究[D]. 张跃明. 苏州大学, 2019