一、上海地区爆发蛋鸭“类减蛋综合症”（论文文献综述）
张琪[1]（2020）在《鹅源减蛋综合征病毒的分离鉴定及其基因组的进化分析》文中研究表明减蛋综合征（Egg drop syndrome,EDS）是由减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的禽类传染性疾病,该病在世界范围内的发生和流行给养禽业带来了巨大的经济损失。鹅是EDSV主要自然宿主之一,成年鹅感染EDSV后只带毒不致病,成为鸡源EDS的传染源之一,雏鹅感染后可引发急性呼吸系统疾病,EDSV仅有一个血清型,不同分离株间致病性存在较大差异。因此,鹅源EDSV的分离鉴定和遗传进化分析不仅为进一步有效防制鹅EDSV感染提供了理论依据和物质基础,同时为防控鸡源EDS起到了积极的作用。本研究中,从吉林省某鹅场疑似感染小鹅瘟的病死雏鹅中采取小肠病料处理后,经PCR鉴定确认为小鹅瘟（Gosling plague,GP）和EDS混合感染。将病料匀浆接种SPF鸭胚盲传至第5代致胚体死亡,继续传至20代,期间进行PCR检测,表明只有EDSV增殖,病毒得到初步纯化。同时,将鸭胚毒接种鸭胚肝细胞（Duck embryo Liver cell,DEL）,72 h后出现EDSV典型的细胞病变。血凝实验表明分离毒只凝集鸡、鸭、鹅等禽类红细胞,不凝集牛、兔、羊等哺乳动物红细胞。扫描电子显微镜观察纯化后的病毒粒子,呈现腺病毒粒子典型形态。以上结果证实分离毒株为EDSV,命名为JL-EDSV-629株。根据Gen Bank上已经发表的EDSV基因组序列,利用引物设计软件设计了15对相互重叠的引物扩增JL-EDSV-629株,除两端的非编码区5’UTR和3’UTR外的基因组序列,拼接测序结果并进行同源性分析。结果表明共获得33215 nt的基因组序列,A+T含量为56.98%,符合富AT腺病毒特征;共编码29个ORF,主要为六邻体（hexon）、五邻体（penton）、纤维蛋白（fiber）、p VIII、p IIIa、p VII、p X和TP等结构蛋白,和DBP、IVa II、52K、EP、100K等非结构蛋白;与EDSV参考毒株AV-127、EDS和D11-JW-032相比,JL-EDSV-629株共有49个核苷酸发生突变,其中16个为错义突变。与EDSV参考毒株基因的氨基酸相比,其中同源性为100%的有penton、p X、hexon、DBP等19个基因,同源性为99.3%～99.8%的有TP、p VII,fiber等10个基因。生物信息学分析表明,该分离毒的基因组结构及基因排列顺序与EDSV参考毒株完全一致。核苷酸序列同源性分析及系统发育进化树分析表明,JL-EDSV-629株与富AT腺病毒属参考毒株同源性较高且亲缘关系较近,其中与EDSV参考毒株同源性达到99.8%,亲缘关系最近;与同属BAd V-4、OAV-287及Sn Ad V-1毒株达到54.6%～60.4%。与其他腺病毒属参考毒株同源性仅有25.8%～36.1%。同时,本研究制备了鸭抗JL-EDSV-629株多克隆抗体,多抗的血凝抑制（Hemagglutination Inhibition,HI）效价可达到13log2。利用原核表达系统制备了penton重组蛋白,ELISA结果显示penton的特异性抗体效价为1:16000,Western Blot结果显示制备的多抗与penton重组蛋白有良好的反应性,为后续研究该分离毒株的血清学诊断方法及结构蛋白的生物学功能提供物质基础。
胥成超[2]（2019）在《鸭坦布苏病毒的分离鉴定及其油乳剂灭活苗制备》文中认为鸭坦布苏病毒病是感染鸭的主要病毒病之一,群内发病率能达到100%,死亡率不高,在没有继发感染情况下死亡率在10%以下。主要表现生长发育迟缓,产蛋下降,甚至停产,对种鸭的危害性巨大,给养殖户造成严重经济损失,同时极大地限制了养鸭业的健康可持续发展。扬州市广陵区某养鸭场鸭群发病,表现体温升高,头颈震颤,站立不稳,食欲废绝,个别病鸭排绿色稀粪。本文采集多份鸭病料接种鸡胚,分离获得了一株毒株,经RT-PCR鉴定该毒株为坦布苏病毒,命名为YZDTV-18。利用该毒株对其生物学特性、致病性、细胞感染性等方面进行了研究。结果表明,该分离株核苷酸同源性比对与鸭坦布苏病毒的同源性最高,达97.5%99.6%;与黄病毒科其他代表登革热病毒、西尼罗病毒遗传进化距离较远。毒株接种7日龄雏鸭能引起死亡,出现明显临床症状和病变,该毒株EID50为10-4.15,表明该毒株致病性较强。毒株理化特性分析表明,对氯仿、高温、酸性、胰蛋白酶敏感,没有血凝活性。YZDTV-18株接种鸭胚成纤维细胞后出现细胞凋亡脱落,进一步证明该毒株具有较强致病性。免疫接种是预防和控制该病的关键措施之一,有效及针对性的疫苗对于该病的预防至关重要。本研究以YZDTV-18分离株作为抗原,甲醛灭活后制备油乳剂灭活苗,免疫45周龄父母代高邮鸭,分析疫苗对种鸭产蛋率、采食量、保护率的影响。结果显示,免疫鸭血清中和效价最高达到为1:19,免疫鸭群在攻毒后采食量、产蛋率与健康对照组没有显着差异,而未免疫鸭群在攻毒后采食量、产蛋率明显下降。疫苗能有效抵御病毒感染,免疫鸭在攻毒后未出现临床症状及病理变化,而攻毒对照组出现临床症状,表现为精神萎靡,拉绿色粪便,并有死亡病例。发病鸭剖检可见卵泡出血,脾脏坏死,病理组织学可见肝脏脂肪变性及坏死,脾脏淋巴细胞浸润。综上所述,本研究在广陵区某养鸭场病鸭群分离到一株致病性较强的坦布苏病毒,并以该毒株作为灭活抗原开展了对高邮鸭种鸭的免疫保护评价,研究结果为鸭坦布苏病毒感染防控及疫苗的研究提供参考。
汪小丽[3]（2018）在《鸭坦布苏病毒卵黄抗体制备》文中提出鸭坦布苏病是鸭的一种烈性传染病,是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）引起的以蛋鸭的产蛋量下降,严重侵害生殖系统和20日龄左右雏鸭出现头颈震颤,四肢麻痹等神经症状为主要特征的疾病。该病严重影响我国养鸭业的发展,目前尚无有效的治疗措施。治疗用抗体属于被动免疫制剂,具有安全、特异、高效、无残留等优点。为了获得一款可用作紧急预防和治疗鸭坦布苏病毒病的被动免疫生物制剂,本研究以临床分离的鸭坦布苏病毒为基础毒株,经RT-PCR定后作10倍稀释,经尿囊腔接种于11日龄麻鸭胚,连续传代7次后,死亡时间集中在35 d,死亡胚体全身充血、头颈背部肌肉点状出血,肝脏坏死,病死胚明显小于正常鸭胚。将收集的尿囊液离心去除杂质,再经切向流浓缩。加入β丙内脂灭活病毒,与佐剂按重量比3:7混合,制成鸭坦布苏病毒灭活疫苗。以该灭活疫苗三次免疫蛋鸡,每次免疫间隔周期为14 d,首免剂量为1 mL/只,二免和三免剂量均为0.2 mL/只,免疫途径均为颈背部和胸部皮下多点注射。三免后两周收集高免鸡蛋,提取蛋黄液。再经过水稀释法抽提、硫酸铵盐析、小型切向流超滤浓缩、透析除盐分离纯化卵黄中的IgY（Immunoglobulin of yolk）抗体。为确定制备卵黄抗体的生物活性,采用间接ELISA试验测定其抗体效价。结果显示,以RT-PCR方法可从尿囊液中扩增153 bp的DNA片段,经测序为DTMUV。该毒株的ELD50约为102.9/0.2 mL。制备的灭活疫苗呈乳白色,液质均匀。获得的粗制抗体呈白色半透明,液质均匀。间接ELISA测得卵黄抗体效价达29210。本试验从临床上鸭坦布苏病病例出发为制备鸭坦布苏病毒灭活苗和卵黄抗体奠定了基础,为有效预防和治疗鸭坦布苏病毒病提供了理论依据和技术手段。然而IgY也有很多问题有待解决,其制备受禽的免疫程序及方式,日龄和品种等各方面影响,其效果评价和质量检测标准也还没有规范。这些因素都会影响抗鸭坦布苏病毒病高免卵黄抗体在实际临床防治应用中的效果。
吕金宝[4]（2018）在《鸭坦布苏病毒病疫苗免疫雏鸭的研究》文中进行了进一步梳理【目的与意义】鸭坦布苏病毒病是2010年在我国出现并开始流行的一种新发急性传染病,其临床症状主要表现为蛋鸭产蛋量骤然下降,剖检以出血性卵巢炎为主要病变。疫苗免疫接种是预防和控制传染病的主要措施之一,目前预防鸭坦布苏病毒病的疫苗有商品化的灭活苗和活苗,但是对于雏鸭选择何种疫苗免疫,业界存在较多争议。本试验采用实验室自制鸭坦布苏病毒病弱毒疫苗和灭活疫苗在安全性和效力两方面进行比较,为雏鸭在防控该病过程中疫苗的使用提供参考依据。【方法】采用鸭坦布苏病毒病灭活疫苗和弱毒疫苗,对金定鸭雏鸭进行安全性和免疫效力比较。实验室自制弱毒疫苗、灭活疫苗各3批,免疫7日龄和4周龄雏鸭,设立非免疫对照组。免疫期间观察临床症状,体重变化,剖检观察临床病理变化,并通过病理组织学观察,对灭活疫苗和弱毒疫苗对雏鸭的安全性进行研究。选取弱毒疫苗、灭活疫苗各3批,分别对7日龄和4周龄雏鸭进行常规免疫（首免0.5 mL,首免后14 d进行二次免疫）,设立非免疫对照组。免疫不同时期采血测定鸭坦布苏病毒病HI抗体效价,同时进行鸭坦布苏病毒人工感染试验,以0.5 mL/只的剂量进行肌肉注射(含100个DID50),攻毒2 d后采血分离血清,测定免疫攻毒保护率,攻毒后1周剖检,观察病理变化,并通过病理组织学观察,对灭活疫苗和弱毒疫苗的对雏鸭的保护效力进行研究。【结果】安全性试验:在免疫鸭坦布苏病毒病弱毒疫苗和灭活疫苗后,弱毒疫苗组体重与灭活苗活组和对照组体重相比较轻,呈现显着性差异（P<0.05）。病理学检查表明,弱毒苗免疫组,脾脏明显肿大,白髓内淋巴细胞坏死、崩解、出现空斑;肝脏轻微肿大,土黄色,肝细胞严重脂肪变性,见血管周围炎;脑组织出现轻微水肿,血管周围形成淋巴细胞性管套;肾脏出现炎性细胞浸润。灭活苗组与对照组试验鸭均只是肝脏出现轻微脂肪变性,无其他病变。效力检验:在免疫后测定HI抗体效价水平弱毒疫苗组高于灭活苗组,并且弱毒疫苗组产生抗体迅速;但灭活苗组也可产生较高的抗体保护水平。弱毒苗攻毒保护率（91.3%）高于灭活苗组（76.48%）。【结论】安全性试验:鸭坦布苏病毒弱毒苗免疫后对试验雏鸭免疫系统有一定损伤,减缓机体发育,该病灭活苗未见引起明显病变。效力检验:弱毒苗免疫后在产生抗体速度和含量上均高于灭活苗,并且攻毒保护率高于灭活苗。
李桂平[5]（2017）在《鸭黄病毒病的流行与防控研究》文中认为笔者阐述鸭黄病毒病的发展历史以及病原特性、流行病学、临床症状、诊断方法、防控措施,为养殖户提供参考,减少损失。
张英[6]（2015）在《坦布苏病毒在种鸭中垂直传播及其对种鸭的致病性研究》文中提出坦布苏病毒感染（Tembusu virus infection）,是我国在2010年新出现的由坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）引起的一种传染性疾病,该病主要引起产蛋鸭产蛋下降以及雏鸭出现头颈震颤、四肢麻痹等神经症状。目前该病在我国养鸭集中的地区均有发生,给养鸭业造成了巨大的损失（Su,et al.2011）。TMUV属于黄病毒科（Flaviviridae）、黄病毒属（Flavivirus）、恩塔亚病毒群（Ntaya virus group）（Cao,et al.2011）。本试验就TMUV能否在种鸭中垂直传播及TMUV对种鸭的致病性进行研究,为该病的控制提供可靠的流行病学依据。1、自然感染病例种鸭、种蛋、鸭胚、雏鸭中TMUV检测2013年,山东省聊城、泰安、广饶地区共4个种鸭场相继发生TMUV自然感染。收集发病鸭产的种蛋,共125枚。从中随机抽取35枚种蛋,无菌收取卵黄膜样品。将其余90枚种蛋（自然感染组）全部孵化,按照孵化场中樱桃谷种鸭蛋孵化要求设置孵化参数。同时,取20枚健康樱桃谷种鸭蛋作为对照组进行孵化。将不同来源的种蛋分开孵化。每天照蛋一次,挑出未受精蛋和死亡鸭胚,及时无菌收取卵黄膜或胚脑、肝、脾等样品。对出壳雏鸭在1日龄剖杀,取脑、肝、脾等组织。所有收取的样品置于-80oC保存。通过尿囊腔途径接种9日龄健康鸭胚进行病毒分离,采用半套式RT-PCR检测方法对收获的尿囊液进行病毒检测。结果显示,自然感染组总受精率为82.22%（74/90）,总孵化率为62.16%（46/74）;对照组的受精率和孵化率分别为95%（19/20）和84.21%（16/19）。在孵化过程中,28枚（31.1%）鸭胚死亡,剖检可见胚脑充血、出血、水肿,心脏和肝脏出血。病毒检测结果显示,种蛋、死亡鸭胚和雏鸭中TMUV检出率分别为51.43%（18/35）、60.71%（17/28）和10.87%（5/46）。此外,挑出的16枚未受精种蛋中有2枚检测为TMUV阳性（12.5%）。总计,自然感染组的TMUV总检出率为33.6%（42/125）。对照组的种蛋、鸭胚和雏鸭检测均为TMUV阴性。首次从死亡鸭胚中分离到一株TMUV,命名为TMUV-SDDE株,该分离株的ELD50为10-2.50/0.2 mL。用PCR扩增TMUV-SDDE的E基因,测序。序列分析结果显示,TMUV-SDDE与其他TMUV分离株的同源性高达96%-99.5%。经动物回归试验,可以从攻毒雏鸭中重新分离到该病毒。根据本试验结果,我们推测TMUV可能经种蛋发生垂直传播。2、tmuv人工感染动物模型的建立基于上述试验结果,我们通过人工感染tmuv阴性的健康樱桃谷种鸭建立动物模型,进行tmuv能否垂直传播及tmuv对种鸭致病性的研究。将38周龄的樱桃谷种鸭随机分为a、b、c、d、e五组。a、b、c三组,每组15只母鸭、4只公鸭,公母鸭混群饲养。a组母鸭和b组公鸭静脉接种tmuv-sdsg株（eld50=10-2.37/0.2ml）,2.5ml/只,a组公鸭和b组母鸭不接种病毒。c组作为对照组,接种等量生理盐水。d和e组各20只母鸭,d组静脉接种2.5ml的tmuv-sdsg株,e组接种等量生理盐水。各组隔离饲养。收集a、b、c三组种蛋,分别孵化,记录种蛋受精和孵化情况。出壳后的1日龄雏鸭,随机剖杀其中的一部分,取脑、肝、脾等。其余的雏鸭饲养于spf隔离罩中,至15日龄剖杀,取脑、肝、脾等。收取饲养过程中死亡雏鸭的上述组织。对收集的各组织进行处理后,接种鸭胚进行病毒分离和半套式rt-pcr检测。结果显示,a组种蛋的受精率和孵化率分别82.2%（74/90）和62.2%（46/74）,b组种蛋的受精率和孵化率分别为78.0%（67/86）和65.7%（44/67）,而c组种蛋的受精率和孵化率分别为94%（94/100）和85.1%（80/94）。a组43枚和b组37枚鸭胚在孵化过程中死亡。剖检可见,胚体出血、卵黄吸收不良、卵黄稀薄、肝脏或心脏出血。有的鸭胚颈部水肿、出血,脑水肿、充血。a组4只和b组7只弱雏死亡,剖检可见脑水肿、或有出血点,卵黄吸收不良。病毒检测结果显示,a组种蛋、死亡鸭胚、1日龄雏鸭、15日龄雏鸭和死亡弱雏中tmuv检出率分别为60%,67.44%,35.48%,16.67%和100%。b组相应的tmuv检出率分别为50%,51.35%,46.88%,10%和71.43%。c组各样品未检测到tmuv。将阳性扩增片段进行序列分析,结果与tmuv-sdsg株同源性在98.7%-100%。从种蛋、鸭胚到孵出的雏鸭均能检测到tmuv,表明tmuv可以通过感染的种鸭经鸭胚传给下一代,即tmuv可以在种鸭中发生垂直传播。3、tmuv对种鸭的致病性研究d和e组,每组随机标记出10只,分别在1、4、7、10、13、16、19dpi采血一次,采集泄殖腔棉拭子样品一次,用间接elisa方法检测鸭血清中抗体水平,用细胞因子检测试剂盒检测ifn-γ和il-4水平,用半套式rt-pcr检测攻毒鸭排毒情况。每组另外10只,分别在3、7、11、15、19dpi随机剖杀两只,无菌采集脑、肝脏、脾脏、卵泡膜等组织,制作病理切片,用荧光定量pcr检测各组织中tmuv载量。结果显示,攻毒后,攻毒组种鸭产蛋下降（约由80%至60%）,排白色稀便。攻毒组种鸭抗体水平从1dpi后开始升高;至10dpi左右,达到最高水平;之后逐渐下降。IL-4和IFN-γ表达水平均在1dpi后开始上升,分别在13dpi和16dpi达到高峰,之后开始下降。对照组种鸭的抗体阴性,IFN-γ和IL-4表达水平无明显变化。从4dpi开始能够检测到排毒,一直持续到试验结束时（19dpi）检测仍为阳性。在3dpi时,仅脑、胰脏、卵泡膜检测为TMUV阳性;在7dpi时,卵泡膜、脑、胰脏、脾脏、肝脏、十二指肠检测为TMUV阳性;从11dpi开始,各组织均检测为TMUV阳性,其中卵泡膜、脑、胰脏、肝脏病毒载量较高。上述结果表明,TMUV感染种鸭后能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;病毒主要侵害种鸭的卵泡、脑、胰脏、肝脏等组织器官;攻毒后种鸭可经泄殖腔排毒,且持续时间较久,有利于TMUV在鸭群中的传播。
于可响[7]（2013）在《鸭坦布苏病毒生物学特性、基因组特征、诊断方法以及感染性克隆的研究》文中指出鸭坦布苏病毒感染于2010年在我国首次爆发,迅速席卷了整个养鸭密集地区,给我国养鸭业造成了巨大损失,目前该病已成为我国主要鸭病之一。本研究从病毒的生物学特性、基因组测序与进化分析、实验室诊断方法的建立以及感染性克隆的构建等四个方面对鸭坦布苏病毒进行了相关研究。1、病毒分离鉴定与特性分析从全国各地发病的鸭群中分离到十多株鸭坦布苏病毒,通过理化特性分析,发现该病毒不能凝集鸡、鸭、鹅和鸽的红细胞,对氯仿和去氧胆酸钠敏感,对酸敏感,不耐热,MgCL2起不到保护作用。通过电镜观察,我们发现该病毒为圆形或椭圆形粒子,大小约为50nm。该病毒可通过鸡胚或鸭胚进行分离,胚体在72h～120h内死亡,胚体水肿,胚肝出血、坏死明显。该病毒在DEF、Vero、DF-1、BHK-21等细胞上生长良好、病变明显。不同毒株对CEF的适应性存在较大差异,有的毒株盲传3代就可适应CEF,而有的毒株盲传6代仍不适应。动物回归试验显示,通过脑内、颈部皮下和点眼滴鼻口服三种途径均能复制出该病典型的症状和病变,但这三种途径发病快慢有所差别,脑内接种最快,点眼滴鼻口服最慢。2、基因组测序与进化分析我们通过随机引物以及参考其他黄病毒设计的引物扩增得到鸭坦布苏病毒BZ-10株的全基因组序列,进而又完成了另外5株病毒基因组测序工作。通过对基因组的分析,我们发现6株病毒的基因组全长均为10990nt,包含一个长10278nt的阅读框（ORF）,编码一个长3426aa的多聚蛋白,5’UTR长94nt,3’UTR长618nt,多聚蛋白包括10个蛋白,除了WFZ-12株外,其他5株病毒基因组均有17个糖基化位点,而WFZ-12株E蛋白的第154位氨基酸的糖基化位点缺失。通过对鸭坦布苏病毒的遗传进化分析,我们发现,该病毒与从马来西亚库蚊中分离到的Tembusu virus口从发病肉鸡中分离到的Sitiawan virus的遗传关系最近,同源性分别为88.7%和87.3%。通过对鸭坦布苏病毒E蛋白的空间结构进行模拟分析发现,该病毒E蛋白包括三个功能区,有两个糖基化位点,分别位于第103位和第154位氨基酸处,其中第103位糖基化位点在病毒复制和致病性方面可能起着重要的作用。大多数鸭坦布苏病毒E蛋白的第154位氨基酸处有个糖基化位点,但是WFZ-12株的第154位氨基酸未发生糖基化,而Tembusu virus和Bagaza virus同样存在这种情况。这提示着,鸭坦布苏病毒在疾病进展过程中,它的一些感染机制可能正在发生着改变。通过进化树分析,我们发现鸭坦布苏病毒根据E基因可划分为Ⅰ、Ⅱ两个基因型,其中基因Ⅱ型又可细分为Ⅱ.a和Ⅱ.b两个亚型。有意思的是,基因Ⅰ型的毒株均为2010年分离,这似乎提示近两年该病毒有一定的变异。但分属于Ⅰ、Ⅱ.a和Ⅱ.b三个基因型的BZ-10、GX-11、FX-12这三株病毒的血清交叉中和试验显示,它们的中和指数都在0.9以上,这说明它们属于同一血清型,也就是说明这三株病毒虽然在基因型上有些许差异,但在抗原性上并没有发生变异。3、实验室诊断方法的建立针对病原检测,我们建立了RT-PCR和荧光定量PCR两种检测方法,临床应用表明,这两种方法都具有快速、准确、敏感性高、特异性好等优点,其中RT-PCR方法对病毒的最低检出毒价为1.0TCID50/0.1ml,而荧光定量PCR的最低检出毒价为0.1TCID50/0.1ml,敏感性更高。针对抗体检测,我们以原核表达的E蛋白作为包被抗原建立了高通量的间接ELISA检测方法,该方法的临界值为0.336,与血清中和试验的符合率为95.0%。4、感染性克隆的构建利用基因组内部的酶切位点作为连接位点,将基因组分为五个片段分别进行扩增,然后将这五个片段依次克隆入pBR322载体,得到BZ-10株基因组全长cDNA克隆。测序表明,该cDNA克隆与亲本毒的序列同源性达到99.9%,其中5’端和3’端非编码区完全一致,多聚蛋白的氨基酸序列也十分忠实。全长cDNA克隆体外转录出的RNA转染DF-1细胞,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验和酶切鉴定,结果表明我们成功拯救到子代病毒BZ10-R。子代病毒在鸡胚尿囊液中的ELDso为104.6/0.2mL,在DF-1上的TCID50为105.3/0.2mL,与亲本毒的差别都不大。但是,由于我们在构建cDNA克隆时,选择了外源基因容量并不是很大的pBR322载体,最终得到cDNA克隆很不稳定,可能为后续的工作带来了困难。
杨少艳[8]（2013）在《鸭坦布苏病毒E和NS1基因序列分析及其重组蛋白的初步应用》文中指出鸭坦布苏病毒病自2010年4月以来，在我国主要养鸭地区爆发，该病主要引起肉鸭的神经症状、产蛋鸭的产蛋量急剧下降，传播非常迅速，波及范围较大，给我国养鸭业带来巨大经济损失。为给该病的流行病学调查以及后续疫苗的研制提供免疫效果评价的依据，本研究成功表达了囊膜蛋白E和非结构蛋白NS1，并分别建立了E蛋白和NS1蛋白间接ELISA检测方法，与血清中和试验相比，间接ELISA检测方法省时省力且成本低廉，更适用于大批量样品检测。本研究还对鸭坦布苏病毒E基因和NS1基因进行了序列分析，为鸭坦布苏病毒病防控技术的研究提供了依据。本研究主要分为3部分：1．鸭坦布苏病毒E基因、NS1基因的序列分析将E基因和NS1基因的测序结果利用DNAstar软件包MegAlign程序进行序列比对分析，发现DTMUV的E蛋白与NS1蛋白与登革热病毒、黄热病毒等常见且危害严重的黄病毒的氨基酸同源性较低，仅在48-50％之间，而与1955年从马来西亚吉隆坡库蚊中分离到的Tembusu virus和2000年从马来西亚发病肉鸡中分离到的Sitiawan virus的氨基酸同源性很高，均在93％以上。利用MEGA4.0生物学软件分别对鸭坦布苏病毒的E基因和NS1基因进行遗传进化分析，通过系统进化树可以发现，鸭坦布苏病毒LC-10株与Tembusu virus和Sitiawan virus有较近的亲缘关系，而与登革热病毒、黄热病毒等的亲缘关系较远。2．鸭坦布苏病毒E基因的原核表达及初步应用参照GenBank已发表的鸭坦布苏病毒基因序列，设计一对特异性引物，利用PCR方法从鸭坦布苏病毒山东分离株（LC-10株）扩增出整个E基因，全长1503bp，将其克隆到pMD18-T载体中，然后将双酶切的目的片段亚克隆入pET-28a（+）载体，成功构建出重组表达质粒PET28a-E。将PET28a-E转化BL21（DE3）后，经IPTG诱导可表达出约58KD的蛋白，经Western blotting分析呈阳性，表明E蛋白具有很好的反应原性。(杨少艳等，2012以纯化的E蛋白作为包被抗原，鸭坦布苏病毒血清作为一抗，HRP标记的羊抗鸭IgG作为二抗建立间接ELISA方法。采用该方法对80份送检鸭血清进行检测，并与中和试验进行比较，结果显示，两者符合率为95.0%，表明该方法具有较好的应用前景（杨少艳等，2012）。3．鸭坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达及初步应用黄病毒的非结构蛋白NS1是在病毒感染细胞时产生的，因此可利用NS1蛋白来区分自然感染和灭活苗免疫产生的抗体。故本研究参照GenBank已发表的鸭坦布苏病毒基因序列，设计一对特异性引物，利用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒的NS1基因，利用大肠埃希菌表达系统对鸭坦布苏病毒的NS1蛋白进行重组表达，经IPTG诱导，表达出分子量约为43KD的蛋白，Western blotting分析呈阳性，说明表达的NS1蛋白有很好的反应原性。利用纯化的NS1蛋白作为包被抗原，以鸭坦布苏病毒阳性血清为一抗，HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗建立间接ELISA检测方法，该检测方法的建立为判断鸭体内的抗体是否是自然感染所产生的打下基础。
唐熠[9]（2013）在《坦布苏病毒的分离鉴定及重组腺病毒介导shRNA抑制坦布苏病毒在体外复制的研究》文中提出坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）是导致肉鸭神经症状及产蛋鸭出血性卵巢炎（duck hemorrhagic ovaritis，DHO）的主要病原，主要引起20日龄以内的雏鸭出现严重的神经症状，死淘率增高及产蛋鸭的产蛋大幅下降。发病雏鸭通常表现为采食量下降，腹泻，共济失调，瘫痪等症状。发病蛋鸭体温升高；四肢无力、瘫痪；食欲废绝；发病后不久开始产蛋大幅下降；发病后期排草绿色稀便，气味恶臭，出现神经症状。剖检可见卵泡破裂出血，卵黄性腹膜炎，脾脏出血，胰腺出血坏死，肝脏肿大、出血。TMUV属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类的恩塔亚病毒群，是一种具有包膜的单股正链RNA病毒，通过节肢动物的叮咬进行传播而导致宿主发病。病毒的基因组全长约为11kb，包含5’和3’的非编码区，仅含有一个开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码3种结构蛋白和8种非结构蛋白。其中包膜蛋白（Envelop protein，E）蛋白是病毒的主要结构蛋白，与病毒的吸附，融合，注入，血凝性及宿主范围和细胞嗜性有密切关系；NS5蛋白为TMUV分子量最大的蛋白，也是最保守的蛋白，它具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，与病毒基因组的复制密切相关。在本研究中我们利用建立的多种TMUV核酸检测方法应来确定TMUV感染的宿主范围，以阐明该疾病的流行特点。并利用腺病毒介导shRNA技术靶向干扰E基因和NS5基因，探索TMUV防治的新策略，为我国有效防治该病奠定基础。1. TMUV的半套式RT-PCR检测方法的建立根据与TMUV同源性较高的Bagaza病毒的NS3基因的保守序列设计了3条引物，建立了一种适用于TMUV检测的半套式RT-PCR快速检测方法。采用该方法对TMUV山东分离株进行检测。结果显示,半套式RT-PCR对两株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对照病原：鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合症病毒、扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示第一轮扩增的敏感度1×105copies/μL，第二轮扩增的敏感度为1×102copies/μL，第二次扩增的敏感性比第一次高103倍；该方法对山东省各地采集的24份疑似病料的检测出率可达87.5%。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于TMUV感染的临床诊断和流行病学调查。2. TMUV的RT-LAMP检测方法的建立及四种核酸检测方的比较根据TMUV的NS5基因的保守序列设计一套引物，建立了一种适用于TMUV的逆转录环介导等温扩增快速检测方法。该方法检测的敏感性可达1×101拷贝/μL；对3株TMUV山东分离株的检测均为阳性，而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、扩增结果均为阴性;应用该方法对山东省各地采集的76份疑似病料可检出68份阳性。表明本试验所建立的环介导等温扩增检测方法简便、快速、灵敏、特异性高，可用于TMUV感染的临床诊断和流行病学调查。利用针对TMUV的NS5基因建立的RT-PCR,半套式RT-PCR,荧光定量RT-PCR及RT-LAMP四种检测方法对系列稀释的质粒DNA以及TMUV基因组RNA进行检测，评价4种检测方法的检测敏感度。结果显示四种检测方法的质粒检测敏感度分别为2×104拷贝/μL,20拷贝/μL,2拷贝/μL和20拷贝/μL,基因组RNA的检测敏感度分别为100pg,100fg,10fg和100fg。在针对采自疑似TMUV感染的鸭场的69份泄殖腔棉拭子的检测中，四种检测方法的检出率分别为38/69（55.1%）,52/69（75.4%）,57/69（82.6%）和55/69（79.7%）。综上所述，四中核酸检测方法中RT-LAMP以其在敏感度，特异性及检测时间等方面的优势，作为TMUV检测中的首选检测方法。3.不同宿主来源的TMUV的分离鉴定为研究TMUV的自然感染宿主范围及流行特点，我们从山东省各地采集麻雀样品68份，蚊子样品35组，蛋鸡样品73份，蛋鸭样品132份和雏鸭样品112份，应用建立的半套式RT-PCR进行TMUV的检测，并对阳性样品进行分离鉴定。结果显示5种样品的检出率分别为66%（45/68）,60%（21/35）,33%（24/73）,62%（82/132）和69%（77/112）。对每类样品选取一株分离株进行NS5基因的序列分析，结果5株分离株的NS5基因同源性高达99.5%以上。代表毒株TMUV-SDHS与经典毒株YY5，BYD的相应基因的同源性在99%以上，与TMUV国外分离株的同源性在87%-91%之间。攻毒试验显示TMUV-SDHS及TMUV-SDMS可以引起55周龄的樱桃谷鸭种鸭发病且临床症状与剖检变化与自然感染病例一致。以上结果表明山东省TMUV感染现象已经十分普遍；山东省不同宿主来源的TMUV分离毒株为同一种病毒；TMUV不仅可以感染产蛋鸭及雏鸭也可以感染蛋鸡和麻雀，但无明显症状；麻雀及蚊子可携带TMUV并与TMUV在自然界中的传播有着密切的关系；麻雀携带TMUV与该病毒在冬季仍然流行有着密切关系。4.TMUV山东分离株全基因序列的测定及分析从山东潍坊发生产蛋下降的鸭群中分离到一株TMUV（SD1001），应用RT-PCR及RACE技术对该分离株的全基因序列进行测定并对获得的序列进行分析。结果显示该TMUV分离株为单股正链RNA病毒，基因组全长10990nt，仅含有一个独立的开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码3410个氨基酸。基因组两端分别为5’和3’非编码区，长度分别为142nt和618nt。病毒基因组共编码11种蛋白，其中3种结构蛋白，8种非结构蛋白。通过将各编码蛋白的氨基酸序列与JEV、WNV、YFV、DEN2V、BAGV、TBEV的相应序列进行比较，结果TMUV与BAGV的氨基酸同源性最高（81.4%），与TBEV的同源性最低（41.8%）。同时TUMV的非编码区序列与BAGV具有高度的一致性，包含多个保守区域（conserved sequences, CS），CS序列为RCS3-CS3-RCS2-CS2-CS1。以上研究结果为研究病毒宿主特点及组织嗜性提供了有力的数据支持。5.腺病毒介导shRNA在体内外抑制TMUV复制研究.RNA干扰（RNA interference, RNAi），又称RNA沉默，是指双链RNA特异性诱导mRNA降解的过程，是一种转录后基因表达沉默（post transcripitional gene silence,PTGS）现象。近年来RNAi在疾病治疗领域展现出极大的潜力，特别是抗病毒治疗等方面。（1）靶向干扰TMUV E基因和NS5基因shRNA序列的筛选本研究针对TMUV的E和NS5基因分别设计构建了三个特异性shRNA（short hairpinRNAs）表达载体pSilencer-E1、 pSilencer-E2、 pSilencer-E3及pSilencer-NS51、pSilencer-NS52、pSilencer-NS53。用RT-PCR扩增TMUV的E、NS5部分基因,纯化后将二者分别克隆到pEGFP-N1载体中,构建荧光报告重组质粒pEGFP-E和pEGFP-NS5。干扰载体和目的基因报告载体共转染293T细胞后的检测结果表明，6个干扰载体均不同程度的干扰了目的基因的表达，其中pSilencer-E1及pSilencer-NS52的抑制效果最佳，分别为75.8%和68.7%。将六种的shRNA表达载体分别转染293T细胞，转染24h后接种TMUV病毒，接种后48h应用相对定量荧光RT-PCR上述试验中病毒RNA的相对数量。结果显示两种干扰载体都能有效干扰病毒在细胞中的复制，抑制效率分别为74%及86%，因此选择pSilencer-NS52用于进一步研究。（2）干扰TMUV复制的重组腺病毒的构建与鉴定表达shRNA-NS52的腺病毒载体的构建采用AdMax载体系统，将shRNA-NS52表达盒从pSilencer-NS52转移到腺病毒穿梭载体pDC312上，构建重组穿梭载体pDC312-NS52。将腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1与pDC312-NS52穿梭质粒按1:3比例共转染HEK293细胞，进行同源重组,成功产生重组腺病毒pAd-NS52并通过HEK293细胞多次扩增后测定重组病毒滴度分别为2.1×109PFU/ml.（3）重组腺病毒介导的shRNA抑制TMUV在HEK293细胞中复制的研究为评价重组腺病毒pAd-NS52对TMUV的体外干扰效果。将重组病毒pAd-NS52接种HEK293细胞，24h后再接种TMUV病毒，继续培养48h后用相对荧光定量RT-PCR检测TMUV。结果显示pAd-NS52可以显着抑制TMUV在HEK293细胞中的复制。试验中发现pAd-NS52的抑制效果与感染剂量有关，当感染剂量500个MOI时，抑制效果为88%。
李成益[10]（2012）在《鲁北地区种鸭场鸭坦布苏病毒病综合诊断及流行病学调查》文中研究说明鸭坦布苏病毒病于2010年在我国发生以来,该病迅速波及全国主要养鸭地区,已成为危害养鸭业最严重的传染性疾病之一,给养鸭业造成了巨大的经济损失,引起了国内学者及生产者的高度关注。六和集团做为全国饲养肉鸭最大的公司之一,自2010年8月份以来,公司的许多肉种鸭场和商品肉鸭场遭受了鸭坦布苏病毒感染,六和公司鲁北片区种鸭场5个,存养肉种鸭1800个单元,母鸭20.7万套,是六和集团最大的种鸭公司之一,在2012年1月之前未见该病发生,但2012年2月初两种鸭场突然发生疑似疾病,为了解该区域种鸭场鸭坦布苏病毒的感染状态及流行情况,对该区域发病种鸭场进行综合诊断,对病鸭的发病规律、临床症状及病理学变化进行系统观察,并进行了病毒分离鉴定及病毒分子生物学特性研究,以期为鸭坦布苏病毒病的有效防控提供科学的理论依据。研究结果表明：2012年1月份以前,鲁北片区各种鸭场并未遭到鸭坦布苏病毒感染,这主要得益于良好的生物安全措施。而2012年2月初两产蛋高峰期种鸭群突然遭受了鸭坦布苏病毒病的侵袭,鸭群抗体阴性,加之处于产蛋高峰期的应激反应,使鸭群处于极度易感状态,该区域社会鸭该病广为流行,是两鸭群发病的主要原因。病鸭心内、外膜出血,卵泡膜充血、出血,卵泡液化、破裂,回肠中部淋巴组织集中处黏膜发生局灶性灰白色卵圆形肿胀,是本病最具特征的剖检病变。另外肝脏土黄色肿大,脾脏肿大、坏死也具有一定的参考价值。轻度病毒性脑炎病变,回肠黏膜肿胀处淋巴组织显着增生,脾脏淋巴细胞不同程度的坏死病变,肝细胞普遍表现变性坏死及淋巴细胞浸润,卵泡膜充血、出血,卵巢淋巴细胞浸润,是该病的组织病理学病变特征。竞争ELISA的方法检测鸭坦布苏病毒抗体,具有准确、灵敏之特点,对了解鸭群的感染状态、疫苗免疫效果评价、风险评估等具有重要参考价值。病料多代次鸡胚接种及PCR检测是较灵敏的病原学检测方法。鸭坦布苏病毒病的出现势必要打破原有鸭病尤其是病毒性肝炎、禽流感、副黏病毒病的平衡,使鸭病的发生复杂化。因而在饲养的过程中应加强饲养管理,健全生物安全体系,严格执行免疫计划,增强鸭群集体免疫力,减少疾病的发生,减少经济损失。
二、上海地区爆发蛋鸭“类减蛋综合症”（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、上海地区爆发蛋鸭“类减蛋综合症”（论文提纲范文）
（1）鹅源减蛋综合征病毒的分离鉴定及其基因组的进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 腺病毒概述 |
| 1.2 EDS的病原学 |
| 1.2.1 EDSV的分类 |
| 1.2.2 EDSV基本生物学特性 |
| 1.2.3 EDSV的基因组结构与复制周期 |
| 1.2.4 EDSV的蛋白及功能 |
| 1.3 EDS的流行病学与致病性 |
| 1.3.1 发生与分布及存在的问题 |
| 1.3.2 传播、携带者和传播媒介 |
| 1.3.3 致病性及其致病机制 |
| 1.4 EDS的诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 剖检及组织学诊断 |
| 1.4.3 病毒的分离 |
| 1.4.4 血清学诊断 |
| 1.4.5 分子生物学诊断 |
| 1.5 EDS的防治 |
| 1.5.1 综合防治措施 |
| 1.5.2 疫苗 |
| 1.5.3 药物防治 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料及试验动物 |
| 2.1.2 质粒、菌株及载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 JL-EDSV-629 毒株的分离 |
| 2.2.2 JL-EDSV-629 毒株的鉴定 |
| 2.2.3 JL-EDSV-629 毒株在鸭胚上传代及血凝价测定 |
| 2.2.4 JL-EDSV-629 毒株基因组克隆 |
| 2.2.5 JL-EDSV-629 毒株基因组生物信息学分析 |
| 2.2.6 全病毒多抗血清的制备及抗体效价的测定 |
| 2.2.7 JL-EDSV-629 毒株penton的克隆及原核表达 |
| 2.2.8 penton特异性抗体效价的测定及免疫反应性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 JL-EDSV-629 毒株的分离 |
| 3.1.1 病料的PCR鉴定 |
| 3.1.2 JL-EDSV-629 毒株的分离 |
| 3.2 JL-EDSV-629 毒株的鉴定 |
| 3.2.1 PCR鉴定 |
| 3.2.2 血凝特性及理化特性 |
| 3.2.3 病毒的超离纯化及病毒粒子形态学的观察 |
| 3.2.4 感染DEL细胞的特性 |
| 3.3 JL-EDSV-629 毒株在鸭胚上传代及血凝价测定 |
| 3.4 JL-EDSV-629 毒株基因组克隆 |
| 3.4.1 基因组的分段扩增 |
| 3.4.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.5 JL-EDSV-629 毒株基因组序列分析 |
| 3.5.1 JL-EDSV-629 株基因组结构特征分析 |
| 3.5.2 基因组同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.3 penton基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.4 fiber基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.5 hexon基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.6 DBP基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.6 鸭抗JL-EDSV-629 株多克隆抗体效价的测定 |
| 3.7 JL-EDSV-629 毒株penton的克隆及原核表达 |
| 3.7.1 penton基因的克隆 |
| 3.7.2 p MD18-T-EDSV-penton重组质粒的鉴定 |
| 3.7.3 p ET-32a-EDSV-penton重组质粒的鉴定 |
| 3.7.4 penton重组蛋白的诱导表达 |
| 3.7.5 penton重组蛋白的纯化浓缩 |
| 3.8 penton特异性抗体效价的测定及免疫反应性鉴定 |
| 3.8.1 penton特异性抗体效价的测定 |
| 3.8.2 重组蛋白免疫反应性的Western Blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 JL-EDSV-629 株病毒的分离鉴定 |
| 4.2 JL-EDSV-629 毒株在鸭胚上传代及血凝价测定 |
| 4.3 JL-EDSV-629 株病毒基因组扩增 |
| 4.4 JL-EDSV-629 株病毒序列分析 |
| 4.5 多抗制备、penton蛋白的表达及免疫反应性分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）鸭坦布苏病毒的分离鉴定及其油乳剂灭活苗制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 鸭坦布苏病毒病研究进展 |
| 1.1 鸭坦布苏病毒病的病原学 |
| 1.2 鸭坦布苏病毒结构 |
| 1.3 鸭坦布苏病毒的基因组 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒生物学特性 |
| 1.5 鸭坦布苏病毒病的流行病学 |
| 1.6 鸭坦布苏病毒病传染源和传播途径 |
| 1.7 临床特征 |
| 1.7.1 种蛋鸭和商品蛋鸭 |
| 1.7.2 商品鸭和育成期种鸭 |
| 1.8 病理变化 |
| 1.9 组织病理学 |
| 1.10 诊断 |
| 1.10.1 临床诊断 |
| 1.10.2 实验室诊断 |
| 1.11 鉴别诊断 |
| 1.12 治疗措施 |
| 1.13 防控措施 |
| 1.14 本研究的目的意义 |
| 第2章 鸭坦布苏病毒分离鉴定及生物学特性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2. 结果 |
| 2.2.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.2 分离株理化特性结果 |
| 2.2.3 毒株对鸭胚成纤维细胞感染性 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 鸭坦布苏病毒灭活疫苗的制备及对种鸭免疫效果的初步评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.1.4 种鸭免疫效果 |
| 3.1.5 试验观察 |
| 3.1.6 中和抗体检测 |
| 3.1.7 病理切片 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病毒纯化 |
| 3.2.2 半成品检验结果 |
| 3.2.3 灭活苗成品检验 |
| 3.2.4 种鸭免疫效果 |
| 3.2.5 疫苗攻毒保护效果 |
| 3.2.6 病理组织切片 |
| 3.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）鸭坦布苏病毒卵黄抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 DTMUV的病原学研究 |
| 1.1.1 分类学地位 |
| 1.1.2 形态结构 |
| 1.1.3 理化特性和培养特性 |
| 1.2 DTMUV的流行病学 |
| 1.3 诊断 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 病毒分离鉴定 |
| 1.3.3 分子生物学诊断 |
| 1.3.4 血清学方法 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒病的防治 |
| 1.4.1 生物安全措施 |
| 1.4.2 免疫预防 |
| 1.4.3 药物治疗 |
| 2 卵黄抗体的研究 |
| 2.1 IgY的理化特性 |
| 2.2 卵黄抗体的作用机理 |
| 2.3 IgY制备 |
| 2.4 IgY分离 |
| 2.4.1 水稀释法 |
| 2.4.2 有机溶剂法 |
| 2.5 IgY提取与纯化 |
| 2.6 卵黄抗体的应用 |
| 2.6.1 卵黄抗体在疾病诊断方面的应用 |
| 2.6.2 卵黄抗体在疾病治疗方面的应用 |
| 2.6.3 卵黄抗体在鸭病预防和治疗上的应用 |
| 2.7 本研究的目的和意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 胚胎 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 主要试剂及配制 |
| 3.1.6 间接ELISA试验用液 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒的增殖 |
| 3.2.2 DTMUV的RT-PCR的鉴定 |
| 3.2.3 DTMUV病毒浓缩 |
| 3.2.4 DTMUV病毒半数致死量的测定 |
| 3.2.5 DTMUV灭活疫苗的制备 |
| 3.2.6 疫苗质量检测 |
| 3.2.7 免疫蛋鸡 |
| 3.2.8 卵黄抗体制备 |
| 3.2.9 鸭坦布苏病毒卵黄抗体效价检测 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 DTMUV的繁殖与致死鸭胚的形态观察 |
| 4.2 DTMUV病毒的RT-PCR鉴定 |
| 4.3 DTMUV病毒半数致死量的测定结果 |
| 4.4 DTMUV灭活疫苗的安全和无菌检测结果 |
| 4.5 蛋鸡免疫结果 |
| 4.6 卵黄抗体制备结果 |
| 4.7 卵黄抗体的浓缩和透析去盐 |
| 4.8 IgY的无菌与安全性检测结果 |
| 4.9 间接ELISA检测IgY效价的结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 病毒的分离和鉴定 |
| 5.2 IgY分离、提取和纯化 |
| 5.3 IgY抗体效价检测 |
| 5.4 IgY优点及应用前景 |
| 6 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（4）鸭坦布苏病毒病疫苗免疫雏鸭的研究（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 1 综述 |
| 1.1 鸭坦布苏病毒病概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 病毒分类 |
| 1.2.2 DTMUV的形态结构 |
| 1.2.3 DTMUV病毒体内复制过程 |
| 1.2.4 理化特性 |
| 1.2.5 生物学特性 |
| 1.2.6 分子生物学特征 |
| 1.3 流行病学特点 |
| 1.3.1 传染源 |
| 1.3.2 传播途径 |
| 1.3.3 易感动物 |
| 1.3.4 流行现状 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 病理学诊断 |
| 1.4.3 实验室诊断 |
| 1.5 防控措施 |
| 1.5.1 鸭坦布苏病毒病的防治措施 |
| 1.5.2 免疫及药物治疗的选择 |
| 1.6 研究目的及意义 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验主要仪器设备 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 病毒 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 主要试剂及配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 安全性检验 |
| 2.2.2 效力检验方法 |
| 2.2.3 试验及动物饲养地点 3 结果 |
| 3.1 安全性试验结果 |
| 3.1.1 7日龄鸭安全性试验结果 |
| 3.1.2 4周龄鸭安全性试验结果 |
| 3.2 效力检验试验结果 |
| 3.2.1 7日龄鸭效力检验试验 |
| 3.2.2 4周龄鸭效力检验试验 4 讨论 |
| 4.1 安全性试验 |
| 4.2 效力检验试验 5 结论 致谢 参考文献 作者简介 |
（5）鸭黄病毒病的流行与防控研究（论文提纲范文）
| 1 历史及现状 |
| 2 病原特征 |
| 3 流行病学 |
| 4 临床症状及剖检变化 |
| 5 诊断方法 |
| 6 预防及控制措施 |
（6）坦布苏病毒在种鸭中垂直传播及其对种鸭的致病性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 坦布苏病毒感染概述 |
| 1.2 TMUV的生物学特性 |
| 1.2.1 分类地位 |
| 1.2.2 形态结构和核酸类型 |
| 1.2.3 分子生物学特性 |
| 1.2.4 理化特性和培养特性 |
| 1.3 TMUV感染的流行病学 |
| 1.4 TMUV感染的临床症状及病理变化 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 病理变化 |
| 1.5 TMUV感染的诊断方法 |
| 1.5.1 临床诊断 |
| 1.5.2 实验室检测 |
| 1.6 坦布苏病毒感染的防制 |
| 1.6.1 预防 |
| 1.6.2 药物治疗 |
| 1.7 关于垂直传播 |
| 1.7.1 垂直传播的概念及方式 |
| 1.7.2 黄病毒垂直传播 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 种蛋、鸭胚及雏鸭 |
| 2.1.4 毒种及试验动物 |
| 2.2 主要溶液的配置 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳相关溶液 |
| 2.2.2 原核表达相关溶液 |
| 2.2.3 间接ELISA检测方法相关溶液 |
| 2.3 自然感染病例种鸭、种蛋、鸭胚、雏鸭中TMUV的检测 |
| 2.3.1 发病种鸭病毒分离与鉴定 |
| 2.3.2 主要器官病理切片的制作 |
| 2.3.3 种蛋孵化和病原检测 |
| 2.4 TMUV垂直感染动物模型的建立 |
| 2.4.1 人工感染动物试验 |
| 2.4.2 种蛋孵化和样品采集 |
| 2.4.3 种蛋、鸭胚、雏鸭中TMUV分离与鉴定 |
| 2.5 TMUV对种鸭的致病性研究 |
| 2.5.1 人工感染试验 |
| 2.5.2 样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 自然感染病例种鸭、种蛋、鸭胚、雏鸭中TMUV分离与鉴定 |
| 3.1.1 发病种鸭剖检变化 |
| 3.1.2 发病种鸭主要器官病理组织学变化 |
| 3.1.3 发病种鸭病毒分离与鉴定 |
| 3.1.4 种蛋孵化情况 |
| 3.1.5 种蛋、鸭胚、雏鸭中细菌分离 |
| 3.1.6 种蛋、鸭胚、雏鸭中病毒分离与鉴定 |
| 3.2 TMUV垂直感染动物模型的建立 |
| 3.2.1 种鸭临床表现 |
| 3.2.2 种蛋孵化情况 |
| 3.2.3 种蛋、鸭胚、雏鸭中TMUV分离与鉴定 |
| 3.3 TMUV对种鸭的致病性研究 |
| 3.3.1 人工感染种鸭临床症状和剖检变化 |
| 3.3.2 人工感染种鸭主要器官病理组织学变化 |
| 3.3.3 人工感染种鸭血清中TMUV抗体水平变化情况 |
| 3.3.4 人工感染种鸭血清中IFN-γ、IL-4 变化情况 |
| 3.3.5 人工感染种鸭排毒检测 |
| 3.3.6 人工感染种鸭组织中病毒载量的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TMUV在种鸭中垂直传播的研究 |
| 4.2 TMUV对种鸭致病性的研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（7）鸭坦布苏病毒生物学特性、基因组特征、诊断方法以及感染性克隆的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 符号说明 氨基酸的简写符号 综述一 鸭坦布苏病毒感染研究进展 |
| 参考文献 综述二 黄病毒基因组结构与功能的研究进展 |
| 参考文献 综述三 正链RNA病毒反向遗传操作技术研究进展 |
| 参考文献 第一章 鸭坦布苏病毒的分离鉴定及特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 病毒特性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.2 病毒特性分析 |
| 参考文献 第二章 鸭坦布苏病毒的基因组测序和进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 随机引物扩增BZ-10株 |
| 2.2 BZ-10株基因组测序 |
| 2.3 其他5株病毒基因组测序 |
| 2.4 鸭坦布苏病毒基因组特征 |
| 2.5 鸭坦布苏病毒进化地位分析 |
| 2.6 鸭坦布苏病毒E蛋白结构与进化分析 |
| 2.7 不同鸭坦布苏病毒株的血清交叉中和试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第三章 鸭坦布苏病毒实验室诊断方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR检测方法 |
| 2.2 荧光定量PCR检测方法 |
| 2.3 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第四章 鸭坦布苏病毒感染性克隆的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因片段扩增 |
| 2.2 全长cDNA克隆的构建 |
| 2.3 RNA体外转染DF-1细胞 |
| 2.4 RT-PCR方法鉴定 |
| 2.5 间接免疫荧光试验鉴定 |
| 2.6 酶切鉴定 |
| 2.7 子代病毒的接种鸡胚 |
| 2.8 子代病毒在DF-1上的TCID_(50) |
| 3 讨论 |
| 参考文献 全文总结 附录 |
| 附录1：实验用6株鸭坦布苏病毒的多聚蛋白氨基酸序列比对 |
| 附录2：DNA Marker的分子量 致谢 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）鸭坦布苏病毒E和NS1基因序列分析及其重组蛋白的初步应用（论文提纲范文）
| 符号说明 目录 中文摘要 Abstract 1 引言 |
| 1.1 鸭坦布苏病毒发病史及现状 |
| 1.2 病毒病原学特性 |
| 1.2.1 分类 |
| 1.2.2 形态特征 |
| 1.2.3 化学组成 |
| 1.2.4 病毒复制 |
| 1.2.5 对理化因素的抵抗力 |
| 1.2.6 实验宿主系统 |
| 1.3 分子生物学特性 |
| 1.4 病毒流行病学特性 |
| 1.5 病毒临床症状及病理组织学变化 |
| 1.5.1 临床症状 |
| 1.5.2 剖检变化 |
| 1.5.3 病理组织学变化 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 临床诊断 |
| 1.6.2 实验室诊断 |
| 1.7 防控措施 |
| 1.7.1 生物安全措施 |
| 1.7.2 疫苗预防 |
| 1.7.3 药物预防 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、菌株、载体、阳性血清 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭坦布苏病毒 E 基因、NS1 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.2 鸭坦布苏病毒 E 基因的克隆表达及初步应用 |
| 2.2.3 鸭坦布苏病毒 NS1 基因的克隆表达及初步应用 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭坦布苏病毒 E 和 NS1 基因扩增与基因分析 |
| 3.1.1 E 基因的克隆 |
| 3.1.2 NS1 基因的克隆 |
| 3.1.3 E 和 NS1 基因的序列分析 |
| 3.2 鸭坦布苏病毒 E 基因的克隆表达及初步应用 |
| 3.2.1 表达载体的构建 |
| 3.2.2 重组菌的诱导表达 |
| 3.2.3 E 蛋白的纯化与 Western blotting 分析 |
| 3.2.4 间接 ELISA 方法的建立 |
| 3.2.5 间接 ELISA 方法的初步应用 |
| 3.3 鸭坦布苏病毒 NS1 基因的克隆表达及初步应用 |
| 3.3.1 表达载体的构建 |
| 3.3.2 重组菌的诱导表达 |
| 3.3.3 NS1 蛋白的纯化 |
| 3.3.4 Western blotting 分析 |
| 3.3.5 间接 ELISA 方法的建立 |
| 3.3.6 间接 ELISA 方法的初步应用 |
| 3.3.7 NS1 蛋白和 E 蛋白对不同血清的反应情况 4 讨论 |
| 4.1 鸭坦布苏病毒 E 蛋白与 NS1 蛋白序列分析 |
| 4.2 鸭坦布苏病毒 E 基因的原核表达及初步应用 |
| 4.3 鸭坦布苏病毒 NS1 基因的原核表达及初步应用 5 结论 参考文献 致谢 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）坦布苏病毒的分离鉴定及重组腺病毒介导shRNA抑制坦布苏病毒在体外复制的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 中文摘要 ABSTRACT 1 引言 |
| 1.1 坦布苏病毒病概述 |
| 1.2 TMUV 的生物学特性 |
| 1.2.1 TMUV 的分类地位 |
| 1.2.2 黄病毒的形态结构 |
| 1.2.3 黄病毒的基因组及编码蛋白 |
| 1.2.4 黄病毒的复制机制 |
| 1.2.5 黄病毒基因组末端倒置互补序列 |
| 1.2.6 TMUV 的研究进展 |
| 1.3 RNAi 研究进展 |
| 1.3.1 RNAi 概念 |
| 1.3.2 RNAi 在抗病毒治疗中的应用 |
| 1.3.3 黄病毒 RNAi 研究进展 |
| 1.4 腺病毒载体研究进展 |
| 1.5 研究的目的意义 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒株及抗体 |
| 2.1.2 实验动物及细胞 |
| 2.1.3 主要试剂、试剂盒及化学药品 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.1.5 载体 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 TMUV 半套式 RT-PCR 检测方法的建立与应用 |
| 2.2.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的建立与应用 |
| 2.2.3 TMUV 多种核酸检测方法的比较 |
| 2.2.4 不同宿主来源的 TMUV 的分离与鉴定 |
| 2.2.5 TMUV 山东分离株 SD1001 全基因序列测定 |
| 2.2.6 靶向干扰 TMUV E 基因和 NS5 基因的 shRNA 序列的筛选 |
| 2.2.7 干扰 TMUV 复制的重组腺病毒的构建与鉴定及体外干扰试验 3 结果 |
| 3.1 TMUV 半套式 RT-PCR 检测方法的建立与应用 |
| 3.1.1 半套式 RT-PCR 检测方法的特异性试验结果 |
| 3.1.2 半套式 RT-PCR 检测方法的敏感性 |
| 3.1.3 半套式 RT-PCR 对 TMUV 临床样品的检测结果 |
| 3.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的建立与应用 |
| 3.2.1 TMUV RT-LAMP 检测方法的敏感性试验结果 |
| 3.2.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的特异性试验结果 |
| 3.2.3 临床样品检测结果 |
| 3.3 TMUV 多种核酸检测方法的比较 |
| 3.3.1 多种检测方法的敏感性试验结果 |
| 3.3.2 多种检测方法的特异性试验结果 |
| 3.3.3 临床样品检测结果 |
| 3.4 不同宿主来源的 TMUV 的分离与鉴定 |
| 3.4.1 不同宿主来源的 TMUV 流行病学调查 |
| 3.4.2 麻雀分离株 TMUV-SDHS 鸭胚培养特性 |
| 3.4.3 麻雀分离株 TMUV-SDHS 细胞培养特性 |
| 3.4.4 蚊源分离株 TMUV-SDHS 细胞培养特性 |
| 3.4.5 TMUV-SDHS 的 E 基因和 NS5 基因的遗传进化分析结果 |
| 3.4.6 TMUV-SDHS 及 TMUV-SDMS 株对产蛋鸭致病性研究结果 |
| 3.5 TMUV 山东分离株 SD1001 全基因序列测定 |
| 3.5.1 TMUV 基因组分析结果 |
| 3.5.2 TMUV 病毒的蛋白的氨基酸比对结果 |
| 3.5.3 TMUV 5’末端和 3’末端非编码区的分析 |
| 3.5.4 TMUV 病毒的蛋白的潜在糖基化位点预测 |
| 3.5.5 TMUV 开放阅读框 Bootscan 扫描 |
| 3.6 靶向干扰 TMUV E 基因和 NS5 基因的 shRNA 序列的筛选 |
| 3.6.1 重组载体 pEGFP-E 及 pEGFP-NS5 载体的测序鉴定 |
| 3.6.2 转染用细胞的选择 |
| 3.6.3 荧光标签载体转染 293T 细胞 |
| 3.6.4 shRNA 干扰 E-GFP 和 NS5-GFP 融合蛋白的表达 |
| 3.6.5 shRNA 干扰载体与 GFP 融合蛋白的表达载体共转染后的流式细胞检测 |
| 3.6.7 E 基因和 NS5 基因的相对荧光定量检测结果 |
| 3.7 干扰 TMUV 复制的重组腺病毒的构建与鉴定及体外干扰试验 |
| 3.7.1 重组腺病毒的包装出毒 |
| 3.7.2 重组腺病毒的鉴定 |
| 3.7.3 重组腺病毒滴度的测定 |
| 3.7.4 重组腺病毒介导的 shRNA 体外干扰 TMUV 复制的研究 4 讨论 |
| 4.1 TMUV 核酸检测方法的建立及多种核酸检测方法的比较 |
| 4.1.1 TMUV 半套式 RT-PCR 检测方法的建立与应用 |
| 4.1.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的建立与应用 |
| 4.1.3 TMUV 多种核酸检测方法的比较 |
| 4.2 不同宿主来源的 TMUV 的分离与鉴定 |
| 4.3 TMUV 山东分离株 SD1001 全基因序列测定 |
| 4.4 重组腺病毒介导的 shRNA 干扰 TMUV 复制的研究 5 结论 参考文献 附录 致谢 博士在读期间发表论文 |
（10）鲁北地区种鸭场鸭坦布苏病毒病综合诊断及流行病学调查（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 分类 |
| 1.2.2 形态学 |
| 1.2.3 病毒基因组结构 |
| 1.2.4 黄病毒科病毒的生物学特性 |
| 1.2.5 黄病毒对理化因素的抵抗力 |
| 1.2.6 黄病毒科病毒的培养特性 |
| 1.2.7 鸭坦布苏病毒的研究现状 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.3.1 传染源 |
| 1.3.2 流行特点 |
| 1.4 临诊症状及病理变化 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 病理变化 |
| 1.5 诊断 |
| 1.5.1 病原分离 |
| 1.5.2 电镜检测 |
| 1.5.3 实验室诊断 |
| 1.6 防制 |
| 1.6.1 加强管理措施 |
| 1.6.2 免疫接种 |
| 1.6.3 治疗 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 试验材料和试剂 |
| 2.1.3 试验地点 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病例搜集 |
| 2.2.2 流行病学调查及发病鸭群的观察 |
| 2.2.3 病鸭的病理学观察 |
| 2.2.4 血清抗体竞争ELISA |
| 2.2.5 病毒的分离 |
| 2.2.6 红细胞凝集试验 |
| 2.2.7 病毒RNA的提取 |
| 2.2.8 RT-PCR检测 |
| 2.2.9 DH5 α 感受态细胞的制备 |
| 2.2.10 胶回收产物与T载体连接以及连接产物的转化 |
| 2.2.11 重组质粒PCR鉴定 |
| 2.2.12 序列测定和果分 |
| 3 结果 |
| 3.1 流行病学调查结果 |
| 3.2 临诊症状及病理学观察 |
| 3.2.1 临诊症状及剖检病变 |
| 3.2.2 病理组织学观察 |
| 3.3 病原学检测 |
| 3.3.1 鸡胚接种 |
| 3.3.2 血凝试验 |
| 3.3.3 DTMUV抗体竞争ELISA测定结果 |
| 3.4 分子病毒学检测 |
| 3.4.1 PCR检测 |
| 3.4.2 PCR产物序列测定与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鲁北片区种鸭场鸭坦布苏病毒流行病学调查分析 |
| 4.2 鸭坦布苏病毒与鸭肝炎病毒混合感染情况分析 |
| 4.3 鸭坦布苏病毒与流感病毒、副粘病毒等混合感染情况分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、上海地区爆发蛋鸭“类减蛋综合症”（论文参考文献）
- [1]鹅源减蛋综合征病毒的分离鉴定及其基因组的进化分析[D]. 张琪. 东北农业大学, 2020(04)
- [2]鸭坦布苏病毒的分离鉴定及其油乳剂灭活苗制备[D]. 胥成超. 扬州大学, 2019(04)
- [3]鸭坦布苏病毒卵黄抗体制备[D]. 汪小丽. 华南农业大学, 2018(08)
- [4]鸭坦布苏病毒病疫苗免疫雏鸭的研究[D]. 吕金宝. 内蒙古农业大学, 2018(12)
- [5]鸭黄病毒病的流行与防控研究[J]. 李桂平. 畜牧兽医科学(电子版), 2017(01)
- [6]坦布苏病毒在种鸭中垂直传播及其对种鸭的致病性研究[D]. 张英. 山东农业大学, 2015(04)
- [7]鸭坦布苏病毒生物学特性、基因组特征、诊断方法以及感染性克隆的研究[D]. 于可响. 扬州大学, 2013(01)
- [8]鸭坦布苏病毒E和NS1基因序列分析及其重组蛋白的初步应用[D]. 杨少艳. 山东农业大学, 2013(05)
- [9]坦布苏病毒的分离鉴定及重组腺病毒介导shRNA抑制坦布苏病毒在体外复制的研究[D]. 唐熠. 山东农业大学, 2013(05)
- [10]鲁北地区种鸭场鸭坦布苏病毒病综合诊断及流行病学调查[D]. 李成益. 山东农业大学, 2012(08)