一、磷酸寡糖检测方法的研究（论文文献综述）
李雯[1]（2021）在《代谢工程改造大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖》文中指出2’-岩藻糖基乳糖（2’-Fucosyllactose,2’-FL）是母乳寡糖中含量最高的成分,具备很多的生理功能。除了维护婴幼儿的肠道健康,在婴幼儿免疫系统的建立与调节以及大脑神经系统的发育中也发挥着重要的作用。由于其在婴幼儿食品和医药行业的应用价值,获得了广泛的关注。目前,2’-岩藻糖基乳糖主要通过化学法、酶法或全细胞发酵法合成。但传统的化学合成法,存在着步骤繁琐,得率低等问题;酶法合成一般需要昂贵的糖基化合物作为原料,成本较高。全细胞发酵法以大肠杆菌等微生物作为发酵菌株,利用较廉价的原料作为发酵底物,为实现2’-FL的商业化生产提供了更多的可能性。本研究以大肠杆菌BL21（DE3）作为出发菌株,构建鸟苷-5’-二磷酸（GDP）-岩藻糖和2’-FL的代谢合成途径,通过失活支路途径基因,同时优化合成途径基因的表达,提升宿主菌株生产2’-FL的能力。并对摇瓶发酵条件进行优化,通过补料发酵实验,进一步提高2’-FL的产量。主要研究内容如下:（1）首先为提高胞内GDP-岩藻糖的积累量,比较了从头合成途径和补救合成途径生产GDP-岩藻糖的差异,构建GDP-岩藻糖的生产菌株21-bcgw（含质粒p AC-BCGW）、21-fkp（含质粒p ET-F）和21-bcgw F（含质粒p AC-BCGW和p ET-F）,发酵结果显示组合两种途径的菌株21-bcgw F所生产的GDP-岩藻糖的产量最高,是21-bcgw和21-fkp的2倍和1.48倍。（2）在此基础上将编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因fuc T2克隆到质粒p ET-F中,并将质粒p AC-BCGW和p ET-FF共同转入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建2’-FL生产菌株Strain1。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明从头合成途径的磷酸甘露糖突变酶（Man B）、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶（Man C）、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）、GDP-L-岩藻糖合酶（Wca G）和来自于补救合成途径的岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷基转移酶（Fkp）以及α-1,2-岩藻糖基转移酶（Fuc T2）都已成功在菌体内表达,且Strain1菌株经过70 h发酵生产了0.22 g/L 2’-FL。（3）随后利用CRISPR-Cas9技术敲除宿主菌株的β-半乳糖苷酶（Lac Z）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶（Wca J）、岩藻糖异构酶（Fuc I）和岩藻糖激酶（Fuc K）,分别获得了基因编辑菌株BW（Δwca J）、BWL（Δwca J/Δlac Z）和BWLF（Δwca J/Δlac Z/Δfuc IK）。将构建的质粒p AC-BCGW和p ET-FF同时导入以上三种敲除宿主中,构建发酵菌株BW1、BWL1和BWLF1。发酵结果显示敲除四个基因的BWLF1菌株所生产的2’-FL产量最高,是原始菌株的10.36倍;敲除lac Z基因的BWL1菌株乳糖的转化率提高至36%,是BW1菌株的14.7倍;而BWLF1菌株相比于BWL1菌株,乳糖转化率又提高了19%。（4）以BWLF缺陷型菌株作为宿主,利用模块化策略,将来源于从头合成途径的基因man C、man B、gmd和wca G放置于一个模块,来源于补救合成途径的基因fkp以及α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因fuc T2放置于第二个模块,采用双质粒组合形式构建2’-FL生产菌株,并通过变化质粒的拷贝数调节途径基因的表达水平。发酵结果显示表达中拷贝数质粒p CD-BCGW和高拷贝数质粒p ET-FF的BWLF3菌株所生产的2’-FL的产量最高,相较于BWLF1（表达质粒p AC-BCGW和p ET-FF）菌株,产量提高了10%。（5）最后以BWLF3作为出发菌株,对摇瓶发酵条件:IPTG浓度、诱导温度、诱导时间以及碳源进行优化,优化后的发酵条件为:诱导温度为37°C,添加诱导剂IPTG终浓度为0.2 mmol/L,最适诱导时间为菌株长至OD600为1.2,以甘油作为碳源,最终2’-FL的摇瓶发酵产量为2.62 g/L。随后在3 L发酵罐中进行补料发酵,经过补料发酵,2’-FL的产量提高至14.1 g/L。
谢笑莹[2]（2021）在《甘露糖醛酸寡糖增敏氟喹诺酮类抗菌剂抑菌活性机制研究》文中研究表明抗菌药物的滥用使病原菌的耐药率逐年升高,耐药菌感染严重威胁着人类的健康,但是新型抗菌药物的研发步伐远远落后于耐药菌的演化和蔓延。随着抗菌研究的开展,发现构建联合用药策略、恢复耐药菌对现有抗菌药物的敏感性,是治疗耐药菌感染的一个有效途径。褐藻胶寡糖（Alginate oligosaccharide,AOS）是控制褐藻胶降解得到的混合寡糖,其中包括甘露糖醛酸寡糖（MOS）、古罗糖醛酸寡糖（GOS）以及二者的杂合寡糖片段。前期研究表明,MOS与抗菌剂联用具有明确的增敏抗菌剂抑制E.coli的效果,但到目前为止,MOS增敏抗菌剂的抑菌机理尚不清楚。探讨MOS增敏抗菌剂的机制,不仅可以为相关制剂的开发和用药方案的制定奠定基础,还可以延长现有抗菌药物的有效使用寿命,减缓新药研发的迫切性。第一章:绪论。综述了MOS的制备、纯化及生物活性研究,概述了MOS在抑菌应用方面的研究进展。第二章:MOS的制备与纯化。通过酸降解制备了MOS,采用葡聚糖凝胶色谱纯化MOS,经毛细管区带电泳（CZE）表征,确定MOS组成纯化前后基本无变化,且样品聚合度在寡糖范围内。同时为了明确MOS的药理作用,制备了与MOS聚合度组成相似的葡寡糖作为对照,用于后续MOS增敏抗菌剂抑制E.coli活性实验。第三章:MOS联用氟喹诺酮类抗菌剂抑制E.coli活性。通过倍比稀释法对MOS、葡寡糖联合氟喹诺酮类抗菌剂环丙沙星（CPFX）、左氧氟沙星（LVFX）抑制普通E.coli进行活性实验。结果显示,MOS与CPFX、LVFX联用时,高浓度出现拮抗作用,低浓度产生增敏抗菌剂的效果,而葡寡糖则没有此种药理作用。第四章:E.coli体内氟喹诺酮类抗菌剂含量的测定。通过高效液相色谱法（HPLC）考察不同浓度MOS与CPFX、LVFX联用时E.coli体内CPFX、LVFX的含量,探讨MOS增敏CPFX、LVFX抑制E.coli活性的作用机制。结果显示,高浓度MOS与两种抗菌剂联用时,E.coli体内CPFX、LVFX的含量较不加MOS组低;低浓度MOS与抗菌剂联用时,E.coli体内CPFX、LVFX含量较不加MOS组高。而后通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察菌体内抗菌剂的荧光强度进行验证,结果与HPLC法测定E.coli体内CPFX、LVFX的含量趋势一致。第五章:Ca2+对MOS提高E.coli内氟喹诺酮类抗菌剂含量的影响。本章采用倍比稀释法,探究培养基中加入Ca2+对MOS增敏CPFX、LVFX抑制E.coli活性的影响。结果表明,Ca2+离子的加入,一定程度上逆转了高浓度MOS的拮抗作用,提高了CPFX、LVFX在菌体内的浓度。推测系MOS与更多Ca2+离子螯合后,带正电的MOS-Ca2+与带负电的细胞膜作用,提高了细胞膜的通透性,使CPFX、LVFX更易进入菌体内。第六章:结论与展望。
李佩佩[3]（2021）在《枸杞果实发育过程中寡糖特性变化及相关酶研究》文中研究表明寡糖作为小分子糖类聚合物,因其独特的生物益生特性和生物活性,被广泛应用于营养食品和医药行业。已有研究通过对酶解和酸解枸杞多糖产成的枸杞寡糖片段的免疫活性进行鉴定,为寡糖片段活性的进一步研究奠定了一定的理论基础。目前许多研究集中于寡糖的功能活性、益生特性、提取方法和结构特征,但有关枸杞果实寡糖积累途径的研究还未见报道。因此,本研究通过研究不同生长发育时期的枸杞果实寡糖含量、结构特性、合成代谢酶活性,结合蛋白组学方法来探究枸杞生长过程中寡糖的合成代谢途径,并采用实时荧光定量PCR技术对枸杞寡糖合成代谢相关的关键蛋白进行验证,拟通过以上研究对枸杞果实生长发育过程寡糖合成代谢途径进行初步探索,研究结果如下:（1）采用醇溶液法提取不同发育时期枸杞粗寡糖,通过savage法除游离蛋白,测定寡糖含量及寡糖中蛋白含量;研究表明枸杞果实寡糖含量在整个生长发育阶段不断变化,整个生长过程中寡糖积累在青果期（14 d）和黄变后期（28 d）达到高峰,分别为20.43%和22.33%,寡糖含量在青果期和黄变后期与其他三个时期果实有显着差异（p<0.05）;五个时期蛋白平均含量达到0.59%。通过高效液相色谱测得不同时期LB02的分子量主要分布在0.9～1.2 KDa,且随着枸杞果实发育成熟,分子量呈现先减小后增大的趋势,35 d寡糖分子量最大为1.18 KDa,GC-MS检测结果表明寡糖由阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、半乳糖和甘露糖组成。红外光谱研究发现5个生长阶段的寡糖均在3000～2800 cm-1和1400～1200 cm-1出现糖类的特征峰,1640 cm-1左右出现的吸收峰为糖类-COOH伸缩振动吸收峰,糖环构象主要以β-吡喃环形式存在。5个时期枸杞寡糖的XRD谱图在28.4°处均在显示出一个额外的尖锐窄衍射峰,可以得出5个时期的枸杞寡糖的结构均为稳定的晶体结构。热性质分析表明5种寡糖热分解过程主要存在两个阶段,第一阶段为结晶水的脱出,第二阶段为氧化分解,寡糖的分子骨架断裂,热稳定性良好。五个时期的LB02在扫描单子显微镜下整体形态都类似海绵状排列,单个枸杞寡糖分子类似锯齿形。（2）在枸杞果实的发育过程中,蔗糖磷酸合酶和蔗糖合酶的活性,在花开后7-28 d呈现显着升高的趋势,分别为1449.17（IU/g）和1.354（U/g）,蔗糖磷酸合酶与蔗糖合酶活性在花开后28d后均呈现下降趋势。酸性转化酶活性增加至21 d最大为0.52（U/g）,35 d时略有下降。果糖激酶活性在7-14 d显着增加,28 d达到最大为0.315（U/g）,而在28-35 d活性减小。β-淀粉酶活性在7-28 d整体呈现升高趋势,28 d时活性最大为0.904（U/g）高,35 d β-淀粉酶活性下降。内切葡聚糖酶在7 d-28 d活性呈现显着增加趋势,28 d时达到最高为4.046（U/g）且在第28 d后开始下降。（3）在枸杞整个生长发育过程中共筛选得到差异蛋白数为1799种,依据GO数据库筛选出与寡糖合成代谢相关的差异蛋白数共133种。通过KEGG通路富集和差异蛋白表达规律分析得出,其中14d/7d有22个差异蛋白,主要为参与淀粉和蔗糖代谢途径的酸转化酶、β-淀粉酶、蔗糖合成酶,表明青果期主要实现枸杞多糖积累,在这个过程中产生寡糖。21 d/7d共筛选出60个差异蛋白,此时糖酵解过程中的果糖二磷酸醛缩酶和磷酸甘油酸激酶在黄变初期呈现上调,参与糖醛酸代谢和葡萄糖醛酸代谢过程的醛脱氢酶、醛糖1-差向异构酶及参与细胞葡聚糖代谢和细胞多糖代谢过程的葡聚糖内切葡聚糖酶及葡萄糖-6-磷酸异构酶也均显着上调,表明在黄变初期枸杞多糖分解形成寡糖积累,进一步分解后可能向细胞提供能量。28 d/7d和35 d/7d分别筛选出关键差异蛋白106和113个,主要通过参与果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖转化、葡萄糖合成、戊糖和核苷酸糖代谢等途径调控寡糖合成代谢。（4）枸杞果实5个不同时期的RNA纯化后的琼脂糖电泳条带清晰完整,包括枸杞的内参引物EF1a在内的10个基因的溶解曲线均仅存在一个十分光滑单峰。蔗糖磷酸合酶（A0A059T2S5）表达量在整个生长过程中呈现先上升再降低的趋势,在21 d时表达量最高为0.155。己糖基转移酶（A0A0V0IJI5）和蔗糖合酶（M0ZT40）在枸杞生长发育过程中具有相似的表达模式,7 d-14 d表达量增加后迅速减少至28 d分别为0.084和0.003,在35 d表达量增加至最大分别为0.225和0.338。果糖激酶（P37829）、甘露聚糖内-1,4-β-甘露糖苷酶（M0ZVJ3）表达量变化趋势相似,呈现先降低再升高的趋势,在14 d最低分别为0.261和0.005,14-35 d表达量逐渐升高分别为0.177和0.004。棉子糖合酶（A0A0V0ITL0）表达量总体呈现增加趋势,在35d表达量增加至0.011。β-呋喃果糖苷酶（G9IHI6）在7-28 d持续升高且28天表达量最大为2.782,在28-35 d表达量降低。鼠李糖酶1（A0A0V0HSE1）和α-甘露糖苷酶（A0A0V0IX45）在枸杞发育整个过程中表达量均呈现出先降低再升高的趋势,在7-21 d逐渐降低,在21 d表达量显着增加,分别为0.037和0.003。葡聚糖内切酶（Q9ZSP9）的表达量在14-28 d呈现升高趋势,在28d表达量达到最高。这与蛋白组学分析结果一致,为寡糖的合成代谢研究提供参考。
王欢[4]（2021）在《lsgB基因介导的脂寡糖α2，3-唾液酸化在副猪革拉瑟氏菌致病中的作用及机制研究》文中研究说明副猪革拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis,GPS）属于巴氏杆菌科的一种短小杆菌,是猪上呼吸道常在菌。在机体受到应激、免疫力低下或继发感染条件下,侵入上皮细胞、进入血液引发宿主的革拉瑟氏病。该病多发于断奶仔猪,或常见于与其他细菌和/或病毒混合感染的猪群,对生猪养殖业造成严重的经济损失。目前,对该病原的研究主要是对病原毒力因子的挖掘,但对其在上呼吸道定殖以及突破呼吸道屏障的研究较少。已有研究表明:能造成全身系统性感染的菌株都含有lsg B基因,其编码一个α2,3-唾液酸转移酶蛋白,但其具体的机制尚不清楚。本研究从构建lsg B基因缺失菌株出发,在体外细胞模型上证实了该基因缺失能显着降低GPS跨越单层细胞屏障的能力、降低GPS侵入细胞能力、降低GPS在健康猪血清中的存活能力,并发现lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化能识别巨噬细胞表面结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素1（Siglec1）,促进TGF-β1的分泌。我们探究了TGF-β1对上皮屏障完整性的影响,深入分析了TGF-β1调控GPS侵入上皮细胞的机制,主要研究内容如下:1.lsg B基因介导LOS发生α2,3-唾液酸化利用自然转化的方法,我们在5型临床分离的强毒株SH0165（以下称野生菌株）中成功获得lsg B基因缺失菌株,并通过穿梭质粒在缺失菌株中回补该基因成功构建其互补菌株。通过高效液相色谱（HPLC）检测证实:相较于野生菌株和互补菌株,缺失菌株表面的α2,3-唾液酸化水平显着降低,lsg B基因造成GPS菌株去唾液酸化。分别提取上述三株菌的LOS,PAGE银染实验进一步证实去唾液酸化降低LOS分子量,表明lsg B基因编码唾液酸转移酶的作用是修饰GPS的LOS发生α2,3-唾液酸化。2.lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化影响GPS致病力为探究LOS唾液酸化对GPS致病力的影响,我们分别在猪肾上皮细胞（PK-15）和猪髋动脉内皮细胞（PIEC）上进行了黏附侵入实验,结果表明缺失菌株对于上述两种细胞的侵入能力显着减弱,而黏附能力显着增强。分析LOS结构发现,LOS去唾液酸化后暴露了半乳糖残基,通过半乳糖预处理PK15细胞,再进行黏附实验发现缺失菌株黏附增强的现象被显着抑制。同时,我们探究了唾液酸化对GPS在血清中存活能力的影响,血清杀菌实验结果表明缺失菌株在健康猪血清中的存活率显着降低。WB实验结果表明,缺失菌株表面结合的补体抑制因子f H显着低于野生菌株和互补菌株。流式细胞术结果进一步证实沉积在缺失菌株表面C3b和攻膜复合体（MAC）的量显着高于野生菌株和互补菌株。上述结果表明,GPS唾液酸化通过结合补体抑制因子f H降低菌体表面C3b的沉积和MAC的形成,促进GPS在健康猪血清中存活率。小鼠实验结果表明缺失lsg B基因影响GPS对小鼠的致死率。上述结果表明。lsg B基因在GPS致病过程中发挥重要作用。3.α2,3-唾液酸化促进肺泡巨噬细胞TGF-β1的产生在本研究中,通过细菌的Pull Down实验,我们证实了野生菌株能够与重组的Siglec1发生相互作用,而缺失菌株结合较弱。WB和LOS-ELISA证实LOS的α2,3-唾液酸化与重组的Siglec1发生相互作用。野生菌株和缺失菌株及它们的LOS刺激猪肺泡巨噬细胞3D4/21后,WB检测Siglec1蛋白水平表达,证实α2,3-唾液酸化诱导更高水平的Siglec1表达。免疫组化进一步证实α2,3-唾液酸化诱导Siglec1在肺部的高表达。免疫共沉淀证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1能促进DAP12和Syk表达并形成三聚体激活下游级联反应。通过干扰RNA实验证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1/DAP12/Syk三聚体能促进上清中TGF-β1的分泌。WB证实去α2,3-唾液酸化的缺失菌株激活p38的磷酸化显着低于野生菌株,抑制p38通路后上清中TGF-β1的分泌显着减少。同时,通过抑制剂实验进一步证实Syk抑制剂显着抑制p38磷酸化和上清中TGF-β1的分泌。综上所述,α2,3-唾液酸化通过识别巨噬细胞表面受体Siglec1形成Siglec1/DAP12/Syk三聚体影响p38磷酸化调控TGF-β1的分泌。4.TGF-β1诱导GPS侵入上皮细胞及跨越上皮细胞屏障为证实分泌的TGF-β1对上皮屏障的影响。我们通过重组的TGF-β1蛋白对NPTr细胞进行了体外实验。ECIS结果证实TGF-β1能剂量依赖降低NPTr细胞形成的电阻屏障,TGF-β1受体抑制剂证实其降低NPTr电阻屏障依赖其受体发挥作用。WB结果进一步证实TGF-β1能降低NPTr细胞形成的电阻屏障是下调了NPTr细胞间的紧密连接蛋白。此外,我们还发现TGF-β1能通过依赖其受体的方式增加GPS对上皮细胞的侵入。通过WB和荧光素酶报告系统证实TGF-β1能增加GPS侵入NPTr细胞是通过下调Fn的表达来实现的。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对Fn蛋白进行敲除,证实Fn能影响GPS对气管上皮细胞的侵入能力。以上结果表明,lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS突破上皮细胞屏障过程中发挥作用,细菌通过α2,3-唾液酸化修饰利用宿主免疫细胞表面受体来调控上皮细胞屏障入侵深层组织。5.α2,3-唾液酸化修饰诱导宿主免疫细胞耐受通过构建体外耐受模型,我们发现去α2,3-唾液酸化显着降低LOS诱导的免疫细胞耐受水平,降低耐受细胞上清和小鼠血清中TNF-α的含量,降低Siglec1的表达。在耐受细胞中,WB和co-IP结果表明α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1受体来上调其接头分子DAP12和炎症抑制因子SHIP,并形成复合物。共聚焦实验证实去α2,3-唾液酸化减弱Siglec1与SHIP的相互作用。WB证实耐受细胞中去α2,3-唾液酸化降低p65磷酸化并降低上清中TNF-α和NO的分泌量。干扰RNA实验进一步证实耐受细胞中SHIP的上调依赖于Siglec1的激活。小鼠耐受模型中,α2,3-唾液酸化显着上调小鼠脾脏巨噬细胞中Siglec1的表达。以上结果证实,α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1上调SHIP诱导内毒素耐受。本研究证实了lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS致病力、突破上呼吸道屏障和逃避宿主天然免疫中发挥重要作用。本研究深入探究了α2,3-唾液酸化在GPS在逃避宿主天然免疫、突破屏障和逃避补体杀伤过程中的重要作用,为更好的理解GPS引发系统性疾病提供理论依据。
崔连杰[5]（2021）在《黄芪活性多糖APS-Ⅱ免疫调控机制及其酶解寡糖片段的结构和活性研究》文中指出选题依据:黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）具有广泛的生物活性,目前大多数研究以黄芪总多糖作为主要的研究对象,但黄芪多糖相对分子量分布广泛,限制了对其生物活性作用机制的深入研究,无法精确阐明免疫调节作用与其相对分子质量的关系,也难以揭示黄芪多糖在分子水平发挥免疫调节作用的机制。本课题组前期研究表明黄芪多糖APS-Ⅱ是黄芪中免疫调节活性主要物质,由于多糖结构难于精确测定,限制了黄芪多糖体内分子作用机制的深入研究。“多糖受体学说”认为免疫活性多糖分子中存在一种或多种寡糖片段“活性中心”,因此将黄多糖降解为寡糖,从寡糖水平研究多糖的活性中心,为突破黄芪多糖结构研究和作用机制研究提供了新思路。目的:超滤技术分离获得不同分子量黄芪多糖,采用“环磷酰胺免疫抑制”方式造模,通过小鼠血清代谢组学技术探讨黄芪多糖的免疫增强作用机制。将本课题组已制备的免疫活性多糖APS-Ⅱ（10 k Da组分）通过单因素试验和正交试验确定最佳降解条件,通过聚丙烯酰胺凝胶色谱制备不同聚合度寡糖组分,对不同聚合度寡糖组分进行结构分析及免疫活性筛选。研究方法与研究内容:（1）通过超滤法将黄芪总多糖得到不同分子量黄芪多糖APS-I（>2000 k Da）、APS-Ⅱ（1.02×104 Da）、APS-ⅡI（286 Da）,分别作用于“环磷酰胺免疫抑制”模型小鼠,收集小鼠血清进行UPLC-HRMS检测,结合多元统计分析探讨黄芪多糖的免疫增强作用机制。（2）免疫活性多糖APS-Ⅱ采用内切α-1,4-葡聚糖酶酶解,通过单因素试验和正交试验确定最佳降解条件,降解后的寡糖混合物通过聚丙烯酰胺凝胶色谱制备不同聚合度寡糖组分。对不同寡糖组分结构进行分析,通过高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）确定单糖组成,通过甲基化方法确定寡糖结构中单糖连接方式,通过红外光谱（IR）确定APS-Ⅱ降解后寡糖的特征官能团和糖链构型,通过核磁共振波谱（NMR）确定APS-Ⅱ降解后寡糖片段的糖苷键构型,通过质谱法（MS/MS）确定APS-Ⅱ降解后寡糖片段的精细结构。（3）从机体特异性免疫和非特异性免疫两方面对不同寡糖片段活性进行研究,通过不同寡糖组分对Raw 264.7细胞吞噬活性和自然杀伤细胞（NK）的作用,探究它们对机体非特异性免疫功能的影响;通过不同寡糖组分协同伴刀豆蛋白A（Con A）和脂多糖（LPS）对小鼠脾淋巴细胞的作用,探究它们对机体特异性免疫功能的影响。研究结果:1.不同分子量黄芪多糖均可不同程度提高小鼠血清中免疫细胞数量,改善免疫器官损伤,其中APS-Ⅱ效果最佳。与空白组相比,模型组小鼠血清中29个代谢物发生显着变化,APS、APS-I、APS-Ⅱ、APS-ⅡI分别能显着回调其中24、13、25、19个代谢物至正常水平。代谢组学分析揭示了黄芪多糖中APS-Ⅱ是发挥免疫调节活性的主要成分,其机制可能与调控小鼠体内苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢有关。2.通过单因素试验和正交试验确定了APS-Ⅱ最佳降解条件,在内切α-1,4-葡聚糖酶浓度0.5 U·ml-1,酶解温度60℃,酶解时间90 min下,APS-Ⅱ降解得到的寡糖数量最多,含量最高,且降解一致性较好,寡糖混合物通过聚丙烯酰胺凝胶色谱分离得到四个寡糖组分,P1:1-3糖,P2:3-6糖,P3:7-14糖,P4:10-18糖。3.APS-Ⅱ经内切α-1,4-葡聚糖酶降解后形成聚合度1-18的寡糖,经聚丙烯酰胺凝胶色谱分离得到四个组分,对APS-Ⅱ降解后寡糖混合物结构的结构进行分析,APS-Ⅱ酶降解后产生的1-3糖、3-6糖和7-14糖主要成分为葡萄糖,而10-18糖和酶降解后总的寡糖混合物中除葡萄糖外,还存在其余单糖,其中半乳糖和阿拉伯糖含量较多。其中聚合度1-3糖和3-6糖主要结构为线性1,4-连接葡聚糖;聚合度7-14糖主要结构为线性1,4-连接葡聚糖,但相较于1-6糖,其糖链结构中分支度高的葡萄糖单糖数量增加,此外出现少量阿拉伯糖和半乳糖;聚合度10-18寡糖组分中,糖链主要连接方式为1→2,4-Glcp和1→4,6-Glcp,与前三个寡糖组分糖相比,1→4-Glcp和1-Glcp含量明显降低,半乳糖和阿拉伯糖含量增加,分支度高的葡萄糖成为糖链中主要成分。综合酶解产物结构可推测黄芪活性多糖APS-Ⅱ的结构,以α-D-1,4-连接葡聚糖为主链,主链包含连续线性九糖的直链结构和糖环C2位、C3和C6位的支链结构,此外多糖结构中还存在少量1,5-连接阿拉伯糖,1-连接阿拉伯糖以及2,3,4-连接半乳糖,2,4,6-连接半乳糖。4.APS-Ⅱ酶降解产物均可通过增强巨噬细胞的吞噬功能,增强NK细胞的杀伤活性,促进非特异性免疫功能,还可以协同Con A促进小鼠脾淋巴细胞增殖,协同LPS促进小鼠脾淋巴细胞增殖并分泌细胞因子Ig G,增强特异性免疫功能,不同寡糖组分中活性最强的为糖链C-2和C-6位存在支链的α-D-1,4-连接葡聚糖10～18寡糖组分。结论:代谢组学分析揭示了黄芪多糖中APS-Ⅱ是发挥免疫调节活性的主要成分,其机制可能与调控小鼠体内苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢有关,因此推测黄芪多糖在体内发挥免疫活性的主要方式可能为:通过调节吞噬细胞和树突状细胞的活性,直接影响机体的非特异性免疫,通过相关代谢产物间接影响机体的特异性免疫,最终表现出较强的整体免疫功能修复活性。在“多糖受体学说”理论指导下,初步建立了活性黄芪多糖APS-Ⅱ的酶降解获得寡糖的方法,并对降解后的寡糖分离,初步探究了不同聚合度寡糖混合物的免疫活性,结果发现与免疫活性多糖APS-Ⅱ相比,不同寡糖组分在不同免疫活性有明显差异,其中聚合度10～18寡糖免疫活性最高,结合结构解析结果可知,相较于低聚合度寡糖,10～18寡糖结构为糖链C-2和C-6位存在支链的α-D-1,4-连接葡聚糖,且支链结构较多,表明带有支链结构的α-D-1,4-连接葡聚糖结构具有免疫增强活性,其中糖链C-2和C-6位存在支链的α-D-1,4-连接葡聚糖免疫活性较强。因此我们推测免疫活性多糖APS-Ⅱ多糖分子中的寡糖片段“活性中心”可能位于寡糖10-18糖结构中。本研究结果为进一步阐明黄芪多糖结构与功能奠定了基础,丰富了多糖受体学说,也为黄芪多糖的开发提供了新思路。
陈春[6]（2021）在《Arthrobacter ramosus MTSase/MTHase分子改造及其制备海藻糖研究》文中指出海藻糖由两个葡萄糖基通过α-1,1糖苷键连接形成,其作为一种安全、稳定的天然二糖,素有“生命之糖”的美誉,被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。麦芽寡糖基海藻糖合酶（MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）是以淀粉为底物制备海藻糖的两个关键酶。MTSase通过分子内转糖苷反应将底物还原端的α-1,4糖苷键异构为α-1,1糖苷键,生成麦芽寡糖基海藻糖,MTHase作为协同酶专一性水解麦芽寡糖基海藻糖中与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成产物海藻糖。其中,MTSase催化的转糖苷反应对海藻糖转化率更为重要。目前,海藻糖主要通过中温MTSase/MTHase催化制备,其反应温度一般在45℃左右,容易造成生产过程中淀粉底物老化以及微生物污染,降低海藻糖转化率。高温MTSase/MTHase耐热性能好但存在可溶性表达差、酶活低问题,应用成本高。针对以上问题,本研究首先选取具有高表达量优势的来源于Arthrobacter ramosus的中温MTSase（Ar MTSase）进行研究,首次解析该酶晶体结构,揭示该酶与高温MTSase热稳定性差异的结构基础,为该酶热稳定性改造提供理论依据,之后通过分子改造提高该酶的热稳定性。同时,因为MTSase对海藻糖转化率具有重要的影响,通过分子改造提高该酶海藻糖转化率。在此基础上,通过分子改造来源于A.ramosus的中温MTHase（Ar MTHase）,提高其热稳定性并与Ar MTSase优势突变体复配应用,实现了在高温条件下高产量制备海藻糖。本研究主要结果如下:（1）Ar MTSase晶体结构解析。通过优化蛋白纯化方法和筛选蛋白结晶条件获得适合X-ray衍射的晶体,通过分子置换解析Ar MTSase的晶体结构。阐释Ar MTSase“漏斗型”催化中心和“侧沿协助效应”在该酶独特的催化特点和对高分子量麦芽寡糖底物的偏好性方面所发挥的重要作用。结构分析表明,该酶芳香族氨基酸、二硫键、盐桥键参与的分子内相互作用力显着低于高温MTSase,可能是影响该酶与高温MTSase热稳定性差异的主要因素。此外,分子动力学模拟结果表明,相对高温MTSase,该酶在温度升高时,整体氨基酸残基波动增强以及催化残基E261和D475难以维持正常催化构象,是Ar MTSase热稳定性较差的分子层面原因。（2）Ar MTSase分子改造提高热稳定性。通过定向进化获得G415P突变体,摇瓶发酵酶活与野生型酶差异不明显,60℃半衰期是野生型酶的3.0倍。通过Ar MTSase晶体结构分析以及与高温MTSase的序列比对,设计引入盐桥键的S361R/S444E突变体,摇瓶发酵酶活是野生型酶的1.1倍,半衰期是野生型酶的3.2倍。叠加后的S361R/S444E/G415P（M3）突变体,摇瓶发酵酶活与野生型酶差异不明显,半衰期是野生型酶的19.7倍,说明M3热稳定性显着提高。以野生型酶晶体结构为模板,同源建模分析发现,该突变体的361、444和415氨基酸位点空间位置靠近,促使“脯氨酸效应”与盐桥键具有协同作用,从而促进M3热稳定性显着提高。（3）Ar MTSase分子改造提高海藻糖转化率。建立提高海藻糖转化率高通量筛选的方法,通过定向进化获得S44P突变体。其对麦芽五糖的Km相比野生型酶降低47%,kcat/Km是野生型酶的2.2倍。以葡萄糖当量（DE）值为16的大米淀粉为底物在45℃制备海藻糖,突变体因更能充分利用底物中的低分子量麦芽寡糖,促使海藻糖转化率由野生型酶的70.3%提高到76.9%。同时解析S44P突变体的晶体结构,发现Pro44加强了底物通道入口处Loop E41-D51与底物的结合,促进了底物的利用,提高了海藻糖转化率。基于Loop E41-D51上氨基酸残基保守性分析,针对位点Ser47设计相应的突变体,探究其与底物之间疏水、氢键作用和位阻效应对海藻糖转化率的影响。其中S47A具有较高的海藻糖转化率,但其热稳定性降低。之后将S44P、S47A分别与M3叠加,分别得到M4P和M4A。60℃保温15 min,M4A的残留酶活相比M3下降16.6%,表明其热稳定性降低,M4P的残留酶活相比M3无明显差异,同时其海藻糖转化率由M3的71.6%提高到75.0%。（4）Ar MTSase优势突变体与MTHase的复配应用。MTSase制备海藻糖需要MTHase的协同作用,为了验证M4P是否可以满足高温应用条件,选取不同来源的高温MTHase进行研究。结果表明,M4P和Sulfolobus acidocaldarius ATCC 35092来源的MTHase复配具有最高的海藻糖转化率74.7%,相同条件下野生型Ar MTSase转化率为32.1%,表明M4P可以满足高温应用条件。Ar MTHase相比上述高温MTHase具有外源表达量高、用酶成本低的优势,更具有工业应用前景,但热稳定性差。通过定向进化改造Ar MTHase提高其热稳定性,获得L137M和A216T突变体,两个突变体摇瓶发酵酶活与野生型酶无明显差异,半衰期分别为野生型酶1.3和1.5倍。但双突变体L137M/A216T不具有协同作用。经酶反应条件优化,突变体A216T和M4P在57℃下复配制备海藻糖,转化率最高为75.3%,相比野生型Ar MTSase/Ar MTHase复配的最适应用温度为45℃,转化率最高为70.3%,二者复配应用将反应体系温度提高了12℃,海藻糖转化率提高了5%,实现了在高温条件下高产量制备海藻糖。
贾继祥[7]（2021）在《ALG1-CDG生物标记物疫苗的制备及免疫活性研究》文中研究指明先天性糖基化疾病（Congenital disorders of glycosylation,CDG）是一类罕见的遗传性疾病,由编码寡糖链生物合成过程中相关酶的基因缺陷导致。ALG1基因编码的β1,4甘露糖基转移酶Alg1参与内质网寡糖链初始阶段的生物合成,该基因缺陷导致多萜醇寡糖（Dolichol linked oligosaccharides,DLO）无法被顺利的合成,进而影响生命体正常的活动,由ALG1基因缺陷所引起的CDG被称为ALG1-CDG。目前还没有能够应用到ALG1-CDG临床快速诊断的特异性检测方法。近期研究发现ALG1-CDG病人血清中存在由两个N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine,Glc NAc）,一个半乳糖（Galactose,Gal）和一个唾液酸（Sialic acid,Sia）构成的ALG1-CDG生物标记物（Sia-Gal-Gn2）。前期的免疫学研究结果表明该生物标记物无法单独激发免疫反应,通过将其装载到脂质体上制备成脂质体疫苗可以激发产生特异性抗体,但是免疫反应强度较弱。本研究通过化学酶法在体外合成该标记物,优化了疫苗的制备。最后通过免疫学试验发现新疫苗刺激产生了强烈的免疫应答反应和特异性的IgG抗体。主要研究内容如下:（1）以N,N-二乙酰基壳二糖（GlcNAc2）为原料通过化学的方法合成酶促反应底物芴甲氧羰基甘氨酸乙酰壳二糖4（Gn2GlyFmoc）。（2）利用大肠杆菌Rosetta（DE3）表达并纯化美人鱼发光杆菌来源的唾液酸转移酶（Sialyltransferase,SiaT）和人来源的半乳糖转移酶（Galactosyltransferase,GalT）。利用这两种酶以Gn2Gly Fmoc为底物合成了芴甲氧羰基甘氨酸连接的ALG1-CDG生物标记物6（Sia-Gal-Gn2GlyFmoc）,此外利用实验室已有的植烷醇乙酰壳二糖（Phytanyl-Pyrophosphate-Chitobiose,PPGn2）为底物酶法合成植烷醇连接的ALG1-CDG生物标记物25（Sia-Gal-Gn2PP-Phy）。（3）制定了两种提高ALG1-CDG生物标记物免疫原性的试验方案:一是将合成的Sia-Gal-Gn2GlyFmoc通过双交联剂装载到KLH上制备大分子糖缀合物疫苗,同时使用佐剂加强免疫;二是通过脂质体装载合成的Sia-Gal-Gn2PP-Phy制备成脂质体疫苗,并加入PBS57协助刺激免疫反应。（4）利用制备的两种疫苗进行免疫学试验,探究它们对ALG1-CDG生物标记物免疫原性的影响,使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清抗体,结果发现相比于单独的使用ALG1-CDG生物标记物,两种优化方法都可以显着的增强免疫刺激的效果,通过加入佐剂可以进一步提高免疫反应的强度,实验中所产生抗体对ALG1-CDG生物标记物有很高的特异性。
佟丽娜,徐明亮,高金波[8]（2017）在《马铃薯淀粉中磷酸寡糖检测方法》文中进行了进一步梳理磷酸寡糖属于新型功能性低聚糖类,除了具备低聚糖的基本特点外,还具有其他功能,比如促进钙铁等矿物质吸收的主要功能。本次分析马铃薯淀粉中磷酸寡糖的检测方法和结果,并对结果展开相应分析,旨在为今后实际生产应用奠定基础。
杨丽,杨文军,刘霞,杜先锋[9]（2011）在《由马铃薯淀粉制得磷酸寡糖的定性定量测定》文中指出对以马铃薯淀粉为原料、全酶法制得的磷酸寡糖进行定性定量分析。通过采用薄层层析法（thin layerchromatography,TLC）和高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（high-performance anionic exchange chromatography-air puls-ing ampere detectors,HPAEC-PAD）对磷酸寡糖组分进行检测分析,同时利用红外吸收光谱（infrared spectroscopy,IR）对其进行结构分析。结果表明:磷酸寡糖是结合有磷酸基团的并且聚合度在3～7之间的麦芽低聚糖混合物,以麦芽三糖至麦芽六糖组分居多。
杨丽[10]（2011）在《磷酸寡糖的制备及分离研究》文中认为磷酸寡糖（Phosphorylated oligosaccharides,Pos）是指麦芽低聚糖中的葡萄糖残基通过共价键与磷酸酯键（C-O-P）相连接的一种新型功能性低聚糖，主要组成成分是聚合度在36之间的麦芽寡糖。上世纪九十年代日本学者Kamasaka, H在对马铃薯淀粉进行水解研究时发现了磷酸寡糖这一新型的具有特殊功效的低聚糖，并对其进行了进一步研究。磷酸寡糖除了具备一般寡糖的功能特性外，还具有抑制体内不溶性钙盐的形成，从而促进钙质的吸收和溶解，还可强化牙齿釉质再矿化，达到防止龋齿的目的。同时具有抗淀粉老化，无不良风味及口感，在食品、医药、保健及饲料添加剂等行业可以广泛应用。本实验研究了磷酸寡糖前体—低DE值的麦芽低聚糖的制备方法，以马铃薯淀粉为原料，采用全酶法对其进行液化、糖化处理。综合考虑了对制备工艺有主要影响的因素pH、酶用量、糖化时间和糖化温度，通过单因素实验分别考虑对DE值的影响程度，再设计正交试验优选出低DE值麦芽低聚糖的最佳制备条件为：20%的淀粉浆，pH6.1，耐高温α-淀粉酶10μl，真菌酶用量1.0μl，普鲁兰酶用量1.0μl，糖化温度60℃，糖化时间120min。优选出的制备工艺将DE值控制在30%～40%内，麦芽低聚糖的得率较高，为后期磷酸寡糖的制备和提取奠定了很好的基础。本实验采用阴离子交换树脂对磷酸寡糖进行分离纯化，考察了5种阴离子交换树脂D201，7170，D315，AB-8，201×4对磷酸寡糖的洗脱收率，通过静态吸附试验综合考虑吸附率和解析率最终选择7170强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂为分离制备磷酸寡糖的树脂填料，同时对洗脱浓度及洗脱速度的优化确定了7170分离磷酸寡糖的工艺条件：去离子水洗脱中性糖后，以含有0.1mol/LNaCl的乙酸—乙酸钠缓冲液洗脱磷酸寡糖，洗脱速度为1.5mL/min。采用薄层色谱法和HPAEC-PAD法对磷酸寡糖进行组分分析，同时结合红外光谱溴化钾压片法进一步对其进行组分和结构分析，结果表明磷酸寡糖在1080cm-1处有P-O-C基团的伸缩振动吸收峰，928cm-1处有五价磷的P-O伸展振动。进一步确定了磷酸寡糖是分子中结合有磷酸根的聚合度在27之间的麦芽低聚糖的混合物。本实验进行了磷酸寡糖中试制备的工艺设计，主要工艺包括喷射液化工序、糖化工序、离子交换分离工序和浓缩工序，设计了主要的工艺流程图。同时，进行了中试设配配置以及产业化的前期研究，使磷酸寡糖制备具有经济可行性，为其产业化生产铺垫直接基础。
二、磷酸寡糖检测方法的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、磷酸寡糖检测方法的研究（论文提纲范文）
（1）代谢工程改造大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写符号说明 |
| 1 绪论 |
| 1.1 2'-岩藻糖基乳糖概述 |
| 1.1.1 2'-岩藻糖基乳糖的结构与性质 |
| 1.1.2 2'-岩藻糖基乳糖的功能与应用 |
| 1.2 2'-岩藻糖基乳糖的合成 |
| 1.2.1 化学法合成 |
| 1.2.2 酶法合成 |
| 1.2.3 全细胞发酵法 |
| 1.3 模块化策略 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂与材料 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 培养基和主要试剂的配制 |
| 2.2.1 培养基 |
| 2.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳试剂 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶核酸电泳试剂 |
| 2.2.4 高效液相色谱流动相 |
| 2.3 分子生物学操作 |
| 2.3.1 菌株基因组的提取 |
| 2.3.2 质粒的抽提 |
| 2.3.3 PCR扩增反应体系 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.3.5 重组质粒的构建 |
| 2.3.6 重组菌株的构建 |
| 2.3.7 电转法转化DNA片段和质粒 |
| 2.3.8 基因编辑 |
| 2.4 培养方法 |
| 2.4.1 GDP-岩藻糖的摇瓶发酵 |
| 2.4.2 2'-岩藻糖基乳糖的摇瓶发酵 |
| 2.4.3 摇瓶发酵条件的优化 |
| 2.4.4 补料发酵生产2'-岩藻糖基乳糖 |
| 2.5 分析方法 |
| 2.5.1 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.5.2 质粒表达的检测方法 |
| 2.5.3 2'-岩藻糖基乳糖的检测方法 |
| 2.5.4 GDP-岩藻糖的检测方法 |
| 2.5.5 LC-MS检测方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 构建2'-岩藻糖基乳糖的合成代谢通路 |
| 3.1.1 构建GDP-岩藻糖合成的从头合成和补救合成途径 |
| 3.1.2 构建2'-FL生产菌株 |
| 3.1.3 产物2'-FL的分析与鉴定 |
| 3.2 改造宿主菌株优化2'-岩藻糖基乳糖的代谢合成途径 |
| 3.2.1 弱化前体代谢途径优化2'-FL的合成 |
| 3.2.2 阻碍底物代谢途径优化2'-FL的合成 |
| 3.2.3 敲除岩藻糖代谢的支路途径优化2'-FL的合成 |
| 3.2.4 改造后宿主发酵结果的分析 |
| 3.2.5 模块化组合调控基因的转录水平 |
| 3.3 发酵优化 |
| 3.3.1 IPTG的添加量对于2'-FL产量的影响 |
| 3.3.2 诱导温度对于2'-FL产量的影响 |
| 3.3.3 诱导点对于2'-FL产量的影响 |
| 3.3.4 碳源的种类对于2'-FL产量的影响 |
| 3.3.5 最优条件下的摇瓶发酵结果分析 |
| 3.3.6 3 L发酵罐发酵 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一:作者在攻读硕士期间发表的论文 |
（2）甘露糖醛酸寡糖增敏氟喹诺酮类抗菌剂抑菌活性机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 褐藻胶寡糖的生物活性与抑菌研究进展 |
| 1.1.1 褐藻胶寡糖的生物活性 |
| 1.1.2 AOS抑菌相关研究进展 |
| 1.2 E.coli的研究现状 |
| 1.2.1 E.coli的耐药情况 |
| 1.2.2 E.coli的破碎方法 |
| 1.3 甘露糖醛酸寡糖概述 |
| 1.3.1 MOS的制备 |
| 1.3.2 MOS的纯化 |
| 1.4 本课题的立题依据及思路 |
| 第二章 MOS的制备与纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器与试药 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试药 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 溶液的配制 |
| 2.3.2 MOS的制备 |
| 2.3.3 葡寡糖的制备 |
| 2.3.4 MOS的纯化 |
| 2.3.5 MOS的 CZE测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 MOS的检测 |
| 2.4.2 MOS的CZE测定结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MOS联用氟喹诺酮类抗菌剂抑制E.coli活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与试药 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试药 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 溶液的配制 |
| 3.3.2 MIC值的测定 |
| 3.3.3 MOS联合CPFX、LVFX抑制E.coli实验 |
| 3.3.4 葡寡糖联合CPFX、LVFX抑制E.coli实验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MIC测定 |
| 3.4.2 MOS与 CPFX、LVFX联用抑制E.coli |
| 3.5 小结 |
| 第四章 E.coli体内氟喹诺酮类抗菌剂含量的测定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与试药 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 试药 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 溶液的配制 |
| 4.3.2 色谱条件 |
| 4.3.3 E.coli体内CPFX、LVFX的提取方法 |
| 4.3.4 HPLC法测定E.coli体内CPFX、LVFX含量的方法学验证 |
| 4.3.5 E.coli对 CPFX、LVFX的摄取曲线 |
| 4.3.6 E.coli体内CPFX、LVFX的提取优化 |
| 4.3.7 MOS与 CPFX、LVFX联用对E.coli体内CPFX、LVFX含量的影响 |
| 4.3.8 激光共聚焦显微镜观察E.coli体内CPFX、LVFX含量 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 方法学验证 |
| 4.4.2 E.coli对 CPFX、LVFX的摄取曲线 |
| 4.4.3 E.coli体内CPFX、LVFX的提取优化 |
| 4.4.4 MOS与 CPFX、LVFX联用对E.coli体内CPFX、LVFX含量的影响 |
| 4.4.5 激光共聚焦显微镜观察结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Ca~(2+)浓度对MOS提高E.coli体内氟喹诺酮类抗菌剂含量的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器与试药 |
| 5.2.1 仪器 |
| 5.2.2 试药 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 溶液的配制 |
| 5.3.2 Ca~(2+)对增敏CPFX、LVFX抑菌效果的影响 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）枸杞果实发育过程中寡糖特性变化及相关酶研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物寡糖研究进展 |
| 1.1.1 植物寡糖 |
| 1.1.2 植物寡糖的生物功能 |
| 1.1.3 植物寡糖的合成代谢路径 |
| 1.2 植物果实寡糖代谢相关酶研究进展 |
| 1.3 蛋白质组学在研究植物果实生长发育中的应用 |
| 1.3.1 蛋白质组学概述 |
| 1.3.2 基于iTRAQ同位素标记的蛋白质组学在果实生长发育中的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 枸杞果实生长发育过程中寡糖含量和结构分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 采样 |
| 2.2.2 枸杞果实生长指数测量 |
| 2.2.3 寡糖提取方法 |
| 2.2.4 寡糖含量的测定 |
| 2.2.5 寡糖中蛋白含量测定 |
| 2.2.6 分子量测定 |
| 2.2.7 单糖组成分析 |
| 2.2.8 红外光谱法(IR) |
| 2.2.9 X射线衍射(XRD) |
| 2.2.10 差示量热法(DSC)和热重分析(TGA) |
| 2.2.11 扫描电子显微镜(SEM)分析 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 不同生长时期枸杞果实变化 |
| 2.3.2 寡糖含量测定结果 |
| 2.3.3 可溶性蛋白含量测定结果 |
| 2.3.4 枸杞果实生长发育过程中寡糖分子量分析结果 |
| 2.3.5 枸杞果实生长发育过程中寡糖的单糖组成分析 |
| 2.3.6 枸杞果实生长发育过程中寡糖红外光谱测定结果 |
| 2.3.7 枸杞果实生长发育过程中寡糖的X射线衍射分析 |
| 2.3.8 枸杞果实生长发育过程中寡糖的热性质 |
| 2.3.9 枸杞果实生长发育过程中寡糖表面形态特征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 枸杞果实生长发育过程中寡糖合成代谢相关酶活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 酶提取方法 |
| 3.2.2 酶测定方法 |
| 3.2.3 数据分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 枸杞果实生长发育过程中蔗糖合成酶活性变化 |
| 3.3.2 枸杞果实生长发育过程中蔗糖磷酸合酶活性变化 |
| 3.3.3 枸杞果实生长发育过程中酸性转化酶活性变化 |
| 3.3.4 枸杞果实生长发育过程中β-淀粉酶活性变化 |
| 3.3.5 枸杞果实生长发育过程中果糖激酶活性变化 |
| 3.3.6 枸杞果实生长发育过程中内切葡聚糖酶活性变化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 枸杞果实生长发育过程中寡糖合成代谢蛋白质组学分析 |
| 引言 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样品制备 |
| 4.2.2 iRAQ标记和SCX分馏 |
| 4.2.3 LC-MS检测分析 |
| 4.2.4 差异蛋白功能、通路注释和分类筛选 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 枸杞果实生长发育过程中寡糖代谢相关差异蛋白变化 |
| 4.3.2 枸杞果实生长发育过程中寡糖合成代谢相关蛋白GO功能注释 |
| 4.3.3 枸杞果实生长发育过程中寡糖合成代谢关键蛋白 |
| 4.3.4 枸杞果实生长发育过程中寡糖合成代谢通路分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 枸杞果实寡糖合成代谢关键酶基因的实时荧光定量分析 |
| 引言 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 筛选得到目的基因的 |
| 5.2.2 实时荧光定量PCR引物设计 |
| 5.2.3 总RNA分离和cDNA合成 |
| 5.2.4 实时定量PCR |
| 5.2.5 统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 RNA提取及检测结果 |
| 5.3.2 溶解曲线分析 |
| 5.3.3 枸杞果实生长过程中寡糖合成代谢相关酶基因的相对表达量 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）lsgB基因介导的脂寡糖α2，3-唾液酸化在副猪革拉瑟氏菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 副猪革拉瑟氏菌研究进展 |
| 1.1.1 副猪革拉瑟氏菌病原学及流行病学 |
| 1.1.2 副猪革拉瑟氏菌致病机制研究进展 |
| 1.1.3 副猪革拉瑟氏菌LOS及其修饰机制 |
| 1.1.4 小结与展望 |
| 1.2 唾液酸化研究进展 |
| 1.2.1 唾液酸简述 |
| 1.2.2 微生物唾液酸和类唾液酸分子合成机制的追溯 |
| 1.2.3 唾液酸转移酶研究进展 |
| 1.2.4 唾液酸化的生物学意义 |
| 1.2.5 小结与展望 |
| 1.3 唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素Siglecs |
| 1.3.1 Siglecs家族简述 |
| 1.3.2 Siglec1简述 |
| 1.3.3 Siglecs参与病原体免疫反应的研究进展 |
| 1.3.4 小结与展望 |
| 1.4 呼吸道屏障简述 |
| 1.4.1 呼吸道黏液屏障 |
| 1.4.2 呼吸道上皮细胞屏障 |
| 1.4.3 呼吸道病原菌的竞争及屏障破坏 |
| 1.4.4 胞外基质与呼吸道屏障 |
| 1.4.5 小结与展望 |
| 1.5 转化生长因子研究进展简述 |
| 1.5.1 转化生长因子简述 |
| 1.5.2 TGF-β1信号转导 |
| 1.5.3 转化生长因子的主要功能 |
| 1.5.4 小结与展望 |
| 1.6 内毒素耐受研究进展 |
| 1.6.1 内毒素耐受简述 |
| 1.6.2 内毒素耐受分子机制 |
| 1.6.3 内毒素耐受对疾病的影响 |
| 1.6.4 小结与展望 |
| 第2章 目的与意义 |
| 第3章 副猪革拉瑟氏菌lsgB基因功能的初步研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和细胞 |
| 3.1.2 相关质粒 |
| 3.1.3 试剂和试剂盒 |
| 3.1.4 培养基及抗生素的配制 |
| 3.1.5 主要溶液及其配制 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.1.7 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 副猪革拉瑟氏菌株的复苏和传代培养 |
| 3.2.2 p KWHK自杀性质粒的构建 |
| 3.2.3 lsgB基因缺失菌株的筛选 |
| 3.2.4 lsgB缺失菌株的RT-PCR鉴定 |
| 3.2.5 p SWHG穿梭质粒的构建 |
| 3.2.6 lsgB互补菌株的构建 |
| 3.2.7 野生菌株、缺失菌株及互补菌株生长曲线比较 |
| 3.2.8 野生菌株、缺失菌株及互补菌株的血清杀菌实验 |
| 3.2.9 热酚-水法(hot phenol-water)提取细菌内毒素(大量制备) |
| 3.2.10 鲎试剂终点显色法测定内毒素活性 |
| 3.2.11 脂多糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染 |
| 3.2.12 野生菌株、缺失菌株及互补菌株的自身凝集能力检测 |
| 3.2.13 野生菌株、缺失菌株及互补菌株对细胞黏附及侵入能力检测 |
| 3.2.14 野生菌株、缺失菌株及互补菌株与血清补体抑制因子f H结合实验 |
| 3.2.15 流式细胞术 |
| 3.2.16 黏附抑制实验 |
| 3.2.17 毒力评估实验 |
| 3.2.18 高效液相色谱检测唾液酸含量 |
| 3.2.19 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 缺失菌株缺失长度的选择 |
| 3.3.2 pKWHK和pSWHG重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.3 lsgB基因缺失菌株及互补菌株的PCR鉴定 |
| 3.3.4 lsgB基因缺失菌株RT-PCR和qPCR鉴定 |
| 3.3.5 lsgB基因缺失不影响GPS菌株的生长 |
| 3.3.6 lsgB基因缺失影响GPS菌株LOS末端的唾液酸化 |
| 3.3.7 lsgB基因缺失影响GPS菌株抵抗血清杀伤的能力 |
| 3.3.8 lsgB基因缺失影响GPS菌株对细胞的黏附和侵入 |
| 3.3.9 lsgB基因缺失影响GPS菌株的自身凝集 |
| 3.3.10 LOS唾液酸化影响补体fH因子在GPS菌株表面的沉积 |
| 3.3.11 LOS唾液酸化影响GPS菌株的毒力 |
| 第4章 lsgB-介导的LOS唾液酸化在GPS突破气管上皮屏障中的作用探究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和细胞 |
| 4.1.2 相关质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细菌侵入和Transwell实验 |
| 4.2.2 ELISA试剂盒测定TGF-β1分泌量 |
| 4.2.3 免疫组化 |
| 4.2.4 细菌与重组蛋白pull-down实验 |
| 4.2.5 Western Blot |
| 4.2.6 荧光定量PCR(qPCR) |
| 4.2.7 免疫共沉淀 |
| 4.2.8 siRNA干扰 |
| 4.2.9 细胞的转染及co-IP |
| 4.2.10 LOS-ELISA |
| 4.2.11 流式细胞术 |
| 4.2.12 双荧光素酶实验 |
| 4.2.13 利用CRISPR-Cas9技术在NPTr细胞中构建基因缺失细胞系 |
| 4.2.14 ECIS测定细胞的跨细胞电阻值 |
| 4.2.15 感染动物组织采样 |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 LOS唾液酸化诱导巨噬细胞Siglec1分子的高表达 |
| 4.3.2 LOS唾液酸化诱导肺泡巨噬细胞产生TGF-β1 |
| 4.3.3 唾液酸化的LOS通过Siglec1/DAP12/Syk轴促进TGF-β1分泌 |
| 4.3.4 猪源Siglec1胞内存在ITAM-like基序 |
| 4.3.5 p38参与Siglec1/DAP12/Syk介导的TGF-β1产生 |
| 4.3.6 TGF-β1影响气管上皮细胞屏障功能 |
| 4.3.7 LOS唾液酸化调控TGF-β1的产生来促进GPS的跨细胞迁移 |
| 4.3.8 LOS唾液酸化调控TGF-β1的产生来促进GPS侵入细胞 |
| 第5章 LOS唾液酸化在诱导免疫细胞耐受中的作用及机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和细胞 |
| 5.1.2 相关质粒 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 GPS和HI的LOS提取及去唾液酸化 |
| 5.2.2 内毒素耐受动物模型和细胞模型 |
| 5.2.3 小鼠脾脏单细胞悬液的制备 |
| 5.2.4 脾脏单细胞表面的染色 |
| 5.2.5 RAW264.7细胞免疫荧光染色及激光共聚焦 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 去唾液酸化的LOS降低巨噬细胞内毒素耐受能力 |
| 5.3.2 去唾液酸化减弱耐受细胞Siglec1和SHIP的表达及其相互作用 |
| 5.3.3 Siglec1是内毒素耐受潜在分子靶标 |
| 5.3.4 DAP12对下游信号的特异性调控 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 lsgB基因功能的初步探索 |
| 6.2 Siglecs与细菌感染的“磋商” |
| 6.3 唾液酸在机会致病菌中的“变装” |
| 6.4 机会致病菌的“无声”入侵 |
| 6.5 小结与展望 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）黄芪活性多糖APS-Ⅱ免疫调控机制及其酶解寡糖片段的结构和活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 立题背景及意义 |
| 1.2 研究内容、技术流程图及创新点 |
| 1.2.1 研究内容 |
| 1.2.2 技术路线图 |
| 1.2.3 创新点 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 黄芪多糖结构与活性研究现状 |
| 2.2 活性多糖降解制备寡糖方法 |
| 2.3 寡糖结构与活性研究现状 |
| 2.3.1 寡糖生物活性研究现状 |
| 2.3.2 寡糖结构解析研究现状 |
| 第三章 不同分子量黄芪多糖血清代谢组学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 不同分子量黄芪多糖的制备 |
| 3.3.2 实验动物 |
| 3.3.3 分组与给药 |
| 3.3.4 药效学评价 |
| 3.3.5 LC-MS代谢组学数据采集 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同分子量黄芪多糖的纯度及分子量 |
| 3.4.2 药效学评价 |
| 3.4.3 UHPLC Q-Exactive MS代谢组学研究 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 免疫活性多糖APS-Ⅱ酶降解 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 仪器与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 APS-Ⅱ分离制备的操作方法 |
| 4.3.2 黄芪多糖定向酶解 |
| 4.3.3 APS-Ⅱ酶解寡糖混合物的分离纯化 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 APS-Ⅱ分离制备 |
| 4.4.2 黄芪多糖定向酶解条件 |
| 4.4.3 寡糖混合物分离纯化 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 酶解寡糖的结构研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和仪器 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 酶解寡糖的红外光谱测定 |
| 5.3.2 酶解寡糖单糖组成分析 |
| 5.3.3 酶解寡糖甲基化分析 |
| 5.3.4 酶解寡糖核磁共振波谱分析 |
| 5.3.5 酶解寡糖质谱解析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 酶解寡糖红外光谱分析 |
| 5.4.2 酶解寡糖单糖组成分析 |
| 5.4.3 酶解寡糖甲基化分析 |
| 5.4.4 酶解寡糖核磁共振波谱分析 |
| 5.4.5 酶解寡糖质谱分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 不同寡糖组分免疫活性比较研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和仪器 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 不同寡糖组分对Raw264.7细胞吞噬活性影响 |
| 6.3.2 不同寡糖组分对NK细胞的细胞杀伤活性的影响 |
| 6.3.3 不同寡糖组分对淋巴细胞增殖影响 |
| 6.3.4 不同寡糖组分对脾淋巴细胞分泌IgG的影响 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 不同寡糖组分对Raw264.7细胞吞噬活性影响 |
| 6.4.2 不同寡糖组分对小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响 |
| 6.4.3 不同寡糖组分协同LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响 |
| 6.4.4 不同寡糖组分协同ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响 |
| 6.4.5 不同寡糖组分协同LPS对小鼠脾淋巴细胞分泌IgG的影响 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 工作总结 |
| 7.1.1 不同分子量黄芪多糖血清代谢组学研究 |
| 7.1.2 免疫活性多糖APS-Ⅱ酶降解方法建立 |
| 7.1.3 活性多糖APS-Ⅱ酶降解寡糖结构解析 |
| 7.1.4 不同寡糖组分免疫活性比较研究 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（6）Arthrobacter ramosus MTSase/MTHase分子改造及其制备海藻糖研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 海藻糖概述 |
| 1.1.1 海藻糖的结构和性质 |
| 1.1.2 海藻糖的生物功能 |
| 1.1.3 海藻糖的应用 |
| 1.1.4 海藻糖的制备 |
| 1.2 MTSase概述 |
| 1.2.1 MTSase的来源和性质 |
| 1.2.2 MTSase的分子改造 |
| 1.3 MTHase概述 |
| 1.4 蛋白质结构解析方法 |
| 1.5 酶分子改造策略 |
| 1.6 本课题的立题依据和研究意义 |
| 1.7 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 ArMTSase晶体结构解析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 突变体的构建 |
| 2.2.5 酶的摇瓶发酵 |
| 2.2.6 酶的分离纯化 |
| 2.2.7 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 2.2.8 蛋白结晶条件的筛选和优化 |
| 2.2.9 蛋白晶体的衍射和数据处理 |
| 2.2.10 分子动力学模拟 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 ArMTSase蛋白晶体的获得 |
| 2.3.2 ArMTSase蛋白晶体衍射及数据处理 |
| 2.3.3 ArMTSase的结构分析 |
| 2.3.4 ArMTSase和高温MTSase热稳定性差异的原因分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 ArMTSase分子改造提高热稳定性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 突变体的构建 |
| 3.2.5 突变文库的构建 |
| 3.2.6 转化子的挑取和培养 |
| 3.2.7 酶的摇瓶发酵 |
| 3.2.8 高通量筛选以及摇瓶发酵酶活的测定 |
| 3.2.9 酶的分离纯化 |
| 3.2.10 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 3.2.11 动力学稳定性测定 |
| 3.2.12 热动力学稳定性测定 |
| 3.2.13 酶的最适温度和最适p H测定 |
| 3.2.14 酶动力学参数测定 |
| 3.2.15 海藻糖的制备 |
| 3.2.16 海藻糖的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 理性设计提高ArMTSase的热稳定性 |
| 3.3.2 定向进化和理性设计结合提高ArMTSase的热稳定性 |
| 3.3.3 野生型及突变体的分离纯化 |
| 3.3.4 野生型及突变体的酶学性质 |
| 3.3.5 野生型及突变体制备海藻糖 |
| 3.3.6 突变体热稳定性提高的原因分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 ArMTSase分子改造提高海藻糖转化率 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 突变体的构建 |
| 4.2.5 突变文库的构建 |
| 4.2.6 转化子的挑取和培养 |
| 4.2.7 酶的摇瓶发酵 |
| 4.2.8 阳性突变体的筛选 |
| 4.2.9 酶活的测定 |
| 4.2.10 酶的分离纯化 |
| 4.2.11 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 4.2.12 酶的热稳定性检测 |
| 4.2.13 酶的最适温度和最适p H以及酶动力学参数测定 |
| 4.2.14 海藻糖的制备和检测 |
| 4.2.15 晶体结晶条件的筛选、优化、衍射和数据处理 |
| 4.2.16 酶的分子对接和结合自由能计算 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 ArMTSase定向进化提高海藻糖转化率 |
| 4.3.2 ArMTSase理性设计提高海藻糖转化率 |
| 4.3.3 海藻糖转化率提高突变体和热稳定性提高突变体的组合 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 ArMTSase优势突变体与MTHase的复配应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 突变体文库的构建 |
| 5.2.5 转化子的挑取和培养 |
| 5.2.6 酶的摇瓶发酵 |
| 5.2.7 阳性突变体的筛选 |
| 5.2.8 酶活的测定 |
| 5.2.9 酶的分离纯化 |
| 5.2.10 蛋白浓度的测定及SDS-PAGE |
| 5.2.11 酶的半衰期测定 |
| 5.2.12 酶的最适温度和最适p H测定 |
| 5.2.13 酶的动力学参数测定 |
| 5.2.14 海藻糖的制备 |
| 5.2.15 海藻糖的检测 |
| 5.2.16 突变体和野生型的同源建模 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同来源高温MTHase的选择 |
| 5.3.2 不同来源高温MTHase的克隆表达 |
| 5.3.3 不同来源高温MTHase和 M4_P复配制备海藻糖 |
| 5.3.4 Ar MTHase的定向进化提高热稳定性 |
| 5.3.5 Ar MTHase突变体的分离纯化 |
| 5.3.6 Ar MTHase突变体的酶学性质 |
| 5.3.7 Ar MTHase突变体热稳定性提高的原因分析 |
| 5.3.8 ArMTHase突变体和M4_P复配制备海藻糖 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表论文 |
（7）ALG1-CDG生物标记物疫苗的制备及免疫活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 糖基化修饰 |
| 1.1.1 蛋白质糖基化 |
| 1.1.2 多萜醇寡糖的合成 |
| 1.2 先天性糖基化疾病 |
| 1.2.1 先天性糖基化疾病的相关研究 |
| 1.2.2 先天性糖基化疾病的诊断方法 |
| 1.3 ALG1-CDG |
| 1.3.1 ALG1-CDG的研究现状 |
| 1.3.2 ALG1-CDG生物标记物 |
| 1.4 糖抗原 |
| 1.5 研究的意义及内容 |
| 1.5.1 本论文研究的意义 |
| 1.5.2 本论文研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂和溶剂 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要缓冲液及溶液的配制 |
| 2.1.5 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GalT和SiaT的表达 |
| 2.2.2 GalT和SiaT的纯化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE检测 |
| 2.2.4 Gn2GlyFmoc与GnGlyFmoc的合成 |
| 2.2.5 Sia-Gal-Gn2GlyFmoc与Sia-Gal-GnGlyFmoc的合成 |
| 2.2.6 Sia-Gal-PPGn2的合成 |
| 2.2.7 薄层色谱(TLC)检测方法 |
| 2.2.8 糖缀合物疫苗的制备 |
| 2.2.9 糖缀合物载糖量的测定 |
| 2.2.10 脂质体疫苗的制备 |
| 2.2.11 脂质体粒径的测量 |
| 2.2.12 Zeta电位的测量 |
| 2.2.13 透射电镜检测 |
| 2.2.14 免疫学试验方法 |
| 2.2.15 用ELISA检测血清抗体 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 半乳糖转移酶和唾液酸转移酶的表达纯化 |
| 3.2 糖缀合物疫苗的制备 |
| 3.2.1 化学合成Gn2GlyFmoc |
| 3.2.2 化学合成GnGlyFmoc |
| 3.2.3 酶法合成Gal-Gn2GlyFmoc和Sia-Gal-Gn2GlyFmoc |
| 3.2.4 酶法合成Gal-GnGlyFmoc和Sia-Gal-GnGlyFmoc |
| 3.2.5 制备糖缀合物 |
| 3.3 脂质体疫苗的制备 |
| 3.3.1 酶法合成Sia-Gal-PPGn2 |
| 3.3.2 制备脂质体 |
| 3.4 免疫学试验及抗体的检测 |
| 3.4.1 免疫学试验方法 |
| 3.4.2 糖缀合物组与脂质体组血清抗体滴度的分析 |
| 3.4.3 不同免疫时期血清抗体的滴度 |
| 3.4.4 糖缀合物组抗体种类和特异性的分析 |
| 3.4.5 脂质体组抗体种类和特异性的分析 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 核磁图 |
| 附录二:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（8）马铃薯淀粉中磷酸寡糖检测方法（论文提纲范文）
| 1 材料和主要设备 |
| 2 具体检测方法 |
| 2.1 处理磷酸寡糖的方法 |
| 2.2 磷酸寡糖的鉴别方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 展开剂选择比较结果 |
| 3.2 显色剂的比较结果 |
| 3.3 马铃薯淀粉中磷酸寡糖检测结果 |
| 3.4 马铃薯淀粉中磷酸寡糖回收率检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
（10）磷酸寡糖的制备及分离研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 功能性寡糖概述 |
| 1.1.1 功能性寡糖的概念 |
| 1.1.2 功能性寡糖的生理功效 |
| 1.1.3 寡糖的生产及应用 |
| 1.2. 磷酸寡糖的研究现状 |
| 1.2.1 磷酸寡糖的组成及结构 |
| 1.2.2 磷酸寡糖的制备研究 |
| 1.3 磷酸寡糖的生理功能 |
| 1.3.1 促进人体对钙、铁等矿物质元素的吸收 |
| 1.3.2 抗龋齿、促进牙齿再矿化 |
| 1.3.3 抗淀粉老化 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 引言 |
| 2.1 研究意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 3 材料和方法 |
| 3.1 原料 |
| 3.2 酶制剂 |
| 3.3 主要试剂 |
| 3.4 阴离子交换树脂 |
| 3.5 仪器及耗材 |
| 3.6 原料的分析 |
| 3.6.1 淀粉水分含量的测定 |
| 3.6.2 总磷含量的测定 |
| 3.6.3 游离磷含量的测定 |
| 3.6.4 结合磷含量的计算 |
| 3.7 低DE值的麦芽低聚糖优化工艺研究 |
| 3.7.1 总糖含量的测定方法 |
| 3.7.2 还原糖含量的测定方法 |
| 3.7.3 DE值的计算方法 |
| 3.7.4 酶法制备低DE值麦芽低聚糖的研究 |
| 3.7.5 HPAEC-PAD分析麦芽低聚糖浆的组分 |
| 3.8 磷酸寡糖的分离纯化 |
| 3.8.1 树脂的预处理 |
| 3.8.2 树脂的筛选 |
| 3.8.3 中性糖的洗脱 |
| 3.8.4 洗脱条件的选择 |
| 3.8.5 磷酸寡糖的脱盐处理 |
| 3.9 磷酸寡糖的组分及结构分析 |
| 3.9.1 磷酸寡糖的薄层层析 |
| 3.9.2 磷酸寡糖的组分分析 |
| 3.9.3 磷酸寡糖的结构分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 淀粉原料的分析 |
| 4.1.1 磷标准曲线的绘制 |
| 4.1.2 马铃薯淀粉原料的分析结果 |
| 4.2 低DE值的麦芽低聚糖优化工艺研究 |
| 4.2.1 总糖标准曲线的绘制 |
| 4.2.2 还原糖标准曲线的绘制 |
| 4.2.3 酶解单因素试验 |
| 4.2.4 低DE值麦芽低聚糖的最佳制备工艺条件的确定 |
| 4.2.5 HPAEC-PAD法分析麦芽低聚糖浆的组分 |
| 4.3 磷酸寡糖的分离纯化 |
| 4.3.1 阴离子交换树脂的筛选 |
| 4.3.2 中性糖洗脱曲线 |
| 4.3.3 洗脱液浓度的选择 |
| 4.3.4 洗脱速度的选择 |
| 4.4 磷酸寡糖的定性定量分析 |
| 4.4.1 磷酸寡糖薄层层析结果 |
| 4.4.2 HPAEC-PAD分析磷酸寡糖的组分 |
| 4.4.3 磷酸寡糖的结构分析 |
| 5 磷酸寡糖的中试生产工艺设计 |
| 5.1 磷酸寡糖的中试生产工艺设计 |
| 5.1.1 磷酸寡糖中试生产工艺概述 |
| 5.1.2 生产工艺要点 |
| 5.2 磷酸寡糖产业化前期研究 |
| 5.2.1 磷酸寡糖产业化的原料 |
| 5.2.2 磷酸寡糖产业化仪器设备选型 |
| 5.2.3 磷酸寡糖产业化工厂及设备平面图 |
| 5.2.4 磷酸寡糖产品要求 |
| 6 讨论 |
| 7 主要结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 硕士期间发表的论文 |
四、磷酸寡糖检测方法的研究（论文参考文献）
- [1]代谢工程改造大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖[D]. 李雯. 江南大学, 2021(01)
- [2]甘露糖醛酸寡糖增敏氟喹诺酮类抗菌剂抑菌活性机制研究[D]. 谢笑莹. 河北大学, 2021(09)
- [3]枸杞果实发育过程中寡糖特性变化及相关酶研究[D]. 李佩佩. 宁夏大学, 2021
- [4]lsgB基因介导的脂寡糖α2，3-唾液酸化在副猪革拉瑟氏菌致病中的作用及机制研究[D]. 王欢. 华中农业大学, 2021(02)
- [5]黄芪活性多糖APS-Ⅱ免疫调控机制及其酶解寡糖片段的结构和活性研究[D]. 崔连杰. 山西大学, 2021(12)
- [6]Arthrobacter ramosus MTSase/MTHase分子改造及其制备海藻糖研究[D]. 陈春. 江南大学, 2021(01)
- [7]ALG1-CDG生物标记物疫苗的制备及免疫活性研究[D]. 贾继祥. 江南大学, 2021(01)
- [8]马铃薯淀粉中磷酸寡糖检测方法[J]. 佟丽娜,徐明亮,高金波. 食品安全导刊, 2017(18)
- [9]由马铃薯淀粉制得磷酸寡糖的定性定量测定[J]. 杨丽,杨文军,刘霞,杜先锋. 食品科学, 2011(14)
- [10]磷酸寡糖的制备及分离研究[D]. 杨丽. 安徽农业大学, 2011(07)