一、吗啡依赖对小鼠肺表面活性物质分泌的影响（论文文献综述）
王志超[1]（2021）在《陈皮碱性提取物调控内质网应激治疗肺纤维化的机制研究》文中研究指明目的:肺纤维化是一种少见的间质性肺疾病,预后较差,治疗有限。团队前期研究发现,陈皮碱性提取物（Citrus Alkaline Extracts,CAE）能够发挥抗肺纤维化的作用,对肺成纤维细胞有明显抑制作用,但其抗肺纤维化的分子机制仍不完全明确,尤其对肺泡上皮细胞（Alveolar Epithelial Cell,AEC）的作用还有待探索。本研究首先进一步完成对CAE主要成分的鉴定,随后验证CAE对博来霉素（Bleomycin,BLM/Bleo）诱导的小鼠肺纤维化模型的治疗作用,之后利用组织样本及AECⅡ,体内体外探讨CAE对内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）、ATF3/PINK1信号通路以及线粒体稳态的调节作用,最后探索AEC Ⅱ和肺成纤维细胞间的交互作用及可能参与这个过程的细胞介质。方法:1.CAE的制备、鉴定和质控:利用95%乙醇反复煎煮陈皮饮片,通过过滤、浓缩、分散、调酸、调减、萃取等步骤从陈皮乙醇煎液中提取黄色粉末CAE;通过UPLC-ESI-MS/MS对CAE进行检测并完成质量控制,获得CAE总离子流图,提取保留时间、母离子分子量、子离子分子量、相对分子质量、峰强度等信息,利用植物次生代谢物数据库Metware对CAE二级谱进行智能匹配完成物质定性分析,采用多反应监测模式检测物质相对含量完成相对定量分析;2.BLM诱导小鼠肺纤维化模型:将120只小鼠分为空白组、腰穿针气管插管模型组、留置针气管插管模型组和气管切开模型组,分别利用腰穿针气管插管造模法、留置针气管插管造模法和气管切开造模法注射BLM诱导肺纤维化模型,观察小鼠一般情况,通过H&E和Masson染色观察肺组织病理学改变,并通过ELISA检测肺组织羟脯氨酸水平;3.CAE对小鼠肺纤维化的抑制作用:将50只小鼠分为空白组、模型组、CAE低剂量组（32 mg/kg/d）、CAE中剂量组（64 mg/kg/d）和CAE高剂量组（96 mg/kg/d）,利用腰穿针气管插管法气管注射BLM诱导肺纤维化模型,并分别以不同浓度CAE的CMC-Na溶液灌胃21天,通过H&E、Masson以及天狼星红染色观察小鼠肺组织病理学改变,并通过Western Blot检测肺组织胶原沉积水平;4.CAE缓解AEC Ⅱ中ERS调控ATF3/PINK1通路:通过Western Blot检测ERS相关蛋白以及ATF3、PINK1在肺组织中的表达情况,通过免疫荧光观察肺组织中ERS标志物BiP以及ATF3、PINK1的变化及重叠情况,再通过免疫荧光观察肺组织中AEC Ⅱ标志物SPC以及ATF3、PINK1的变化及重叠情况;之后将A549细胞分为空白组,模型组,CAE低剂量组（50 μg/mL）,CAE中剂量组（100μg/mL）、CAE高剂量组（200 μg/mL）和阳性对照组（TUDCA,5 μg/mL）,利用衣霉素（Tunicamycin,TM,2μg/ml）干预 12 h 建立 ERS模型,分别用含不同浓度CAE的培养基干预48 h,通过Western Blot检测ERS相关蛋白以及ATF3、PINK1在A549细胞中的表达情况,再通过免疫荧光观察A549细胞中BiP以及ATF3、PINK1的变化及重叠情况;5.CAE通过ATF3/PINK1通路调控AEC Ⅱ线粒体稳态:首先通过JC-10检测A549细胞的线粒体膜电位水平,再通过ROS检测试剂盒检测A549细胞的ROS水平,从而观察A549细胞线粒体功能;之后通过shRNA质粒对A549细胞的ATF3及PINK1进行基因沉默,并再次通过JC-10和ROS检测试剂盒检测A549细胞的线粒体膜电位及ROS水平,从而观察A549细胞线粒体功能;6.CAE通过调控AEC Ⅱ影响肺成纤维细胞:A549细胞经TM和CAE干预后,更换不含CAE的低血清培养基继续培养72 h,收集细胞上清干预MRC5细胞,通过Western Blot检测MRC5细胞的胶原水平,并通过ELISA检测细胞上清中TGF-β1、IL-6及IL-10的水平。结果:1.CAE的制备、鉴定和质控:CAE为黄色粉末,平均产量约1.56 mg/kg;通过UPLC-ESI-MS/MS鉴定出315种物质,包括143黄酮类物质和32种生物碱类物质,其中80种物质的一级结构和二级结构完全匹配,可以确定为CAE的活性成分,包括47黄酮类物质和5种生物碱类物质,其中具有代表性的黄酮类物质有桔皮素、川陈皮素、芸香柚皮苷、新橙皮苷、甜橙素、橙皮苷,具有代表性的生物碱类物质有辛弗林、枸橼苦素Ⅰ、扁平桔碱Ⅰ、芽子碱;不同批次CAE样本间无明显差异;2.BLM诱导小鼠肺纤维化模型:在腰穿针气管插管模型组、留置针气管插管模型组和气管切开模型组三组中,气管切开模型组体重下降最为明显,存活率也最低（60%）,相比而言,留置针气管插管模型组存活率是最高的（90%）;腰穿针气管插管模型组和气管切开模型组肺泡炎及肺纤维化程度较高,且第21天最明显,而留置针气管插管模型组较低;腰穿针气管插管模型组和气管切开模型组羟脯氨酸含量显着高于空白组（P<0.001）;3.CAE对小鼠肺纤维化的抑制作用:CAE干预组肺泡结构改善,炎症浸润减少,胶原沉积减轻,尤以CAE高剂量组最为明显;和模型组相比,CAE高剂量组的肺泡炎评分显着降低（P<0.05）,肺纤维化评分及胶原半定量分析也显着降低（P<0.001）,同时COLlα1和COL3蛋白表达均显着降低（P<0.05）;4.CAE缓解AEC Ⅱ中ERS调控ATF3/PINK1通路:在肺组织中,CAE干预组和模型组相比,BiP、PERK、p-eIF2α、ATF4和ATF3表达均明显降低,PINK1则明显升高,且呈浓度依赖性,其中CAE高剂量组差异最显着（P<0.05;P<0.001;P<0.01;P<0.001;P<0.01;P<0.01）,且BiP和ATF3的免疫荧光变化有较大重叠,ATF3和PINK1的免疫荧光变化均与SPC有较大重叠。在A549细胞中,BiP、PERK、p-eIF2α、ATF4和ATF3表达均明显降低,PINK1则明显升高,且呈浓度依赖性,其中CAE高剂量组差异最显着（P<0.05;P<0.001;P<0.01;P<0.001;P<0.01;P<0.01）,且 BiP 和 ATF3 的免疫荧光变化有较大重叠;5.CAE通过ATF3/PINK1通路调控AEC Ⅱ线粒体稳态:在A549细胞中,CAE干预组和模型组相比,线粒体膜电位明显降低,呈浓度依赖性,其中CAE高剂量组差异最显着（P<0.001）,ROS浓度也明显降低,呈浓度依赖性,其中CAE高剂量组差异最显着（P<0.01）;ATF3沉默后,和模型组相比,CAE干预组和阳性对照组PINK1表达未见显着升高,线粒体膜电位虽略有升高,但没有显着性差异;PINK1沉默后,线粒体膜电位虽略有升高,但同样没有显着性差异;6.CAE通过调控AEC Ⅱ影响肺成纤维细胞:在MRC5细胞中,CAE干预组和模型组相比,COLlαl和COL3表达均有明显降低,且呈浓度依赖性,其中CAE高剂量组有显着差异（P<0.05;P<0.05）;在细胞上清中,CAE干预组和模型组相比,TGF-β1、IL-6和IL-10表达均有明显降低,且呈浓度依赖性,其中CAE高剂量组有显着差异（P<0.001;P<0.05;P<0.05）。结论:1.CAE的活性成分主要为黄酮类物质和生物碱类物质;2.CAE可以缓解AEC Ⅱ的ERS,并通过ATF3/PINK1信号通路调节AEC Ⅱ线粒体稳态;3.CAE通过减少AEC Ⅱ中TGF-β1等细胞因子的分泌,间接降低肺成纤维细胞的胶原表达,最终缓解肺纤维化。
李君[2]（2021）在《肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接在ARDS中变化及机制》文中研究表明研究背景急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratory distress syndrome,ARDS）是由各种肺内因素和（或）肺外因素引起的急性弥漫性肺损伤,肺血管内皮及肺泡上皮细胞受损,肺血管通透性及肺泡通透性增加,进而导致肺水肿形成,是ARDS基本病理特点。ARDS是临床常见的急危重症,病死率高达46%,目前治疗以机械通气为主,尚缺乏有效药物治疗。大量水肿液从气道溢出和胸部影像学表现为“白肺”的特征是重度ARDS患者严重肺水肿的典型临床表现。ARDS根据始发因素不同通常分为:肺内源性ARDS与肺外源性ARDS。肺外源性ARDS的诱发因素主要包括腹腔、皮肤软组织等非肺源性的重症感染、急性胰腺炎、重大胸部创伤、车祸等,其首先受损的细胞是肺血管内皮细胞;而在肺内源性ARDS（如SARS、H1N1流感、COVID-19感染,误吸,溺水,肺挫伤等）中,肺泡上皮细胞成为首要受损的靶细胞,上皮屏障的破坏成为ARDS发生发展的关键因素。研究表明单纯损伤内皮细胞不足以充分诱发肺水肿,近年来肺泡上皮细胞的破坏在ARDS肺水肿形成中的作用越来越受到重视。尤其在肺内因素所致ARDS中,肺泡上皮屏障的结构和功能的损伤是ARDS发生的关键因素。因此研究肺泡上皮屏障损伤及机制,将可能成为未来ARDS治疗的突破口。肺泡上皮屏障主要由Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞、细胞间连接、细胞表面的活性物质及肺泡上皮细胞多糖包被等构成。肺泡上皮细胞多糖包被是覆盖在肺泡上皮细胞表面一层带负电荷的多糖-蛋白质复合物,主要由核心蛋白和侧链构成,其侧链结构主要包括硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）、透明质酸及硫酸软骨素等,其中HS含量最多,占侧链结构的50%以上,对多糖包被的完整性和功能起着至关重要的作用,是肺泡上皮屏障的重要组成部分。乙酰肝素酶（heparanase,HPA）是哺乳动物体内唯一一种特定将多糖包被侧链HS裂解为小片段而调控HS的葡萄糖醛酸酶内切酶。肝素酶Ⅲ（heparinase Ⅲ）,一种HS特异性的细菌葡萄糖醛酸酶内切酶,亦可以降解多糖包被侧链HS。非抗凝的肝素（N-desulfated/re-N-acetylated heparin,NAH）是HPA的竞争性拮抗剂。当前,国内外大多数研究集中于内皮细胞多糖包被,而肺泡上皮细胞多糖包被一直被忽略。近年来在肺内源性ARDS动物模型中发现肺泡上皮细胞多糖包被在维持肺实质结构、促进细胞信号转导等方面发挥重要作用,是防止宿主感染的重要屏障。肺泡上皮多糖包被和上皮细胞紧密连接（tightjunction）是肺泡屏障的重要组成部分,其破坏所致肺泡通透性的增加是ARDS肺水肿形成的重要因素。推测肺泡上皮细胞多糖包被和紧密连接的损伤是ARDS尤其是肺内源性ARDS发生发展的重要靶位。因此,研究ARDS发生发展中肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接的损伤及机制,可能为临床药物治疗ARDS提供新的靶点。本研究以肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接为研究切入点,拟包括以下四部分内容。第一部分LPS对肺泡上皮细胞多糖包被侧链-HS的影响目的:肺泡屏障破坏所致通透性增加是ARDS肺水肿形成的重要因素,近年来发现上皮细胞多糖包被是肺泡屏障的重要组成部分,其损伤可能参与ARDS肺水肿的形成。本研究旨在观察脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）致ARDS中肺泡上皮多糖包被侧链HS的变化。方法:①体内实验以C57BL/6小鼠为研究对象,应用气管内滴注LPS建立小鼠ARDS模型,小鼠随机分为正常对照组、LPS组。②体外实验利用人肺泡上皮细胞（A549）为研究对象,分为正常对照组和LPS组。通过观察肺组织病理学改变评估肺损伤程度,测量肺组织湿/干比（W/D）来评估肺泡通透性的变化。通过免疫荧光技术分析小鼠肺泡上皮细胞及A549细胞多糖包被HS的变化,评估ARDS发生中肺泡上皮细胞HS的损伤及程度。结果:LPS组小鼠与正常对照组相比,肺组织病理显示炎症细胞浸润增多、肺泡间隔增厚,同时W/D增高,肺泡腔渗出增多,肺水肿形成。免疫荧光结果显示LPS组小鼠肺泡上皮细胞及A549细胞HS表达较正常对照组降低（P<0.05）。结论:LPS致ARDS肺泡上皮细胞多糖包被侧链HS表达减少。第二部分LPS致ARDS中HPA对肺泡上皮细胞多糖包被的结构及功能的影响目的:HPA是HS特异性调控酶,非抗凝的肝素（N-desulfated/re-N-acetylated heparin,NAH）是HPA的竞争性拮抗剂。本研究的主要目的是探明LPS致ARDS中肺泡上皮细胞HS表达减少的机制。方法:以C57BL/6小鼠及人肺泡上皮细胞（A549）为研究对象,应用气管内滴注LPS建立小鼠ARDS模型及LPS刺激A549细胞构建细胞损伤模型。将体内外实验分为正常对照组、LPS组、肝素酶Ⅲ（外源性添加HPA）组、LPS+NAH（HPA的竞争性拮抗剂）组、灭活的肝素酶Ⅲ组及NAH组。通过观察肺组织病理学改变评估肺损伤程度,测量肺组织湿/干比（W/D）来评估肺泡通透性的变化。利用 ELISA 检测肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF）、血液、BALF/血液及细胞上清液中HS含量评估肺泡上皮细胞多糖包被的降解程度。通过免疫荧光分析上皮细胞残留的多糖包被HS的变化。通过透射电镜观察小鼠肺泡上皮细胞多糖包被超微结构的变化。结果:LPS组及肝素酶Ⅲ组小鼠肺组织炎症细胞浸润增多、肺泡渗出增多、肺泡间隔增厚,同时W/D增高,肺泡通透性增加,NAH预处理组病理学改变有所减轻,W/D降低。ELISA结果显示LPS组细胞上清液中HPA产生显着增加。同时LPS及肝素酶Ⅲ组细胞上清液、BALF、BALF/血清中脱落的HS含量较正常对照组升高,NAH预处理组HS则较LPS组明显减少（P<0.05）。免疫荧光结果显示LPS组及肝素酶Ⅲ组小鼠肺泡上皮细胞及A549细胞残留的HS较正常对照组低,NAH预处理组较LPS组有所改善（P<0.05）。透射电镜显示正常对照组小鼠肺泡上皮细胞多糖包被是连续的,而LPS刺激后多糖包被部分或完全脱落,NAH预处理组肺泡上皮细胞多糖包被脱落有所减轻。结论:LPS致ARDS模型中肺泡上皮细胞多糖包被侧链HS的降解与特异性调控酶HPA增加有关,NAH通过抑制HPA对HS的降解,减少LPS对HS的破坏,保护肺泡上皮细胞多糖包被的完整性,改善肺水肿。第三部分LPS致ARDS中肺泡上皮细胞紧密连接的变化目的:肺泡上皮细胞多糖包被和紧密连接是肺泡屏障重要组成部分,上皮多糖包被与紧密连接破坏是ARDS肺水肿形成的重要病理生理机制。本研究第一与第二部分的研究结果表明LPS可导致ARDS肺泡上皮细胞多糖包被HS的破坏,与肺水肿形成有关。然而,上皮细胞紧密连接的破坏也与肺水肿形成有密切关系。本研究旨在观察LPS致ARDS中肺泡上皮细胞紧密连接的变化,进一步探讨LPS致肺损伤的机理。方法:以C57BL/6小鼠及人肺上皮细胞（A549）为研究对象,应用气管内滴注LPS建立小鼠ARDS模型及LPS刺激A549细胞构建细胞损伤模型。将体内外实验分为正常对照组、LPS组、肝素酶Ⅲ组、LPS+NAH组、灭活的肝素酶Ⅲ组及NAH组。通过免疫荧光和western blot分析上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin4）的变化。通过透射电镜观察小鼠肺泡上皮细胞紧密连接超微结构的变化。结果:小鼠组织免疫荧光显示LPS组及肝素酶Ⅲ组紧密连接蛋白（occludin、ZO-1、claudin4）表达水平较正常对照组均降低。同时LPS及肝素酶Ⅲ刺激A549细胞后,细胞免疫荧光及western blot显示occludin、ZO-1、claudin 4表达水平也较正常对照组降低。NAH预处理后上述紧密连接蛋白破坏减少,灭活的肝素酶Ⅲ组及NAH组较正常对照组无明显差异。透射电镜显示正常对照组小鼠肺泡上皮细胞紧密连接是完整的,而LPS刺激后细胞间裂隙增宽、紧密连接蛋白结构破坏,而NAH预处理组肺泡上皮细胞紧密连接的破坏有改善。结论:①LPS可引起肺泡上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin 4）的破坏。②肝素酶Ⅲ破坏肺泡上皮细胞多糖包被HS后,紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin 4）亦破坏,而HPA的竞争性拮抗剂NAH保护多糖包被HS后上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin4）损伤也得以改善。推测HPA-HS与紧密连接可能存在潜在关系。第四部分探讨HPA-HS与紧密连接损伤的相关性目的:前期研究发现外源性添加HPA可破坏肺泡上皮细胞多糖包被HS,引起上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin4）的破坏增加,导致肺泡通透性增加,而HPA的竞争性拮抗剂NAH可在减轻肺泡上皮细胞多糖包被HS的降解同时减轻上皮细胞间紧密连接蛋白的损伤,改善肺泡屏障。HPA是HS特异性调控酶。HPA不直接作用于紧密连接,HPA降解多糖包被侧链HS后紧密连接破坏增加,说明紧密连接与多糖包被侧链HS具有潜在的相关性。本研究旨在进一步探讨HPA-HS致紧密连接破坏的潜在机制。方法:①为探讨HPA-HS与ZO-1破坏的关系,利用内源性重组HPA（2 U/ml）刺激人肺泡上皮细胞（A549）12h建立细胞损伤模型,将细胞分为正常对照组、重组HPA组。采用细胞免疫荧光技术观察细胞HS表达的变化,分析多糖包被侧链HS的变化。运用细胞免疫荧光及western blot观察紧密连接蛋白ZO-1的表达。应用实时定量PCR技术研究紧密连接蛋白（ZO-1 mRNA）表达。②为探讨HPA-HS与ZO-1破坏是否与STAT3信号通路有关,将A549细胞分为正常对照组,重组HPA组,重组HPA+STAT3-IN-1（STAT3抑制剂）组以及STAT3-IN-1组,利用western blot检测各组p-STAT3的表达变化。结果:①细胞免疫荧光分析显示,重组HPA可使细胞多糖包被HS的表达降低（P<0.05）。同时细胞免疫荧光及western blot结果显示,与正常对照组相比,重组HPA组ZO-1的表达减少（P<0.05）。此外,重组HPA刺激A549细胞后ZO-1 mRNA也显着降低（P<0.001）。②Western blot结果显示正常对照组,HPA组,HPA+STAT3-IN-1组以及STAT3-IN-1组p-STAT3的表达差异无统计学意义。结论:①重组HPA在降解肺泡上皮细胞多糖包被HS的同时,破坏上皮细胞紧密连接ZO-1,HPA-HS干预ZO-1 mRNA的合成,进而减少ZO-1蛋白的表达。②STAT3信号通路不参与重组HPA-HS对上皮细胞紧密连接蛋白的影响。总之:上述结果表明LPS致ARDS肺上皮细胞HPA增加,破坏多糖包被HS使多糖包被的结构和功能受损而参与ARDS肺水肿的形成;LPS致ARDS肺泡上皮细胞紧密连接结构和功能蛋白也受损伤,与多糖包被损伤共同参与ARDS的肺水肿形成,为ARDS药物治疗及开发应用提供新的途径。LPS-HPA-HS与紧密连接损伤的关系尚待进一步研究。
江敏[3]（2021）在《兰坪虫草多糖缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化》文中进行了进一步梳理肺纤维化是持续性肺损伤和肺组织结构异常后重塑的结果,其主要特征为炎症弥漫性肺泡损伤,成纤维细胞分化导致的胶原蛋白沉积。尽管对肺纤维化发病机理的探究已有二十年之久,但是目前临床上仍以糖皮质激素和免疫抑制剂治疗为主,毒副作用大且不能从根本上逆转肺纤维化。因此,迫切需要找到治疗肺纤维化的新方法和新策略。兰坪虫草（Ophiocordyceps lanpingensis）是近些年发现的线虫草属新种,主要分布在云南省兰坪县。当地的少数民族长期将兰坪虫草用于保健和治疗疾病,尤其对呼吸系统疾病疗效显着,但药理机制仍不明晰。我们的前期研究表明,兰坪虫草多糖可能是兰坪虫草的主要活性成分,本研究以兰坪虫草多糖为实验药物,探究其对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的缓解效果及其作用机制,为兰坪虫草资源的开发和利用提供理论支撑,也为临床上肺纤维化的治疗提供借鉴依据。本论文的研究内容主要包括以下两个方面:1.兰坪虫草多糖对小鼠肺纤维化的药效研究50只C57BL/6雄性小鼠,分为对照组、模型组、兰坪虫草多糖低/中/高剂量组,每组10只,共5组。通过单次气管内滴注6 mg/kg博来霉素建立小鼠肺纤维化模型。兰坪虫草多糖低、中、高剂量组每天灌胃相应剂量（0.3 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg）的多糖溶液,对照组给予等量生理盐水,给药21天后,观察肺组织形态结构变化,检测肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量和氧化应激指标,同时取肺组织进行HE、Masson染色,观察其病理变化。结果表明:兰坪虫草多糖显着改善纤维化小鼠的疾病状态,缓解小鼠肺组织水肿和降低了肺系数。病理切片结果显示兰坪虫草多糖可以有效减轻肺泡炎,抑制胶原纤维沉积。此外,兰坪虫草多糖减少了肺组织内HYP含量以缓解胶原沉积,同时增加了超氧化物歧化酶、谷胱甘肽含量,增强肺组织抗氧化防御机制,减少了丙二醛的产生。以上研究明确了兰坪虫草多糖能够有效缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化进程。2.兰坪虫草多糖缓解小鼠肺纤维化的机制研究采用实时荧光定量PCR检测单核细胞趋化因子MCP-1和巨噬细胞标志物基因NOS2、CXCL10/IP10、MARCO、ST2的m RNA表达水平,并进一步检测巨噬细胞分泌的炎性相关细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13和关键致纤维化因子TGF-β1以及调节炎性因子表达的多效应细胞因子OSM的基因表达量;采用免疫组织化学染色、免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测巨噬细胞标记物CD68+,促炎因子IL-6和成纤维细胞标志基因α-SMA的蛋白表达水平。结果表明,兰坪虫草多糖显着下调了MCP-1、NOS2、CXCL10/IP10、MARCO和ST2的表达,有效抑制了TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、OSM、TGF-β1的表达,同时,使CD68+、IL-6和α-SMA的蛋白表达水平下降,以上结果说明兰坪虫草多糖通过减少巨噬细胞在肺部的募集以及抑制细胞因子的分泌来缓解肺纤维化进程。采用荧光定量PCR检测自噬相关基因Beclin1、ATG7、p62和自噬负调控通路PI3K/AKT/m TOR各基因表达量,利用蛋白质免疫印记法检测该信号通路的磷酸化水平;此外,检测了与基质金属蛋白酶相关的MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1、E-cadherin、Collagen-I、Collagen-III的表达,明确其对ECM沉积的影响。结果表明兰坪虫草多糖可以抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路表达,促进Beclin1、ATG7表达,降低p62表达,进而促进肺部细胞自噬;同时,兰坪虫草多糖可升高E-cadherin表达量,降低Collagen-I、Collagen-III表达水平,维持MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1平衡。以上结果表明,兰坪虫草多糖抗肺纤维化的作用机制可能与促进细胞自噬和维持基质金属蛋白酶系统的平衡有关,最终达到减轻ECM异常沉积的目的,缓解了肺纤维化进程。综合上述研究成果,表明兰坪虫草多糖可以有效缓解BLM诱导的小鼠肺纤维化,其药理机制包括兰坪虫草多糖可以抑制肺组织的氧化应激状态和炎症反应,减少巨噬细胞在肺组织中的募集,进而降低细胞因子的释放和影响;同时,兰坪虫草多糖还可以促进细胞自噬,维持基质金属蛋白酶系统的平衡,减轻ECM异常沉积。以上多层面的共同作用,最终实现缓解BLM诱导的肺纤维化进程。
王明哲[4]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中认为背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
王博[5]（2021）在《我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选》文中研究说明第一部分我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科,全球共70余种,我国分布有17种,优势种为平颏海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus）,在北部湾及海南、福建近海最为多见。海蛇毒是由多种蛋白、多肽和小分子物质共同组成的混合物,其主要组分为神经毒素和多种酶类,致死性极强。由于海蛇种类、地域分布及猎食对象的不同,海蛇毒中所含的蛋白种类和占比也有一定差异。为了更好地研究我国海域平颏海蛇毒（H.curtus venom,Hcu V）和青环海蛇毒（H.cyanocinctus venom,Hcy V）的组成,比较分析两者差异情况,本部分以平颏海蛇和青环海蛇为研究对象,首先构建了海蛇毒腺转录组数据库;其次利用液相色谱-质谱联用技术,通过蛋白组学方法对两种海蛇毒的蛋白组成进行了比较分析;在组学基础之上,我们又进一步对海蛇毒相关的生物学性质进行了测定与分析。主要结果如下:1.首先应用Illumina Hi Seq?平台对我国两种海蛇毒腺进行了转录组测序,成功构建了高质量的毒腺转录组数据库,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别获得38,710和35,716条unigenes序列。我们将毒腺的转录组数据在公共数据库（NR、KEGG、GO、KOG、Swiss Prot）中进行了功能注释,在NR数据库中,两种海蛇毒腺注释序列来源最多的3个物种均为Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah;在KEGG注释中,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别注释了10,949和10,683条unigenes,主要集中在信号转导和疾病发生相关的路径中;对简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点检测,平颏海蛇和青环海蛇毒腺转录组中分别发现了15,171和12,908个SSR位点,其中以单核苷酸为重复单元的类型占比最高,均超过了50%。通过与Uni Prot动物毒素库（Uni Prot animal toxin and venom database）Blast比对,在两种海蛇毒腺中总共筛选到了17种蛇毒蛋白,充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的资源。2.通过液相色谱-质谱联用技术,获得Hcu V和Hcy V蛋白组分的原始肽段,匹配检索Uni Prot动物毒素数据库,在Hcu V和Hcy V中分别鉴定到47和38种毒素相关蛋白。根据功能分类,鉴定到的毒素相关蛋白可归为15个家族,主要包括:三指毒素、蛋白酶类、磷脂酶类、富含半胱氨酸毒素蛋白类、毒素因子、离子通道抑制剂等。这些毒素多见于蛇类,但也有少数见于其它有毒生物,包括蜘蛛（Lycosa singoriensis）、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。3.通过毒素蛋白组比较分析发现,不同毒素家族在Hcu V和Hcy V中所占比例不同,具体的蛋白组成也有一定差异。Hcu V和Hcy V中比例最高的两类毒素均为三指毒素（主要包括短链和长链神经毒素）和磷脂酶A2,在Hcu V中所占比例分别为54%和38%,在Hcy V中分别为69%和22%,与文献报道的不同海域海蛇毒的组成及占比有明显差异。两种海蛇毒的生物学活性测定结果表明,Hcu V和Hcy V的小鼠半数致死量(LD50)分别为0.34 mg/kg和0.24 mg/kg,都有很强的致死性;两种海蛇毒均检测到明显的神经毒性、磷脂酶A2活性,以及微弱的蛋白酶活性和间接溶血毒性,但无明显的促凝与抗凝活性,这些活性检测结果与组学分析结果相一致。本部分通过对Hcu V和Hcy V进行多组学分析,并结合蛇毒生物学活性检测,揭示了我国两种优势种海蛇毒组成的分子多样性,也提示毒素蛋白组成比例的不同与其咬伤症状表现和致死效应之间可能存在的关系,为后续研制针对我国海域海蛇咬伤中毒的抗毒血清提供了重要基础。第二部分抗平颏海蛇毒血清的制备及其抗毒效果评价海蛇毒主要组分为神经毒素,能阻断神经突触传递,从而产生一系列中毒症状。海蛇毒的毒性极强,可诱发严重的呼吸衰竭,死亡率高,目前针对海蛇咬伤最有效的急救方式是尽快注射抗毒血清,但我国仅生产几种抗陆地蛇毒血清,对海蛇咬伤救治效果不佳。第一部分研究结果提示,不同海域、不同种类的海蛇,其毒素组成存在一定差异,因此有必要研制特异性针对我国海域优势种海蛇毒的抗毒血清,本论文第二部分即以我国海域优势种平颏海蛇毒为抗原,经过抗原处理、免疫马匹、抗体纯化等步骤,制备了高效价的抗毒血清;并进一步对抗海蛇毒血清的体内外抗毒效果进行了评价,明确了抗毒血清的有效用量和使用时机,为今后临床应用提供了参考。主要结果如下:1.采用0.6%甲醛浓度灭活毒素再添加弗氏不完全佐剂进行乳化,使毒素抗原获得最大的免疫原性,免疫马匹后50天采血可获得最高效价的马血清;经过酶消化、硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等抗体纯化步骤后,抗海蛇毒血清中抗体F（ab’）2蛋白纯度达到91.6%,杂质大量减少,同时具备较好的毒素中和能力。2.抗平颏海蛇毒血清（H.curtus antivenom,Hcu AV）体外抗毒实验结果显示,Hcu AV对平颏海蛇毒和青环海蛇毒均有良好中和效果:1 m L Hcu AV能够对抗1.2 mg平颏海蛇毒或0.9 mg青环海蛇毒,使半数实验动物存活,提示Hcu AV能交叉中和多种海蛇毒,并为体内实验的抗毒血清用量提供了依据。3.Hcu AV体内抗毒实验结果显示,海蛇咬伤中毒后注射Hcu AV能显着提高实验动物的存活率,但需在短时间内（出现中毒症状前）尽早注射足量抗毒血清才能达到较好的救治效果,预防用药和延迟用药均无法降低中毒死亡率。同时,Hcu AV能有效减轻海蛇毒造成的多器官病理学变化。本部分以平颏海蛇毒为抗原,制备了高效价、高纯度的抗平颏海蛇毒马血清,能有效中和Hcu V和Hcy V,覆盖我国海域优势种海蛇毒。海蛇咬伤后尽快注射足量抗毒血清,能显着地降低中毒死亡率,保护机体脏器免受损伤,为今后抗海蛇毒血清的临床应用提供了实验依据。第三部分平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析海蛇毒由多种酶类、非酶类蛋白和多肽、小分子物质组成,是一类重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了剧烈的毒性之外,也含有多种结构特异、功能新颖的活性物质,具有多样的药理学效应如:镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物质是海洋生物资源开发研究的热点之一。本部分以我国南海海域平颏海蛇为研究对象,分离其毒腺组织,利用M13噬菌体展示技术构建了平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库。然后以内毒素LPS为靶标分子,经过多轮淘选,筛选出一个高亲和力的噬菌体克隆,通过基因测序、氨基酸序列预测与性质分析等,最终通过化学合成法获得了一段功能性多肽,并通过体内、体外实验评价其对内毒素的拮抗效果。本部分主要结果如下:1.构建了高质量的平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库,文库库容达到2.2×109,随机测序验证外源插入片段准确无误;c-Myc标签检测结果表明,外源插入片段在噬菌体外壳表面得到了高效的展示。2.以LPS为靶标分子,经过4轮固相淘选、阳性克隆测序、氨基酸序列预测等过程,获得了一段平颏海蛇毒腺来源的21肽。多肽性质分析结果表明,该多肽富含碱性氨基酸,理论分子量为2523.15,理论等电点为10.76,在中性溶液中携带正电荷;该多肽的二级结构主要为α-螺旋,氨基与羧基端呈现出双亲性结构,能够与带负电荷疏水性的LPS特异性结合。3.通过化学合成方式成功合成并纯化了该21肽,纯度超过95%,质谱测定实际分子量与软件预测的理论值相符,证明合成的多肽无误,可用于进一步实验。利用生物膜干涉技术（BLI）对该多肽与LPS的结合力进行测定,结果表明,该多肽与LPS具有较强的结合能力,结合方式为“快结合-慢解离”。内毒素中和实验表明,该海蛇毒腺来源的21肽具有明确的内毒素中和效果,因而将其命名为H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide,简称Hc-ENP。4.体外实验结果表明,Hc-ENP具有明确的LPS拮抗效果,在5-10μg/m L浓度下,能够有效抑制LPS与RAW264.7细胞的结合。Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等结果显示,Hc-ENP能通过抑制MAPK、NF-κB炎性信号通路的激活,从而有效抑制LPS刺激细胞产生的一系列炎性反应,包括:炎性因子释放、炎性相关酶表达量升高、活性氧含量增加等,进而发挥抗炎活性。5.体内实验结果表明,Hc-ENP能够有效抑制LPS刺激机体引发的全身性炎性反应,包括:靶器官炎性细胞浸润、血清炎性因子水平升高、器官组织中炎性相关酶表达量升高、组织病理改变等。本部分通过构建高质量海蛇毒腺M13噬菌体展示库来进行淘选,从而获得平颏海蛇毒腺中的特定活性分子。本实验中我们获得了一个平颏海蛇毒腺来源的内毒素中和肽—Hc-ENP,其在体内外均有明确的LPS拮抗效果,本研究为进一步开发利用海蛇基因资源,探索其开发应用价值提供了新的途径。
陶宁宁[6]（2021）在《Liproxstatin-1缓解博来霉素诱导的肺纤维化及其机制研究》文中研究指明研究背景:特发性肺纤维化（idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF）是一种病因不详的、高致死性间质性肺疾病,其诊断后平均生存期仅2-3年。在遗传及环境等因素共同作用下,肺泡上皮细胞反复出现破坏,再上皮化修复异常,大量促纤维化介质释放,诱导成/肌成纤维细胞异常激活,促进细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）过度累积,最终引起肺组织纤维化。目前大量数据表明,氧化还原失衡（氧化应激增加和抗氧化能力下降）在IPF的发病过程中起重要作用。不仅在空气中可检测到氧化的蛋白质和脂质,而且在来源于IPF患者的样本（血清、支气管肺泡灌洗液和肺组织）中亦可检测到大量氧化及过氧化代谢物的产生及抗氧化介质含量的降低、活性的减弱等。研究发现,通过干预重塑小鼠肺组织内氧化还原平衡后,小鼠肺纤维化的严重程度可得到缓解。然而乙酰半胱氨酸等抗氧化治疗在进一步的临床试验中被认为无明显抗纤维化作用。抗氧化药物在肺纤维化治疗中的研究仍道阻且长。Liproxstatin-1（Lip-1）是一种强有效的细胞自氧化抑制剂,其通过直接抑制自由基链增殖反应发挥效用。已有研究发现,Lip-1可减轻急性辐射所致小鼠肺损伤,抑制香烟烟雾提取物引起的支气管上皮细胞死亡等。Lip-1是否可以缓解IPF目前尚无相关研究。研究目的:本研究旨在探讨Lip-1对博来霉素（bleomycin,BLM）诱导的小鼠肺纤维化及肺泡上皮细胞损伤是否具有缓解作用,并阐明其可能机制。研究方法:1.通过给予8周龄的C57BL/6J雄性小鼠气道注射BLM构建肺纤维化模型。全部小鼠随机被分为4组:Con组（对照组）,BLM组（博来霉素:3.5mg/kg处理组）,Lip-1 组（Lip-1:10mg/kg 处理组）,BLM+Lip-1 组（博来霉素+Lip-1 处理组）。建模21天,称量小鼠体重及肺重,计算肺重/体重比;收获小鼠血清及肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid,BALF）,酶联免疫吸附测定（Enzymelinked immunosorbent assay,Elisa）法检测促炎因子水平;收获小鼠肺组织,石蜡包埋切片,进行苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin Staining,HE）、马松染色、天狼星红染色,观察小鼠肺组织结构改变、胶原产生及分布情况;通过Tunel染色,检测肺组织细胞凋亡程度;通过免疫荧光方法,评估肺泡上皮细胞分布范围;借助透射电镜观察肺细胞超微形态;提取小鼠肺组织蛋白,评估氧化还原相关指标:活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平,及过氧化氢酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）酶活性;通过Western blot及免疫荧光法,检测氧化应激相关通路（ROS/p53）。2.给予不同浓度的 BLM（0、10、40、80、160、320、640、80（）ug/ml）刺激肺泡上皮细胞（A549细胞）,采用MTT检测法评估肺泡上皮细胞的细胞活力变化情况;给予不同刺激时间长,筛选BLM诱导肺泡上皮细胞损伤模型的适宜时间。3.体外构建BLM诱导的肺泡上皮细胞损伤模型,将A549细胞分为4组:Con组（对照组）,BLM组（BLM:40ug/ml处理组）,Lip-1组（Lip-1:2UM处理组）,BLM+Lip-1 组（Lip-1:2UM 预给药 30min,BLM:40ug/ml 处理组）。采用 MTT法检测A549细胞的细胞活力,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）法检测细胞毒性物质的释放;通过细胞荧光染色,评估ROS的产生情况;裂解细胞蛋白,检测氧化还原相关指标（MDA、GSH、CAT、T-SOD）的变化情况;通过Western blot法及免疫荧光法检测ROS/p53相关靶点Bcl-2相关X蛋白（BCL2-Associated X,BAX）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）及 p21 表达水平,探讨Lip-1的肺泡上皮细胞保护机制。研究结果:体内实验部分1.构建小鼠肺纤维化模型,HE染色发现BLM可诱导小鼠肺组织炎症浸润、肺泡结构破坏,Lip-1干预可减轻BLM诱导的小鼠肺组织损伤。2.Lip-1干预还可减轻BLM诱导的小鼠BALF中炎症因子:转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）、白介素 6（Interleukin-6,IL-6）、白介素 10（Interleukin-10,IL-10）、肿瘤坏死因子α（tumournecrosisfactor-α,TNF-α）的释放（p<0.05）。3.马松染色、天狼星染色及羟脯氨酸检测（hydroxyproline,HYP）检测发现Lip-1干预可减轻BLM诱导的小鼠肺组织胶原分泌。4.氧化应激相关检测发现,在BLM刺激下小鼠肺组织氧化产物ROS、MDA水平升高,抗还原相关介质GSH、CAT、T-SOD的酶活性降低,Lip-1干预可重塑小鼠肺组织氧化还原的平衡。5.Lip-1干预可缓解BLM诱导的小鼠肺组织细胞凋亡、肺泡上皮细胞减少以及线粒体破坏。6.BLM可激活小鼠肺组织氧化还原相关通路ROS/p53,Lip-1干预可降低上述通路激活水平,减轻肺纤维化。体外实验部分1.BLM可引起A549细胞生存力减低,且以浓度依赖的方式发挥作用,浓度越高细胞生存力越低。2.BLM可诱导A549细胞发生上皮样向间质样细胞的改变,且以时间依赖的方式发挥作用,刺激24h细胞形态改变明显。3.Lip-1可改善BLM引起的A549细胞活力减低,并减少LDH的产生。4.Lip-1可减轻BLM造成的A549细胞氧化损伤,降低ROS及MDA的产生。5.Lip-1可缓解BLM对A549细胞还原能力的破坏,提升GSH水平,但对CAT及T-SOD的酶活力影响不大。6.BLM可激活A549细胞氧化还原相关通路ROS/p53,Lip-1干预可减弱ROS/p53下游BAX（凋亡相关）及α-SMA（纤维化相关）的表达,但不影响p21（衰老相关）的表达。研究结论:1.BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中,肺组织炎症浸润广泛、氧化还原紊乱、胶原分泌增加、细胞凋亡增加、肺泡上皮细胞破坏并减少。2.Lip-1可以改善BLM诱导的小鼠肺纤维化进程中炎症反应,重塑氧化还原平衡,抑制胶原分泌,保护肺泡上皮细胞及线粒体,减轻肺纤维化程度。3.Lip-1可以减弱BLM诱导的A549细胞破坏,减轻氧化损伤,提高抗氧化能力。4.Lip-1缓解BLM诱导的小鼠肺纤维化及肺泡上皮细胞损伤的机制可能与其对氧化还原相关通路ROS/p53的调控有关。
凌新宇[7]（2021）在《SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进海水淹溺性急性肺损伤中肺上皮细胞铁死亡的机制研究》文中研究说明一、研究背景近年来,随着我国海洋军事力量的显着加强,溺水事故逐步受到关注与重视。因海中溺水引起的淹溺性急性肺损伤（seawater drowning-induced acute lung injury,SWD-ALI）,继而导致呼吸循环系统衰竭甚至死亡,已成战斗性减员不容忽视的重要因素之一。减轻SWD-ALI,对改善海水淹溺患者的临床预后、减少战斗性减员具有重要意义。目前研究表明氧化应激参与了ALI的病理过程。有研究指出,氧化应激与铁死亡关系紧密,诱导了细胞的铁死亡。当铁过量存在于细胞和组织中时,会破坏氧化还原稳态并催化ROS的传播,从而导致氧化应激,继而导致铁依赖的细胞死亡。铁死亡是非细胞凋亡性的细胞死亡形式,有两大主要特征,一是铁依赖性,二是ROS堆积为特点。近年来发现,铁死亡是与缺血性器官损伤、神经变性和癌症相关的细胞死亡的关键机制,充分参与了细胞的代谢、氧化、及各种疾病如外伤性脑损伤、肺缺血再灌注损伤、帕金森氏病、肺部肿瘤、肺损伤。铁死亡在肺损伤中发挥了重要的调控作用,但铁死亡是否参与到海水淹溺性肺损伤的病理变化过程中,具体机制是怎样的,仍有很多研究空白。已有研究工作证实,TNFAIP3的表达与铁死亡正相关。通过生信分析发现SOX9为TNFAIP3的上游转录因子,SOX9可使TNFAIP3的表达上调。因此我们推测,下调SOX9是否能抑制TNFAIP3的表达从而减少铁死亡,起到减轻海水诱导的急性肺损伤的作用呢?二、研究目的（一）构建海水淹溺性肺损伤的细胞模型,并通过转录组测序技术筛选差异基因,发现在肺损伤过程中高表达的差异基因;（二）验证TNFAIP3对海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡的作用;（三）通过生信分析筛选调控TNFAIP3的转录因子SOX9,进一步验证转录因子的表达与TNFAIP3-ACSL4通路、铁死亡的相关性;（四）探讨转录因子SOX9和差异表达基因TNFAIP3于在体实验中,对小鼠肺损伤铁死亡的作用。三、研究方法（一）海水淹溺性肺损伤细胞模型的建立及差异表达基因的筛选和验证首先探究建立海水淹溺性肺损伤BEAS-2B细胞模型的条件:海水浓度及海水刺激时间。再用转录组测序技术筛选出差异基因。（二）TNFAIP3对海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡的作用研究采用流式细胞术对细胞的死亡情况进行评估;采用ROS的流式细胞检测,明确细胞中ROS的变化,反应细胞脂质过氧化的情况;采用Ferrostatin-1、DFO、Z-V AD-FMK、GSK’872处理细胞,确定细胞死亡的主要类型;用MDA和GSH的试剂盒检测细胞内含量变化,反应铁死亡的水平;采用JC-1探针对MMP进行检测。同时采用Western blot对TNFAIP3和铁死亡相关蛋白TRF、GPX4、ACSL4测定,探讨TNFAIP3与铁死亡的相互作用关系。通过质粒转染的BEAS-2B细胞上调TNFAIP3的表达,并进行相关实验,实验方法同上一个步骤。通过siRNA转染BEAS-2B细胞进行实验,实验方法同上一个步骤。（三）转录因子SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进BEAS-2B细胞中铁死亡的作用研究我们采用UCSC网站和JASPAR网站查找出靶向TNFAIP3启动子区域的转录因子SOX9。紧接着我们采用荧光素酶报告基因实验,验证SOX9与TNFAIP3启动子的靶向关系。然后采用质粒对SOX9进行细胞转染,以上调SOX9的表达,从而研究TNFAIP3的表达情况。最后采用siRNA对SOX9进行细胞转染后,用Western blot的方法对SOX9、TNFAIP3和铁死亡相关蛋白进行检测,验证SOX9-TNFAIP3-ACSL4通路对铁死亡的调控作用。（四）海水淹溺诱导的小鼠急性肺损伤中铁死亡的验证研究首先建立小鼠SWD-ALI模型。进行血气分析并计算OI;肺组织HE染色,观察病理改变,并行肺组织损伤评分;肺组织称干湿重量,计算W/D ratio;对肺组织切片铁死亡、凋亡相关蛋白进行免疫荧光染色。最后用Western blot的方法对SOX9、TNFAIP3和铁死亡相关蛋白进行检测,验证在体实验和细胞实验的结果是否具有一致性。四、研究结果（一）海水淹溺性肺损伤细胞模型的建立及差异表达基因的筛选和验证海水淹溺性肺损伤BEAS-2B细胞模型,采用30%海水浓度配制的DMEM培养基培养细胞6h。转录组测序中,我们选取高差异倍数,显着性明显的TNFAIP3基因进行研究。TNFAIP3基因在SW组中表达上调显着。（二）TNFAIP3在海水刺激诱导的BEAS-2B细胞中铁死亡的作用研究1、TNFAIP3在海水淹溺BEAS-2B细胞中与铁死亡的相关性（1）流式检测海水淹溺导致了明显的细胞死亡,且该死亡与铁死亡密切相关,与细胞凋亡和细胞坏死关联性较低;海水淹溺刺激下BEAS-2B细胞产生了过多的ROS;（2）海水淹溺能引起GSH消耗和MDA的增多;（3）海水刺激BEAS-2B细胞严重影响了线粒体功能并促进铁死亡;（4）SW组中TNFAIP3、TRF、ACSL4蛋白表达水平升高明显,GPX4蛋白表达水平明显降低;（5）以上各项指标的变化均可别铁死亡抑制剂抑制。2、TNFAIP3在质粒转染的BEAS-2B细胞中与铁死亡的相关性（1）TNFAIP3质粒转染细胞能诱导细胞死亡,也会产生过多的ROS;（2）TNFAIP3质粒转染细胞能引起GSH消耗和MDA的增多;（3）TNFAIP3质粒转染的细胞上调了TNFAIP3的表达后严重影响了线粒体功能并促进铁死亡;（4）质粒转染的细胞中,TNFAIP3、TRF、ACSL4蛋白表达水平升高明显、GPX4蛋白表达水平明显降低;（5）以上各项指标的变化均可别铁死亡抑制剂抑制。3、TNFAIP3在siRNA转染的BEAS-2B细胞中与铁死亡的相关性（1）siRNA转染的细胞能有效抑制细胞的死亡;经siRNA转染的细胞胞内ROS显着减少;（2）经siRNA转染后的细胞能降低MDA堆积并减少GSH的消耗;（3）siRNA转染的细胞下调了TNFAIP3的表达后,减轻了对线粒体功能的影响,减少了铁死亡;（4）siRNA转染细胞中,TNFAIP3、TRF、ACSL4蛋白表达水平明显降低、GPX4蛋白表达水平明显升高。上述结果提示siRNA转染细胞后TNFAI P3表达下调,铁死亡相关蛋白的表达受到负调控,限制了铁死亡。（三）转录因子SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进BEAS-2B细胞中铁死亡的作用研究1、TNFAIP3的转录因子SOX9的筛选与确认我们采用UCSC网站和JASPAR网站查找出靶向TNFAIP3启动子区域的转录因子SOX9;2、在海水淹溺细胞中SOX9的表达是显着上调的;3、SOX9质粒转染的细胞中,SOX9的高表达可以诱导TNFAIP3的高表达;4、海水淹溺细胞中SOX9的高表达伴随着TNFAIP3的高表达,同时诱发了铁死亡;而si-SOX9转染的细胞SOX9表达降低后伴随着TNFAIP3的表达降低,铁死亡得到了有效的抑制。SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路调节铁死亡。（四）海水淹溺诱导的小鼠急性肺损伤中铁死亡的验证研究1、小鼠动脉血气相关指标及氧合指数的变化SW组中,p H值明显下降,p O2值明显下降,p CO2值明显上升,Sa O2明显下降,OI明显下降,Lac明显上升,HCO3-明显上升。结果提示海水淹溺后的小鼠,呼吸氧合显着降低,气体交换减少,呈现明显的呼吸性酸中毒合并代谢性酸中毒,已达到急性肺损伤的诊断标准。2、肺组织病理改变及肺组织损伤评分HE染色后观察发现,部分肺泡壁增厚、水肿、出血,肺泡间隙减少,肺泡未扩张,肺实质化;部分肺泡破坏融合成肺大疱;肺泡间隙中性粒细胞浸润。SW组的小鼠的肺损伤评分显着高于Ctl组。3、肺组织湿干比SW组的肺组织湿干比相较于Ctl组明显升高,提示海水淹溺后的小鼠肺组织肺水肿明显加重。4、肺组织铁死亡相关蛋白GPX4、PTGS2的免疫荧光染色海水淹溺后的小鼠肺组织中GPX4的表达下降、TUNEL的表达上调、PTGS2的表达上调。5、肺组织SOX9、TNFAIP3、GPX4、ACSL4的蛋白印迹检测海水淹溺的小鼠肺组织中,SW组相较于Ctl组,SOX9、TNFAIP3、ACSL4的蛋白表达升高,GPX4的蛋白表达降低。结果与细胞实验一致。五、研究结论（一）TNFAIP3参与了海水刺激诱导的BEAS-2B细胞的铁死亡过程,TNFAIP3的高表达可以诱导铁死亡;（二）转录因子SOX9可以通过TNFAIP3-ACSL4通路靶向调控铁死亡,抑制SOX9的表达可以减少铁死亡的发生;（三）小鼠在体实验中SOX9、TNFAIP3及铁死亡相关蛋白的表达与细胞实验相一致。
彭文潘[8]（2021）在《麦味养肺汤基于PINK1调控AECⅡ线粒体自噬抗肺纤维化的机制研究》文中指出目的:肺纤维化作为呼吸系统中不可逆性的间质性肺系疾病,目前临床治疗药物和方法较为单一,临床疗效差异性较大,且具有明显的副作用。在此基础上,依托现代生物技术,采用中西医结合的方法,探究中药复方麦味养肺汤治疗肺纤维化的分子机制,充分发挥中医药特色。方法:1麦味养肺汤成分分析首先制备麦味养肺汤水煎液,并处理好标准品及供试品,设定好色谱及质谱条件。最后将麦味养养肺汤水煎液进行上机检测,将结果数据与标准品比对。2麦味养肺汤抗小鼠肺纤维化作用将C57BL/6J小鼠随机分为6组,即空白对照组（Control）、模型组（Model）、低剂量组（20g/kg/d）、中剂量组（40g/kg/d）、高剂量组（60g/kg/d）和吡非尼酮组,每组10只。适应性饲养一周后,除Control组外,其余各组予博来霉素气管内雾化造模。造模后第二天开始灌胃给药,Control组和吡非尼酮组分别以对应体表面积量的生理盐水和吡非尼酮灌胃,其余各组予麦味养肺汤灌胃,同时每天检测小鼠体重变化。第21d末次给药后拍摄小鼠肺部CT,并进行肺功能检测。颈椎离断猝死,取小鼠肺组织,-80℃保存备用。对肺组织进行石蜡切片,行HE和Masson染色,同时检测小鼠肺组织中羟脯氨酸含量。3基于网络药理学探究麦味养肺汤抗肺纤维化机制通过TCMSP、TCMID获取麦味养肺汤的活性成分,并整合HPLC的成分鉴定结果。将所得化合物信息全部输入到 TCMSP、TCMID、SEA、PharmMapper 和SwissTargetPrediction数据库,获取所有化合物的潜在作用靶点,融合并剔除重复即得麦味养肺汤的潜在作用靶点。以“Pulmonary fibrosis”为检索词,通过OMIM、CTD、TTD和GeneCards Suite数据库获取疾病相关的所有靶点信息。将药物相关靶点映射到疾病相关靶点中,获取公共靶点即得麦味养肺汤治疗肺纤维化的潜在作用靶点。通过对潜在靶点之间关系的研究,配合拓扑学分析获取潜在靶点中的核心靶点。通过DAVID数据库对核心靶点进行KEGG和GO富集分析。4麦味养肺汤基于PINK1调控的AECⅡ线粒体自噬抗肺纤维化通过Real-time qPCR检测肺组织中网络药理学筛选出的核心靶点差异性表达情况。检测小鼠肺组织中线粒体DNA（mtDNA）含量变化。通过免疫组化观察肺组织中TOM20蛋白的表达情况。通过ATP synthase和SP-C蛋白共染,免疫荧光法观察线粒体聚集的部位。通过透射电镜观察小鼠肺组织中线粒体形态。通过Western Blot检测肺组织中线粒体自噬相关蛋白PINK1、p62和LC3的表达情况。CCK8确定含药血清的干预细胞的浓度。体外共培养MLE-12和小鼠肺成纤维细胞,分为Control组、TGF-β组、20g/kg/d组、40 g/kg/d 组、60 g/kg/d 组。Control 组使用 Control 组含药血清,TGF-β 组使用 10 ng/mL 浓度的 TGF-β 干预（Control 组含药血清）,20 g/kg/d、40 g/kg/d、60 g/kg/d 组分别使用 A、B、C组含药血清干预（均含有TGF-β）。使用JC-1荧光探针检测共培养模型中MLE-12细胞线粒体膜电位变化。通过DCFH-DA检测共培养模型中MLE-12细胞ROS含量变化。通过免疫荧光观察共培养模型中MLE-12细胞内自噬的变化。体外培养MLE-12细胞,分别使用PINK1-shRAN质粒和Con-shRNA空载质粒转染MLE-12细胞,并分别与小鼠肺成纤维细胞构建细胞共培养模型。共培养模型分为Control组、TGF-β 组、PINK1-shRNA 组、Con-shRNA 组、MWYF-DS+TGF-β 组、MWYF-DS+TGF-β+PINK1-shRNA组。Control组使用Control组含药血清共培养非转染MLE-12和成纤维细胞,TGF-β组使用含10ng/mL浓度TGF-β的Control组含药血清干预非转染MLE-12和成纤维细胞,PINK1-shRNA组使用Control组含药血清干预PINK1-shRNA质粒转染的MLE-12 和成纤维细胞,Con-shRNA 组使用 Control 组含药血清干预 Con-shRNA 空载质粒转染的MLE-12和成纤维细胞,MWYF-DS+TGF-β组是使用C组含药血清干预Con-shRNA空载质粒转染的 MLE-12 和成纤维细胞（10ng/mL 的 TGF-β）,MWYF-DS+TGF-β+PINK1-shRNA组是使用C组含药血清干预PINK1-shRNA质粒转染的MLE-12和成纤维细胞（10 ng/mL的TGF-β）。24小时后通过Western Blot和Real-time qPCR检测肺成纤维细胞内α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白表达和基因转录情况。ELISA法检测细胞共培养模型培养基中hydroxyproline含量的变化。通过免疫荧光观察共培养模型中MLE-12细胞内自噬变化。结果:1麦味养肺汤成分分析经过与标准品比对,共发现9种化合物,分别是麻黄碱、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、党参炔苷、迷迭香酸、黄芩苷、甘草酸、五味子醇甲。2麦味养肺汤抗小鼠肺纤维化作用麦味养养肺汤能够明显缓解小鼠造模后体重下降的速率和肺部影像学改变,改善肺功能,提升小鼠肺组织的静态顺应性;HE和Masson染色显示该方能够降低肺组织炎症反应,减少胶原沉积和羟脯氨酸含量。3基于网络药理学探究麦味养肺汤抗肺纤维化机制共获得麦味养肺汤活性成分179个,潜在的作用靶点260个;疾病相关靶点1657个,药物与疾病的公共靶点124个,拓扑分析筛选出19个核心靶点。富集分析差异性最大的信号通路是线粒体自噬。4麦味养肺汤基于PINK1调控的AECⅡ线粒体自噬抗肺纤维化肺组织中mtDNA检测显示模型组中线粒体数量明显增加,给药干预后,mtDNA呈现明显下降趋势,且高剂量组最为明显;TOM20的免疫组化结果与mtDNA趋势相似,免疫荧光显示累积的线粒体主要集中在上皮细胞内;通过肺组织的透射电镜发现,模型组上皮细胞内出现了大量的形态异常的线粒体,且随着给药浓度的增加异常线粒体的数量明显降低;对线粒体的形态进行分析发现,麦味养肺汤干预的肺组织中线粒体形态逐渐趋于正常;CCK8实验显示,干预细胞的最适含药血清浓度是C组;通过对细胞共培养模型中MLE-12细胞检测,结果显示麦味养肺汤能够改善MLE-12内线粒体膜电位,降低细胞内ROS含量;Western Blot检测肺组织中线粒体自噬相关蛋白PINK1、p62和LC3,发现麦味养肺汤能够降低博来霉素干预的肺组织中p62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的含量（n=3）,提高肺组织中PINK1蛋白的表达（n=3）;对MLE-12细胞内的溶酶体（lysosomal）和PINK1免疫荧光检测发现,麦味养肺汤能够促进线粒体的自噬;使用PINK1-shRNA质粒转染的MLE-12细胞与成纤维细胞共培养,免疫荧光发现,PINK1低表达后麦味养肺汤含药血清的作用显着减弱（n=3）;Western Blot和Real-time qPCR检测发现,麦味养肺汤含药血清对共培养模型中成纤维细胞内α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白和基因的调控作用是依赖于PINK1的表达;ELISA检测细胞上清中羟脯氨酸含量,PINK1低表达后,含药血清失去对羟脯氨酸的调控作用。结论:1麦味养肺汤能够缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。2麦味养肺汤能够减少肺纤维化小鼠肺组织AECⅡ中线粒体数量和改善线粒体功能。3麦味养肺汤通过调控AEC Ⅱ内PINK1介导的线粒体自噬发挥抗肺纤维化作用。
刘姗姗[9]（2021）在《基于干旱环境影响大鼠肺与气管组织形态及SP-D、AQPs等表达的“燥邪伤肺”微观机制研究》文中认为目的:基于大鼠肺与气管组织形态学表现及SP-D、AQPs等蛋白的表达,探索燥邪伤肺的微观机制。方法:按体质量将60只SPF级SD雌鼠随机分组,正常对照组（N-S和N-L）置于常温常湿环境中,干燥组（D-S和D-L）与干旱组（A-S和A-L）置于人工营造的干燥和干旱风沙环境中予燥邪干预,分期采集干预后大鼠右肺中叶及气管,HE染色镜下观察并采用免疫组化分析组织中蛋白的表达量。结果:1.燥邪可致大鼠肺间隔增厚充血,肺泡融合,肺内细小支气管黏膜增生,气管黏膜局灶性炎性浸润伴增生充血等。2.大鼠饮食量A-S高于D-S（P<0.05）,D-L分别低于N-L（P<0.05）和A-L（P<0.05）。大鼠饮水量N-S低于D-S（P<0.01）及A-S（P<0.01）,D-S低于A-S（P<0.01）;N-L低于D-L（P<0.01）和A-L（P<0.01）。N-S低于D-S（P<0.01）和D-L（P<0.01）,D-S低于D-L（P<0.01）;N-S低于A-S（P<0.01）和A-L（P<0.01）,A-S低于A-L（P<0.01）。3.肺SP-D表达N-S分别低于D-S（P<0.01）和A-S（P<0.01）,D-S也低于A-S（P<0.01）。D-S高于N-S（P<0.01）和D-L（P<0.01）,A-S和D-L均分别高于N-L（P<0.01）和A-L（P<0.01）。肺IL-10表达A-L高于N-L（P<0.01）、D-L（P<0.01）、N-S（P<0.01）及A-S（P<0.01）。肺TNF-α表达N-S低于D-S（P<0.05）和A-S（P<0.05）,D-S高于D-L（P<0.05）,A-S高于N-L（P<0.01）和A-L（P<0.05）。肺AQP-5表达N-S低于D-S（P<0.01）、D-L（P<0.01）和A-S（P<0.01）,D-L分别高于N-L（P<0.01）和A-L（P<0.01）,A-S分别高于N-L（P<0.05）和A-L（P<0.05）。4.气管黏膜SP-A表达仅A-S低于N-S（P<0.05）与A-L（P<0.05）,气管黏膜SP-D表达D-L高于N-L（P<0.05）和A-L（P<0.05）,D-L高于N-S（P<0.05）和D-S（P<0.05）。结论:1.肺组织、气管及细小支气管黏膜组织形态的改变,肺和气管黏膜SP-D、AQP-5、TNF-α、IL-10、SP-A表达的变化是燥邪影响机体的微观表现,SP-D、AQP-5表达可能与肺卫外防御功能密切相关。2.秋燥之邪和燥火风寒合邪在燥邪伤肺中的致病微观机制同中有异。
张静[10]（2020）在《人SP-B基因1580C/T多态性与铜绿假单胞菌肺炎致肺损伤易感性的研究》文中提出研究背景肺表面活性蛋白B（SP-B）是由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种疏水蛋白,在降低肺泡表面张力和宿主防御方面起着重要的作用。SP-B在肺表面活性物质功能中起重要作用,而且与肺部疾病相关。SP-B缺乏的小鼠在出生时死于严重急性呼吸衰竭。人SP-B基因有数个多态性基因位点,其中重要的单核苷酸多态性（SNP rs1130866,即SP-B 1580 C/T）,该多态性形成两种常见的遗传等位基因,SP-B C和T等位基因,C等位基因有额外的N-连接糖基化位点而T等位基因没有,这种糖基化位点的不同可能影响SP-B蛋白在某些疾病或压力状态下的加工和功能,该多态性具有不同的维持呼吸稳态能力和宿主防御功能。研究表明SP-B 1580C/T基因多态性与肺部疾病有关。SP-B基因1580位点携带C等位基因的成年以及儿童患者更容易受到严重的肺损伤。铜绿假单胞菌肺炎是一种ICU常见的革兰氏阴性菌感染,可直接引起肺损伤,严重者可引起脓毒症甚至可危及生命,导致死亡率较高。人SP-B基因1580C/T多态性对铜绿假单胞菌肺炎尤其是重症肺炎的易感性研究较少,其相关机制研究更少。转人类基因（hTG）小鼠模型为人类基因多态研究扩展了更多可能性,可研究人类基因复杂的病理生理过程,是人类疾病研究的有利工具。本研究采用hTG SP-B 1580C/T小鼠建立铜绿假单胞菌肺炎模型,研究其不同等位基因的易感性差异并探讨相关机制。研究目的1.建立hTG SP-B 1580C/T小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型,监测小鼠体内细菌变化,在组织学及分子水平上分析组织损伤及炎性水平;2.研究铜绿假单胞菌肺炎hTG小鼠的肺SP-B变化,NF-κB/NLRP3信号通路及细胞死亡;3.研究人SP-B 1580C/T小鼠不同等位基因的易感性差异并探讨相关机制。研究方法一、转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察1.选取8-12周鼠龄,体重25g左右的转人类SP-B基因小鼠（FVB/N系背景）以及FVB/N野生型WT小鼠,对所有小鼠剪尾提取DNA进行PCR基因鉴定,根据PCR结果将小鼠分为三组SP-B-T组、SP-B-C组、WT组。每组小鼠再随机分为2组:肺炎组（Pneumonia组）以及对照组（Control组）。2.将表达生物荧光的铜绿假单胞菌Xen5菌株进行细菌培养,分光光度法测定菌液的浓度,并接种在琼脂板培养基隔夜培养进行菌落计数以确定菌液浓度。将菌液用无菌生理盐水稀释500倍,肺炎组的小鼠每只经气管内注入50μl稀释的菌液（每只小鼠约4 ×104 CFU）,对照组每只小鼠经气管内注入50μl无菌生理盐水。肺炎模型建立后,定期观察小鼠的一般情况,并定期进行体内荧光活体成像,监测铜绿假单胞菌在小鼠体内的生长状况,观察肺炎模型小鼠的生存状况,计算该肺炎模型小鼠的死亡率指标。3.建模24小时后,麻醉处死各组小鼠,留取新鲜血液,肺泡灌洗液（BALF）及新鲜肺组织。取新鲜稀释的BALF液进行琼脂板培养基接种细菌培养,观察BALF中的细菌菌落计数。光学显微镜下计数肺泡灌洗液中的细胞总数,并将BALF甩片经HEMA3染色后观察巨噬细胞和中性粒细胞分类情况。新鲜肺组织经10%福尔马林固定24小时后,进行石蜡包埋切片HE染色,观察肺组织病理变化并进行肺组织损伤评分,以评估肺损伤的严重程度。应用透射电子显微镜观察肺组织在细胞水平的病理变化。4.将肺组织用PBS液充分匀浆,高速离心后,收集上清液并用BCA方法测定总蛋白浓度,Western Blot法测定各组肺组织中SP-B蛋白表达水平。测定BALF中总蛋白浓度,并用Western Blot法测定各组BALF中SP-B蛋白表达水平。免疫荧光法观察各组肺组织SP-B表达水平,并比较各组SP-B的差异。5.将新鲜BALF高速二次离心后提取大聚体（LAs）,应用约束液滴表面光度法（constrained drop surfactometry,CDS）测定表面张力。37℃和相对湿度接近100%下,以每秒20循环的速度压缩和膨胀吸附的表面活性剂膜,以模拟正常的潮汐呼吸。采用闭环轴称滴形分析法（closed-loop axisymmetric drop shape analysis,CL-ADSA）同时测定表面活性剂膜的表面张力和表面积。用动态循环期间的最小表面张力（γmin）作为表面活性的指标。二、人SP-B基因1580C/T多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制6.用免疫荧光法及Western Blot法观察肺组织pNF-κB的表达,同时应用ELISA方法测定血清、肺组织匀浆液及BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平,比较该模型下各组小鼠炎性水平的差异。7.用TUNEL方法观察各组小鼠肺组织凋亡细胞情况并比较其差异。Western Blot法测定各组肺组织中凋亡相关蛋白Bcl-2,cleaved caspase-3的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞凋亡情况。8.用免疫荧光方法观察各组小鼠肺组织pMLKL表达情况并比较其差异。Western Blot法测定各组肺组织中坏死性凋亡相关蛋白RIP3,MLKL,pMLKL的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞坏死性凋亡情况。9.用免疫荧光方法观察各组小鼠肺组织NLRP3表达情况并比较其差异。Western Blot 法测定各组肺组织中NLRP3,ASC,cleaved caspase-1,GSDMD的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞焦亡情况。10.统计学方法:结果以平均值±SEM的形式表示。本研究采用SigmaStat统计学软件进行统计学处理,并应用GraphPad Prism绘图软件进行作图。数据经检验符合正态分布,两组之间采用独立样本Student’s t检验,三组小鼠之间的比较是通过单因素方差分析进行分析。生存率的比较使用Kaplan-Meier生存曲线并通过Log-rank检验进行统计学分析。当P<0.05时,考虑各组之间有统计学差异,当P<0.01时认为统计学差异非常显着。结果一、转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察1.PCR基因分型鉴定结果显示hTG小鼠表达人SP-B C或T等位基因,但不表达小鼠SP-B基因,WT小鼠仅表达mSP-B基因。Western Blot和免疫荧光观察正常hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠的肺组织中SP-B的表达,结果显示,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠的肺中均正常表达SP-B。此外,Western半定量分析表明,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠肺中的SP-B水平相当。2.建模后三种小鼠对照组精神状态好,饮食及活动正常;而肺炎组小鼠精神萎靡不佳,饮食量明显减少,行动迟缓。IVIS-200活体成像系统动态监测小鼠体内细菌荧光成像,结果显示感染后小鼠体内大量细菌生长。感染12小时后三种类型小鼠体内细菌都急剧增加;与SP-B-T和WT小鼠相比,SP-B-C小鼠的细菌负荷水平在感染后24、36和48小时都最高。感染后SP-B-C小鼠48小时的死亡率高于SP-B-T和WT小鼠,对照组小鼠均没有死亡,表明三种类型的小鼠对该铜绿假单菌肺炎存在敏感性差异。3.感染24小时后,感染小鼠与对照组相比BALF中的总细胞数显着增加,且SP-B-C小鼠的总细胞数在三类感染小鼠中最高。显微镜下观察到对照组的BALF中仅有巨噬细胞,而感染小鼠的BALF中90%以上的细胞是嗜中性粒细胞。感染后BALF中巨噬细胞较对照组增加,三种小鼠间巨噬细胞无差异。感染后BALF嗜中性粒细胞较对照组增加,三种小鼠中SP-B-C小鼠嗜中性粒细胞数目最高。感染小鼠的BALF有大量细菌生长,而对照组小鼠BALF未培养出细菌,肺炎感染组SP-B-C小鼠肺中细菌CFU数在三种小鼠中最高。4.肺组织切片HE染色显示,与对照组相比,感染小鼠出现明显的肺损伤,肺泡内及肺间质中可见大量炎性细胞聚集,并可见大量蛋白质碎片堆积,以及肺泡壁增厚。肺损伤评分显示三种类型感染小鼠的评分均显着高于各个对照组,感染SP-B-C小鼠的损伤评分高于感染SP-B-T及WT小鼠。5.透射电子显微镜观察到各对照组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞内有许多正常的板层小体以及线粒体结构,而感染后的小鼠在电镜下可观察到自噬小体数目增加,板层小体结构受损,线粒体异常,以及Ⅱ型肺泡细胞中微绒毛数量减少。6.免疫荧光结果显示,感染后SP-B表达下降,每个高倍镜视野下SP-B表达阳性的细胞数SP-B-C小鼠明显低于SP-B-T和WT小鼠。Western Blot结果显示,三种小鼠的肺组织以及BALF中SP-B表达也显示出相似的趋势。Western半定量分析表明,各种类小鼠之间肺组织和BALF中SP-B表达的存在显着差异,三种类型的感染小鼠中SP-B-C小鼠的SP-B表达最低。7.小鼠BALF中肺表面活性物质（主要指大聚体LAs）表面张力测定结果显示,与对照组小鼠相比,肺炎组小鼠的最小表面张力（γmin）显着增高,提示感染后小鼠肺表面活性功能明显受损。三类小鼠的对照组的γmin无差别,而肺炎组的γmin有显着差异,SP-B-C>SP-B-T>WT,表明在感染条件下,hSP-B基因多态对肺泡表面张力的调节存在差异。二、人SP-B 1580C/T基因多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制8.应用免疫荧光和Western Blot分析方法检查了肺组织中NF-κB炎性信号通路中活化的pNF-κB蛋白的表达。免疫荧光显示,对照组小鼠无pNF-κB蛋白的表达,肺炎组小鼠pNF-κB表达显着增高。pNF-κB表达阳性的细胞数统计分析显示,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠肺炎组pNF-κB表达均比对照组明显升高,有统计学差异,与受感染的SP-B-T及WT小鼠相比,感染的SP-B-C小鼠的pNF-κB蛋白水平最高。Western Blot结果显示同样的趋势,感染后hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠pNF-κB表达显着增高,与受感染的SP-B-T及WT小鼠相比,感染的SP-B-C小鼠的pNF-κB/NF-κB 比例最高,差别有统计学意义。9.ELISA方法测定结果显示,感染后三种小鼠的血清、肺组织匀浆液及BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平均较对照组显着增高,感染后SP-B-C小鼠细胞因子水平明显高于感染后的SP-B-T及WT小鼠,有显着性差异。10.用TUNEL方法分析感染小鼠肺细胞凋亡情况,感染24小时后,三种类型小鼠均可见大量的凋亡细胞,而对照组小鼠则未见凋亡细胞。TUNEL 阳性细胞的定量分析表明,感染的SP-B-C小鼠的凋亡细胞数量显着高于感染的SP-B-T和WT小鼠。Western Blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内Bcl-2水平低于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的Bcl-2水平低于SP-B-T和WT小鼠。感染后三种类型小鼠肺内cleaved caspase-3水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的cleaved caspase-3水平高于SP-B-T和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生细胞凋亡,且SP-B-C小鼠的凋亡更严重。11.免疫荧光显示感染小鼠的肺内pMLKL高表达,而对照组小鼠中未见表达,提示存在细胞坏死性凋亡。pMLKL阳性细胞的定量分析显示,肺炎组SP-B-C 小鼠中pMLKL阳性细胞数量明显高于SP-B-T和WT小鼠。Western blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内RIP3水平低于对照组,SP-B-C小鼠的RIP3水平低于WT小鼠。感染后MLKL和pMLKL的表达增加,SP-B-C小鼠的MLKL和pMLKL水平高于SP-B-T和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生坏死性凋亡,且SP-B-C小鼠的坏死性凋亡更严重。12.应用免疫荧光和Western Blot分析方法检查了肺组织中NLRP3和焦亡相关蛋白的表达。免疫荧光显示感染小鼠的肺内NLRP3大量激活,而对照组小鼠中未见激活。NLRP3阳性细胞的定量分析显示,感染的SP-B-C小鼠中NLRP3阳性细胞数量显着高于感染的SP-B-T和WT小鼠,而SP-B-T小鼠高于WT小鼠。Western blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内NLRP3水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的NLRP3水平高于SP-B-T和WT小鼠。感染后ASC和cleaved caspase-1的表达增加,SP-B-C小鼠的水平高于SP-B-T小鼠。三种类型的小鼠中,肺炎组小鼠的肺内GSDMD水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的GSDMD水平高于SP-B-T小鼠和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生焦亡,且SP-B-C小鼠的焦亡更严重。结论在铜绿假单胞菌肺炎模型中,感染后转人基因SP-B 1580C/T小鼠体内细菌大量生长,出现严重的肺损伤,大量炎性细胞及高死亡率,肺内SP-B蛋白水平明显降低,肺表面活性物质表面张力明显升高,小鼠体内NF-κB及NLRP3信号通路激活,炎性细胞因子水平增加,出现细胞凋亡,坏死性凋亡和焦亡等细胞死亡类型,SP-B-C小鼠较SP-B-T小鼠表现出更高的易感性,炎性损伤更重,更多的细胞死亡。提示SP-B 1580C/T多态可通过调节NF-κB及NLRP3通路及细胞死亡发挥对肺炎致ARDS的易感性调控作用。
二、吗啡依赖对小鼠肺表面活性物质分泌的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、吗啡依赖对小鼠肺表面活性物质分泌的影响（论文提纲范文）
（1）陈皮碱性提取物调控内质网应激治疗肺纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一章 肺纤维化中西医研究进展 |
| 第一节 中医对肺纤维化的认识 |
| 1. 中医病名 |
| 2. 病因病机 |
| 3. 辨证论治 |
| 4. 方药进展 |
| 第二节 西医对肺纤维化的认识 |
| 1. 疾病简介 |
| 2. 流行病学 |
| 3. 诊断方法 |
| 4. 治疗方法 |
| 4.1 吡非尼酮 |
| 4.2 尼达尼布 |
| 4.3 吡非尼酮和尼达尼布 |
| 5. 未来展望 |
| 5.1 精准医疗 |
| 5.2 新的靶点 |
| 第三节 ERS与肺纤维化的关系 |
| 1. 肺纤维化发病机制 |
| 2. ERS的分子机制 |
| 3. ERS与肺纤维化 |
| 3.1 上皮细胞 |
| 3.2 成纤维细胞 |
| 3.3 巨噬细胞 |
| 4. 通过ERS治疗肺纤维化 |
| 第二章 陈皮碱性提取物制备、鉴定与质控 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验药材 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CAE的制备 |
| 3.2 CAE的鉴定 |
| 3.3 CAE的质控 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 陈皮碱性提取物对小鼠肺纤维化的作用 |
| 第一节 BLM诱导小鼠肺纤维化模型 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 造模后小鼠体重变化 |
| 3.2 造模后小鼠存活率 |
| 3.3 造模后肺组织病理变化 |
| 3.4 造模后肺组织羟脯氨酸水平变化 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 CAE对小鼠肺纤维化的作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CAE对肺组织肺泡炎水平的影响 |
| 3.2 CAE对肺组织纤维化水平的影响 |
| 3.3 CAE对肺组织胶原沉积水平的影响 |
| 3.4 CAE对肺组织胶原蛋白水平的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 陈皮碱性提取物抗肺纤维化的分子机制 |
| 第一节 CAE对AEC Ⅱ中ERS及ATF3/PINK1的调控作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CAE对肺组织ERS相关蛋白水平的影响 |
| 3.2 CAE对A549细胞ERS相关蛋白水平的影响 |
| 3.3 CAE对肺组织ATF3/PIINK1共表达的影响 |
| 3.4 CAE对A549细胞ATF3/PINK1共表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 CAE对AEC Ⅱ中线粒体稳态的调控作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CAE对A549细胞线粒体膜电位水平的影响 |
| 3.2 CAE对A549细胞ROS水平的影响 |
| 3.3 A549细胞shRNA质粒载体构建 |
| 3.4 A549细胞ATF3 & PINK1基因沉默 |
| 3.5 CAE对ATF3-/- A549细胞中PINK1及线粒体膜电位水平的影响 |
| 3.6 CAE对PINK1-/- A549细胞中线粒体膜电位水平的影响 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 CAE通过AEC Ⅱ对肺成纤维细胞的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验耗材 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CAE对MRC5细胞胶原蛋白水平的间接影响 |
| 3.2 CAE对A549细胞上清细胞因子水平的影响 |
| 4. 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 缩略词表 |
| 附录二：文献综述 内质网应激：特发性肺纤维化的潜在治疗方向 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接在ARDS中变化及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 图A:总技术路线图 |
| 第一部分 LPS对肺泡上皮细胞多糖包被侧链-HS的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 LPS致ARDS中HPA对肺泡上皮细胞多糖包被的结构及功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第三部分 LPS致ARDS中肺泡上皮细胞紧密连接的变化 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第四部分 探讨HPA-HS与紧密连接损伤的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第五部分 创新性与局限性 |
| 第六部分 全文总结 |
| 综述 肺泡上皮屏障在ARDS中研究新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 (待发表) |
（3）兰坪虫草多糖缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺纤维化的研究概况 |
| 1.1.1 肺纤维化的发病机制 |
| 1.1.2 肺纤维化的治疗现状 |
| 1.2 多糖的概述 |
| 1.2.1 多糖的结构分析 |
| 1.2.2 多糖的药理活性研究 |
| 1.3 兰坪虫草的研究进展 |
| 1.3.1 兰坪虫草的成分研究 |
| 1.3.2 兰坪虫草的活性研究 |
| 1.4 本课题研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 兰坪虫草多糖缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.2.1 实验动物材料 |
| 2.2.2 实验主要试剂 |
| 2.2.3 实验主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠肺纤维化模型制备方法 |
| 2.3.2 实验动物的分组及给药 |
| 2.3.3 实验动物的处理与标本采集 |
| 2.3.4 小鼠生理状况观察与测定 |
| 2.3.5 肺组织病理学检测及评分 |
| 2.3.6 肺组织重要生理生化指标检测 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 兰坪虫草多糖对肺纤维化小鼠生活状态的影响 |
| 2.5.2 兰坪虫草多糖对肺纤维化小鼠肺组织形态及肺系数的影响 |
| 2.5.3 兰坪虫草多糖明显降低了肺纤维化小鼠肺组织病理学评分 |
| 2.5.4 兰坪虫草多糖显着降低了肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量 |
| 2.5.5 兰坪虫草多糖显着改善了肺纤维化小鼠肺部氧化应激状态 |
| 2.6 讨论与小结 |
| 第3章 兰坪虫草多糖对小鼠肺纤维化的治疗机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.2.1 实验动物材料 |
| 3.2.2 实验主要试剂 |
| 3.2.3 实验主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物的处理与标本收集 |
| 3.3.2 实时荧光定量PCR检测 |
| 3.3.3 蛋白质免疫印迹分析法检测 |
| 3.3.4 免疫组织化学检测 |
| 3.3.5 免疫荧光检测 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 兰坪虫草多糖显着减少肺巨噬细胞的募集 |
| 3.5.2 兰坪虫草多糖有效抑制促炎因子和促纤维化因子的表达 |
| 3.5.3 兰坪虫草多糖明显提高肺组织细胞自噬水平 |
| 3.5.4 兰坪虫草多糖明显抑制PI3K/ AKT/ m TOR信号通路的表达 |
| 3.5.5 兰坪虫草多糖显着减少ECM沉积 |
| 3.6 讨论与小结 |
| 第4章 结论及展望 |
| 4.1 研究结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（4）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗平颏海蛇毒血清的制备及抗毒效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 蛇毒中活性组分的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（6）Liproxstatin-1缓解博来霉素诱导的肺纤维化及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 图形摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 Lip-1缓解BLM诱导的小鼠肺纤维化及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验对象及材料 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 主要仪器 |
| (四) 实验试剂配制 |
| 二、实验分组及流程 |
| (一) 分组 |
| (二) 流程 |
| (三) 技术路线 |
| 三. 试验方法及步骤 |
| (一) 小鼠肺纤维化模型 |
| (二) 一般情况记录 |
| (三) 取材 |
| (四) 苏木精-伊红( Hematoxylin-Eosin Staining,HE)染色 |
| (五) 马松(Masson)染色 |
| (六) 天狼星红(Sirius Red)染色 |
| (七) 肺组织羟脯氨酸(HYP)水平检测 |
| (八) 组织切片免疫荧光染色 |
| (九) 细胞凋亡( Tunel)染色 |
| (十) 蛋白提取及Western Blot |
| (十一) 丙二醛(MDA)水平检测 |
| (十二) 还原性谷胱甘肽(GSH)水平检测 |
| (十三) 过氧化氢酶(CAT)活性检测 |
| (十四) 超氧化物歧化酶(T-SOD)活性检测 |
| (十五) ELISA |
| (十六) 透射电镜 |
| 四. 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1. 小鼠一般情况 |
| 1.1 行为 |
| 1.2 体重、肺重/体重比 |
| 2. 肺组织形态学观察 |
| 2.1 大体形态 |
| 2.2 光镜下形态 |
| 3. 纤维化相关指标 |
| 3.1 Masson染色 |
| 3.2 Sirius Red染色 |
| 3.3 HYP水平 |
| 3.4 α-SMA水平 |
| 4. 肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子水平 |
| 5. 氧化还原相关检测 |
| 5.1 ROS水平 |
| 5.2 MDA水平 |
| 5.3 GSH水平 |
| 5.4 CAT酶活性 |
| 5.5 T-SOD酶活性 |
| 6. Tunel水平 |
| 7. SP-C染色 |
| 8. 氧化应激相关通路 |
| 9. 电镜学 |
| 实验讨论 |
| 实验结论 |
| 第二部分 Lip-1缓解BLM引起A549细胞破坏及其机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一. 实验对象及材料 |
| (一) 实验对象 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 主要仪器和设备 |
| (四) 实验试剂配制 |
| 1. 细胞培养相关试剂 |
| 2. MTT检测相关试剂 |
| 3. 免疫荧光相关试剂 |
| 4. 细胞内ROS水平检测相关试剂 |
| 二、试验方法及步骤 |
| (一) 细胞培养 |
| 1. 细胞复苏 |
| 2. 细胞传代 |
| 3. 细胞冻存 |
| 4. 细胞计数 |
| (二) 细胞毒性/细胞增殖(MTT)检测 |
| (三) 乳酸脱氢酶(LDH)活性检测 |
| (四) 蛋白提取及Western Blot |
| (五) 免疫荧光染色 |
| (六) 细胞ROS水平检测 |
| (七) MDA、 GSH、 CAT、 T-SOD检测(详见第一部分) |
| 三、统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1. 浓度梯度 |
| 2. 时间梯度 |
| 3. 细胞形态学 |
| 4. 细胞计数 |
| 5. MTT水平 |
| 6. LDH活性 |
| 7. 氧化还原相关检测 |
| 7.1 ROS水平 |
| 7.2 MDA水平 |
| 7.3 GSH水平 |
| 7.4 CAT酶活性 |
| 7.5 T-SOD酶活性 |
| 8. ROS/p53下游靶点的检测 |
| 8.1 Western Blot |
| 8.2 免疫荧光 |
| 实验讨论 |
| 实验结论 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 IPF的发病机制及治疗进展 |
| 参考文献 |
| 缩写词 |
| 个人信息 |
| 就读期间科研情况 |
| 致谢 |
（7）SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进海水淹溺性急性肺损伤中肺上皮细胞铁死亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 海水淹溺性肺损伤细胞模型的建立及差异表达基因的筛选和验证 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 TNFAIP3 在海水诱导的人正常肺上皮细胞铁死亡中的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 转录因子SOX9 通过TNFAIP3-ACSL4 通路促进人正常肺上皮细胞中铁死亡的作用机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 海水淹溺诱导的小鼠急性肺损伤中铁死亡的验证研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 TNFAIP3在海水淹溺性急性肺损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（8）麦味养肺汤基于PINK1调控AECⅡ线粒体自噬抗肺纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 中医对肺纤维化的认识 |
| 1.1 病因病机 |
| 1.2 辨证要点 |
| 1.3 中医治疗进展 |
| 1.4 讨论 |
| 2 西医对肺纤维化的认识 |
| 2.1 肺纤维化的发病机制 |
| 2.2 西医治疗进展 |
| 2.3 讨论 |
| 第二章 麦味养肺汤成分分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 麦味养肺汤煎煮方法 |
| 2.4 溶液处理 |
| 2.5 高效液相色谱法检测 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 麦味养肺汤抗小鼠肺纤维化作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验药物 |
| 2.3 试剂与抗体 |
| 2.4 实验器材 |
| 2.5 给药剂量确定 |
| 2.6 动物分组 |
| 2.7 动物造模 |
| 2.8 小鼠肺功能检测 |
| 2.9 小鼠胸部CT |
| 2.10 肺组织HE、Masson染色 |
| 2.11 免疫组化 |
| 2.12 酶联免疫吸附法(ELISA) |
| 3 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 小鼠一般情况 |
| 4.2 小鼠体重变化 |
| 4.3 小鼠肺功能变化 |
| 4.4 小鼠胸部CT变化 |
| 4.5 组织病理学改变 |
| 4.6 肺组织中羟脯氨酸的变化 |
| 4.7 肺组织胶原含量变化 |
| 5 讨论 |
| 第四章 基于网络药理学探究麦味养肺汤抗肺纤维化机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据库 |
| 2.2 软件 |
| 2.3 麦味养肺汤活性成分及对应靶点获取 |
| 2.4 肺纤维化相关靶点获取 |
| 2.5 获取公共靶点 |
| 2.6 网络图绘制 |
| 2.7 核心靶点筛选 |
| 2.8 GO和KEGG富集分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 麦味养肺汤活性成分及靶点获取 |
| 3.2 药物和疾病公共靶点 |
| 3.3 药物-化合物-靶点-疾病网络图 |
| 3.4 核心靶点筛选 |
| 3.5 富集分析结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 麦味养肺汤基于PINK1调控AEC Ⅱ线粒体自噬抗肺纤维化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与抗体 |
| 2.2 实验器材 |
| 2.3 Real-time qPCR |
| 2.4 Western Blot |
| 2.5 肺组织免疫组化 |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 透射电镜 |
| 2.8 含药血清制备 |
| 2.9 CCK8筛选最佳含药血清浓度 |
| 2.10 原代肺成纤维细胞 |
| 2.11 细胞转染 |
| 2.12 细胞共培养 |
| 2.13 流式细胞技术检测MLE-12线粒体膜电位 |
| 2.14 流式细胞技术检测MLE-12细胞中ROS含量 |
| 3 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 网络药理学核心靶点的表达 |
| 4.2 肺组织中线粒体DNA含量变化 |
| 4.3 麦味养肺汤对肺组织TOM20蛋白表达影响 |
| 4.4 肺组织中线粒体累积的部位及变化 |
| 4.5 麦味养肺汤对AECⅡ中线粒体结构的影响 |
| 4.6 麦味养肺汤对AECⅡ中线粒体面积的影响 |
| 4.7 含药血清的最适浓度确定 |
| 4.8 麦味养肺汤含药血清对MLE-12中线粒体膜电位的影响 |
| 4.9 麦味养肺汤含药血清对MLE-12中ROS的影响 |
| 4.10 麦味养肺汤对线粒体自噬的影响 |
| 4.11 麦味养肺汤的抗肺纤维化依赖于PINK1的表达 |
| 5 讨论 |
| 总结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 文献综述 PINKl/Parkin介导的线粒体自噬：上皮细胞凋亡和肺纤维化之间的纽带 |
| 1 引言 |
| 2 PINK1/Parkin介导的线粒体自噬分子机制 |
| 2.1 PINK1和Parkin结构特征 |
| 2.2 PINK1/Parkin介导的线粒体自噬过程 |
| 2.3 自噬受体的识别与结合 |
| 3 线粒体调控的内源性细胞凋亡 |
| 3.1 内源性凋亡机制 |
| 3.2 线粒体释放的凋亡相关因子 |
| 4 细胞凋亡与肺纤维化 |
| 5 抗肺纤维化未来研究方向 |
| 5.1 抗氧化酶 |
| 5.2 非酶抗氧化物 |
| 5.3 线粒体营养素 |
| 参考文献 |
| 附录二 缩略词表 |
| 附录三 RNAi构建 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 发表论文 |
| 课题项目 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）基于干旱环境影响大鼠肺与气管组织形态及SP-D、AQPs等表达的“燥邪伤肺”微观机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验内容与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 燥邪致病微观机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（10）人SP-B基因1580C/T多态性与铜绿假单胞菌肺炎致肺损伤易感性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二部分 人SP-B 1580C/T基因多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 肺表面活性蛋白B(SP-B)在肺部疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 Three types of cell death and differential susceptibility of humanizedtransgenic surfactant protein B (SP-B) variants and wild type FVB/Nmice in Pseudomonas aeruginosa induced pneumonia mod |
| 英文论文二 Clinical study of voriconazole combined with caspofungin or micafungin for invasive pulmonary aspergillus in ICU mechanical ventilation patients |
四、吗啡依赖对小鼠肺表面活性物质分泌的影响（论文参考文献）
- [1]陈皮碱性提取物调控内质网应激治疗肺纤维化的机制研究[D]. 王志超. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接在ARDS中变化及机制[D]. 李君. 山东大学, 2021(11)
- [3]兰坪虫草多糖缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化[D]. 江敏. 昆明理工大学, 2021(01)
- [4]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选[D]. 王博. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [6]Liproxstatin-1缓解博来霉素诱导的肺纤维化及其机制研究[D]. 陶宁宁. 北京协和医学院, 2021(02)
- [7]SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进海水淹溺性急性肺损伤中肺上皮细胞铁死亡的机制研究[D]. 凌新宇. 中国人民解放军海军军医大学, 2021
- [8]麦味养肺汤基于PINK1调控AECⅡ线粒体自噬抗肺纤维化的机制研究[D]. 彭文潘. 南京中医药大学, 2021(01)
- [9]基于干旱环境影响大鼠肺与气管组织形态及SP-D、AQPs等表达的“燥邪伤肺”微观机制研究[D]. 刘姗姗. 新疆医科大学, 2021(08)
- [10]人SP-B基因1580C/T多态性与铜绿假单胞菌肺炎致肺损伤易感性的研究[D]. 张静. 山东大学, 2020(04)