一、心脏发育中的细胞凋亡（论文文献综述）
袁婺洲,张亚楠[1]（2022）在《心脏发育和疾病的表观遗传调控机制》文中研究说明表观遗传调控机制是后基因组时代的重点研究领域,当前许多证据表明表观遗传学调控心脏发育进程,参与多种心脏疾病的调控。本文综述了DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物和microRNAs在心脏发育中的作用,以及在动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌缺血、心肌纤维化等心脏疾病中表观遗传调控的研究进展,同时概述了生物活性食品化合物在心脏保护中的作用,为心脏发育的分子机制研究和心脏疾病的预防与治疗方向提供新的视角。
李琪[2]（2021）在《miRNA-129-1-3p在芦丁减轻吡柔比星所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌药效中的介导作用》文中提出蒽环类药物吡柔比星（Pirarubicin,THP）是多种实体肿瘤和血液淋巴系统恶性肿瘤的常用化疗药物,疗效确切、抗肿瘤强,其中乳腺癌是以THP为一线药物进行治疗的癌症之一。在过去20年的早期诊断中,手术、放化疗和靶向治疗等显着降低了乳腺癌的死亡率。然而,存活率的提高使人们意识到抗癌治疗过程中改善THP所致心脏毒性的重要性。临床观察和研究显示THP主要毒副作用之一是心脏毒性,且往往呈进展性和不可逆性,严重限制了THP在临床上广泛和长期的使用。因此,发现新的药物靶点干预THP所致心脏毒性显得尤为重要。芦丁（Rutin,RUT）又名芸香苷,属黄酮类化合物,是《中国药典》收录的传统中药槐花的主要有效成分之一,广泛存在于槐花、银杏叶、大枣等中药材中。RUT具有抗自由基、抗脂质过氧化、抗炎、抗癌和保护心血管等药理作用。本课题组多年来一直进行RUT对心血管系统保护作用的研究,在大鼠实验中证实RUT对THP所致心脏毒性具有保护作用,并利用微小RNA（microRNA,miRNA）芯片技术构建RUT干预THP诱导大鼠心脏毒性miRNA表达谱。但RUT的具体作用机制尚未进行深入的探索,且对于RUT干预疾病发生发展过程中miRNA的作用知之甚少。本研究基于RUT干预THP诱导心肌损伤miRNA表达谱的分析结果,并通过miRbase数据库,发现miR-129-1-3p是与RUT抑制心脏毒性密切相关的一种潜在的生物标志物,且在不同物种中高度保守。随后使用Target Scan数据库搜索miR-129-1-3p的靶基因,将靶基因通过KEGG富集分析后发现,富集分析结果中的Ca2+通路与蒽环类药物所致心脏毒性的机制相关,我们对位于Ca2+通路中靶基因进行挑选,发现GRIN2D与miR-129-1-3p的靶向性最好。由此,我们推测RUT通过miR-129-1-3p直接靶向GRIN2D调节Ca2+通路,从而发挥对THP诱导的心肌细胞损伤的保护作用。随后,通过双荧光素酶报告基因实验证实,miR-129-1-3p可直接调控GRIN2D。此外,通过文献检索发现miR-129-1-3p在多种肿瘤中起到抑制作用。因此,本研究从细胞及整体动物实验对miR-129-1-3p/GRIN2D调控Ca2+通路介导的RUT减轻THP所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌的作用进行了探索,以期系统深入地揭示miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT干预心脏毒性和乳腺癌发生发展中所扮演的角色,从miRNA的角度阐明RUT治疗心脏毒性和乳腺癌的可能机制。（1）在心肌细胞（体外）实验中,我们采用RUT 100μM预处理,THP 5μM刺激小鼠心肌HL-1细胞24h,模拟RUT改善THP所致HL-1细胞损伤内环境,从细胞水平探讨RUT对THP诱导HL-1细胞损伤保护的具体机制。通过qPCR在HL-1细胞中进行验证,发现miR-129-1-3p在THP处理后的HL-1细胞中下调,而在RUT干预后使其上调,GRIN2D mRNA与其趋势相反,说明miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT对THP诱导HL-1细胞损伤的保护作用中发挥重要作用。为了研究miR-129-1-3p在RUT对THP诱导的心肌细胞损伤的保护作用,将miR-129-1-3p模拟物（mimics）转染至HL-1细胞中,通过DCFH-DA、MAD、SOD、Fluo-3 AM、TUNEL和Western blot实验证实,RUT和miR-129-1-3p可以抑制THP诱导的心肌细胞氧化损伤、钙超载,使Ca2+相关通路蛋白GRIN2D、钙调蛋白-1（Calm1）、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ（Ca MKⅡδ）和磷酸化的雷诺定受体2（Ry R2-p S2814）表达减少,肌质内皮网钙泵（SERCA2a）和钠钙交换剂1（NCX1）表达增加,并降低细胞凋亡率及抑制凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3的表达。（2）在乳腺癌细胞（体外）实验中,我们采用体外培养小鼠乳腺上皮HC11细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞,通过CCK-8检测发现,100μM的RUT抑制4T1细胞增殖,且与THP发挥协同作用。qPCR检测miR-129-1-3p在两种细胞中的表达,发现4T1细胞miR-129-1-3p的表达水平低于HC11细胞,而加入RUT干预后4T1细胞miR-129-1-3p的表达水平上升,GRIN2D mRNA与其趋势相反,说明miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT抑制小鼠乳腺癌细胞增殖的作用中也同样发挥重要作用。为了研究miR-129-1-3p对4T1细胞的抑制作用,将miR-129-1-3p mimics和miR-129-1-3p抑制物（inhibitor）分别转染至4T1细胞中,应用平板克隆、细胞划痕、Transwell、Fluo-3 AM和Western blot实验证实,miR-129-1-3p mimics可以抑制4T1细胞增殖、迁移和侵袭及其相关蛋白CD147、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达、抑制Ca2+水平及GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ蛋白的表达,促进Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达,而miR-129-1-3p inhibitor发挥相反作用。（3）在动物（体内）实验中,采用BALB/c小鼠作为研究对象,成功构建乳腺荷瘤与THP心脏毒性小鼠复合模型。给予RUT灌胃给药或尾静脉注射miR-129-1-3p模拟物（agomirs）4周后,BALB/c小鼠的心脏毒性得到明显减轻,心电图和心肌组织病理学损伤得以改善,心肌酶指标趋于正常,心肌组织miRNA-129-1-3p表达升高,GRIN2D mRNA表达降低,使Ca2+水平降低,GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ和Ry R2-p S2814蛋白表达减少,SERCA2a和NCX1的蛋白表达增加、心肌细胞凋亡减少,Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达降低。并且BALB/c小鼠乳腺肿瘤的生长、肝转移及肺部炎症反应得到进一步控制,肿瘤组织中miRNA-129-1-3p表达进一步上升,GRIN2D mRNA表达进一步下降,进一步抑制肿瘤组织中Ca2+含量及GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ、CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF的表达,并进一步促进肿瘤组织细胞凋亡及其相关蛋白Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3的表达。综上所述,本研究通过体内外实验得到以下结论:（1）体内外THP诱导小鼠HL-1细胞/心肌损伤实验证明,RUT可逆转THP诱导的HL-1细胞/心肌氧化应激损伤、小鼠心脏系数增加、血清心肌酶损伤、心电图异常及心肌组织病理学改变,对THP诱导的心脏毒性发挥保护作用。（2）RUT逆转THP诱导的小鼠HL-1细胞/心肌组织中miRNA-129-1-3p下调、GRIN2D mRNA上调、钙超载及细胞凋亡。表明RUT通过逆转THP所致小鼠心脏毒性的机制可能是通过miR-129-1-3p抑制GRIN2D表达及其调控的Ca2+通路,进而抑制心肌细胞凋亡所实现的。（3）体内外THP抑制乳腺癌实验证实,RUT可增敏THP抑制4T1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制肿瘤生长、肝转移及肺部炎症反应,对THP抑制乳腺癌发挥增敏作用。（4）RUT增敏THP抑制4T1细胞/肿瘤组织中miRNA-129-1-3p下调、GRIN2D mRNA上调、使钙水平进一步降低并促进细胞凋亡。表明RUT通过增敏THP抑制小鼠乳腺癌的机制可能是通过miR-129-1-3p抑制GRIN2D表达及其调控的Ca2+通路,进而促进肿瘤细胞凋亡所实现的。本研究拓展了RUT的药理作用,并对miR-129-1-3p/GRIN2D的生物学功能提供了重要的补充,表明miR-129-1-3p可能是治疗THP所致心脏毒性及乳腺癌的新靶点,可作为开发治疗蒽环类药物所致心脏毒性和乳腺癌的新型药物的理论基础和实验依据。
聂瀚[3]（2021）在《基于生物信息学分析LncRNA SNHG5通过mir-205-5p/SMAD4在腹主动脉瘤中改变血管平滑肌细胞的功能》文中认为研究背景腹主动脉瘤（AAA）是指在血压的作用下腹主动脉璧像肿瘤一样逐渐膨大的疾病。通常,当腹主动脉直径超过3厘米或与正常人相比增加超过50%时,可以诊断为AAA。AAA通常发生在年龄65岁以上的老年男性,其这种疾病的发病率可达到8%。由于血管无法承受血流对其的压力,最严重的后果是动脉壁破裂,动脉瘤破裂死亡率可超过80%并且接受手术修复的AAA破裂患者的死亡率仍超过50%。迄今为止,尚未发现用于临床AAA管理的有效药理疗法,血管内修复或开腹手术仍然是预防动脉瘤破裂的唯一选择。非编码RNA（nc RNA）是不会翻译成蛋白质的转录本。在过去的二十年中,nc RNA发生了翻天覆地的变化。最初被认为是“垃圾”,现在被认为是生理和病理过程的重要调节剂。本研究旨在分析AAA患者样本的基因测序芯片,构建在AAA中起重要作用的ceRNA网络并从中找出影响AAA发生发展的重要nc RNA。目的通过分析AAA患者长非编码RNA（lnc RNA）-信使RNA（m RNA）共表达网络的特点,探讨lnc RNA-SNHG5在AAA中对血管平滑肌细胞（VSMC）功能的影响。研究方法从GEO数据库下载人类基因表达谱GSE57691的芯片数据。基因芯片包括49例AAA患者和10例器官供体对照腹主动脉标本的基因表达阵列数据。我们分析了主动脉瘤（AAA）和正常主动脉标本中差异表达的lnc RNAs和m RNAs,并用Cytoscape软件构建ceRNA网络并分析了5个关键的lnc RNAs,以确定它们在生物网络中的关键作用。我们选择腹主动脉瘤中表达显着下调的SNHG5,通过交互网络发现其可能通过mir-205调节mir-205和SMAD4。收集2019年1月至2020年1月之间在南昌大学第二附属医院和中山大学第一附属医院确诊为AAA并进行开放手术治疗的患者的AAA瘤璧样本8例。采用双荧光素酶报告基因分析、核糖核酸免疫沉淀（RIP）分析证实了SNHG5与mir-205之间的相互作用。流式细胞仪检测细胞凋亡。用EDU检测细胞增殖能力,用24孔Transwell插入物评价细胞迁移能力。免疫印迹分析检测蛋白表达。研究结果5个LncRNA与34个mirna和112个m RNA高度相关。ceRNA网络中的m RNAs参与蛋白质结合、信号转导、DNA、RNA转录、发育和细胞分化。SNHG5在腹主动脉瘤中表达下调,可作为mir-205的分子海绵。下调SNHG5可增加mir-205-5p的表达。mir-205-5p的增加可以抑制SMAD4的产生,从而抑制VSMC的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。结论我们利用生物信息学的方法来探讨AAA产生的分子机制,lnc RNA-SNHG5可以通过mir-205-5p/SMAD4轴调控血管平滑肌细胞的增殖和凋亡。SNHG5是一种重要的新型平滑肌细胞生物调节剂,可能是治疗AAA疾病的潜在靶点。
张文硕[4]（2021）在《转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究》文中认为恶性肿瘤是危及人类生命健康的一种严重的疾病,其最大的特点就在于恶性肿瘤细胞会出现扩散和转移现象,进而危及到全身的器官和组织,恶性肿瘤的转移往往是肿瘤治疗失败的主要原因,因此,解析肿瘤细胞转移的机制已经成为国内外研究的热点。近年来,黑腹果蝇由于其具有生活周期短,容易饲养,繁殖力强,染色体少,突变体多等优点,其已经成为研究肿瘤细胞迁移的一个非常重要的生物学模型,有研究表明肿瘤细胞的迁移是一个机制复杂且由多种基因及信号通路参与的过程。越来越多的以果蝇为细胞迁移模型的研究表明,JNK信号通路不仅与细胞凋亡有着极大关系,它还能在发育过程中调控细胞移动和粘附,JNK信号通路的激活往往会导致肿瘤细胞的迁移,所以JNK信号通路在肿瘤细胞的迁移过程中发挥重要作用。在果蝇中Apontic是一个bZIP类转录因子,由于它可以调控多个靶基因的表达,所以在果蝇气管、头、心脏、眼睛、边界细胞等器官发育过程中都扮演着重要角色。此外,Apt在进化上高度保守,其在人类中的同源蛋白FSBP在人体心脏、肝脏、肺、骨骼肌等组织器官中均有表达,但是目前为止,转录因子Apt在细胞迁移运动方面的机制和功能尚不清楚。本研究在果蝇中以转录因子Apt为研究对象,综合运用特异性组织表达系统、免疫荧光抗体染色、Western Blot、实时荧光定量PCR、原核蛋白表达、小鼠抗体制作、双荧光素酶报告实验等技术和方法,探究了Apt对肿瘤细胞迁移的影响并进一步解析了其中的调节机制。本研究获得的主要实验结果如下:（1）在果蝇翅原基中利用RNA干涉技术敲降apt后会发生细胞迁移的现象,我们然后在果蝇翅原基中敲降细胞极性因子scrib来构建了肿瘤细胞迁移模型,随后在此肿瘤模型基础上分别过表达和敲降apt后,发现肿瘤细胞的迁移能力分别被抑制和促进,由此表明转录因子Apt可以抑制肿瘤细胞的迁移。（2）通过免疫荧光抗体染色发现将apt敲降之后JNK信号通路的靶基因puc、mmp1的表达水平都显着升高并且磷酸化的JNK水平也有所上升,由此表明,敲降apt可以激活JNK信号通路。通过体内挽救实验发现转录因子Apt调控细胞迁移是通过JNK信号通路来实现的,并且通过遗传学上下游关系实验我们发现Apt是通过调控JNK信号通路中的元件基因msn来影响JNK信号通路的。（3）通过原核诱导表达、注射小鼠等实验我们获得了Msn的抗体,然后结合免疫荧光抗体染色、实时荧光定量PCR以及双荧光素酶报告实验发现Msn可以负调控JNK信号通路,并且Apt对msn的调控是直接的正调控关系。（4）敲降apt可以引发细胞凋亡,并且当凋亡被抑制后,由敲降apt引起的细胞迁移被抑制,然后进一步发现敲降jnk可以抑制由敲降apt导致的细胞迁移和细胞凋亡,由此表明,敲降apt可以通过JNK信号通路引发细胞凋亡并导致细胞迁移。（5）在果蝇翅原基中过表达人类同源基因fsbp不仅可以抑制由敲降apt引起的细胞迁移也可以抑制由敲降scrib引起的肿瘤细胞迁移,并且过表达fsbp可以抑制由敲降apt引起的JNK信号通路的激活。由此表明,Apt在调控细胞迁移及JNK信号通路方面具有进化上的保守性。综上所述,我们解析了转录因子Apt、JNK信号通路、细胞凋亡三者之间相互作用调节肿瘤细胞转移的可能机制,并初步表明了Apt在调控细胞转移及JNK信号通路方面具有进化保守性。本研究不但进一步拓展了转录因子Apt的生物学功能,而且对于预测和防治恶性肿瘤细胞转移具有重要意义,同时也为临床上对于恶性肿瘤的治疗提供了新的理论依据和研究思路。
袁雨培,唐其柱[5]（2021）在《Notch受体家族与心肌重构的研究进展》文中认为心肌重构是多种心脏疾病的关键病理生理过程,寻找有效的干预措施具有重要的科学意义。Notch受体家族是一种高度保守的膜蛋白受体家族,广泛表达于心脏组织,研究证明Notch家族各个成员可通过抗氧化、抗凋亡、抗纤维化及促血管生成等不同方式参与心肌重构的发生发展,研究其具体作用及机制可为心肌重构的治疗提供方向。文章对Notch受体家族与心肌重构的研究进展进行综述。
薛丹[6]（2021）在《早期左旋甲状腺素干预改善妊娠期亚临床甲减子代心脏发育的研究》文中提出目的:妊娠期亚临床甲减（SCH）占妊娠期甲状腺功能异常疾病中2-3%,表现为TSH升高,T3、T4正常。临床工作中发现妊娠期亚临床甲减胎儿出现心律不齐,产时出现胎儿宫内窘迫的发生率较高,既往研究也表明甲状腺功能低下胎儿心脏畸形发病率较高,胎儿超声心动图有改变,但目前关于妊娠期亚临床甲减对胎儿心脏影响方面的研究较少,文献中检索到多是妊娠期甲减方面的相关研究。本研究通过临床病例回顾性分析了解左旋甲状腺素（LT4）早期治疗对妊娠期亚临床甲减胎儿心脏功能的影响,并进一步探讨影响妊娠期亚临床甲减胎儿心脏发育的因素。既往研究表明BMP信号通路、GATA家族基因,NKX家族基因都与心脏发育密切相关。骨形态发生蛋白（BMPs）在脊椎中胚层诱导和心脏发育中起核心作用,还是一个直接的甲状腺激素靶标,甲状腺激素可以通过作用于BMP4而促进细胞分化。BMP配体可与Ⅱ型受体结合,激活I型受体,使BMP受体调节的Smads4信号转导通路激活,然后诱导下游基因的转录。含锌指结构的转录因子（Gata4）和转录因子相关位点5（Nkx2-5）已被证明是BMP信号通路的下游靶基因,BMP4可诱导心肌祖细胞表达Nkx2-5和Gata4。因此,本研究第二部分通过动物实验研究进一步观察左旋甲状腺素早期治疗妊娠期亚临床甲减对后代心脏发育相关的BMP4/Smad4通路中与心脏发育相关蛋白Gata4和Nkx2-5表达水平的变化规律,以便深入了解妊娠期亚临床甲减对胎儿心脏的影响及机制,为妊娠期亚临床甲减胎儿监护提供一定依据。方法:1.回顾性分析于2016年6月至2018年7月在原解放军第二O二医院妇产科分娩的妊娠期亚临床甲减患者的临床资料。共有115名孕妇符合条件并在妊娠期间定期随访,具备完整资料。其中有LT4早期干预治疗亚临床甲减组（SCH+LT4组）病人40例,亚临床甲减组（SCH组）32例和正常妊娠对照组43例。LT4早期干预治疗亚临床甲减组入组病人均是在妊娠6-7周检查并确诊为妊娠期亚临床甲减者,并在8周前开始药物干预治疗的患者。各组研究对象均每隔4周复查甲状腺功能指标。比较妊娠32周时各组孕妇血清离子检测,血糖（空腹血糖）,血脂,凝血等血液生化指标检查结果。对比各组孕妇妊娠24周和32周时胎儿超声心动图检查结果。对比各组妊娠分娩结局,包括妊娠期高血压,妊娠期糖尿病,羊水量,新生儿出生体重等围生期情况。2.制备妊娠期甲减及妊娠期亚临床甲减大鼠动物模型。将雌性Wistar大鼠模型分为假手术组、甲减组、亚临床甲减组（SCH）、LT4干预（E10）组（妊娠第l0天开始LT4治疗）、LT4干预（E13）组（妊娠第l3天开始LT4治疗）和LT4干预（E17）组（妊娠第l7天开始LT4治疗）,每组30只,共180只。每组动物根据观察胎鼠、仔鼠心脏的不同时间又分为6个亚组:E16（妊娠第16天）、E18（妊娠第18天）、P0（产后当天）、P5（产后第5天）、P7（产后第7天）和P10（产后第10天）。测定各组孕鼠产时当天血清TSH、TT4水平,比较各组各不同时间点子代大鼠心脏重量,心脏重量/体重比,各代谢酶活表达及胎鼠、仔鼠心肌细胞组织病理学变化。为阐明LT4对SCH孕鼠心脏发育的影响,采用免疫组织化学、实时定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹Western blotting方法检测了BMP4/Smad4信号通路相关蛋白的表达水平,比较了心肌发育相关蛋白GATA4、Nkx2-5的表达,探讨LT4调控SCH孕鼠子代心脏发育的可能分子机制。结果:1.SCH+LT4组基础血清TSH水平明显高于对照组（P<0.05）;SCH+LT4组基础血清TSH水平略高于SCH组,但二者比较无显着性差异（P>0.05）;在接受LT4治疗后血清TSH水平明显下降,从孕24周至孕末期始终与对照组水平相当,且明显低于同时点SCH组孕妇水平。2.SCH+LT4组比SCH组的妊娠高血压和妊娠糖尿病的发病率减低,差异具有统计学意义（均P<0.05）,SCH组羊水量异常,胎儿生长受限,产后出血发病率高于对照组和SCH+LT4组,差异具有统计学意义（均P<0.05）;SCH+LT4组和SCH组胎儿产时胎儿宫内窘迫发生率高于对照组,差异具有统计学意义（均P<0.05）。3.仔鼠出生当日SCH孕鼠血清TSH水平与假手术组相比显着升高。SCH+LT4组孕鼠血清TSH水平较SCH组明显降低,接近假手术组。4.SCH+LT4组子代大鼠心脏与SCH组子代大鼠心脏相比,早期LT4干预组子代大鼠心脏重量增加,心脏重量/体重比增加,琥珀酸脱氢酶（SDH）、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性增加。子代大鼠心脏组织HE染色显示SCH+LT4组子代大鼠心脏比SCH组子代大鼠心脏心肌细胞皱缩和核染色、充血、淤血和空泡变性减少。5.SCH+LT4孕鼠子代大鼠心肌中与心脏发育相关Gata4和Nkx2-5的m RNA和蛋白表达较SCH组增加,且越早期干预表达水平越高。6.SCH+LT4孕鼠子代大鼠心肌中BMP4/Smad4信号通路相关蛋白表达较SCH组增加,且越早期干预表达水平越高。结论:1.LT4的早期治疗能够维持妊娠期亚临床甲减患者妊娠全程血清TSH水平,同时可以改善妊娠期亚临床甲减妊娠期高血压、妊娠期糖尿病发生率,可减少胎儿生长受限、产后出血、羊水量异常的发生。2.《2015年胎心监护应用专家共识》中明确指出,胎儿宫内窘迫可以较敏感地反映胎儿心脏功能的变化。本研究中SCH+LT4组和SCH组产时胎儿宫内窘迫发生率均高于正常妊娠组,反映出妊娠早期的TSH水平异常可能影响胎儿心脏发育,妊娠期亚临床甲减对胎儿心脏功能可能有影响。3.早期LT4干预可显着降低血清TSH水平,可提高子代大鼠心脏重量、心脏重量/体重比、琥珀酸脱氢酶（SDH）、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性,但减少心肌细胞皱缩和核染色、充血、淤血和空泡变性。4.早期LT4干预能显着提高SCH子代大鼠心肌组织中与心脏发育相关Gata4和Nkx2-5的m RNA和蛋白表达。5.早期LT4干预能增加BMP4/Smad4信号通路相关蛋白的表达,可能参与调控SCH妊娠大鼠子代心脏的发育过程,改善其子代心脏发育。
文日[7]（2021）在《长链非编码RNA-AABR07066529.3在脓毒性休克大鼠心肌损伤中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:脓毒症是因为感染引起宿主反应失调进而导致危及生命的器官功能障碍,是重症监护病房常见的疾病之一。脓毒性休克作为脓毒症的一种亚型,具有更高的病死率。脓毒症心肌损伤是脓毒性休克常见的并发症,其发生促进了脓毒性休克的进展与恶化,是导致死亡的重要原因。因此,明确脓毒症心肌损伤的发病机制有助于临床医生找到新的治疗靶点,降低患者的病死率。脓毒症心肌损伤发病机制复杂,目前尚无一种或几种理论可以完全阐明。最广为接受的理论是多种因素相互作用,共同参与脓毒症心肌损伤的发病过程。包括炎症因子、细胞凋亡、线粒体功能障碍等。近年,研究表明,细胞焦亡也可能参与脓毒症心肌损伤的发生发展过程。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是在真核生物中发现的一类长度超过200个核苷酸、没有长开放阅读框的RNA。近年,越来越多的研究表明lncRNAs可以在表观遗传、转录以及转录后等多水平调控基因的表达,进而参与多种重要的生物学过程。研究发现,多种lncRNAs参与到脓毒症的发病机制中。但是,lncRNA与脓毒症心肌损伤的研究很少。课题组前期对脓毒性休克大鼠心肌组织进行了全转录组测序,结果显示炎症与凋亡相关通路和基因呈现显着富集。同时测序结果显示,lncRNA-AABR07066529.3在模型组表达显着升高,并且可能与炎症、细胞凋亡与细胞焦亡通路相关。此外,生信分析表明,髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）可能是lncRNA-AABR07066529.3的靶基因。MyD88是一种经典的连接蛋白,在多种炎症相关疾病中都参与炎症与凋亡的调控。此外,有研究报道,MyD88可以影响NLRP3炎症小体的表达,说明MyD88也参与细胞焦亡的调控。基于以上背景,本课题拟研究在脓毒症心肌损伤中,lncRNAAABR07066529.3是否可以通过调节炎症、细胞凋亡与细胞焦亡影响心肌细胞损伤,并探究lncRNA-AABR07066529.3发挥作用的具体机制。研究方法:第一部分:脓毒性休克大鼠心肌损伤模型中炎症、细胞凋亡和细胞焦亡情况及lncRNA-AABR07066529.3的验证1、将幼年Wister大鼠分为对照组和脓毒症心肌损伤组。LPS（20mg/kg）腹腔注射构建脓毒症心肌损伤模型,对照组给予等量生理盐水。12h后取材,HE染色观察心肌组织损伤情况。2、不同浓度LPS处理H9c2心肌细胞不同时间,CCK8检测心肌细胞活力情况,确定LPS干预的最佳干预浓度和时间。3、炎症损伤的检测。Luminex多因子技术检测各组大鼠腹主动脉血中炎症因子TNF-α与IL-6的含量;并用Western blot检测各组细胞中TNF-α与IL-6的表达情况。4、细胞凋亡的检测。Tunel染色检测各组大鼠心脏组织中细胞凋亡的情况;流式细胞技术检测各组细胞中细胞凋亡率的变化;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase3的表达情况。5、细胞焦亡的检测。Luminex多因子技术检测各组大鼠腹主动脉血中炎症因子IL-1β与IL-18的含量;电镜观察大鼠心肌组织损伤情况;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT的表达情况。6、PCR检测各组大鼠心脏组织以及各组H9c2心肌细胞中lncRNA-AABR07066529.3的表达情况。7、网站预测（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lnc Locator/）lncRNA-AABR07066529.3的细胞定位,并利用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybrid ization,FISH）实验验证。Northern blot实验观察lncRNA-AABR07066529.3大小,c DNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of c DNA ends,RACE）实验获取lncRNA-AABR07066529.3全长。第二部分:lncRNA-AABR07066529.3对LPS诱导的H9c2心肌细胞的作用1、利用慢病毒构建lncRNA-AABR07066529.3敲减载体,荧光显微镜观察转染情况,PCR检测敲减效率。将细胞分为四组:对照组、LPS组、LPS+NC-KD以及LPS+KD组。流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化情况。Western blot检测各组细胞中炎症因子TNF-α与IL-6、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT的表达情况。2、利用腺病毒构建lncRNA-AABR07066529.3过表达载体,PCR检测过表达效率。将细胞分为四组:对照组、LPS组、LPS+NC-OE组以及LPS+OE组,检测心肌细胞中炎症、细胞凋亡及细胞焦亡的变化情况。第三部分:lncRNA-AABR07066529.3在脓毒症心肌损伤中发挥作用的可能机制1、Western blot检测MyD88在各组大鼠心脏组织以及各组H9c2心肌细胞中的表达情况。2、利用si-RNA构建MyD88敲减载体,进行PCR和Western blot检测敲减效率。利用Western blot实验检测各组细胞中炎症、细胞凋亡以及细胞焦亡相关蛋白的表达变化情况。明确MyD88对LPS诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响。3、lncRNA-AABR07066529.3敲减/过表达后,Western blot检测MyD88的表达变化,观察lncRNA-AABR07066529.3对MyD88的调控作用。4、进行同时敲减lncRNA-AABR07066529.3和MyD88的回复实验,验证lncRNA-AABR07066529.3通过MyD88发挥作用。将细胞分为LPS+KD+si-NC组以及LPS+KD+si-MyD88组,Western blot检测各组细胞中炎症因子、细胞凋亡以及细胞焦亡相关蛋白的表达变化情况。5、进行RNA pulldown实验,深入探究lncRNA-AABR07066529.3与MyD88的调控机制。研究结果:第一部分:脓毒性休克大鼠心肌损伤体内外模型均存在炎症、细胞凋亡以及细胞焦亡损伤。lncRNA-AABR07066529.3在脓毒症心肌损伤体内外模型中表达升高,且主要表达于细胞质。1、LPS作用1-2小时后,脓毒性休克组大鼠MAP和心功能下降,且达到休克水平（MAP下降>20-25%）。HE染色显示与对照组相比,脓毒性休克组大鼠心脏组织中炎症浸润增多、心肌纤维断;当LPS浓度达到10mg/ml（24h）时,H9c2心肌细胞活力显着下降,且光镜下可见LPS处理组细胞较对照组分布稀疏、细胞皱缩。表明脓毒症心肌损伤体内外模型构建成功。2、Luminex多因子实验发现模型组大鼠腹主动脉血中TNF-α、IL-6、IL-1β与IL-18含量高于对照组（P<0.05）;Tunel染色显示脓毒症心肌损伤组大鼠心脏组织中细胞凋亡增多（P<0.05）;且电镜下在模型组心肌组织中可以观察到凋亡小体与焦亡小体。与对照组细胞相比,Western blot实验发现LPS处理组细胞中TNF-α与IL-6、促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT的表达增加（P<0.05）而抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少（P<0.05）;流式细胞技术结果也显示LPS后心肌细胞凋亡增加（P<0.05）。表明脓毒症心肌损伤体内外模型中均存在炎症、细胞凋亡与细胞焦亡损伤。3、PCR结果显示lncRNA-AABR07066529.3在LPS诱导的脓毒症心肌损伤体内外模型中表达均增加,与测序结果一致。4、网站预测和FISH实验皆表明lncRNA-AABR07066529.3主要位于细胞质中。此外,Northern Blot与RACE实验发现lncRNA-AABR07066529.3全长为4786nt。第二部分:lncRNA-AABR07066529.3可以抑制LPS诱导的H9c2细胞中炎症、细胞凋亡与细胞焦亡1、PCR筛选敲减效率最高的慢病毒载体（p<0.005）,并用嘌呤霉素成功筛选lncRNA-AABR07066529.3敲减的H9c2稳转细胞株用于后续实验。2、与LPS组和LPS+NC组相比,LPS+KD组中炎症因子TNF-α和IL-6、促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT蛋白表达增加（P<0.05）,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达减少（P<0.05）。同时,流式实验也显示LPS+KD组细胞凋亡增加（p<0.005）。说明抑制lncRNA-AABR07066529.3后,炎症、细胞凋亡和细胞焦亡增加,提示lncRNA-AABR07066529.3可以抑制LPS引起的H9c2心肌细胞中的炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。3、PCR筛选过表达效率最高的腺病毒载体,成功过表达lncRNAAABR07066529.3（P<0.05）。与敲减相反,lncRNA-AABR07066529.3过表达后,炎症因子TNF-α和IL-6、促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3以及焦亡相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT蛋白表达减少（P<0.05）,而抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）,进一步表明lncRNA-AABR07066529.3可以抑制LPS引起的H9c2心肌细胞中的炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。第三部分:在H9c2心肌细胞中,lncRNA-AABR07066529.3通过抑制MyD88抑制LPS引起的炎症、细胞凋亡与细胞焦亡损伤。1、在脓毒症心肌损伤体内外模型中,MyD88蛋白表达均增加（P<0.05）。2、PCR和Western blot筛选敲减效率最高的si-RNA,成功敲减MyD88（P<0.05）。与LPS组和LPS+si-NC组相比,LPS+si-MyD88组中TNF-α、IL-6、Bax、cleaved-caspase3、NLRP3、cleaved-caspase1和GSDMD-NT表达减少（P<0.05）,而Bcl-2表达增加（P<0.05）,表明MyD88可以加重LPS引起的H9c2心肌细胞中的炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。3、敲减lncRNA-AABR07066529.3后,MyD88蛋白表达增加（P<0.05）;而lncRNA-AABR07066529.3过表达后,MyD88蛋白表达减少（P<0.05）,说明lncRNA-AABR07066529.3可以抑制MyD88的表达。4、与单独敲减lncRNA-AABR07066529.3相比,同时敲减lncRNAAABR07066529.3和MyD88时炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤减轻（P<0.05）,提示lncRNA-AABR07066529.3可能是通过MyD88发挥作用的。5、RNA pull-down结果中没有获得MyD88,提示lncRNA-AABR07066529.3不是通过与MyD88直接结合发挥作用。研究结论:1、在LPS诱导的脓毒症心肌损伤体内外模型中,均存在炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤。lncRNA-AABR07066529.3在LPS诱导的脓毒症心肌损伤体内外模型中表达升高。2、在H9c2心肌细胞中,lncRNA-AABR07066529.3过表达可以抑制LPS引起的炎症、细胞凋亡与细胞焦亡损伤。3、在LPS诱导的H9c2细胞中,lncRNA-AABR07066529.3通过抑制MyD88的表达,抑制炎症、细胞凋亡和细胞焦亡损伤,发挥保护作用
王宏书[8]（2020）在《转录因子NKX2-5在心脏发育中的作用研究》文中研究说明[目 的]NKX2-5是调控胚胎期心脏发育的关键转录因子,同时在维持心脏正常的收缩功能和电生理活动中也起重要作用,其功能异常导致心脏结构和功能异常。目前NKX2-5调控心脏发育及心肌细胞分化与功能的具体分子机制尚待剖析,本课题旨在研究NKX2-5调控心脏发育及心肌细胞分化与功能的分子机制以及NKX2-5基因突变与人类先天性房间隔缺损发生之间的相关性。[方 法]（1）提取30例ASD患者和30例健康对照者的外周血DNA,以Illumina测序技术对NKX2-5基因全长进行测序。（2）构建shRNA慢病毒载体,敲低大鼠心肌细胞系H9c2的Nkx2-5,对H9c2细胞的增殖能力、迁移能力和心肌细胞分化发育相关基因（Actn1,Tnnt2,Tbx5,Gata4,Hand2,Fgf10）的表达进行检测。（3）RNA-seq技术分析敲低Nkx2-5后H9c2细胞的基因表达谱改变,生物信息学分析差异表达基因富集到的信号通路,寻找Nkx2-5调控的关键基因及信号通路。（4）qRT-PCR对差异表达基因进行验证,western blot技术对富集到的信号通路的活化状态进行检测。（5）TGF-β信号通路抑制剂和MAPK信号通路抑制剂分别抑制H9c2细胞的TGF-β信号通路和MAPK信号通路,检测H9c2细胞的增殖能力及心肌细胞分化和功能相关基因的表达。[结 果]（1）在ASD患者的NKX2-5中检测到单核苷酸变异,变异位点包括rs2277923,rs3131915,173233524,173233520,173233516 和 rs703752,变异频率分别为83.3%,13.3%,70%,26.7%,3.3%和 10%。在健康对照者的 NKX2-5 中检测到单核苷酸位点变异,变异位点包括rs2277923,rs3131915,173233524,173233520,173233516 和 rs703752,变异频率分别为 80%,13.3%,80%,16.7%,10%和 13.3%。在ASD患者组和健康对照组中,上述单核苷酸位点变异的OR值（95%置信期间）分别为 1.25（0.34-4.64）,1,0.58（0.18-1.91）,1.82（0.52-6.32）,0.31（0.03-2.84）和0.72（0.15-3.57）。（2）敲低H9c2细胞的Nkx2-5导致细胞增殖减低、细胞迁移增强、心肌细胞分化标记物Tnnt2、细胞收缩相关蛋白Actn1和细胞缝隙连接蛋白Gja1的表达减低,同时也导致心脏发育相关基因Tbx5,Gata4,Hand2的表达减低。（3）RNA-seq结果提示敲低Nkx2-5导致下游基因的表达改变,GO富集分析提示差异表达基因富集于细胞外空间、细胞外基质、钙离子依赖的磷脂结合、钙离子依赖性胞吐作用的调节、心脏内皮间质化、心脏HIS束发育和心肌细胞增殖等生物学过程,pathway富集分析提示差异表达基因富集于TGF-β信号通路、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、心律失常性右心室心肌病相关通路。（4）RNA-seq结果提示敲低Nkx2-5导致下游miRNAs的表达改变,通过靶基因预测后再对这些差异表达的miRNAs的靶基因进行GO富集分析,结果提示差异表达的miRNAs的靶基因富集于多种生物学过程,包括基因的转录调节、氧化还原反应、细胞信号转导、细胞分化、细胞凋亡、细胞增殖、蛋白磷酸化、蛋白水解、细胞内信号转导、蛋白泛素、基因表达,所发挥的功能包括蛋白结合、金属离子结合、ATP结合、同源蛋白结合、同源结构域蛋白二聚体活性、DNA结合、RNA结合、锌离子结合、钙离子结合。pathway富集分析提示差异表达的miRNAs的靶基因富集于MAPK信号通路,FoxO信号通路,mTOR信号通路,p53信号通路,Ras s信号通路和Sphingolipid信号通路。（5）qRT-PCR结果提示敲低Nkx2-5导致与细胞增殖、迁移及心肌细胞分化与功能相关的关键基因即TGF-β2,Id2,Wt1,Cacna1g,Heyl,Tnnt2,Actn1,Gja1,Tbx5,Gata4,Myl2,Hand2,Fgf10和miRNA1的表达改变,Western blot结果提示敲低Nkx2-5导致MAPK信号通路抑制。（6）抑制TGF-β信号通路导致H9c2细胞增殖减低,抑制TGF-β信号通路导致Tnnt2表达减低,Actn1,Gjal,Gata4,Hand2,Id2,Wnt4和Xdh表达增加。（7）抑制MAPK信号通路导致H9c2细胞增殖减低,抑制MAPK信号通路导致Tnnt2,Wnt4 和 Lrp2 表达增加,Actn1,Gjal,Tbx5,Hand2,Wt1,Heyl,Xdh,Cacna1g,Syt1,Pou5f1和Xdh 表达减低。[结 论]1.ASD患者的NKX2-5中存在有单核苷酸位点变异,这些位点变异可能与ASD的发生相关。2.Nkx2-5促进大鼠心肌细胞H9c2增殖,抑制细胞迁移,调控心肌细胞分化及功能相关基因的表达。3.TGF-β信号通路激活可促进大鼠心肌细胞H9c2增殖并调控心肌细胞分化及功能相关基因的表达。4.MAPK信号通路激活可促进大鼠心肌细胞H9c2增殖并调控心肌细胞分化及功能相关基因的表达。5.转录因子 NKX2-5 可能通过TGF-β2,Id2,Wt1,Cacna1g,Heyl,Tnnt2,Actn1,Gja1,Tbx5,Gata4,Myl2,Hand2,Fgf10,miRNA1,TGF-β信号通路和 MAPK信号通路调控心肌细胞的增殖、迁移、分化及功能。
赵乾聪[9]（2020）在《线粒体分裂蛋白Drp1在小鼠胚胎心脏发育中的作用》文中认为心脏是胚胎发育过程中第一个开始发育的器官,心脏在胚胎期的发育异常会导致先天性心脏病的发生,而先心病在人类中是最常见的先天畸形,其发病率可达1%至5%。先心病不光在心血管系统危害人类的健康,先心病也是引起其他系统的疾病的重要因素,包括心律失常、猝死、肺功能障碍等疾病。了解并探索心脏胚胎发育中的分子与遗传机制可以为更好的预防和治疗先心病提供重要的线索。对临床和基础科研都有重要意义。线粒体是真核细胞中的非常重要的细胞器,起源于20亿年前。线粒体为双层脂膜结构,其内膜折叠成嵴,目的在于扩大内膜表面积。外膜则是线粒体与细胞基质的分界,其上有多种受体,可以与其它细胞器进行交流。在内膜上有氧化磷酸（OXPHOS）复合体I到V,其主要功能是参与ATP的产生。线粒体渗透性转变孔（mPTP）位于线粒体膜上,其准确定位目前还未可知。内外膜之间是膜间隙,其中包含了细胞色素C,它在氧化磷酸复合体中起传递电子的作用,此外它也可以促使细胞凋亡的发生。内膜内是线粒体基质,其中有线粒体DNA,核糖体,酶以及各种离子。线粒体的融合与裂变的动态循环可以保证其在不同细胞中的形态,分布和大小,这一过程称为“线粒体动力学”。线粒体在心脏发育过程中起到了非常关键的作用,现发现在心脏发育过程中,线粒体生物发生,活性氧（ROS）,细胞凋亡,线粒体融合与分裂等均在小鼠心脏发育中起关键作用。Dynamin-related protein 1（Drp1）是蛋白质发动蛋白超家族的成员,由GTP酶和GTP酶效应结构域组成,它们通过螺旋状氨基酸区段相互分离。Drp1作用于线粒体外膜诱导线粒体分裂。此前有研究表明同属GTP酶的dynamin-2也可作用于线粒体的分裂,可最近研究表明,只有Drp1对于线粒体的分裂有重大意义,而Dynamin1-3在线粒体分裂中是可有可无的。而Drp1在小鼠心脏发育中的作用已经有相关研究,先前研究使用Cre-Loxp系统在小鼠心脏心肌细胞中条件性敲除Drp1,先前的研究的主要是在出生后新生鼠中使用Mhy-6-Cre-Drp1loxp/loxp与Mck-Cre-Drp1loxp/loxp在心肌细胞中敲除Drp1,研究发现敲除Drp1会导致新生鼠死亡,基因缺陷鼠出现扩张性心肌病,心脏形态改变,心肌细胞形态改变,线粒体正常功能丧失。而Drp1在胚胎时期心脏心肌细胞发育中的作用依然不清楚。在我们目前的研究中,我们主要探讨在小鼠胚胎时期在心肌细胞中条件性敲除Drp1对于小鼠胚胎期心脏发育的影响。方法:1.探讨胚胎时期在心肌细胞中条件性敲除Drp1对于心脏形态发育的影响;用Mef2C-Cre;Drp1loxp/+雄性小鼠与Drp1loxp/loxp雌性小鼠杂交以获得实验组（突变型）(Mef2C-Cre;Drp1loxp/loxp)以及对照组（野生型）(Drp1loxp/+)小鼠。将E9.5和E10.5的实验组胚胎及其同窝对照组胚胎进行矢状切片,之后进行免疫荧光染色以检测Drp1在胚胎心脏中的表达情况。将E11.5至E16.5对照组和实验组的心脏切片并做HE染色。2.探讨胚胎时期在心肌细胞中条件性敲除Drp1对于心肌细胞增殖、凋亡以及在心室壁中取向的影响;将E12.5的对照组与实验组的心脏切片,并利用免疫荧光染色检测心脏心肌细胞中的细胞增殖、细胞凋亡以及心室壁上的心肌细胞的取向。3.探讨对照组与实验组心肌细胞在心室壁中取向不同的原因;将E12.5的对照组和实验组心脏冰冻切片,利用免疫荧光染色检测不同基因型心肌细胞表面N-钙粘蛋白的表达;采用Western blot技术对从心脏中提取出的蛋白中N-Cadherin蛋白的表达进行检测。4.探讨条件性敲除Drp1后心肌细胞中线粒体在细胞中分布以及形态的改变;将E10.5的对照组和实验组胚胎做石蜡切片,使用免疫荧光染色心肌细胞中的线粒体在心肌细胞中的分布情况;将E14.5的对照组和实验组心脏心肌细胞进行体外细胞培养,使用免疫荧光染色技术对心肌细胞进行染色,观察对照组与实验组心肌细胞中线粒体在细胞中的分布情况;将E11.5与E14.5的对照组和实验组心脏做成电镜切片,使用电子显微镜技术观察野生型与实验组心肌细胞中线粒体的超微结构的改变。5.探讨条件性敲除Drp1后心肌细胞中线粒体内膜上氧化磷酸化复合体功能的改变;将E14.5的对照组和实验组心脏做新鲜组织冰冻切片,采用DAB染色与NADH染色技术,检测对照组与实验组心肌细胞中线粒体中的氧化磷酸化复合体I和复合体IV的功能;将E14.5的对照组与实验组小鼠心脏取出,采用检测心肌组织在不同时期氧气消耗以及呼吸速率的方法对线粒体内膜上的呼吸链电子传递以及ATP的产生的功能进行检测。6.探讨条件性敲除Drp1后对照组与实验组心肌细胞的RNA表达谱的差别;从E13.0的对照组与实验组心脏中提取心肌细胞,经过细胞分选,采用单细胞RNA测序技术,检测这个时期各个不同细胞群中基因的表达,通过对RNA测序的分析,检测对照组与实验组心肌细胞因缺失Drp1所引起心肌细胞中相关的RNA表达的改变。结果:1.免疫荧光分析显示Drp1在E9.5实验组胚胎心脏右心室和流出道中部分被灭活,而在E10.5实验组胚胎心脏右心室和流出道中全部被灭活;从E12.5开始,实验组心脏形态开始发生改变,实验组心脏右心室发育开始减缓,右心室体积较野生型心脏右心室小,直至E17.5,所有实验组胚胎死亡。2.E12.5时,免疫荧光分析显示实验组心脏右心室心肌细胞增殖较对照组明显降低,而实验组心脏右心室心肌细胞凋亡较对照组明显增加,实验组心脏右心室室壁心肌细胞取向同对照组心脏右心室室壁心肌细胞取向不同。3.免疫荧光分析显示,E12.5时实验组心脏右心室心肌细胞表面N-钙粘蛋白表达较对照组右心室心肌细胞明显下降;Western blot显示,实验组心脏蛋白中的N-钙粘蛋白表达较对照组下降。4.免疫荧光分析显示,E10.5时实验组心脏右心室心肌细胞中线粒体的分布同对照组不同;E14.5时,体外心肌细胞染色显示实验组的细胞周围线粒体分布同对照组细胞周围线粒体分布不同,实验组细胞出现过度融合征象;电子显微镜显示,E11.5和E14.5时,实验组和对照组心脏中心肌细胞的线粒体超微结构之间差异明显。5.E14.5时实验组心脏中氧化磷酸化复合体I和复合体IV的功能相对于对照组心脏降低;实验组心脏的线粒体的呼吸链电子传递同ATP的产生耦合度较对照组心脏降低。6.E13.0时实验组和对照组心肌细胞测序发现实验组和对照组中共有240个基因的表达改变,根据基因表达,共有35条通路改变,参与细胞内核糖体构建的多个基因表达异常。结论:在小鼠胚胎心脏心肌细胞发育的早期过程中,Drp1起到了至关重要的作用。早期条件性敲除Drp1会引起胚胎致死性,小鼠胚胎发育中心脏形态、结构及功能的异常。实验组心脏中心肌细胞的增殖减低,细胞凋亡增加。在发育过程中心肌细胞的取向异常,而该取向异常通过N-Cadherin蛋白途径控制。实验组心肌细胞中线粒体的分布、超微结构及功能异常,E10.5时心肌细胞中线粒体的分布发生改变,E14.5时可见线粒体过度融合。在电镜下,实验组在E11.5和E14.5时发现线粒体的超微结构发生改变。通过对心肌细胞中线粒体功能的测试,发现实验组心肌细胞的线粒体呼吸功能相对于对照组下降。通过单细胞RNA测序,E13.0时实验组和对照组心肌细胞中大量基因的表达不同,从而导致了许多蛋白表达通路不同,其中参与核糖体构成的多个基因表达异常,我们首次在小鼠胚胎心脏发育中发现线粒体裂变异常可能对编码核糖体蛋白的基因的转录产生强烈影响,表明线粒体动力学与蛋白翻译之间存在串扰。
曹美玲[10]（2020）在《TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究》文中指出研究背景和目的:先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）是新生儿常见的重大出生缺陷,是导致围产儿死亡和儿童死亡的主要原因。研究证实,CHD主要由于胚胎时期遗传与环境因素共同作用引起,其中遗传因素具有重要作用。心脏发育相关基因及信号通路与CHD关系的机制仍不明确。心脏发育过程为多基因共同调控的极复杂的生物学过程。研究表明转录因子可通过直接或间接调控靶基因的表达,而影响心肌细胞的迁移、增殖及分化,从而参与心脏发育及CHD的发生。TBX1基因是T-box基因家族成员之一,在胚胎发育早期表达,与心脏发育密切相关,是CHD的致病基因之一。目前,对TBX1基因的研究多集中于TBX1基因编码区的核苷酸变异或基因缺失和重复,而关于TBX1基因表达异常调控的研究较少。本课题组前期研究发现TBX1基因T350M多态性与法洛氏四联症（TOF）具有明显的相关性,可能是TOF的遗传易感基因。课题组首次发现CHD患者心肌组织中ACTC1基因表达水平降低,该异常可诱导胚胎发育时期心肌细胞过度凋亡,从而导致人类CHD的发生。课题组进一步研究发现ACTC1上游调控序列中存在HOXA3转录因子结合位点,转录因子HOXA3与TBX1相互作用参与心脏发育,与CHD的发生密切相关。胚胎早期发育过程中,凋亡相关的心肌细胞缺失是导致CHD发生的关键因素之一,与心肌细胞凋亡相关的基因调控异常可能是影响CHD发生的原因之一,其确切机制亟待研究。TBX3基因参与胚胎早期多器官发育,研究表明,TBX3基因可抑制细胞周期调节蛋白P21表达,从而发挥调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进增殖的作用。P21基因为周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）家族的抑制剂,在调节细胞周期和细胞增殖过程中发挥关键作用,而其在心肌细胞中的作用尚未见报道。因此,有必要深入探讨TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,以及TBX3基因是否作为TBX1基因下游信号分子通过P21基因调控心肌细胞生物学功能。进一步阐明TBX1基因参与心脏发育信号通路的分子机制,有助于探索新的先天性心脏病产前诊断靶点,并为先天性心脏病靶向治疗提供新的理论依据。研究方法:第一部分:采用TBX1 siRNA转染大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞,利用高通量基因芯片技术,筛选TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,进行GO富集分析和KEGG数据库Pathway富集分析;Real-time PCR和ELISA方法验证TBX3基因在CHD心肌组织中的mRNA和蛋白表达情况。第二部分:建立TBX3基因沉默和过表达H9C2细胞,Real-time PCR和Western blot检测TBX3基因mRNA和蛋白表达;采用CCK-8和Ki67免疫荧光染色检测细胞活性;流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot检测周期蛋白CyclinA,CyclinB1,CyclinD1表达;利用Hoechst33342染色和Annexin V/PI双重染色法检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2表达;Jc-1法检测线粒体膜电位、试剂盒法检测线粒体ATPase活性和ROS含量;采用Real-time PCR和Western blot检测P21基因mRNA和蛋白表达,ChIP实验验证TBX3基因对P21的调控作用。最后,通过同时敲减TBX3基因和P21基因,检测P21基因对TBX3基因沉默诱导的P21基因表达和细胞增殖的影响。结果:第一部分:1.TBX1基因下游差异表达的基因995个,其中上调基因240个,下调基因755个。2.GO富集分析显示,上调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:糖酵解过程、胆固醇合成、碳水化合物磷酸化、细胞迁移和脂质磷酸化等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏瓣膜发育和心脏形态发生,相关的差异基因包括:Tgfb2、Sox9、Tab1。下调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:细胞分化、染色体分离、有丝分裂细胞周期和对病毒的反应等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管形成、胚胎心导管左/右模式形成、心率调节以及心脏发育等,相关的差异基因包括:TBX3、Cited2、Tead2、Pln、Casq2、Dmd、Ift122、Kcne2、Dchs1、Nrp2、Gli2。3.KEGG数据库Pathway富集分析表明,差异基因中具有统计学意义的信号通路主要有:细胞周期、胞质DNA传感通路、减数分裂等。4.在CHD心肌组织标本中TBX3基因mRNA和蛋白表达水平着降低。第二部分:1.敲减TBX3基因明显抑制H9C2细胞增殖活性和Ki67蛋白表达;过表达TBX3基因作用相反。2.敲减TBX3基因显着增加G1期H9C2细胞数,减少S期H9C2细胞数,抑制Cyclin D1,Cyclin A和Cyclin B1表达;过表达TBX3基因可以增强细胞周期蛋白表达,对细胞周期分布无显着影响。3、TBX3基因沉默H9C2细胞表现出典型的凋亡形态特征,包括核碎裂和染色质浓缩,凋亡细胞百分比明显增加,cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax表达上调、Bcl-2表达下调;过表达TBX3基因对细胞的凋亡状态无显着影响。4.敲减TBX3基因可显着下调H9C2细胞线粒膜电位和ATPase活性,增加ROS含量,并且增加胞质中细胞色素C含量,降低线粒体中细胞色素C含量。5.TBX3基因沉默使H9C2细胞中P21基因mRNA和蛋白表达水平显着升高,且TBX3蛋白与P21基因DNA存在靶向结合。6.同时敲减TBX3基因和P21基因使H9C2细胞中P21蛋白表达显着降低,并可明显恢复TBX3基因沉默诱导的H9C2细胞增殖能力的下降。结论:1.TBX1基因下游上调差异基因可能与生物合成和磷酸化反应等有关,下调差异表达基因可能与细胞分化、细胞周期和对某些生化物质的反应等有关;与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管左右模式形成、心脏左/右不对称发育、心率调节和心脏发育等。2.TBX3基因是TBX1基因下游心脏发育相关的基因。3.TBX3基因表达下调与CHD的发生相关。4.TBX3基因沉默抑制H9C2细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1期。5.TBX3基因沉默诱导H9C2细胞线粒体功能障碍,促进细胞凋亡。6.P21基因是TBX3基因的下游靶基因。7.TBX3基因表达下调通过靶向调控P21基因的表达而抑制H9C2细胞增殖。
二、心脏发育中的细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、心脏发育中的细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）心脏发育和疾病的表观遗传调控机制（论文提纲范文）
| 1 DNA甲基化与心脏发育 |
| 2 组蛋白修饰与心脏发育 |
| 3 染色质重塑复合物与心脏发育 |
| 4 micro RNAs与心脏发育 |
| 5 心脏疾病的表观遗传机制 |
| 5.1 动脉粥样硬化 |
| 5.2 心力衰竭 |
| 5.3 心肌缺血 |
| 5.4 心肌纤维化 |
| 6 食用表观遗传活性功能食品对心脏的保护作用 |
| 7 结语 |
（2）miRNA-129-1-3p在芦丁减轻吡柔比星所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌药效中的介导作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词对照表 |
| 第1篇 前言 |
| 第2篇 文献综述 蒽环类药物致乳腺癌患者心脏毒性的研究进展 |
| 1.1 蒽环类药物心脏毒性临床表现 |
| 1.1.1 蒽环类药物心脏毒性发病率 |
| 1.1.2 蒽环类药物心脏毒性临床类型 |
| 1.1.3 蒽环类药物心脏毒性病理特征 |
| 1.2 蒽环类药物所致心脏毒性的发生机制 |
| 1.2.1 氧化应激 |
| 1.2.2 内质网应激和肌浆网钙稳态 |
| 1.2.3 线粒体功能障碍 |
| 1.2.4 铁调节蛋白紊乱 |
| 1.2.5 炎症反应 |
| 1.2.6 细胞自噬 |
| 1.2.7 细胞凋亡 |
| 1.3 蒽环类药物所致心脏毒性的药物防治 |
| 1.3.1 右雷佐生 |
| 1.3.2 卡维地洛 |
| 1.3.3 他汀类药物 |
| 1.3.4 辅酶Q10 |
| 1.3.5 中药 |
| 1.4 蒽环类药物所致心脏毒性与miRNAs |
| 1.4.1 miRNAs简介 |
| 1.4.2 心脏miRNAs表达的变化 |
| 1.4.3 循环miRNAs表达的变化 |
| 1.4.4 miRNAs在预防和治疗中的作用 |
| 1.5 乳腺癌与miRNAs |
| 1.5.1 诊断与分型 |
| 1.5.2 治疗 |
| 1.5.3 预后 |
| 1.6 miRNAs在蒽环类药物致乳腺癌患者心脏毒性中应用的展望 |
| 第3篇 实验研究 |
| 第1章 RUT减轻THP所致心脏毒性的miRNA生物信息学分析及miRNA-129-1-3p/GRIN2D介导的Ca~(2+)通路的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 miRNA芯片生物信息学分析及信号通路构建 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.2.4 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 生物信息学分析预测miR-129-1-3p靶基因和Ca~(2+)通路的联系 |
| 1.3.2 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.4 本章小结 |
| 第2章 miRNA-129-1-3p在 RUT减轻THP诱导的小鼠心肌细胞损伤中的介导作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 实验用药配制 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞毒性-增殖检测 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR) |
| 2.2.5 细胞转染 |
| 2.2.6 ROS检测 |
| 2.2.7 细胞丙二醛检测 |
| 2.2.8 超氧化物歧化酶检测 |
| 2.2.9 Fluo-3 AM钙离子检测 |
| 2.2.10 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 RUT、THP对心肌细胞作用的最佳浓度和时间确定 |
| 2.3.2 RUT逆转THP处理的HL-1细胞中miR-129-1-3p下调和GRIN2D mRNA上调 |
| 2.3.3 miR-129-1-3p转染至HL-1细胞中的效率评价 |
| 2.3.4 RUT和miR-129-1-3p改善THP诱导的HL-1细胞损伤 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 miRNA-129-1-3p在 RUT协同THP抑制乳腺癌4T1细胞增殖、迁移及侵袭中的介导作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HC11及4T1细胞培养 |
| 3.2.2 实验用药配置 |
| 3.2.3 CCK-8细胞毒性-增殖检测 |
| 3.2.4 qPCR |
| 3.2.5 细胞转染 |
| 3.2.6 平板克隆形成实验 |
| 3.2.7 划痕实验 |
| 3.2.8 Transwell迁移和侵袭实验 |
| 3.2.9 Fluo-3 AM钙离子检测 |
| 3.2.10 Western blot |
| 3.2.11 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 RUT和/或THP对乳腺(癌)细胞作用及最佳浓度和时间确定 |
| 3.3.2 RUT协同THP上调4T1细胞miR-129-1-3p、下调GRIN2D mRNA的表达 |
| 3.3.3 miR-129-1-3p mimics/inhibitor成功转染至4T1细胞 |
| 3.3.4 miR-129-1-3p介导4T1细胞增殖、迁移、侵袭的作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 miRNA-129-1-3p在RUT对乳腺荷瘤与THP心脏毒性复合模型小鼠心肌保护及增敏抗肿瘤的介导作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.14T1细胞培养 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 乳腺荷瘤与心脏毒性小鼠复合模型的复制方法 |
| 4.2.4 实验分组及处理因素 |
| 4.2.5 小鼠血液标本的采集 |
| 4.2.6 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织标本的采集 |
| 4.2.7 心电监测 |
| 4.2.8 心脏系数的测定 |
| 4.2.9 血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶检测 |
| 4.2.10 血清MDA检测 |
| 4.2.11 血清SOD检测 |
| 4.2.12 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织HE染色 |
| 4.2.13 肿瘤组织免疫组织化学染色 |
| 4.2.14 qPCR |
| 4.2.15 心肌与肿瘤组织中Ca~(2+)水平检测 |
| 4.2.16 TUNEL检测心肌与肿瘤组织细胞凋亡 |
| 4.2.17 Western blot |
| 4.2.18 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠一般状况及体重变化 |
| 4.3.2 小鼠肿瘤生长情况 |
| 4.3.3 小鼠心电图变化 |
| 4.3.4 小鼠心脏系数变化 |
| 4.3.5 小鼠血清LDH及CK变化 |
| 4.3.6 小鼠血清MDA、SOD变化 |
| 4.3.7 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织病理学改变 |
| 4.3.8 小鼠肿瘤组织中Ki67 变化 |
| 4.3.9 小鼠心肌和肿瘤组织中miR-129-1-3p和GRIN2D mRNA的变化 |
| 4.3.10 小鼠心肌和肿瘤组织中钙含量变化 |
| 4.3.11 小鼠心肌和肿瘤组织的细胞凋亡 |
| 4.3.12 小鼠肿瘤组织中与迁移、侵袭相关蛋白表达的变化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第4篇 讨论 |
| 1.1 THP诱导小鼠心肌细胞损伤模型及乳腺荷瘤与THP心脏毒性复合小鼠模型的复制 |
| 1.1.1 THP诱导的小鼠心肌细胞损伤模型的复制 |
| 1.1.2 乳腺荷瘤与心脏毒性复合小鼠模型的复制 |
| 1.2 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用及机制 |
| 1.2.1 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用 |
| 1.2.2 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用机制 |
| 1.3 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌中的作用及机制 |
| 1.3.1 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌中的作用 |
| 1.3.2 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌的作用机制 |
| 第5篇 结论 |
| 创新点 |
| 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于生物信息学分析LncRNA SNHG5通过mir-205-5p/SMAD4在腹主动脉瘤中改变血管平滑肌细胞的功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 腹主动脉瘤中关键ceRNA网络的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 腹主动脉瘤样本的数据处理和差异分析 |
| 2.3.2 腹主动脉瘤中重要ceRNA网络的构建 |
| 2.3.3 腹主动脉瘤中重要ceRNA网络参与的GO和KEGG |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 LncRNA SNHG5通过mir-205-5p/SMAD4影响血管平滑肌细胞的功能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SNHG5、mir-205-5p和SMAD4在AAA组织和正常主动脉组织中的表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 干扰SNHG5可以上调mir-205-5p并且抑制SMAD4的表达从而抑制VSMC的迁移和增殖并促进凋亡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Mir-205-5p可以与LncRNA SNHG5和SMAD4直接结合 |
| 4.3.2 Mir-205-5p与LncRNA SNHG5以Ago 2依赖的方式靶向结合 |
| 4.4 下调LncRNA SNHG5可以增加VSMC中mir-205-5p的表达,降低SMAD4 的表达 |
| 4.5 体外实验验证下调LncRNA SNHG5、过表达mir-205-5p或下调 SMAD4可以抑制VSMC的迁移和增殖并促进凋亡 |
| 第五章 讨论与展望 |
| 第六章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果及荣誉 |
| 综述 MMP-9和TIMP-1在劲动脉粥样硬化过程中的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 模式生物果蝇概述 |
| 1.1.1 果蝇发育过程简介 |
| 1.1.2 果蝇在肿瘤学研究中的优势 |
| 1.1.2.1 果蝇和人类在信号传导通路上具有保守性 |
| 1.1.2.2 果蝇相对缺乏基因冗余 |
| 1.1.2.3 果蝇在肿瘤学研究中的应用前景 |
| 1.2 果蝇中常用的研究方法 |
| 1.2.1 特异性组织表达系统 |
| 1.2.2 RNA干涉技术 |
| 1.2.3 嵌合体克隆技术 |
| 1.3 转录因子Apt研究进展 |
| 1.3.1 Apt概述 |
| 1.3.2 Apt在果蝇翅发育中的功能 |
| 1.3.3 Apt在卵室发育中的功能 |
| 1.3.4 Apt在眼睛发育中的功能 |
| 1.3.5 Apt在心脏发育中的功能 |
| 1.3.6 Apt的其它功能 |
| 1.4 JNK信号通路的研究进展 |
| 1.4.1 JNK信号通路简介 |
| 1.4.2 应激反应中JNK信号通路的相关功能 |
| 1.4.2.1 对细胞自我保护的影响 |
| 1.4.2.2 对细胞凋亡的影响 |
| 1.4.2.3 对个体寿命的影响 |
| 1.4.3 JNK信号通路的负调控 |
| 1.4.4 JNK信号通路与恶性肿瘤的侵袭转移 |
| 1.5 恶性肿瘤转移研究进展 |
| 1.6 果蝇中的肿瘤转移研究模型 |
| 1.6.1 果蝇成虫中的肿瘤转移模型 |
| 1.6.2 果蝇幼虫中的肿瘤转移模型 |
| 1.6.3 果蝇翅原基中的肿瘤转移模型 |
| 1.7 本课题研究的目的和意义 |
| 1.8 本课题的研究思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 所用果蝇品系及培养条件 |
| 2.1.2 抗体及荧光染料 |
| 2.1.3 试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 信息检索分析网站及数据处理软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验过程中所用引物 |
| 2.2.2 相关试剂的配置 |
| 2.2.3 DNA片段扩增及载体的构建 |
| 2.2.3.1 DNA片段的扩增 |
| 2.2.3.2 DNA片段的酶切 |
| 2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 2.2.3.4 胶回收 |
| 2.2.3.5 DNA片段的酶连 |
| 2.2.3.6 载体转化及扩增 |
| 2.2.3.7 小量提取质粒 |
| 2.2.3.8 大量提取质粒 |
| 2.2.3.9 同源重组及定点突变 |
| 2.2.4 果蝇翅原基解剖及抗体染色 |
| 2.2.5 果蝇S2 细胞实验相关操作 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因分析实验 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.7.1 果蝇翅原基总RNA的提取 |
| 2.2.7.2 RNA质量的测定及逆转录合成cDNA |
| 2.2.7.3 实时荧光定量PCR体系及反应条件 |
| 2.2.8 Western blot实验 |
| 2.2.8.1 果蝇组织蛋白的提取 |
| 2.2.8.2 SDS凝胶电泳 |
| 2.2.8.3 转膜 |
| 2.2.9 鼠抗Msn多克隆抗体的制备 |
| 2.2.9.1 蛋白的原核表达 |
| 2.2.9.2 SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.9.3 小鼠免疫 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 敲降apt诱导细胞发生迁移 |
| 3.2 Apt抑制肿瘤细胞迁移 |
| 3.3 Apt抑制JNK信号通路的表达 |
| 3.3.1 Apt与 JNK信号通路协同调控背板发育 |
| 3.3.2 敲降apt激活puc-Lac Z的表达 |
| 3.3.3 敲降apt激活mmp1 的表达 |
| 3.3.4 敲降apt使磷酸化的JNK水平升高 |
| 3.4 Apt通过JNK信号通路调控细胞迁移 |
| 3.5 Apt在 JNK信号通路中的作用位置 |
| 3.6 Msn负调控JNK信号通路 |
| 3.7 Msn抗体检验 |
| 3.8 Apt直接正调控msn的表达 |
| 3.9 Apt介导的细胞迁移与细胞凋亡的关系 |
| 3.10 Apt影响细胞迁移具有进化保守性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）Notch受体家族与心肌重构的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Notch受体家族概述 |
| 2 Notch受体家族与心肌重构 |
| 2.1 Notch1受体与心肌重构 |
| 2.2 Notch2受体与心肌重构 |
| 2.3 Notch3受体与心肌重构 |
| 2.4 Notch4受体与心肌重构 |
| 3 小 结 |
（6）早期左旋甲状腺素干预改善妊娠期亚临床甲减子代心脏发育的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LT_4治疗妊娠期亚临床甲减对后代心脏影响的临床研究 |
| 1前言 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 临床资料 |
| 2.2 纳入及排除标准 |
| 2.2.1 妊娠期亚临床甲减诊断标准 |
| 2.2.2 妊娠期亚临床甲减患者入组标准 |
| 2.2.3 排除标准 |
| 2.3左旋甲状腺素LT_4干预治疗方法 |
| 2.4 观察指标 |
| 2.5 甲状腺功能检查方法 |
| 2.6 血糖、血脂及血清离子水平检测方法 |
| 2.7 凝血指标检测方法 |
| 2.8 胎儿超声心动图 |
| 2.9 妊娠结局采集 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 基础甲状腺功能比较 |
| 3.3 LT_4治疗SCH对血清TSH动态变化水平的影响 |
| 3.4 LT_4治疗SCH对孕妇妊娠32 周空腹血糖水平的影响 |
| 3.5 LT_4治疗SCH对孕妇妊娠32 周血脂水平的影响 |
| 3.6 LT_4治疗SCH孕妇妊娠32 周血清离子情况 |
| 3.7 LT_4治疗SCH孕妇妊娠32 周凝血指标情况 |
| 3.8 LT_4治疗SCH胎儿超声心动图检查结果 |
| 3.9 LT_4治疗SCH对母婴妊娠结局的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 LT_4干预治疗对妊娠期亚临床甲减孕妇甲状腺功能指标变化的影响 |
| 4.2 LT_4干预治疗对妊娠期亚临床甲减孕妇血糖、血脂水平的影响 |
| 4.3 LT_4治疗SCH对胎儿心脏的影响 |
| 5 结论 |
| 第二部分:早期LT_4干预通过激活BMP4/Smad4 信号通路改善亚临床甲状腺功能减退妊娠大鼠子代心脏发育的研究 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物及分组 |
| 2.2.2 SCH孕鼠模型构建 |
| 2.2.3 血清TT_4 和TSH含量测定 |
| 2.2.4 ATP活性检测 |
| 2.2.5 实时荧光定量(Real-time PCR)检测 |
| 2.2.6 病理技术 |
| 2.2.7 蛋白免疫印迹(Western blot)检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LT_4对亚临床甲减孕鼠血清TSH和 TT4表达的影响 |
| 3.2 LT_4改善亚临床甲减孕鼠子代的心脏发育 |
| 3.3 LT_4改善亚临床甲减孕鼠子代的心肌代谢功能 |
| 3.4 LT_4减轻亚临床甲减孕鼠子代心肌组织损伤 |
| 3.5 LT_4增加亚临床甲减孕鼠子代心肌组织BMP4/Smad4 mRNA表达 |
| 3.6 LT_4促进亚临床甲减孕鼠子代心肌组织BMP4/Smad4 信号通路蛋白的表达 |
| 3.7 免疫组化检测亚临床甲减孕鼠子代心肌组织BMP4/Smad4 信号通路蛋白表达及定位 |
| 3.8 LT_4促进亚临床甲减孕鼠子代心肌发育相关基因mRNA的表达 |
| 3.9 LT_4促进亚临床甲减孕鼠子代心肌发育相关蛋白的表达 |
| 3.10 免疫组化检测亚临床甲减孕鼠子代心肌发育相关蛋白表达及定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本研究课题的背景及临床价值 |
| 4.2 LT_4干预可改善SCH孕鼠子代的心脏发育 |
| 4.3 LT_4干预SCH孕鼠用药时机对其子代心脏发育的影响 |
| 4.4 LT_4干预SCH孕鼠影响其子代心脏发育的机制 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 妊娠期甲状腺功能减退与胎儿心脏发育 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）长链非编码RNA-AABR07066529.3在脓毒性休克大鼠心肌损伤中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:脓毒性休克大鼠心肌损伤模型中炎症、细胞凋亡和细胞焦亡情况及lncRNA-AABR07066529.3的验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验对象及模型构建 |
| 2.2.2 动物标本采集 |
| 2.2.3 组织包埋与HE染色 |
| 2.2.4 Western Blot |
| 2.2.5 Real-time PCR |
| 2.2.6 流式 |
| 2.2.6 电镜 |
| 2.2.7 Tunel染色 |
| 2.2.8 Luminex检测 |
| 2.2.9 Northern Blot |
| 2.2.10 RACE实验 |
| 2.2.11 FISH染色 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 脓毒症心肌损伤动物模型建立 |
| 3.1.1 MAP与心功能 |
| 3.1.2 病理结果 |
| 3.2 脓毒症心肌损伤细胞模型建立 |
| 3.2.1 CCK-8方法确定LPS干预H9c2的最佳时间和浓度 |
| 3.2.2 LPS干预H9c2心肌细胞后细胞形态学变化 |
| 3.3 脓毒症心肌损伤模型中存在炎症损伤 |
| 3.4 脓毒症心肌损伤模型中存在细胞凋亡损伤 |
| 3.5 脓毒症心肌损伤模型中存在细胞焦亡损伤 |
| 3.6 lncRNA-AABR07066529.3在脓毒性休克心肌损伤模型中表达显着升高 |
| 3.7 lncRNA-AABR07066529.3在H9c2心肌细胞中的定位与全长 |
| 3.7.1 lncRNA-AABR07066529.3的定位 |
| 3.7.2 lncRNA-AABR07066529.3的全长 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:lncRNA-AABR07066529.3对LPS诱导的H9c2心肌细胞的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 H9c2大鼠心肌细胞转染及构建稳定转染细胞株 |
| 2.2.3 PCR |
| 2.2.4 Western Blot |
| 2.2.5 流式 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PCR验证慢病毒敲减lncRNA-AABR07066529.3 |
| 3.2 敲减lncRNA-AABR07066529.3后LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症增加 |
| 3.3 敲减lncRNA-AABR07066529.3后LPS诱导的H9c2心肌细胞凋亡增加 |
| 3.4 敲减lncRNA-AABR07066529.3后LPS诱导的H9c2心肌细胞焦亡增加 |
| 3.5 腺病毒过表达lncRNA-AABR07066529.3后LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症、细胞凋亡与细胞焦亡减少 |
| 3.5.1 腺病毒转染H9c2心肌细胞 |
| 3.5.2 过表达lncRNA-AABR07066529.3后LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症TNF-α与IL-6表达减少 |
| 3.5.3 过表达lncRNA-AABR07066529.3后LPS诱导的H9c2心肌细胞凋亡减少 |
| 3.5.4 过表达lncRNA-AABR07066529.3后LPS诱导的H9c2心肌细胞焦亡减少 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:lncRNA-AABR07066529.3在脓毒症心肌损伤中发挥作用的可能机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞操作 |
| 2.2.3Western blot |
| 2.2.4 Real-time PCR |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MyD88在脓毒症心肌损伤中的表达情况 |
| 3.2 在H9c2心肌细胞中,检测MyD88的敲减效率 |
| 3.3 MyD88敲减后,LPS诱导的H9c2心肌细胞损伤减轻 |
| 3.3.1 MyD88敲减后,LPS诱导的H9c2心肌细胞中炎症因子TNF-α与IL-6表达降低 |
| 3.3.2 MyD88敲减后,LPS诱导的H9c2心肌细胞中细胞凋亡减少 |
| 3.3.3 MyD88敲减后,LPS诱导的H9c2心肌细胞中细胞焦亡减少 |
| 3.4 lncRNA-AABR07066529.3可以负向调控MyD88的表达 |
| 3.4.1 在H9c2细胞中,lncRNA-AABR07066529.3敲减后,MyD88表达增加 |
| 3.4.2 在H9c2细胞中,lncRNA-AABR07066529.3过表达后,MyD88表达减少 |
| 3.5 在LPS诱导的H9c2心肌细胞中,同时敲lncRNA-AABR07066529.3和MyD88可以减轻单独敲减lncRNA-AABR07066529.3引起的细胞损伤增加 |
| 3.5.1 同时敲减lncRNA-AABR07066529.3和MyD88对LPS诱导的H9c2心肌细胞中炎症的影响 |
| 3.5.2 同时敲减lncRNA-AABR07066529.3和MyD88对LPS诱导的H9c2心肌细胞中细胞凋亡的影响 |
| 3.5.3 同时敲减lncRNA-AABR07066529.3和MyD88对LPS诱导的H9c2心肌细胞中细胞焦亡的影响 |
| 3.5.4 lncRNA-AABR07066529.3可能结合蛋白分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNAs在心脏发育及心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）转录因子NKX2-5在心脏发育中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 转录因子NKX2-5的分子结构与生物学功能 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）线粒体分裂蛋白Drp1在小鼠胚胎心脏发育中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词汇对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 线粒体分裂相关蛋白简介 |
| 1.2 心脏发育以及心脏细胞中线粒体的成熟 |
| 1.3 线粒体生物激增在小鼠心脏发育中的作用 |
| 1.4 活性氧(ROS)在小鼠心脏发育中的作用 |
| 1.5 细胞凋亡在小鼠心脏发育中的作用 |
| 1.6 线粒体融合蛋白在小鼠心脏发育中的作用 |
| 1.7 线粒体分裂蛋白在小鼠心脏发育中的作用 |
| 1.8 线粒体分裂蛋白在人类疾病中的作用 |
| 第2章 胚胎时期条件性敲除Drp1 对小鼠心脏发育的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 转基因小鼠 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验所需溶液配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 小鼠胚胎基因型鉴定 |
| 2.2.2 小鼠胚胎或心脏组织石蜡切片制备 |
| 2.2.3 制作心脏组织冰冻切片 |
| 2.2.4 心脏组织石蜡切片HE染色 |
| 2.2.5 胚胎或心脏组织石蜡切片免疫荧光染色 |
| 2.2.6 用Western blot检测N-Cadherin蛋白的表达 |
| 2.2.7 数据统计及图片制作 |
| 第3章 小鼠胚胎心脏中敲除Drp1后对心肌细胞中线粒体的形态及功能的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 准备转基因小鼠 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验所需溶液配制 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 基因型确定(同2.2.1) |
| 3.2.2 E14.5 小鼠胚胎心脏原代培养 |
| 3.2.3 心肌细胞免疫荧光染色 |
| 3.2.4 E10.5 胚胎免疫荧光染色观察线粒体在心肌细胞中分布 |
| 3.2.5 E11.5和E14.5 小鼠胚胎心肌细胞中线粒体电镜观察 |
| 3.2.6 E14.5 小鼠胚胎心脏新鲜组织的冰冻切片制作 |
| 3.2.7 线粒体呼吸链复合体电子传递氧化过程与ATP合成中ADP的磷酸化过程耦合的测定 |
| 3.2.8 心肌细胞中核DNA和线粒体DNA的测定 |
| 3.2.9 结果数据统计及图片制作 |
| 第4章 采用单细胞RNA测序法探讨Drp1 缺失胚胎心脏心肌细胞中基因的表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 准备转基因小鼠 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 基因型确定(同2.2-1) |
| 4.2.2 心脏细胞的分离 |
| 4.2.3 单细胞RNA测序 |
| 4.2.4 Qrt-PCR在 E13.0 心肌细胞中确认单细胞RNA测序的结果 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因的筛选与验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 组织标本 |
| 2.1.3 芯片 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 生物学信息分析软件 |
| 2.3 生物信息学数据库 |
| 2.3.1 Gene Ontology(GO)数据库 |
| 2.3.2 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 标本收集 |
| 2.4.3 细胞转染 |
| 2.4.4 提取细胞总RNA |
| 2.4.5 RNA反转录与c DNA合成 |
| 2.4.6 RT-PCR检测m RNA表达水平 |
| 2.4.7 芯片杂交及数据处理 |
| 2.4.8 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.4.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA质检 |
| 3.2 TBX1 siRNA转染效率评价 |
| 3.3 芯片杂交及芯片质量评价 |
| 3.3.1 芯片杂交扫描 |
| 3.3.2 芯片原始数据提取 |
| 3.3.3 主成分分析(PCA) |
| 3.3.4 通过箱线图查看数据的分布状况 |
| 3.3.5 绘制散点图评估芯片数据集中趋势 |
| 3.4 芯片数据差异基因筛选 |
| 3.5 差异表达基因GO富集分析 |
| 3.5.1 上调差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.5.2 下调差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.6 差异表达基因KEGG数据库Pathway分析 |
| 3.7 TBX3基因在CHD心肌组织中表达情况 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 :TBX1通过TBX3/P21途径参与大鼠胚胎心肌细胞H9C2 细胞生物学功能调控的机制研究 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 细胞系 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要配置试剂及配置方法 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养与转染 |
| 6.2.2 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 6.2.3 CCK-8检测细胞活性 |
| 6.2.4 细胞周期检测 |
| 6.2.5 细胞凋亡检测 |
| 6.2.6 细胞免疫荧光染色 |
| 6.2.7 Hoechst33342 染色 |
| 6.2.8 线粒体膜电位实验 |
| 6.2.9 线粒体ROS检测实验 |
| 6.2.10 ATP_(ase)活性检测 |
| 6.2.11 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 6.2.12 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 6.2.13 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 沉默和过表达TBX3基因大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞系建立 |
| 7.1.1 沉默TBX3基因H9C2细胞系建立 |
| 7.1.2 过表达TBX3基因H9C2细胞系建立 |
| 7.2 TBX3沉默抑制H9C2细胞增殖 |
| 7.3 TBX3 沉默使H9C2 细胞细胞周期阻滞于G1期 |
| 7.4 TBX3沉默诱导H9C2细胞凋亡 |
| 7.5 TBX3沉默诱导H9C2细胞线粒体功能障碍 |
| 7.6 P21是TBX3的直接靶基因 |
| 7.7 TBX3基因负向调控P21对H9C2细胞增殖活性的影响 |
| 8 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、心脏发育中的细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]心脏发育和疾病的表观遗传调控机制[J]. 袁婺洲,张亚楠. 生命科学研究, 2022(01)
- [2]miRNA-129-1-3p在芦丁减轻吡柔比星所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌药效中的介导作用[D]. 李琪. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于生物信息学分析LncRNA SNHG5通过mir-205-5p/SMAD4在腹主动脉瘤中改变血管平滑肌细胞的功能[D]. 聂瀚. 南昌大学, 2021(01)
- [4]转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究[D]. 张文硕. 山东农业大学, 2021(01)
- [5]Notch受体家族与心肌重构的研究进展[J]. 袁雨培,唐其柱. 疑难病杂志, 2021(04)
- [6]早期左旋甲状腺素干预改善妊娠期亚临床甲减子代心脏发育的研究[D]. 薛丹. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]长链非编码RNA-AABR07066529.3在脓毒性休克大鼠心肌损伤中的作用机制研究[D]. 文日. 中国医科大学, 2021
- [8]转录因子NKX2-5在心脏发育中的作用研究[D]. 王宏书. 昆明医科大学, 2020(02)
- [9]线粒体分裂蛋白Drp1在小鼠胚胎心脏发育中的作用[D]. 赵乾聪. 吉林大学, 2020(08)
- [10]TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究[D]. 曹美玲. 中国医科大学, 2020