一、利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒（论文文献综述）
冀文婕[1]（2016）在《LSV 16kDa/TGB1抗血清制备及RNA沉默抑制子的鉴定》文中进行了进一步梳理百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）是香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）中的一种,能够严重危害百合种球质量和鲜切花品质,是侵染百合的三大病毒之一。病毒为单链正义RNA,含有6个开放阅读框（ORF）,编码4个蛋白,依5’至3’分别编码：RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）,三基因连锁运动蛋白（TGB1-3）,外壳蛋白（CP）和未知功能蛋白（16kDa）。本研究以感染LSV的百合叶片为试材,通过RT-PCR克隆LSV基因16kDa。将该基因连接至原核表达载体pET-28a（+）,重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）, IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE及质谱分析,证明得到高效表达的16kDa融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在。经镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白。将纯化蛋白16kDa和TGB1分别作为抗原免疫小鼠,制备16kDa和TGB1蛋白抗血清,间接ELISA检测抗血清效价较高。通过Western blot分析,制备的特异性抗血清能与16kDa, TGB1以及百合叶片总蛋白反应,均出现目的杂交条带。制备的抗血清可用于病毒检测、蛋白质印迹、免疫组织化学等方面的研究。为了验证LSV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物RNA沉默,以16kDa和TGBl为研究对象,分别构建TGB1、16kDa和16kDa△的pMDTM18-T载体,测序正确后连至双元表达载体PTF101.1,将获得的重组质粒通过农杆菌共浸润到转GFP本氏烟16c。将TGB1、16kDa分别构建至双元表达载体pGR107,侵染普通本氏烟。结果表明：16kDa蛋白能抑制由GFP介导的局部沉默和系统沉默,其抑制作用较弱；能逆转系统沉默；不能抑制由dsRNA引起的局部沉默；TGB1蛋白无抑制沉默功能。实时定量PCR和Western blot也证明了上述结果,即16kDa是LSV编码的RNA沉默抑制子。另外,TGB1和16kDa均不能加重PVX病毒的症状,证明有些抑制子不会与PVX病毒协同作用。将含有PTT101-16kDa/TGB1质粒的农杆菌分别侵染烟草和百合,提取烟草和百合线粒体的总蛋白,Western blot检测证明16kDa和TGB1都位于线粒体上。免疫胶体金电镜观察发现16kDa和TGB1金颗粒在叶绿体中,但含量极少。以上结果表明：16kDa和TGB1主要作用于细胞线粒体中,对叶绿体影响有限。综上所述,本研究通过LSV编码蛋白TGB1和16kDa功能分析,初步判定16kDa蛋白具有RNA沉默抑制子功能。16kDa和TGB1主要定位在细胞线粒体上。因此可以推断,受百合无症病毒侵染植株外部症状不明显,无致病性,可能16kDa和TGB1蛋白主要受体不是叶绿体,而是线粒体。
源朝政[2]（2014）在《卷丹百合病毒检测及离体培养研究》文中研究说明卷丹百合（Lilium lancifolium）作为一种药用、食用及观赏为一体的百合,在市场上拥有很大的需求量,但由于培育周期长,又易受到病毒、类病毒的危害,使其产量和质量均不能满足市场需要。本研究以卷丹百合作为研究对象,通过田间症状观察和采用血清学、分子生物学两种不同检测方法对试验材料所携带的病毒进行检测；并通过离体组织培养技术,构建起一个有效的快速繁殖体系。主要研究内容和结果如下：1通过田间调查,发现湖南省百合普遍存在病毒侵染的情况,且表现出不同的发病症状,主要有：植株低矮、叶片短小、叶片黄绿交错和叶片畸形、丛簇矮化等类型,其中叶片短小和叶片黄绿交错发生率最高,达到51%和48%,其他情况相对较少。2DAS-ELISA检测结果表明卷丹百合主要受两种病毒侵染：黄瓜花叶病毒（CMV）和百合无症病毒（LSV）,侵染率分别为75%和58%,并且存在两种病毒复合侵染的规象。通过单重RT-PCR和双重RT-PCR两种方法,鉴定了自然条件下的病毒侵染情况,而且形成了一个同时检测多种病毒的方法。3建立了卷丹百合品种的组织培养体系。以MS作为百合组织培养的基本培养基,附加不同类型和浓度的植物生长调节剂,研究得出各成分最适组分为：鳞片最佳诱导培养基为：MS+0.6mg/L6-BA+0.3mg/L NAA；丛芽增殖的最佳培养基为：MS+0.8mg/L6-BA+0.4mg/L NAA；生根诱导的佳培养基为：1/2MS+0.2mg/L NAA.4系统研究了茎尖培养、茎尖培养结合热处理、茎尖培养结合病毒唑三种脱除CMV,LSV病毒的方法,并对三种方法得到的结果进行了比较和分析,最终认为茎尖培养结合热处理的方法脱毒率最高,且保证了较高的成活率。
余澍琼,陈先锋,张吉红,于翠,张慧丽,闻伟刚[3]（2014）在《百合无症病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立》文中认为百合无症病毒（Lily symptomless virus,LSV）是侵染百合科植物的主要病毒之一。根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因（coat protein,CP）的保守序列,设计特异性引物与荧光探针,建立了LSV的实时荧光RTPCR检测方法。利用该方法检测LSV的2个阳性样品,均能够得到典型扩增曲线,而在百合斑驳病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等其他病毒阳性样品中没有典型的扩增曲线,表明了该方法的特异性。与普通RTPCR法相比,此方法灵敏度提高10倍。应用该方法,2012年6月至今,宁波出入境检验检疫局从荷兰进境的67批百合种球样品中检出53批百合无症病毒阳性,检出率为93%。
王贤,田保华,王永勤,熊敏,卫尊征,王月华[4]（2011）在《北京地区百合无症病毒CP基因的克隆与分析》文中研究指明以感染百合无症病毒（LSV）的百合叶片为材料,提取总RNA为模板,通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出856bp大小的LSV CP基因片段。经Blast比对发现,该基因片段与Genbank上发表的LSV CP基因序列（DQ294655.1）同源性为97.31%。由该序列推导出的氨基酸序列与其相似度为98.6%,仅存在某些氨基酸的差异。经过聚类分析表明,该CP基因的氨基酸序列与厦门和兰州分离的病毒遗传距离较近,而与海宁和广州分离的病毒遗传距离较远。
李孙洋[5]（2010）在《百合无症病毒检测方法研究进展》文中指出综述了百合无症病毒病原学、病害流行学和分子生物学的研究进展;系统总结了目前常用的百合无症病毒快速检测方法和技术——免疫电镜法、酶联免疫吸附法、核酸分子杂交技术、反转录PCR技术等。
沈春修[6]（2010）在《分子生物学技术在百合病毒病害检测中的应用》文中研究表明对百合病毒的分子生物学检测技术作了综合评述,主要有RT-PCR检测技术、核酸杂交技术、基因芯片技术等。目前,常用的分子生物学技术以RT-PCR为主,而基因芯片检测技术是近几年发展起来高效的检测手段并在植物病毒检测上有广泛的应用前景。
李焕改[7]（2010）在《百合主要病毒基因组的克隆及感病生理研究》文中认为百合病毒病导致切花品质低下、种球退化严重,给百合种植业带来严重的危害,目前已成为急待解决的世界性难题。本研究通过设计交叉重叠引物,获得LSV和LMoV全基因组序列,利用生物信息学手段对病毒序列进行分析；对CMV和LMoV侵染百合后寄主植物的生理生化指标变化进行测定。其研究结果对了解该病毒的分子特征、致病机理以及抗病毒分子育种具有重要的理论参考价值。以东方百合‘卡萨布兰卡’为试材,利用13对重叠引物扩增出LSV大连分离物（LSV-DL）全基因组序列,全长8,394 bp,编码6个蛋白。LSV各分离物序列具有高度相似性,且LSV-DL与印度和荷兰分离物的亲缘关系最近。依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）为LSV复制酶,RdRp大连分离物（RdRp-DL）基因由5847个核苷酸组成,序列具有高度保守性,与印度和荷兰分离物的亲缘关系最近；与其他麝香石竹潜隐病毒属成员的进化分析显示其与PLV和KLV具有较近的亲缘关系。疏水性分析发现RdRp-DL具有疏水的N端和亲水的C端。RdRp-DL具有三个卷曲螺旋结构,四个保守结构域,将保守结构域蛋白序列提交I-TASSER服务器,获得了四个三级结构模型。以铁炮百合‘白天堂’为试材,得到LMoV分离物,LMoV基因组由长度为9,648 bp的线状单链正义RNA组成,包括一个poly（A）尾巴,编码一个由3,096个氨基酸组成的分子量为351.0 kDa的多聚蛋白。LMoV隶属于Potyvirus属一个较大的分支,在进化关系上与PVV、BYMV和ClYVV最近。测定CMV和LMoV侵染百合后叶绿素含量、SOD、POD、PPO、以及PAL活性,明确了该病毒侵染百合生理生化变化规律。研究结果表明：CMV和LMoV侵染百合后,叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素含量与健康对照植株相比不同程度的减少（CMV分别是10.4%、5.9%和9.0%,LMoV分别是15.8%、11.6%和13.9%）,影响植株的光合作用。CMV和LMoV侵染百合后,抗氧化酶系统呈现规律性反应,即SOD活性比健康对照明显上升,分别增加了17.8%和9.7%；POD活性增长了23.4%和7.3%；PPO活性高峰值和低估值的比值为1.279和1.322。CMV和LMoV侵染后,代谢酶PAL活性分别增长了23.0%和14.8%,原有正常代谢系统发生紊乱,次生代谢系统作用增强。
刘博[8]（2009）在《百合、水仙病毒分子检测及脱毒技术研究》文中研究表明百合、水仙是重要的球根花卉。但是,极易受到病毒病危害,造成种性衰退和商品生产价值丧失。其中,百合百合无症病毒Lily symptomless virus（LSV）发生较为普遍。LSV一般不会造成明显症状,但与黄瓜花叶病毒Cucumber mosais viru（sCMV）或百合斑驳病毒Lily mottle virus（LMoV）复合侵染时,可造成脉明、花叶、畸形、坏死斑以及整株矮化等症状。建立快速、准确的病毒检测和高效的脱毒体系是百合、水仙恢复种性和规模化种球生产的关键技术问题。本研究在我试验室已经建立的同时检测百合三种常见病毒的多重RT-PCR检测方法和剥茎尖结合病毒抑制剂脱毒基础上,进一步开展了百合、水仙的病毒检测和百合无症病毒（LSV）脱毒技术的研究。取得了以下主要结果:1.本研究采用RT-PCR技术从荷兰进口的喇叭水仙‘pink charm’中检测到百合斑驳病毒（LMoV）。将该序列与GenBank上已登录的病毒基因序列作BLAST。分析发现该序列与6个百合斑驳病毒多聚蛋白基因序列AJ748256;AJ564636;AB053256;AF531458;AJ564637;AJ748257相似性均在98%以上,与其他9个百合斑驳病毒基因序列AJ874695;AJ310203;EF158108;AB054886;AM048875;AJ874696; AJ879511; S60810; AY464944相似性也在90%以上,据此判定待测水仙中确带有百合斑驳病毒。该病毒是危害百合属和郁金香属作物的重要病毒病原,在水仙上未见报道。2.水仙黄条病毒（Narcissus yellow stripe virus, NYSV）属马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒,被普遍认为是专一侵染水仙的病原体,其典型病症是沿叶脉产生黄色条斑,病情严重的植株瘦弱、矮化、鳞茎小。目前还未见有对水仙黄条病毒快速检测的报道,本研究用RT-PCR技术快速有效的从漳州水仙上检测到NYSV,为保护水仙品种资源,实现可持续发展提供技术支持,对病毒病的防治有重要意义。3.本试验侧重以探索更加简单方便快捷有效并且能大大降低成本,并应用于生产的百合脱毒方法,克服常规“热处理+茎尖培养”脱毒方法造成的植株成活率低的问题。针对东方百合‘Tiber’带毒（LSV）商品球,采用剥大茎尖（约2mm）结合高温变温（白天38℃-10h,夜间32℃-14h）全暗培养,处理持续一个月后,脱除LSV率达100%。该方法应用于百合脱毒在国内外尚未见报道。4.水杨酸对病毒有一定的抑制作用,但未能脱去病毒,有待于进一步研究。
刘毅[9]（2009）在《侵染百合的南芥菜花叶病毒的分子检测及鉴定》文中进行了进一步梳理南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus ArMV）异名（Raspberry yellow dwarf virus, Rhabarber mosaic virus, Rhubarb mosaic virus）,属于豇豆花叶病毒科（Comoviridae）线虫传多面体病毒属（Nepovirus）成员,是我国二类检疫性植物病毒。百合是近年来发现的南芥菜花叶病毒的新寄主,并且病毒扩散呈上升趋势。因此建立敏感性高、特异性强,快速、安全和可靠的检测方法对于南芥菜花叶病毒的控制和出入境检验检疫至关重要。本研究利用分子生物学的方法,对来自于国外进口及云南省昆明市百合上的ArMV外壳蛋白基因片段进行了克隆测序和序列分析,同时建立了南芥菜花叶病毒的血清学ELISA、RT-PCR、巢式RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR核酸检测体系。对4种检测方法的灵敏度、特异性、安全性以及检测成本进行了比较,其主要内容和结果为：从对国外进口和昆明地区的百合不同品种ArMV的调查结果来看,ArMV侵染百合后,不显示症状。利用DAS-ELISA技术对百合植株不同部位病毒分布情况进行检测。从试验结果来看,病毒在种球、下部叶片和中部叶片上浓度最高,其次为顶部叶片、最低的是茎杆和花瓣。因此,春季是最佳检测病毒的时间,种球、下部叶片和中部叶片是最好的检测材料。此外,DAS-ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、成本较低且简便快速,有广泛应用价值。本文利用特异性引物建立了常规和巢式RT-PCR检测ArMV方法,扩增出了993bp和276bp特异性条带,这两种方法均能稳定、高效、快速地检测出ArMV的存在。通过特异性和敏感性试验显示：常规RT-PCR能对ArMV RNA进行10倍系列稀释后,在1.83×104个拷贝时检测到阳性样品,巢式RT-PCR则能在在0.91×103个拷贝时检测到阳性样品,说明巢式RT-PCR方法具有更高的敏感性。此外,巢式PCR具有更高的特异性。根据基因库中的ArMV高度保守序列,设计合成引物和TaqMan探针,经各反应条件的优化,建立了实时荧光定量PCR技术。对样品进行了特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,实时荧光TaqMan RT-PCR可检测到每个反应相当于1×102个拷贝数的病毒RNA,制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系,相关系数为0.993。与常规的RT-PCR和巢式RT-PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点,能够对样品中微量ArMV进行准确检测,是一种检测ArMV的良好方法。综上所述,本研究成功克隆了ArMV的CP基因片段,并建立了ArMV的血清学ELISA、常规及巢式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测体系。这些检测体系的构建对于ArMV的预防控制有着重要的现实意义,为我国南芥菜花叶病毒的检测和植物检疫提供了坚实的技术支撑。
韩丽娟[10]（2008）在《百合上李属坏死环斑病毒和百合无症病毒的研究》文中研究说明百合（Lilium L.）是集观赏、食用、药用于一身的重要经济作物,现已成为国际上重要切花观赏花卉之一。近年来,随着我国观赏百合种植面积的迅速增加,从国外引进种球的数量和批次迅速增长,百合病毒病开始在各百合种植区发生流行。本文以发生在百合上的两种重要的病毒,百合无症病毒（Lily symptomless virus,LSV）和李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）为研究对象,利用分子生物学技术,对上述两种检疫性病毒基因组的分子特征进行了比较研究,分析不同地区LSV的来源、分布及相关性,建立了多重PCR、RNA点杂交和RNA玻片杂交等适用于进境口岸百合种球病毒检疫工作的快速检测方法。研究获得的主要结果和结论如下:1、揭示了PNRSV外壳蛋白基因序列与其病害症状类型间的相关性,并利用该分子特征建立起的多重RT-PCR检测方法,用于PNRSV轻型和重型两种不同的株系的初诊和快速检测。根据GenBank中已报道的PNRSV外壳蛋白的基因序列,分析不同致病型株系间核酸水平上的差异,设计了两对特异性引物,并通过扩增条件的优化,建立了可区分PNRSV轻型和重型株系的多重PCR检测方法。该方法对已知的待测样品进行检测,在同一反应体系中扩增出了450bp和170bp两种大小的条带,可区分PNRSV轻型和重型两种不同的株系。揭示了PNRSV外壳蛋白基因序列与其病害症状类型间的具有相关性并可用于不同致病型株系的快速诊断和检测。2、在分子水平上鉴定了百合上发生的PNRSV,证实PNRSV可通过百合种球带毒传播。对待测荷兰进口的百合种球进行随机抽样,在温室内种植并观察,长出叶片后,用RNA Extraction Kit （Sangon, China）从幼嫩的叶组织中提取核酸。用根据PNRSV外壳蛋白基因序列设计的特异性引物进行RT-PCR扩增,电泳PCR产物。从待测的两个样品（P-299和P-503）中获得了450bp的目标片段。低熔点胶回收PCR产物,经纯化后克隆至pGEM-TG1载体,测序后进行序列比对分析。将所获得的上述两个分离物的核酸序列与GenBank中已报道的27个PNRSV分离物的CP基因序列进行比对,结果表明,P-299与P-503 CP基因序列相似性为99.8%。P-299和P-503 CP基因序列与27个已报道的分离物CP基因序列的相似性为84.5%～99.1%。据此可知扩增片段为PNRSV的部分CP基因序列,在分子水平上鉴定了百合上发生的PNRSV。将上述两个分离株的CP基因序列登陆GenBank进行了注册,P-299的登陆号为DQ992416;P-503的登陆号为DQ992417。用插入了P-299分离株的部份CP基因互补序列的质粒P-299B做模板进行PCR,回收PCR产物,制备32P标记探针,对来自浙江丽水县田间的野生百合样品进行RNA斑点杂交检测,在24个百合样品中有5个杂交结果为阳性,证实了PNRSV在自然条件下可通过百合种球带毒传播,说明了百合是PNRSV的一个新寄主。3、本研究采用RT-PCR法从来自国内不同地区进口百合次生代样品上获得了7个含有LSV基因组3′端部分序列的分离株。经过测序,应用DNAStar软件比较了其与已报道的12个LSV分离株的CP基因和16kD基因的同源性。序列分析结果表明:7个分离株蛋白外壳部分基因序列和16kD蛋白基因序列的相似性分别为87.4%100%和97.9%100%;在氨基酸水平上的相似性分别为95.9%100%和95.7%100%。系统发育树的比较显示,本研究获得的7个LSV分离株间在系统中有较近的进化关系,但这些分离株间没有明显的地域相关性,也没有发现与块根频繁运输相关的新亚群。4、建立了RNA玻片杂交检测LSV的新方法。使用该方法对国内不同地区的进口和野生百合上LSV的发生情况进行了检测,结果表明LSV是存在中国境内百合上最为普通的病毒之一。
二、利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒（论文提纲范文）
（1）LSV 16kDa/TGB1抗血清制备及RNA沉默抑制子的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 百合及病毒防治 |
| 1.1.1 百合概述 |
| 1.1.2 百合病毒的危害 |
| 1.1.3 百合病毒的检测 |
| 1.1.4 百合病毒的防治 |
| 1.2 百合无症病毒概述 |
| 1.2.1 百合无症病毒编码蛋白结构及功能 |
| 1.2.2 16kDa,TGB1蛋白研究进展 |
| 1.3 RNA沉默抑制子概述 |
| 1.3.1 植物病毒沉默抑制子的发现 |
| 1.3.2 沉默抑制子作用机制 |
| 1.3.3 沉默抑制子的鉴定法 |
| 1.3.4 沉默抑制子研究进展 |
| 1.3.5 细胞定位 |
| 1.4 研究目的、意义及内容 |
| 1.4.1 研究目的、意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 百合无症病毒16kDa蛋白原核表达及纯化 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 原核表达载体pET28a-16kDa的构建 |
| 2.3.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 |
| 2.3.3 融合蛋白的Western blot检测 |
| 2.3.4 融合蛋白16kDa质谱分析 |
| 2.3.5 融合蛋白的纯化 |
| 2.3.6 纯化蛋白浓度的测定 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 原核表达载体pET28a-16kDa的构建 |
| 2.4.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.4.3 融合蛋白的Western blot检测 |
| 2.4.4 融合蛋白16kDa质谱分析 |
| 2.4.5 融合蛋白的纯化 |
| 2.4.6 纯化蛋白浓度的测定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 百合无症病毒16kDa,TGB1蛋白抗血清制备及检测 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 16 kDa,TGB1抗血清制备及抗血清效价测定 |
| 3.3.2 Western blot检测 |
| 3.3.3 百合无症病毒检测 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 16 kDa,TGB1抗血清制备及抗血清效价测定 |
| 3.4.2 Western blot检测 |
| 3.4.3 百合无症病毒检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 百合无症病毒16kDa,TGB1沉默抑制子的鉴定与研究 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组载体构建 |
| 4.3.2 农杆菌浸润接种及鉴定 |
| 4.3.3 实时定量PCR检测 |
| 4.3.4 Western blot分析 |
| 4.3.5 细胞定位 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 重组载体构建 |
| 4.4.2 RNA沉默抑制子的鉴定 |
| 4.4.3 细胞定位 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 论文病毒序列 |
| 附录B 质粒图谱及实验所用Marker |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（2）卷丹百合病毒检测及离体培养研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 百合生物学特性及应用价值 |
| 1.1.1 百合生物学特性 |
| 1.1.2 百合应用价值 |
| 1.2 百合组培及脱毒研究进展 |
| 1.2.1 百合组培研究现状 |
| 1.2.2 外植体的选择及消毒 |
| 1.3 百合病毒脱除技术 |
| 1.3.1 热处理法 |
| 1.3.2 茎尖培养脱毒法 |
| 1.3.3 化学抑制剂脱毒法 |
| 1.3.4 愈伤组织培养脱毒 |
| 1.3.5 其他脱毒方法 |
| 1.4 百合病毒检测技术研究进展 |
| 1.4.1 指示植物检测法 |
| 1.4.2 电子显微镜技术 |
| 1.4.3 血清学检测法 |
| 1.4.4 分子生物学检测法 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 卷丹百合病毒病调查与检测技术 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 田间病害观察及毒源采集 |
| 2.2.2 DAS-ELISA 检测法 |
| 2.2.3 百合鳞片总RNA提取及测定 |
| 2.2.4 供试材料及引物设计 |
| 2.2.5 单重 RT-PCR |
| 2.2.6 双重 RT-PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DAS-ELISA 检测结果 |
| 2.3.2 总RNA提取 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 DAS-ELISA 检测需要注意事项 |
| 2.4.2 PCR 产物的电泳 |
| 2.4.3 DAS-ELISA 和 RT-PCR 检测法比较 |
| 第三章 卷丹百合鳞片离体培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同浓度植物激素配比对不定芽诱导的影响 |
| 3.2.2 不同浓度植物激素配比对不定芽增殖的影响 |
| 3.2.3 不同浓度萘乙酸(NAA)对根系生长的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 卷丹百合的脱毒培养 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 培养条件 |
| 4.1.3 材料处理 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 茎尖培养 |
| 4.2.2 茎尖培养+病毒唑脱除病毒 |
| 4.2.3 茎尖变温处理与恒温处理培养 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 试管苗茎尖大小脱除病毒 |
| 4.3.2 茎尖培养结合病毒唑脱除病毒 |
| 4.3.3 茎尖变温处理与恒温处理培养 |
| 4.4 脱毒后病毒检测 |
| 4.5 小结 |
| 4.5.1 茎尖培养 |
| 4.5.2 病毒唑结合茎尖培养 |
| 4.5.3 热处理结合茎尖培养 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 卷丹百合离体培养体系的建立 |
| 5.2 卷丹百合主要病毒检测DAS-ELISA和RT-PCR检测法 |
| 5.3 卷丹百合脱除病毒方法研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）百合无症病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1. 1主要试剂与仪器 |
| 1. 2病毒样品制备 |
| 1. 3总RNA提取及模板制备 |
| 1. 4引物与探针设计 |
| 1. 5实时荧光RT-PCR扩增 |
| 1. 6百合无症病毒普通RT-PCR方法的建立 |
| 2结果与分析 |
| 2. 1 LSV的实时荧光RT-PCR特异性检测 |
| 2. 2实时荧光RT-PCR检测灵敏度 |
| 2. 3普通RT-PCR检测结果 |
| 2. 4荷兰进境百合中LSV的检测 |
| 3讨论 |
（4）北京地区百合无症病毒CP基因的克隆与分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒RNA的提取。 |
| 1.2.2 引物设计与合成。 |
| 1.2.3 cDNA第1链的合成。 |
| 1.2.4 PCR扩增。 |
| 1.2.5 目的片段的克隆与序列分析。 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 检测RNA |
| 2.2 克隆与测序LSV目的片段 |
| 2.3 比对与已知CP蛋白序列的同源性 |
| 3 讨论 |
（5）百合无症病毒检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 LSV概述 |
| 1.1 LSV基本性状 |
| 1.2 寄主与传播 |
| 1.3 LSV分子生物学 |
| 2 LSV快速检测方法研究进展 |
| 2.1 免疫电镜法 |
| 2.2 酶联免疫吸附法 (ELISA) 和免疫结合试验 (DIBA) |
| 2.3 分子生物学技术 |
（6）分子生物学技术在百合病毒病害检测中的应用（论文提纲范文）
| 1 RT-PCR检测技术 |
| 2 核酸杂交技术 (Nucleic Acid Dot-blot Hybridiza-tion) |
| 3 基因芯片技术 |
（7）百合主要病毒基因组的克隆及感病生理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 百合概述 |
| 1.2 百合病毒病 |
| 1.2.1 百合病毒危害 |
| 1.2.2 百合病毒病防治 |
| 1.2.3 百合病毒检测 |
| 1.3 百合主要病毒的研究进展 |
| 1.3.1 百合无症病毒 |
| 1.3.2 百合斑驳病毒 |
| 1.3.3 黄瓜花叶病毒 |
| 1.4 病毒侵染后寄主植物病理学研究 |
| 1.4.1 病毒侵染后寄主细胞病理学变化 |
| 1.4.2 病毒侵染后寄主植物生理学变化 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 百合病毒基因组的克隆及序列分析 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体质粒 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 百合叶片总RNA的提取 |
| 2.2.2 百合病毒基因组片段的获得 |
| 2.2.3 重组质粒的克隆及检测 |
| 2.2.4 克隆片段序列的测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 百合叶片总RNA的提取 |
| 2.3.2 RT-PCR反应获得目的片段 |
| 2.3.3 重组质粒PCR检测 |
| 2.3.4 重组质粒双酶切反应检测 |
| 2.3.5 克隆片段序列的测定结果 |
| 2.3.6 LSV序列分析 |
| 2.3.7 LMoV序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 LSV复制酶序列分析与蛋白结构预测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RdRp-DL序列系统进化分析 |
| 3.2.2 RdRp-DL功能结构域预测 |
| 3.2.3 RdRp-DL疏水性预测 |
| 3.2.4 RdRp-DL二级结构预测 |
| 3.2.5 RdRp-DL卷曲螺旋结构预测 |
| 3.2.6 RdRp-DL结构域三级结构预测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RdRp-DL序列系统进化关系 |
| 3.3.2 RdRp-DL功能结构域分析 |
| 3.3.3 RdRp-DL疏水性分析 |
| 3.3.4 RdRp-DL二级结构分析 |
| 3.3.5 RdRp-DL卷曲螺旋结构分析 |
| 3.3.6 RdRp-DL结构域三级结构分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 百合感病生理研究 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 病毒接种 |
| 4.1.3 叶绿素含量的测定 |
| 4.1.4 酶液的制备 |
| 4.1.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 |
| 4.1.6 过氧化物酶(POD)活性的测定 |
| 4.1.7 多酚氧化酶(PPO)活性的测定 |
| 4.1.8 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定 |
| 4.1.9 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CMV及LMoV侵染对百合叶片叶绿素含量的影响 |
| 4.2.2 CMV及LMoV侵染对百合叶片SOD活性的影响 |
| 4.2.3 CMV及LMoV侵染对百合叶片POD活性的影响 |
| 4.2.4 CMV及LMoV侵染对百合叶片PPO活性的影响 |
| 4.2.5 CMV及LMoV侵染对百合叶片PAL活性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 病毒序列 |
| 附录B 论文所用质粒图谱和DNA Marker |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）百合、水仙病毒分子检测及脱毒技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 百合、水仙病毒病及其危害 |
| 1.2 植物病毒检测方法研究进展 |
| 1.2.1 生物学鉴定法 |
| 1.2.2 电子显微镜诊断法 |
| 1.2.3 血清学方法 |
| 1.2.4 分子生物学方法 |
| 1.3 脱毒方法研究进展 |
| 1.3.1 病毒脱除理论依据 |
| 1.3.2 病毒脱除技术方法 |
| 1.4 研究的立题背景、意义与研究路线 |
| 1.4.1 立题背景、意义 |
| 1.4.2 试验材料、方法及研究路线 |
| 第二章 百合、水仙主要病毒的RT-PCR 检测 |
| 2.1 百合主要病毒检测 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果与分析 |
| 2.1.3 小结与讨论 |
| 2.2 喇叭水仙中百合斑驳病毒的RT-PCR 检测及序列分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果与分析 |
| 2.2.3 小结与讨论 |
| 2.3 水仙黄条病毒的RT-PCR 检测及序列分析 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.2 结果与分析 |
| 2.3.3 小结与讨论 |
| 第三章 百合无症病毒的脱除 |
| 3.1 试验处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 总结 |
| 4.1 首次在荷兰进境喇叭水仙上检测到百合斑驳病毒 |
| 4.2 应用RT-PCR 方法快速检测水仙黄条病毒 |
| 4.3 高温变温结合剥茎尖全暗培养成功脱除百合无症病毒 |
| 4.4 组培苗在添加水杨酸的培养基中培养脱毒效果不理想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）侵染百合的南芥菜花叶病毒的分子检测及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图和附表清单 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 百合病毒病种类 |
| 1.3 南芥菜花叶病毒 |
| 1.4 植物病毒检疫的各种检测鉴定方法原理 |
| 1.5 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 DAS-ELISA方法检测ArMV在百合病株上的分布 |
| 3.2 南芥菜花叶病毒CP基因片段的克隆与鉴定 |
| 3.3 RT-PCR方法检测南芥菜花叶病毒 |
| 3.4 巢式RT-PCR方法检测南芥菜花叶病毒 |
| 3.5 实时荧光定量TaqMan RT-PCR方法检测南芥菜花叶病毒 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 常规RT-PCR检测 |
| 4.2 巢式RT-PCR检测 |
| 4.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测 |
| 4.4 DAS-EL1SA、常规及巢式RT-PCR和实时荧光定量TaqManRT-PCR 检测方法优缺点的比较 |
| 4.5 总结 |
| 第五章 结论和展望 |
| 5.1 建立了南芥菜花叶病毒的DAS-ELISA检测方法 |
| 5.2 建立了南芥菜花叶病毒RT-PCR检测方法 |
| 5.3 建立了南芥菜花叶病毒的巢式RT-PCR检测方法 |
| 5.4 建立了南芥菜花叶病毒的荧光定量TaqManRT-PCR检测方法 |
| 5.5 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
（10）百合上李属坏死环斑病毒和百合无症病毒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 百合的生产情况 |
| 1.1.1 生产与种植情况 |
| 1.1.2 制约百合生产的主要矛盾 |
| 1.2 两种重要的检疫性病毒 |
| 1.2.1 百合无症病毒（LSV）引起的病害及病毒生物学特性 |
| 1.2.2 李属坏死环班病毒（PNRSV）引起的病害及病毒生物学特性 |
| 1.3 植物病毒诊断技术方法 |
| 1.3.1 生物学方法 |
| 1.3.2 电子显微镜观察法 |
| 1.3.3 血清学方法 |
| 1.3.4 分子生物学方法 |
| 1.3.5 蛋白与核酸特征结合的鉴定方法 |
| 1.3.6 几种常用方法检测植物病毒灵敏度比较分析 |
| 1.4 百合无症病毒的分子特征及检测技术研究进展 |
| 1.4.1 LSV 病毒分子特征研究 |
| 1.4.2 LSV 病毒的检测技术研究 |
| 1.5 李属坏死环斑病毒的分子特征及检测技术研究进展 |
| 1.5.1 PNRSV 病毒分子特征研究 |
| 1.5.2 PNRSV 病毒的检测技术研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PNRSV 的CP 基因特征与多重PCR 检测技术构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 病毒材料的准备 |
| 2.2.2 制备TES DIECA 抽提缓冲液 |
| 2.2.3 总RNA 的提取 |
| 2.2.4 RT-PCR 体系的建立 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PNRSV 与等轴不稳环斑病毒属成员的RNA 3 结构特征比较 |
| 2.3.2 PNRSV 不同株系间在RNA3 上CP 基因的结构变异研究 |
| 2.3.3 基于PNRSV 中RNA3 特征的特异性引物设计 |
| 2.3.4 PNRSV 不同致病类型的分子鉴定 |
| 2.3.5 讨论 |
| 第三章 李属坏死环斑病毒百合分离物的鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 病毒材料的采集与保存 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 引物的设计与合成 |
| 3.2.4 RT-PCR 扩增体系的建立 |
| 3.2.5 RT-PCR 产物克隆、鉴定和测序分析 |
| 3.2.6 RNA 斑点杂交 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PNRSV 百合阳性样品的检出 |
| 3.3.2 PNRSVCP 基因片段的克隆 |
| 3.3.3 PNRSV 的CP 基因核苷酸序列特征分析 |
| 3.3.4 利用斑点杂交技术检测百合中的PNRSV |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 百合无症病毒的分子特征与分子检测技术研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 病毒来源和试剂 |
| 4.2.2 引物 |
| 4.2.3 反转录与PCR 扩增 |
| 4.2.4 核酸序列及同源性比较 |
| 4.2.5 RNA 玻片杂交检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 序列分析 |
| 4.3.2 LSV RNA 点杂交检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒（论文参考文献）
- [1]LSV 16kDa/TGB1抗血清制备及RNA沉默抑制子的鉴定[D]. 冀文婕. 大连理工大学, 2016(03)
- [2]卷丹百合病毒检测及离体培养研究[D]. 源朝政. 湖南农业大学, 2014(09)
- [3]百合无症病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立[J]. 余澍琼,陈先锋,张吉红,于翠,张慧丽,闻伟刚. 浙江农业学报, 2014(01)
- [4]北京地区百合无症病毒CP基因的克隆与分析[J]. 王贤,田保华,王永勤,熊敏,卫尊征,王月华. 中国植保导刊, 2011(05)
- [5]百合无症病毒检测方法研究进展[J]. 李孙洋. 安徽农业科学, 2010(22)
- [6]分子生物学技术在百合病毒病害检测中的应用[J]. 沈春修. 安徽农学通报(上半月刊), 2010(11)
- [7]百合主要病毒基因组的克隆及感病生理研究[D]. 李焕改. 大连理工大学, 2010(10)
- [8]百合、水仙病毒分子检测及脱毒技术研究[D]. 刘博. 中国农业科学院, 2009(10)
- [9]侵染百合的南芥菜花叶病毒的分子检测及鉴定[D]. 刘毅. 昆明理工大学, 2009(03)
- [10]百合上李属坏死环斑病毒和百合无症病毒的研究[D]. 韩丽娟. 中国农业科学院, 2008(10)