一、转基因动物的原理与技术（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中研究表明近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
张芳[2]（2020）在《转基因动物及其产品检测技术研究进展》文中进行了进一步梳理为探索可靠、灵敏的转基因动物及其产品检测技术,从核酸检测和蛋白检测两个方面,综述了转基因动物及其产品不同检测技术的原理、特点及应用,提出了每种检测技术的不足及今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。目前,已经研发的核酸检测技术主要包括多种PCR方法、环介导等温扩增技术、Southern blot技术和染色体原位杂交技术等,蛋白检测方法主要包括酶联免疫吸附检测技术、免疫层析试纸条、Western blot技术、免疫组织化学和免疫荧光技术等。三代测序技术是近年来提出的一种新型基因检测技术,适用于对未知序列转基因动物的分析。随着转基因技术的发展,转基因动物及其产品越来越多,高通量、高灵敏度和低成本的检测技术将成为未来转基因动物及其产品检测的研究重点。
韩静[3]（2020）在《优化CRISPR/Cas9系统提高奶山羊ROSA26位点基因打靶效率》文中指出动物乳腺生物反应器是利用转基因技术将外源基因导入动物基因组中并获得乳腺特异性表达目的蛋白转基因动物的一项技术,目前已有多种相关的医药蛋白产品获批上市,创造了巨大的经济价值,其中奶山羊由于大小合适、妊娠期短和乳汁分泌丰富的特点在乳腺生物反应器中广泛应用。但是目前制备转基因动物的技术仍不成熟,利用体细胞核移植技术获得的转基因动物怀孕率低、死亡率高以及位置效应导致的低表达等因素,都严重影响了动物乳腺生物反应器的应用和发展。基于此,选择高效的基因打靶技术和安全的打靶位点是保证目的蛋白在乳腺中高效表达以及提高转基因动物制备效率的重要因素。高效率、低成本和操作简便的CRISPR/Cas9技术是继ZFNs和TALENs之后出现的第三代基因编辑技术,已在多物种广泛应用,ROSA26基因座则是目前被认为最接近基因插入安全港定义的一个多物种均可整合外源基因的友好位点。本研究首次利用CRISPR/Cas9技术对奶山羊原代细胞的gROSA26基因座进行不同策略的基因打靶,旨在获得一种能够更高效安全制备奶山羊乳腺反应器的基因打靶系统。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞（goat mammary epithelial cell,g MECs）为试验材料,利用RACE技术获得gROSA26转录本序列,通过鉴定核心启动子区域及其启动强度确定了其启动筛选标记基因获取单克隆细胞的可能性。随后利用sgRNA设计网站CRISPOR在gROSA26的第1内含子区域筛选潜在脱靶位点最少的打靶位点,SSA双荧光检测不同位点的体外切割效率得到具有较高打靶效率和较低脱靶效率的sgRNA。进一步利用不同DSB修复机制构建HDR、HMEJ、NHEJ、MMEJ四种供体载体报告质粒,分别和Cas9打靶载体共转染至奶山羊乳腺上皮细胞筛选内源启动子启动筛选标记基因表达的阳性克隆,确认HMEJ策略下的打靶效率最高。最后构建gROSA26内源启动筛选标记以及乳腺特异性启动人溶菌酶的HMEJ供体载体,筛选人溶菌酶基因在gROSA26位点定点整合的阳性克隆,从而获得了一种外源基因整合效率更高并且表达更稳定的CRISPR/Cas9基因打靶系统,也为后续利用奶山羊乳腺生物反应器生产医药蛋白的规模化应用奠定了基础。
高晗,钟蓓[4]（2020）在《转基因技术和转基因动物的发展与应用》文中指出经过数十年的发展,转基因技术发展到今天日趋成熟,转基因动物的制备也涌现出许多的方法。转基因动物制备主要使用的方法有逆转录病毒感染法、DNA显微注射法、基因打靶技术、精子载体法和体细胞核移植法等,这些方法各自有其优缺点。转基因动物如今在生命科学研究、人类疾病模型、异种器官移植、动物品种改良、食品药品生产等方面有着重要应用,对人类健康和社会发展有着重大意义,但该项技术在应用过程中仍存在一些问题。动物转基因技术和转基因动物制备早已成为生命科学领域的研究热点,随着理论和技术不断向前推进,它们必将对人类的疾病治疗、生产生活、社会发展等方面产生巨大的影响。
赵秀玲[5]（2020）在《应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记技术进行哺乳动物胚胎性别鉴定的研究》文中研究说明性别控制技术对于加快优良母畜的繁殖速度,提高限性性状畜牧业的生产效益有重要意义,而早期胚胎性别鉴定是进行性别控制的一种重要方法。在XY型性别决定的哺乳动物中,Y染色体决定雄性性别,如果可以标记Y染色体,区分雌雄性别就会变得轻而易举。本研究的目的是通过基因编辑的手段进行Y染色体标记,建立一种无损伤快速鉴定哺乳动物早期胚胎性别的方法,为哺乳动物性别控制的研究提供一种新的思路。基于此,本研究进行了如下尝试:首先对CRISPR/Cas9系统介导的外源基因整合效率进行优化;基于优化的条件以小鼠为研究模型,采用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术获得Y染色体上插入e GFP基因的转基因雄性小鼠系,e GFP基因就可以随着Y染色体的分离传递到雄性后代的基因组中,绿色荧光蛋白（GFP）的表达可以直观地指示早期胚胎和后代的性别。为了拓展该方法在农业生产上的应用,本研究通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR对巴马猪的肾脏成纤维（PKF）和水牛胎儿成纤维（BFF）细胞进行基因编辑,分别获得Y染色体上整合e GFP基因的成纤维细胞系,通过体细胞克隆成功生产出基因型为Y-Chr-e GFP的转基因克隆胚胎。主要开展的工作和研究结果简述如下:1.CRISPR/Cas9系统介导的外源基因整合效率的优化为了提高HDR的效率,本章针对Tubb3和Actb两个靶位点分别构建了三种不同长度的模板载体,然后在小鼠细胞系中进行优化,结果发现模板载体的同源臂越长,同源重组效率越高。本研究也比较了BFF细胞中同源臂长度分别为300 bp,800 bp和1200 bp的模板载体的HDR效率,结果表明同源臂长度为1200 bp的模板载体的HDR效率更高。通过在BFF细胞中添加P53蛋白的小分子抑制剂Pifithrin-μ（PFT-μ）发现,PFT-μ可以显着提高BFF细胞Actb位点的HDR效率。另外,本研究对比HMEJ（homology mediated end joining,HMEJ）和HDR两种不同的外源基因整合机制介导的基因敲入效率发现,HMEJ介导的外源基因整合效率高于HDR,但差异并不显着（P>0.05）。2.应用CRISPR/Cas9系统介导的Y染色体标记进行小鼠植入前胚胎性别鉴定的研究本章以小鼠为研究对象,通过受精卵胞质注射和胚胎移植获得小鼠Y染色体Uty和Ddx3y基因间隔区导入e GFP基因的Y-Chr-e GFP转基因雄性小鼠系。将转基因雄鼠与野生型雌鼠交配,所获胚胎中表达绿色荧光蛋白的均为雄性,反之为雌性。将所有胚胎单个收集,巢式PCR确定胚胎性别发现,直观地通过荧光鉴定胚胎性别与PCR鉴定的结果完全一致。另外,分别统计Y-Chr-e GFP转基因小鼠与非转基因小鼠后代的性别比例,结果并没有显着差异。3.应用CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术生产巴马猪Y-Chr-e GFP转基因克隆胚胎的研究首先,本章通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术制备Y染色体上导入e GFP基因的Y-Chr-e GFP转基因巴马猪PKF细胞系,并验证外源基因整合位点的准确性。然后对比Y-Chr-e GFP转基因PKF细胞与非转基因细胞的生长特性,结果发现转基因细胞的生长速度和细胞活性均低于非转基因细胞。最后进行体细胞核移植,成功获得了基因型为Y-Chr-e GFP巴马猪转基因克隆胚胎。4.Y-Chr-e GFP转基因水牛胎儿成纤维细胞的生长、增殖、表观遗传相关基因的表达及克隆胚胎的生产首先,本章通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术制备Y染色体导入e GFP基因的BFF细胞系,并验证外源基因整合位点的准确性。然后分析细胞的生长特性,发现Y-Chr-e GFP转基因细胞的增殖速度和细胞活性均低于非转基因细胞;实时荧光定量PCR的结果显示,转基因细胞中DNA甲基化相关基因DNMT1和DNMT3a的表达无显着变化,而组蛋白去乙酰化酶基因HDAC1,HDAC2,HDAC3的表达则显着升高;最后进行体细胞核移植,结果发现Y-Chr-e GFP转基因克隆胚胎的分裂率显着低于非转基因克隆胚胎,但囊胚率并没有显着变化。总之,本研究应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记的方法成功进行了小鼠早期胚胎的性别鉴定,为哺乳动物早期胚胎性别鉴定提供了一种快速且无损伤的鉴定方法。此外,本研究也获得了Y染色体标记的猪和水牛的转基因克隆胚胎,为大动物性别控制的研究提供了新的思路与方法,同时也为体细胞克隆介导的基因修饰技术进行转基因大动物的生产奠定了重要的研究基础。
李红丽[6]（2019）在《CRISPR/Cas9靶向整合轮状病毒VP6基因构建兔乳腺生物反应器模型的初步研究》文中认为小儿腹泻是一种由轮状病毒导致的病毒性疾病,新生婴儿的致死率达80%,全球性危害较严重。VP6蛋白是轮状病毒的免疫原性的结构蛋白,如能在动物的乳腺中表达VP6蛋白,将有可能生产出抗轮状病毒的口服疫苗。为此,本研究拟应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,将具有免疫原性的轮状病毒结构蛋白VP6基因敲入到兔酪蛋白基因座的下游,以期利用酪蛋白的内源性基因调控系统指导外源基因VP6蛋白的表达,在兔奶中获得轮状病毒VP6重组蛋白,为应用乳腺生物反应器生产抗腹泻的口服疫苗奠定基础。研究获得如下结果:1、CRISPR/Cas9介导的兔酪蛋白位点基因组编辑效率检测参考兔酪蛋白基因组序列,设计靶向兔酪蛋白位点第6外显子区的g RNA,构建4条g RNA载体对应的RGS载体,然后转染人293T细胞验证4条g RNA的切割活性。g RNA载体转染293T细胞48小时后的绿色荧光和红色荧光检测结果及流式细胞检测结果显示,4条g RNA均具有切割活性。电转Cas9表达载体及4条g RNA质粒到兔成纤维细胞,靶位点特异性PCR扩增及扩增片段的T7E1酶切结果显示,4条g RNA在内源性靶位点均具有切割活性,4条g RNA的效率分别为:g1:37.1%,g2:42.0%,g3:60.7%,g4:62.4%。显微注射Cas9m RNA及4条sg RNA到兔受精卵胞质,验证胚胎水平4条g RNA的编辑效率,结果发现,四组胚胎发育率无显着差异（g1:72.77±1.12%,g2:70.33±0.56%,g3:73.33±1.84%,g4:73.44±0.86%vs对照组:73.25±1.03%,P>0.05）,g RNA4的编辑效率（T7E1酶切分析结果）显着高于其余3条（g4:72.76±0.32%vs g1:30.14±1.93%,g2:38.53±0.75%,g3:52.26±1.16%,P<0.05）,表明g4位点的外源基因整合效率较高。2、不同长度同源臂对外源基因定点敲入酪蛋白位点效率的影响为验证不同长度同源臂的打靶载体在体内同源重组效率,在设计200bp长度同源臂及1000 bp长度同源臂的打靶载体,通过扩增靶向兔酪蛋白g4位点两端的序列,分别获得200 bp与1000 bp的同源臂序列,然后以p EGFP-N1为模板,扩增EGFP片段,经一步法将两端同源臂与EGFP基因克隆到双酶切的p MD18-T载体上,构建得到两组不同长度同源臂的打靶载体,再通过共转Cas9载体、g RNA4载体及两组同源打靶载体到兔成纤维细胞,验证两组载体的基因打靶效率。结果发现:两组长度打靶载体均能在内源性基因位点介导外源基因的定点整合。为验证两组打靶载体在胚胎水平的敲入效率,两组打靶载体分别与体外转录的Cas9m RNA和sg RNA4胞质注射到兔受精卵内,培养5天后收集单个囊胚进行5’J和3’J特异性检测。结果显示:1000 bp同源臂的打靶载体效率与200 bp同源臂的打靶载体差异不显着（17.25±1.60%vs 19.23±1.73%,P>0.05）,但200 bp打靶载体介导的阳性敲入胚胎中未能检测到完整的5’J和3’J PCR产物（多为3’J）,而1000 bp打靶载体组阳性敲入胚胎中75%的胚胎能够完整的扩增出5’J和3’J PCR产物。表明同源臂为1000 bp的打靶载体打靶效率较高。3、CRISPR/Cas9介导的VP6定点整合兔的生产与鉴定在上述工作的基础上,利用靶向兔酪蛋白的g4位点构建1000 bp同源臂的轮状病毒结构蛋白VP6基因的打靶载体,然后与Cas9和g RNA4共转兔成纤维细胞验证打靶载体的效率。PCR和测序结果显示,VP6基因整合到了酪蛋白基因座g4位点,表明构建的VP6打靶载体在细胞水平是有效的。而后,将Cas9m RNA（100 ng/μL）和Cas9蛋白（100 ng/μL）分别与sg RNA4（50 ng/μL sg RNA4）及VP6打靶载体（100 ng/μL）混合注射到兔受精卵胞质,培养5天后收集囊胚进行外源基因整合检测。结果显示:虽然Cas9m RNA组的整合效率显着高于Cas9蛋白组（20.0%±2.6%vs10.3%±3.1%,P<0.05）,但Cas9蛋白组阳性胚胎100%完整的整合,而Cas9m RNA组有37.5%未完整整合。将来自Cas9m RNA组的91枚胚胎移植到12只受体兔,8只怀孕,产仔20只;将来自Cas9蛋白组的82枚胚胎移植到11只受体兔,6只怀孕,产仔15只。Cas9m RNA移植组获得两只VP6整合仔兔,但两只均未能完整扩增5’J和3’J产物（F0-A3:3’J;F0-A12:5’J）,而Cas9蛋白组成功获得一只VP6定点完整整合的基因编辑兔。上述结果表明,g RNA4的酪蛋白位点靶向切割效率较高;打靶载体的同源臂长度对基因打靶效率有影响,1000 bp的同源臂优于200 bp的同源臂;Cas9蛋白的同源重组效率优于Cas9m RNA,注射Cas9蛋白、sg RNA4和VP6-Donor质粒到兔受精卵胞质,可以获得兔酪蛋白定点敲入VP6的家兔。
杨艳伟,刘苏苏,吕建军,王三龙,张素才,柳全明,范昌发[7]（2019）在《我国临床前药物致癌试验转基因动物模型研究进展》文中提出目的:综述我国临床前药物致癌试验转基因动物模型研究进展。方法:介绍致癌试验常用转基因动物模型的构建、利用转基因动物模型开展致癌试验的优势、国际认可及国际监管机构新药申报中的应用、国内外致癌试验相关指导原则、我国开展基于转基因动物致癌试验面临的困境以及转基因动物模型构建的最新进展。结果与结论:基于转基因动物模型的致癌试验具有诸多优势也是目前国际趋势,在我国建立临床前药物致癌试验转基因动物模型非常必要。
黄卓雅[8]（2019）在《新型初级纤毛标记和生物传感器转基因动物的建立与分析》文中指出纤毛是细胞表面突起的亚细胞区域,根据轴丝微管骨架结构9+2和9+0的差别可分为运动纤毛和初级纤毛（Primary Cilium,PC）[1]。PC因不含有中央微管轴丝,所以不具有运动功能。PC广泛存在于脊椎动物细胞中,研究显示每个细胞有且仅有一根PC[2]。研究证明PC参与多个细胞信号转导途径的调控,如Hedgehog（Hh）、PDGF和WNT信号通路的调控[3]。Hh信号通路是一个在脊椎动物中高度保守的信号转导通路,在动物早期胚胎发育、形态建成以及个体物质能量代谢稳态维持中发挥着重要作用[4]。然而目前对PC在调节Hh通路信号转导的分子机制并不明确。我们前期研究认为PC中的PKA活性可能是调控Hh信号传导的关键,对该假设的验证需要能够在细胞层面监控PC中PKA活性以及其它细胞内可能参与信号传导的分子,如Ca2+等。然而目前对PC区域内信号分子检测缺乏有效的研究方法和研究材料,使得无法精细解析PC在调控Hh信号通路作用以及与PC相关其他信号通路的分子机制。为了解决上述研究的瓶颈,本论文以斑马鱼作为模式动物,旨在建立可以稳定标记PC,以及可以用于检测PC内各种信号分子的生物传感器的生物材料。通过文献检索和实验验证,本研究使用斑马鱼肾消耗相关蛋白3（Nephosistin3,Nphp3）的N末端作为PC定位信号肽,构建zNphp3N-mCherry融合蛋白标记PC,zNphp3N-AKAR2和zNphp3N-GCaMP6分别用于检测PC中的PKA活性和Ca2+。以上融合基因应用ubiquitin和β-actin广泛表达启动子启动,使得所有细胞均可表达上述融合蛋白。本研究成功筛选获得了4种稳定斑马鱼转基因材料,分别为:Tg（β-actin-zNphp3N-mCherry）,Tg（β-actin-zNphp3N-AKAR2）,Tg（Ubi-zNphp3N-AKAR2）,Tg（β-actin-zNphp3N-GCaMP6）。这些稳定转基因品系的胚胎发育正常,没有出现明显的畸形,成体表现正常,稳定可育。进一步通过FRET实验验证zNphp3N-AKAR2对于PC中PKA活性的检测功能,在抑制细胞整体PKA活性dnPKA处理后,未检测到FRET效率,反之在PKA激活剂Foskolin处理组,检测到较强的FRET效率,显示转基因胚胎中zNphp3N-AKAR2可以很好的指示PKA的活性。进而在Hh通路抑制剂Cyclopamine处理组中,可以检测到较高的FRET效率,初步证明PC中的PKA活性确实与Hh通路活性直接相关。分子机制的研究最终拟用于回答人类Hh通路疾病的致病机理。我们临床发现一个新的Hh通路异常激活的家系。经过一系列临床指标的检测,可以证实该家系为Gorlin综合症的家系。进行了全外显子测序分析其致病机制,我们发现PTCH1的一个新的INDEL突变,导致PTCH1提前终止,因此导致Hh信号通路活性上调。进而我们拟应用转基因材料检测PTCH1的截短蛋白是否可以导致PC中PKA活性的变化,以期详细阐明Gorlin综合症的致病机理。综上所述,我们构建了可以用于精细研究PC功能和信号分子变化的转基因材料,并建立的相应的检测方法,为Hh通路分子机制的研究和PC相关的分子机制的研究提供了重要的方法和材料。
齐浩铭[9]（2019）在《TauT转基因大鼠的构建与繁育及对其线粒体功能的初步研究》文中进行了进一步梳理目的:众所周知,牛磺酸在抗衰老、调节渗透压、氧化应激、促进神经系统发育等方面具有重要价值。过去通常以体外注射给药或口服喂食的方式对牛磺酸进行相关研究,稳定性较差。本研究采用神经特异性启动子PDGF,构建在神经系统特异性表达牛磺酸转运体（TauT）的TauT转基因大鼠,并进行繁殖、鉴定,初步探讨TauT转基因大鼠脑组织中线粒体相关功能的变化及可能机制。为研究牛磺酸及牛磺酸转运体在神经系统中的作用提供良好的动物模型。方法:1、TauT转基因大鼠的构建:将编码牛磺酸转运体基因（Slc6a6）的CDs扩增后插入质粒p PDGF4（+）的Nhe I和Xba I之间,构建真核表达载体p DGF4（+）-Slc6a6。载体线性化后显微注射入SD大鼠受精卵内,经短暂体外培养,筛检存活胚胎,移植入假孕受体大鼠输卵管,常规饲育。2、TauT转基因大鼠的鉴定:将得到的F0代TauT转基因大鼠与野生型大鼠1:1配笼繁殖,PCR法鉴定F1代大鼠基因型,RT-PCR检测TauT+/-大鼠大脑组织Slc6a6RNA表达情况,Western Blotting检测TauT+/-大鼠大脑、心、肝组织中TauT蛋白的表达情况,免疫组化及HE染色观察TauT+/-大鼠大脑皮层及海马区TauT蛋白的分布情况及细胞形态。3、TauT转基因大鼠的繁殖和一般情况观察:每2个月观察大鼠一般情况并记录体重、繁育次数、阳性率、平均产仔数等数据。4、TauT转基因大鼠核磁共振检测:采用快速平面自旋回波（FSE）和自旋回波（SE）核磁序列对大鼠行T2WI、T1WI扫描,点分辨波谱序列（point-resolved surface coil spectroscopy,PRESS）对所选择的感兴趣区（ROI）扫描,波谱软件自动计算出各代谢物包括乙酰门冬酰胺（NAA）、胆碱（Cho）、肌酐（Cr）、牛磺酸（Tau）、乳酸（Lac）的值。5、取5月龄TauT+/-大鼠,麻醉处死后取大脑、心、肺、肝、肾、脾、胰、骨骼肌等脏器,计算脏器系数和脏脑系数。6、TauT转基因大鼠的生理检查:大鼠禁食并麻醉后心尖取血,全自动血液细胞分析仪检测大鼠血常规指标30项（白细胞计数、红细胞计数、血小板压积等）,全自动生化分析仪检测大鼠血生化指标23项（白蛋白、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶等）。7、取5月龄TauT+/-大鼠,麻醉处死后提取脑组织线粒体,检测线粒体态3、态4呼吸速率、线粒体膜电位,并计算线粒体RCR、P/O比。结果:1.TauT转基因大鼠的构建:成功构建p DGF-Slc6a6表达质粒,将重组质粒显微注射入假孕大鼠输卵管内待产,经DNA鉴定后得到3只TauT转基因大鼠作为F0代首建鼠。2.TauT转基因大鼠鉴定:将F0代TauT+/-大鼠与野生型大鼠1:1交配得到F1代TauT+/-大鼠,PCR法鉴定基因型,TauT+/-大鼠的PCR扩增产物长度为625bp,TauT-/-大鼠及野生型大鼠没有扩增产物。RT-PCR结果显示TauT+/-大鼠大脑组织Slc6a6 RNA表达水平显着升高（P<0.05）,WB结果显示TauT+/-大鼠大脑组织TauT蛋白表达有升高趋势,TauT+/-大鼠大脑、心、肝组织中TauT蛋白与TauT-/-大鼠相比没有显着差异。免疫组化及HE染色结果显示TauT+/-大鼠与TauT-/-大鼠没有显着差异。3.TauT转基因大鼠可连续繁殖,共繁育20窝174只大鼠,其中阳性63只,阴性111只,阳性率为36%,平均每窝产仔率8.7;F0代繁育6窝81只,阳性26只,阴性55只,阳性率为32%,平均每窝产仔率13.5;F1代繁育14窝93只,阳性37只,阴性56只,阳性率为39.78%,平均每窝产仔率6.64。4.对TauT转基因大鼠进行核磁检测,TauT+/-大鼠脑部未出现水肿或肿瘤等明显病变,波谱分析显示TauT+/-大鼠在ROI区的牛磺酸水平无明显变化。5.TauT+/-大鼠体重略高于TauT-/-大鼠且在外形特征上与阴性大鼠相比无明显差别;TauT+/-大鼠和TauT-/-大鼠比较,TauT+/-大鼠的肝体、肾体系数显着下降,各脏器的脏脑比均无显着性差异。6.TauT+/-大鼠嗜碱性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞绝对值、成熟中性粒细胞百分比显着升高（P<0.05）,大型血小板比率显着降低（P<0.05）;总蛋白、白蛋白、总胆固醇、间接胆固醇及肌酸激酶的含量显着降低（P<0.05）。7.TauT+/-大鼠脑组织线粒体RCR值、线粒体膜电位、P/O比略高于TauT-/-大鼠,且均无显着性差异。结论1、成功构建p DGF4（+）-Slc6a6真核表达载体,繁育出生的大鼠经PCR鉴定,得到3只F0代TauT+/-大鼠,经DNA鉴定、配种繁殖得到实验所需要的TauT+/-大鼠。2、TauT转基因大鼠可连续繁殖,p DGF-Slc6a6基因片段的转入并未改变大鼠体重、脏器重量等生理状态,并未对大鼠脑部造成器质性病变,没有造成大鼠的生理代谢异常。3、初步结果显示,TauT+/-大鼠体内p DGF-Slc6a6基因片段的转入并未使线粒体功能发生明显改变,具体机制待后续进一步研究。
李昊[10]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中认为肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
二、转基因动物的原理与技术（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因动物的原理与技术（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）转基因动物及其产品检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 核酸检测方法 |
| 1.1 定性PCR技术 |
| 1.1.1筛查法 |
| 1.1.2 基因特异性法 |
| 1.1.3 构建特异性法 |
| 1.1.4 转化特异性法 |
| 1.2 巢式和半巢式PCR法 |
| 1.3 多重PCR法 |
| 1.4 实时荧光PCR法 |
| 1.5 热不对称交错PCR技术 |
| 1.6 环介导等温扩增技术 |
| 1.7 Southern blot技术 |
| 1.8 染色体原位杂交技术 |
| 1.9 数字PCR技术 |
| 2 蛋白检测方法 |
| 2.1 酶联免疫吸附检测技术 |
| 2.2 免疫层析试纸条 |
| 2.3 Western blot技术 |
| 2.4 免疫组织化学技术 |
| 2.5 免疫荧光技术 |
| 3 发展中的新技术 |
| 4 展望 |
（3）优化CRISPR/Cas9系统提高奶山羊ROSA26位点基因打靶效率（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 基因安全港与基因打靶制备羊乳腺生物反应器 |
| 1.1 基因安全港概述 |
| 1.1.1 常用的基因安全座 |
| 1.1.2 rosa26基因座的研究进展 |
| 1.2 基因打靶制备羊乳腺生物反应器进展 |
| 1.2.1 制备转基因动物的发展 |
| 1.2.2 高效基因打靶技术的发展 |
| 1.2.3 羊乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 奶山羊ROSA26基因座及其核心启动子鉴定 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 奶山羊乳腺上皮细胞原代分离和培养 |
| 2.2.2 免疫荧光染色鉴定乳腺上皮细胞纯度 |
| 2.2.3 奶山羊ROSA26基因座鉴定 |
| 2.2.4 gROSA26核心启动子鉴定 |
| 2.2.5 高效打靶位点筛选 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 奶山羊乳腺上皮细胞原代分离、培养和鉴定 |
| 2.3.2 奶山羊ROSA26基因座鉴定 |
| 2.3.3 gROSA26核心启动子鉴定 |
| 2.3.4 不同打靶位点效率检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 不同打靶策略下稳定整合ROSA26位点的阳性克隆筛选 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 不同修复策略下报告载体构建 |
| 3.2.2 不同修复策略下打靶效率对比 |
| 3.2.3 人溶菌酶稳定整合ROSA26基因座的阳性克隆筛选 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同修复策略下报告载体构建 |
| 3.3.2 不同修复策略下打靶效率分析 |
| 3.3.3 人溶菌酶基因稳定整合细胞克隆筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）转基因技术和转基因动物的发展与应用（论文提纲范文）
| 1 转基因动物的制备方法 |
| 1.1 逆转录病毒感染法 |
| 1.2 DNA显微注射法 |
| 1.3 基因打靶技术 |
| 1.4 精子载体法 |
| 1.5 体细胞核移植法 |
| 2 转基因动物的应用 |
| 2.1 生命科学研究方面的应用 |
| 2.2 人类疾病模型方面的应用 |
| 2.3 异种器官移植方面的应用 |
| 2.4 动物品种改良方面的应用 |
| 2.5 食品药品生产方面的应用 |
| 3 转基因技术中的问题 |
| 4 展望 |
（5）应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记技术进行哺乳动物胚胎性别鉴定的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 性别决定理论的发展 |
| 1.2 性别控制技术的发展 |
| 1.2.1 X、Y精子的分离 |
| 1.2.2 早期胚胎性别鉴定 |
| 1.3 绿色荧光蛋白示踪的应用 |
| 1.4 基因编辑相关靶向核酸酶的兴起和应用 |
| 1.4.1 ZFNs的发展和应用 |
| 1.4.2 TALENs的发展和应用 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统的发展和应用 |
| 1.5 转基因动物的生产 |
| 1.5.1 转基因动物的构建方法 |
| 1.5.2 体细胞克隆的发展历史和研究现状 |
| 1.5.3 应用体细胞克隆构建基因修饰动物 |
| 1.6 P53蛋白在维持细胞基因组完整性中的作用 |
| 1.6.1 P53蛋白的概述 |
| 1.6.2 P53在维持细胞基因组完整性中的作用 |
| 1.6.3 Pifithrin-μ的作用机制 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 CRISPR/Cas9 系统介导的外源基因整合效率的优化 |
| 前言 |
| 2.1 试验材料与仪器设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 相关载体的构建 |
| 2.2.2 mES细胞的培养 |
| 2.2.3 N2A、NIH/3T3和BFF细胞的培养 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 水牛胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 2.2.6 水牛胎儿成纤维细胞电转参数的优化 |
| 2.2.7 应用RGS报告载体筛选sg RNA |
| 2.2.8 同源臂长度对HDR效率的影响 |
| 2.2.9 HDR和 HMEJ介导的外源基因整合效率的比较 |
| 2.2.10 PFT-μ对水牛胎儿成纤维细胞HDR效率的影响 |
| 2.2.11 细胞周期检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 载体的构建 |
| 2.3.2 水牛Actb位点sg RNA的筛选 |
| 2.3.3 同源臂长度对同源重组效率的影响 |
| 2.3.4 HMEJ和 HDR介导的基因敲入效率的比较 |
| 2.3.5 水牛胎儿成纤维细胞的制备 |
| 2.3.6 水牛胎儿成纤维细胞嘌呤霉素筛选浓度的优化 |
| 2.3.7 水牛胎儿成纤维细胞电转电压和脉冲次数的优化 |
| 2.3.8 PFT-μ对水牛胎儿成纤维细胞HDR效率的影响 |
| 2.3.9 PFT-μ对水牛胎儿成纤维细胞周期的影响 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 应用CRISPR/Cas9介导的Y染色标记技术进行小鼠植入前胚胎性别鉴定的研究 |
| 前言 |
| 3.1 试验材料与仪器设备 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 sgRNAs(single-guideRNAs)的设计及筛选 |
| 3.2.2 模板质粒的构建 |
| 3.2.3 体外转录PCR模板的制备 |
| 3.2.4 Cas9体外转录与纯化 |
| 3.2.5 sgRNA体外转录模板的制备 |
| 3.2.6 sgRNA体外转录与纯化 |
| 3.2.7 合子注射与胚胎移植 |
| 3.2.8 Y-Chr-eGFP转基因小鼠的生产、鉴定及脱靶检测 |
| 3.2.9 小鼠组织总RNA的提取 |
| 3.2.10 RNA的反转录 |
| 3.2.11 实时荧光定量PCR |
| 3.2.12 胚胎性别鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 sgRNA的筛选 |
| 3.3.2 模板载体的鉴定 |
| 3.3.3 Y-Chr-eGFP转基因小鼠的生产、鉴定及脱靶分析 |
| 3.3.4 胚胎性别鉴定 |
| 3.3.5 Q-PCR检测转基因小鼠相关基因的表达情况 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 应用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术生产Y-Chr-eGFP转基因巴马猪克隆胚胎的研究 |
| 前言 |
| 4.1 试验材料与仪器设备 |
| 4.1.1 动物材料 |
| 4.1.2 主要仪器与耗材 |
| 4.1.3 主要试剂与溶液配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 巴马猪肾脏成纤维细胞的制备 |
| 4.2.2 巴马猪肾脏成纤维细胞电转电压的优化 |
| 4.2.3 sgRNA的设计和筛选 |
| 4.2.4 模板载体的构建 |
| 4.2.5 单细胞克隆的筛选和鉴定 |
| 4.2.6 细胞生长曲线的测定 |
| 4.2.7 细胞活性检测 |
| 4.2.8 卵母细胞的获取与成熟培养 |
| 4.2.9 体细胞核移植生产Y-Chr-eGFP转基因巴马猪克隆胚胎 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 巴马小香猪肾脏成纤维细胞的制备 |
| 4.3.2 广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞电转电压的优化 |
| 4.3.3 载体鉴定 |
| 4.3.4 sgRNA设计和筛选 |
| 4.3.5 Y-Chr-eGFP转基因巴马猪肾脏成纤维细胞的生产 |
| 4.3.6 转基因和非转基因细胞活性和增殖速度的比较 |
| 4.3.7 Y-Chr-eGFP转基因巴马猪克隆胚胎的生产 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 Y-Chr-eGFP转基因水牛胎儿成纤维细胞系的建立及转基因克隆胚胎的生产 |
| 前言 |
| 5.1 试验材料与仪器设备 |
| 5.1.1 动物材料 |
| 5.1.2 主要仪器与耗材 |
| 5.1.3 主要试剂与溶液配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 sgRNA的设计和筛选 |
| 5.2.2 模板载体的构建 |
| 5.2.3 水牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定 |
| 5.2.4 单细胞克隆的筛选培养和鉴定 |
| 5.2.5 细胞生长曲线的测定 |
| 5.2.6 细胞活性检测 |
| 5.2.7 转基因细胞相关基因mRNA表达水平的检测 |
| 5.2.8 细胞基因组DNA的提取 |
| 5.2.9 卵母细胞的获取与成熟培养 |
| 5.2.10 颗粒单层的制备 |
| 5.2.11 体细胞核移植生产Y-Chr-eGFP转基因克隆水牛胚胎 |
| 5.2.12 转基因克隆胚胎发育潜能的检验 |
| 5.2.13 统计学分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 sgRNA的筛选 |
| 5.3.3 Y-Chr-eGFP转基因水牛胎儿成纤维细胞的生产 |
| 5.3.4 转基因和非转基因细胞活性和增殖速度的比较 |
| 5.3.5 转基因和非转基因细胞表观遗传相关基因表达情况分析 |
| 5.3.6 Y-Chr-eGFP转基因克隆水牛胚胎的生产 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文总结与展望 |
| 全文总结 |
| 本研究的不足与展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 英文缩写-中文名称对照表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）CRISPR/Cas9靶向整合轮状病毒VP6基因构建兔乳腺生物反应器模型的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 轮状病毒亚单位疫苗研究进展 |
| 1 轮状病毒研究简介 |
| 1.1 轮状病毒结构 |
| 1.2 轮状病毒的类型 |
| 1.3 轮状病毒疫苗研究进展 |
| 2 VP6亚单位疫苗研究进展 |
| 2.1 轮状病毒结构蛋白VP6简介 |
| 2.2 VP6蛋白作为候选疫苗的研究进展 |
| 第二章 基因编辑技术与转基因动物 |
| 1 传统的转基因动物研究技术 |
| 1.1 原核注射法 |
| 1.2 胞质注射法 |
| 1.3 体细胞核移植法 |
| 1.4 胚胎干细胞法 |
| 1.5 病毒载体介导法 |
| 1.6 精子载体法 |
| 1.7 转座子技术 |
| 2 基因编辑技术 |
| 2.1 锌指核酸酶(ZFN)技术 |
| 2.2 转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)技术 |
| 2.3 CRISPR-Cas9 基因打靶技术 |
| 3 CRISPR/Cas9 研究进展 |
| 3.1 CRISPR/Cas系统研究简介 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑动物 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入 |
| 3.4 动物乳腺生物反应器与基因编辑 |
| 第三章 DNA双链断裂与断裂修复途径的选择 |
| 1.DNA双链断裂 |
| 2 NHEJ修复涉及的相关的修复蛋白 |
| 2.1 核酸酶 |
| 2.2 聚合酶 |
| 2.3 连接酶复合体 |
| 2.4 多核苷酸激酶,抑肽酶和酪氨酰DNA磷酸二酯酶1 |
| 3 不同末端结构介导的NHEJ修复途径 |
| 3.1 Ku-XRCC4-DNA连接酶介导的平末端连接 |
| 3.2 核酸酶依赖性修复途径 |
| 3.3 聚合酶依赖性修复途径 |
| 3.4 XLF和 PAXX介导的连接修复途径 |
| 4 其他修复途径的选择 |
| 4.1 微同源序列介导的末端修复(a-EJ修复途径) |
| 4.2 单链退火(SSA)修复途径 |
| 4.3 同源重组修复 |
| 4.4 细胞周期对修复途径的影响 |
| 研究目的与意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 :CRISPR/Cas9 介导的兔酪蛋白位点基因组编辑效率检测 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 兔酪蛋白位点gRNA的设计及CRISPR/Cas9 相关载体的构建 |
| 2.2 RGS双荧光报告载体构建 |
| 2.3 质粒转化及Cracking鉴定 |
| 2.4 PCR片段及酶切产物胶回收 |
| 2.5 去内毒质粒大提 |
| 2.6 细胞解冻与培养 |
| 2.7 Cas9 载体、gRNA载体与RGS载体脂质体共转染293T细胞 |
| 2.8 Cas9 载体、gRNA载体共同电转染兔胎儿成纤维细胞 |
| 2.9 细胞基因组的提取 |
| 2.10 靶序列位点T7E1酶切突变检测 |
| 2.11 体外转录 |
| 2.12 兔的超排与受精卵的收集 |
| 2.13 兔受精卵胞质注射 |
| 2.14 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 兔CSN2基因分析及酪蛋白WB检测 |
| 3.2 兔CSN2 位点gRNA设计及CRISPR/Cas9 相关表达载体的构建 |
| 3.3 双荧光报告载体RGS载体的构建 |
| 3.4 Cas9、gRNA及 RGS载体通过脂质体共转染293T细胞验证4条sgRNA切割活性 |
| 3.5 Cas9 载体及gRNA载体共同电转兔胎儿成纤维细胞验证4条gRNA基因组内源性靶位点的编辑效率 |
| 3.6 CRISPR/Cas9 介导的4条sgRNA在胚胎水平基因编辑效率检测 |
| 4 讨论 |
| 第五章 不同长度同源臂对EGFP基因定点敲入兔酪蛋白位点的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 实验溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 靶向兔酪蛋白位点不同长度同源臂打靶载体的构建 |
| 2.2 Cas9、gRNA、同源打靶载体共转兔成纤维细胞 |
| 2.3 定点敲入外源基因的检测 |
| 2.4 Cas9、gRNA、同源打靶载体共注射兔受精卵 |
| 2.5 囊胚基因型的分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 靶向兔酪蛋白g4位点200bp同源臂打靶载体的构建 |
| 3.2 靶向兔酪蛋白g4位点1000bp同源臂打靶载体的构建 |
| 3.3 EGFP-Donor1与Cas9、gRNA4 共同电转兔成纤维细胞定点敲入的验证 |
| 3.4 EGFP-Donor2与Cas9、gRNA共同电转兔成纤维细胞定点敲入的验证 |
| 3.5 两种打靶载体分别与Cas9m RNA、sgRNA4 共注射兔受精卵基因敲入效率的检测 |
| 4 讨论 |
| 第六章 靶向酪蛋白位点定点整合VP6转基因兔的制备 |
| 前言 |
| 1 实验材料与设备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 轮状病毒亚单位结构VP6基因打靶载体的构建 |
| 2.2 Cas9 质粒、gRNA4 质粒及VP6-Donor质粒共同电转兔成纤维细胞 |
| 2.3 Cas9m RNA、sgRNA4及VP6-Donor质粒共注射兔受精卵 |
| 2.4 胚胎移植 |
| 2.5 F0代仔兔的基因型检测 |
| 2.6 Southern Blot |
| 2.7 F0-B6阳性兔的脱靶检测 |
| 2.8 F0-A3阳性兔F1代建立 |
| 2.9 F1 代阳性兔乳汁的采集及外源蛋白Western Blot检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 轮状病毒免疫原性结构蛋白VP6打靶载体的构建 |
| 3.2 Cas9、gRNA4、VP6-Donor载体电转兔成纤维细胞基因敲入的验证 |
| 3.3 Cas9、gRNA4、VP6 Donor载体共注射兔受精卵基因敲入效率的检测 |
| 3.4 F0代转基因兔的检测 |
| 3.5 三只阳性兔Southern blot分析 |
| 3.6 F0 代敲入阳性兔Rabbit1(F0-B6)的基因型分析 |
| 3.7 F0-B6阳性兔的脱靶检测 |
| 3.8 F0-A3后代的扩繁及F1代仔兔的转基因检测(生殖系遗传) |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
（7）我国临床前药物致癌试验转基因动物模型研究进展（论文提纲范文）
| 1 致癌试验常用转基因动物模型的构建 |
| 2 利用转基因动物模型开展致癌试验的优势 |
| 3 国际认可及国际监管机构新药申报中的应用 |
| 4 国内外致癌试验相关指导原则 |
| 5 我国开展基于转基因动物模型的致癌试验的困境 |
| 6 我国转基因动物模型构建的最新进展 |
| 7 建立我国致癌试验转基因模型的必要性及展望 |
（8）新型初级纤毛标记和生物传感器转基因动物的建立与分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 纤毛 |
| 1.1.1 纤毛的结构和功能 |
| 1.2 初级纤毛(Primary Cilium) |
| 1.3 Hedgehog信号通路 |
| 1.4 初级纤毛和Hedgehog信号通路的关系以及Hh通路研究的难点 |
| 1.5 FRET检测PKA活性的研究情况 |
| 1.6 斑马鱼模式动物 |
| 1.7 本研究的内容和意义 |
| 第二章 zNPHP3 N端肽段作为初级纤毛定位信号肽的功能验证 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.4.1目的基因克隆实验 |
| 2.1.4.2胶回收实验 |
| 2.1.4.3 Gibson Assembly连接反应 |
| 2.1.4.4 测序结果分析与质粒提取 |
| 2.1.4.5 体外转录 |
| 2.1.4.6 显微注射 |
| 2.1.4.7 胚胎免疫荧光染色 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 斑马鱼zNphp3 基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2 斑马鱼全长蛋白z Nphp3 和截短多肽zNphp3N的亚细胞定位情况 |
| 2.2.2.1 斑马鱼zNphp3 全长蛋白可以定位初级纤毛 |
| 2.2.2.2 斑马鱼zNphp3N截短多肽可以定位初级纤毛 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 稳定转基因品系的构建及品系鉴定 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.1.5.1 载体构建 |
| 3.1.5.2 遗传筛选 |
| 3.1.5.3 胚胎免疫荧光染色 |
| 3.1.5.4 原位杂交 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 获得稳定斑马鱼转基因品系 |
| 3.2.3 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛的标记情况 |
| 3.2.3.1 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛成功标记mCherry和 AKAR |
| 3.2.4 原位杂交实验结果 |
| 3.2.4.1 原位杂交探针ptch2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息 |
| 3.2.4.2 原位杂交探针olig2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 AKAR2 的功能验证 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PKA生物传感器建立成功 |
| 4.2.2 PKA在 Hh信号通路中的功能分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 Hh通路异常疾病Gorlin综合症致病机制的研究 |
| 引言 |
| 5.1 研究对象与实验方法 |
| 5.1.1 研究对象 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.2.1 临床病例分析 |
| 5.1.2.2 血液基因组DNA的提取 |
| 5.1.2.3 全外显子测序 |
| 5.1.2.4 Sanger测序验证突变位点 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 临床病理特征分析 |
| 5.2.2 先证者的家系图 |
| 5.2.3 家系成员PTCH1 突变的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（9）TauT转基因大鼠的构建与繁育及对其线粒体功能的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、TauT转基因大鼠的构建与鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 TauT转基因大鼠的构建 |
| 1.2.2 TauT转基因大鼠DNA鉴定结果 |
| 1.2.3 TauT转基因大鼠大脑组织Slc6a6 RT-PCR鉴定结果 |
| 1.2.4 TauT转基因大鼠脑/心/肝TauT蛋白Western Blotting鉴定结果 |
| 1.2.5 TauT转基因大鼠大脑组织免疫组化及HE染色观察结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 转基因动物简介 |
| 1.3.2 牛磺酸及牛磺酸转运体对中枢神经系统的作用 |
| 1.3.3 牛磺酸及牛磺酸转运体对大脑学习能力的影响 |
| 1.3.4 牛磺酸及牛磺酸转运体对钙离子稳态的影响 |
| 1.3.5 TauT转基因大鼠研究现状 |
| 1.4 小结 |
| 二、TauT转基因大鼠的繁育及一般生理生化指标的测定 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TauT转基因大鼠繁育结果 |
| 2.2.2 TauT转基因大鼠的一般表观情况 |
| 2.2.3 TauT转基因大鼠2-8月体重检测结果 |
| 2.2.4 TauT转基因大鼠脏器比/脏脑比结果 |
| 2.2.5 TauT转基因大鼠核磁共振检测结果 |
| 2.2.6 TauT转基因大鼠血常规、血生化检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 SD大鼠简介 |
| 2.3.2 TauT转基因大鼠对大鼠繁殖生育的影响 |
| 2.3.3 TauT转基因大鼠对大鼠一般表观情况的影响 |
| 2.3.4 TauT转基因大鼠对SD大鼠体重的影响 |
| 2.3.5 TauT转基因大鼠对SD大鼠脏器比/脏脑比的影响 |
| 2.3.6 TauT转基因大鼠对SD大鼠血常规、血生化的影响 |
| 2.4 小结 |
| 三、TauT转基因大鼠线粒体功能的初步研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 TauT转基因大鼠脑组织线粒体呼吸功能检测 |
| 3.2.2 TauT转基因大鼠脑组织线粒体膜电位检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 线粒体概述 |
| 3.3.2 牛磺酸对线粒体的影响 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 牛磺酸的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、转基因动物的原理与技术（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]转基因动物及其产品检测技术研究进展[J]. 张芳. 中国动物检疫, 2020(12)
- [3]优化CRISPR/Cas9系统提高奶山羊ROSA26位点基因打靶效率[D]. 韩静. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [4]转基因技术和转基因动物的发展与应用[J]. 高晗,钟蓓. 现代畜牧科技, 2020(06)
- [5]应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记技术进行哺乳动物胚胎性别鉴定的研究[D]. 赵秀玲. 广西大学, 2020(02)
- [6]CRISPR/Cas9靶向整合轮状病毒VP6基因构建兔乳腺生物反应器模型的初步研究[D]. 李红丽. 广西大学, 2019(02)
- [7]我国临床前药物致癌试验转基因动物模型研究进展[J]. 杨艳伟,刘苏苏,吕建军,王三龙,张素才,柳全明,范昌发. 中国药事, 2019(08)
- [8]新型初级纤毛标记和生物传感器转基因动物的建立与分析[D]. 黄卓雅. 山西大学, 2019(01)
- [9]TauT转基因大鼠的构建与繁育及对其线粒体功能的初步研究[D]. 齐浩铭. 天津医科大学, 2019(06)
- [10]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)