一、马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的部分功能（论文文献综述）
赵春芳[1]（2018）在《miRNA和MDV原癌基因Meq在鸡马立克氏病肿瘤转化过程中作用机制研究》文中指出鸡马立克氏病（MD）是由马立克氏病病毒（MDV）引起的噬淋巴细胞肿瘤性疾病。前期miRNA 组测序结果显示 gga-miR-219b、gga-miR-130b-3p 和 gga-miR-140-3p 在鸡感染 MDV 的肿瘤样本中显着下调。本研究中,我们选取这3个miRNAs和MDV原癌基因Meq作为研究对象,研究它们在MD肿瘤形成过程中的作用机制。过表达或抑制gga-miR-219b的试验结果表明,该miRNA抑制MD淋巴细胞MSB1迁移,并通过促进细胞凋亡而不是阻滞细胞周期使细胞增殖发生抑制,抑制细胞侵袭相关基因MMP2和MMP9的表达。这表明gga-miR-219b在MD肿瘤发生过程中发挥抑制作用。通过Targetscan和miRDB预测gga-miR-219b的候选靶基因,双荧光素酶基因报告试验证明B细胞慢性淋巴细胞性/淋巴瘤11B（BCL11B）是gga-miR-219b的一个直接靶基因。利用RNA干扰技术抑制BCL11B的表达,MSB1细胞增殖、迁移和侵袭情况与过表达gga-miR-219b结果类似,说明BCL11B基因在MD肿瘤转化过程中起到促进作用。过表达gga-miR-219b或干扰BCL11B基因表达,抗凋亡基因BCL2和BCL2L1表达下调,促凋亡基因TNFSF10表达上调,这说明gga-miR-219b能够通过介导凋亡通路中的基因表达促进细胞凋亡。此外,gga-miR-219b和BCL11B能够影响MDV最重要的原癌基因Meq表达。Meq基因在马立克氏病肿瘤组织和马立克氏病T类成淋巴细胞系中高表达。为研究Meq基因在MD肿瘤转化过程中的作用机制,我们利用RNA干扰技术抑制Meq基因表达,分析Meq基因干扰对MSB1细胞的生物学效应。在MSB1细胞中,Meq基因的干扰效率达到70%。干扰Meq基因表达后细胞增殖发生显着抑制,凋亡蛋白酶6活性升高,然而细胞周期没有明显变化。进一步研究结果表明Meq基因干扰后,凋亡通路中BCL2基因表达显着降低。干扰Meq基因对细胞迁移没有明显影响,而MMP2和MMP9基因表达显着降低。干扰Meq基因可以影响MD肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭等特征,说明Meq基因在肿瘤细胞转化过程中发挥促进作用。为解析gga-miR-130b-3p在感染MDV的肿瘤组织中低表达的原因,我们分析了感染MDV肿瘤化脾脏和未感染脾脏中gga-miR-130b-3p编码基因上游区域的差异甲基化水平。针对gga-miR-130b-3p基因上游1kb范围设计2个扩增子,覆盖616bp。这一区域有48个CpG位点,其中有8个位点在肿瘤化脾脏中的甲基化水平显着高于未感染脾脏。与未感染脾脏相比,肿瘤化脾脏中DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达上调,去甲基化相关酶Tet 10-11转位蛋白2（TET2）表达显着下调。Gga-miR-130b-3p编码基因上游区域发生甲基化或许是造成其在MD肿瘤组织中表达下调的直接原因。过表达gga-miR-130b-3p显着抑制细胞增殖、迁移和侵袭相关基因的表达,表明gga-miR-310b-3p在MD肿瘤转化过程中发挥抑制作用。与阴性对照组相比,转染gga-miR-140-3p激动剂后,细胞增殖发生显着抑制,细胞迁移数也显着减少。MMP2在转染后24h表达显着下调,48h和72h表达极显着下调,MMP9基因在转染后48h表达显着下调。gga-miR-140-3p作为在MDV感染组织中异常表达的miRNA,影响MD肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,提示该miRNA可能参与MD肿瘤转化过程。综上所述,通过影响鸡MD肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学特征,gga-miR-219b、gga-miR-130b-3p和gga-miR-140-3p在MD肿瘤形成过程中发挥抑制作用,而gga-miR-219b的靶基因BCL11B和MDV原癌基因Meq在这一过程中发挥促进作用。
苏瑞雪[2]（2017）在《马立克氏病毒pp38基因对Toll样受体通路的影响》文中进行了进一步梳理马立克氏病（MD）是一种由马立克氏病病毒（Marek’s Diseas Virus,MDV）感染禽类引起的具有高度细胞结合特性的传染性肿瘤病,马立克氏病病毒（MDV）是一种致T细胞瘤的疱疹病毒,然而病毒的致肿瘤机制仍不十分清楚。所有致肿瘤的MDV均属于血清I型,而与I型MDV致肿瘤相关的3个基因:132-bPr、pp38、meq基因中,pp38基因编码的38 000磷蛋白（pp38）在肿瘤和细胞系中的表达存在差异,而I型特异性的pp38复合体是迄今为止在MDV诱发的肿瘤及非生产性肿瘤细胞系中唯一能检出的MDV特异性抗原,pp38则被证实可抑制机体的免疫应答。CVI988株属于MDVI型疫苗株,RB1B株属于MDV I型强毒株。本研究通过PCR法,从感染MDV强毒株RBIB与疫苗株CVI988的CEF细胞总RNA中扩增pp38基因序列。实验结果表明,疫苗株与强毒株均可扩增出约870bp的pp38基因片段。序列分析比对结果显示,除了在第107和109位氨基酸发生变异外,其余部分完全相同。为了进一步了解pp38在细胞感染MDV后免疫应答中的作用机理,将扩增出的基因片段用限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ酶切消化,然后插入经HindⅢ及XhoⅠ酶切好的真核表达载体pCMV-C-Flag中,经酶切鉴后构建成pCMV-pp38-Flag质粒。构建的表达质粒转染CEF细胞,通过间接免疫荧光试验（IFA）和western-blot实验验证pp38磷蛋白的表达。真核表达载体pCMV-CVI988-pp38和pCMV-RBlB-pp38的正确构建为进一步研究MDV I型强毒株与致弱株间pp38基因对宿主细胞免疫应答抑制机理的差异提供了试验材料。为研究马立克氏病病毒pp38蛋白对宿主细胞天然免疫的影响,本研究将构建的真核表达载体 pCMV-CVI988-pp38 和 pCMV-RBlB-pp38 转染至 CEF 细胞中,经 poly（I:C）刺激,分别在6,12,24小时收集细胞RNA,利用荧光定量的方法检测各个采样时间点TLR基因家族,包括TLR3、TLR7、TLR15、TLR21和TLR2、TLR4,以及TLR3信号通路相关基因的相对表达量。结果表明pp38对TLR3-TRIF通路有一定的抑制作用,并影响通路下游炎性因子的表达,且不同致病力的毒株pp38在分子水平的差异明显。同时也检测了MyD88通路下游基因IRAK4、TRAF6、IFNA、IFNB等基因以及其他一些细胞因子的相对表达水平。实验结果显示pp38对这些因子表达量的影响与MDV的毒力有关。本研究发现MDV疫苗株与强毒株pp38蛋白对TLR3-TIRF途径有抑制作用,且这种抑制作用在不同毒株之间均存在,而pp38对TLR2、7、15以及一些下游细胞因子表达量的影响与毒力有关。这些结果为研究不同MDV毒株的pp38蛋白在体内外对细胞天然免疫的反应提供了依据,也为研究pp38免疫抑制作用在不同毒力的毒株间的差异性奠定了基础,将更有利于全面了解pp38在MDV致肿瘤中的作用机制。
张振杰[3]（2014）在《共表达不同外源基因的重组弱毒Ⅰ型马立克氏病毒的构建和生物学特性比较》文中研究指明马立克氏病毒（Marek′s disease virus, MDV）是α疱疹病毒的成员，基因组为180kb左右的双股DNA，可引起鸡的淋巴细胞瘤。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的第一株整合有网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）长末端重复序列（Long terminal repeat, LTR）的重组野毒株。本实验室前期研究中已经构建了GX0101的细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）克隆，并构建了敲除肿瘤基因meq的突变株GX0101meq病毒。该基因缺失性MDV不但丧失对SPF鸡的致病性，而且不再引起肿瘤以及胸腺和法氏囊萎缩。本文利用敲除meq基因的GX0101株MDV作为载体表达AIV-H9N2和NDV主要保护抗原基因，构建了2株敲除meq致肿瘤基因且同时表达2种不同外源基因的重组MDV。通过体内和体外连续传代分析这些重组MDV在细胞水平和动物体内的复制能力、探讨插入片段在重组MDV基因组中的稳定性、通过免疫SPF鸡这些重组MDV在体内诱导鸡的免疫应答的能力，从而为研发用于预防MDV和H9N2更好的疫苗提供候选疫苗株及相关的技术支持。研究主要从以下几个方面展开:1.荧光定量PCR检测1型MDV在不同感染阶段各组织中病毒含量的变化和分布。感染马立克病毒的鸡持续携带病毒一段时间后，可以增加器官肿瘤的发生率和提高横向传播的能力。鸡的马立克病毒含量与恶性肿瘤的发生率和作为感染性病毒的颗粒的唯一来源的羽毛囊上皮细胞中病毒传播水平呈有正相关的关系。本研究建立了一种SYBR Green双重实时荧光定量PCR的方法，通过选择病毒的meq基因和管家基因-鸡卵铁转蛋白ovo来检测和量化发病鸡的马立克病毒的含量和不同组织病毒的分布。研究中分别用马立克基因组的BAC克隆，BAC-GX0101和携带管家基因-鸡卵铁转蛋白特异性基因片段的质粒（pMD18T-ovo）来定量病毒和宿主基因组。该方法具有1-8logs动态变化范围，其变化的平均值的批间和批内系数小于2%，并且MDV最小的检测含量为10拷贝。利用该方法绝对定量检测感染1000PFU的SDWJ1302菌株发病鸡的分别于7、14、21、28、40、60和90天取不同样品组DNA，空白组的鸡也作同样处理，并与常规的PCR检测方法的灵敏度进行比较。结果表明，感染鸡的免疫器官在感染7天后就可以检测到马立克基因的拷贝数，鸡的血液和不同器官在感染28天后是检测到马立克基因拷贝的高峰期，但40天后逐渐下降。在淋巴细胞，肝脏和脾脏的病毒载量水平均高于其它器官，并且在不同阶段羽毛囊上皮细胞的含量最高。研究数据进一步证明涉及病毒感染的多器官和免疫器官的主要分布，从而导致免疫抑制和免疫细胞的转化。这是首次对早期潜伏感染和发病后阶段的不同组织和器官的马立克基因组的拷贝数进行了绝对定量，应用此方法能有利于促进我们对马立克氏病的发病机机理、传播、诊断、遗传特性和疫苗控制的进一步认识。2.共表达H9N2-NA和NDV-F的meq缺失性重组马立克病毒的构建及其生物学特性研究本实验室以前的研究报道表明，在马立克氏病病毒（MDV）基因组的pp38基因和1.8kb mRNA之间的305bp是一个双向启动子，分别启动MDV的1.8kb mRNA转录子和pp38基因的表达（两个方向作用的启动子分别P1.8kb和Ppp38表示），该双向启动子可被MDV自身表达的pp38/pp24二聚体作为反式转录因子激活。为了构建能同时表达禽流感病毒H9N2株的NA基因和鸡新城疫病毒（NDV）的F基因的meq基因缺失型重组I型MDV，首先以真核表达性质粒pcDNA3.1为骨架，构建了重组表达性载体质粒pPpp38-NA/1.8kb-F。在该质粒中，NDV-F基因位于双向启动子上游，由P1.8kb启动；AIV-NA基因位于该双向启动子下游，由Ppp38启动。为了提供作为反式转录因子pp38/pp24二聚体，将重组质粒pPpp38-NA/1.8kb-F与包含pp38/pp24表达质粒pBud-pp38-pp24共转染CEF。用针对NDV-F和AIV-NA的小鼠血清，对转染细胞做间接免疫荧光反应（IFA），证明了在重组质粒pPpp38-NA/1.8kb-F中该双向启动子确实可同时调控这两个外源基因的表达。为了将NA和F基因共表达盒插入MDV US2的非必要区，分别将MDV插入位点两侧序列并作为同源重组的两同源臂整合到NA和F基因共表达盒的两侧，构建成转基因重组载体质粒pPpp38-NA/1.8kb-F。PCR扩增同源重组大片段，将敲除了meq基因的GX0101（GX0101Δmeq）作为亲本病毒,在EL250大肠杆菌中通过同源重组将NA和F基因共表达盒插入GX0101Δmeq的US2非必要区，构建并筛选到重组MDV （MZC13NA/F）。IFA、ELISA和免疫印迹分析表明，重组病毒MZC13NA/F可在双向启动子的控制及MDV自身pp38/pp24二聚体激活下同时表达NDV-F和AIV-NA基因。MZC13NA/F的体外生长特性也说明，MZC13F/NA与其亲本病毒GX0101的CEF无显着差异。同时也表明,在1.8-kb mRNA转录方向的启动子活性高于pp38基因方向。用MDV的这个自身双向启动子构建并成功同时表达二个外源基因的重组MDV，不仅表明它可以作为一个有潜在利用价值的启动子，而且可在构建的重组MDV中减少外源DNA的插入。3.共表达H9N2-HA和-NA的meq缺失性重组马立克病毒的构建及其生物学特性研究为了构建能够表达来源于低致病性禽流感H9N2HA和NA，将野毒株GX0101作为亲本毒，通过同源重组的方法将强启动子CMV和SV40分别启动HA和NA共表达的串联大片段插入到GX0101基因组的meq位点取代meq基因，得到的病毒命名为MZC12HA/NA。体外进行rMDV和亲本毒GX0101生物学活性比较发现MZC12HA/NA与GX0101在CEF细胞的生长动态无明显差异。Southern bolt表明共表达盒成功插入到meq基因的双拷贝位点，meq基因完全被敲除。RT-qPCR显示HA和NA的mRNA转录水平显着高于MDV自身pp38mRNA的转录。ELISA检测显示HA和NA蛋白的表达也远远高于pp38蛋白的表达。IFA和western bolt分析表明HA和NA能够同时表达，且检测不到meq基因的表达。结果表明，作为AIV-H9N2与MDV重组得到的MZC12HA/NA致肿瘤meq基因被删除，且能够高水平表达H9N2的抗原基因HA和NA。4.同时表达AIV-H9N2的HA和NA基因的MZC12HA/NA重组MDV的免疫原性MZC12HA/NA免疫SPF和海兰褐鸡，在鸡体内均能良好地复制，但复制能力弱；重组病毒免疫SPF鸡后能诱导滴度为2.0左右的H9N2抗体；重组病毒和H9N2对海兰褐的免疫应答有明显协同作用；免疫后SPF鸡H9N2的排毒实验，对H9N2的保护率为30%-35%，所以该重组病毒将来可能应用于抵抗MDV和H9N2感染的重组疫苗的筛选。
苏帅[4]（2013）在《重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究》文中提出马立克氏病毒（Marek′s disease virus, MDV）是α疱疹病毒的成员，基因组为180kb左右的双股DNA，可引起鸡的淋巴细胞瘤。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的第一株整合有网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）长末端重复序列（Long terminal repeat, LTR）的重组野毒株。本实验室前期研究中已经构建了GX0101的细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）克隆以及敲除REV-LTR的突变株GX0101LTR，证实REV-LTR插入片段显着增强了GX0101的横向传播能力。敲除肿瘤基因meq的突变株GX0101meq病毒不但丧失对SPF鸡的致病性，而且不再引起肿瘤以及胸腺和法氏囊萎缩。本学位论文在上述研究的基础上，进一步构建不同的突变株，并以此深入研究MDV相关的生物学活性和研发MDV的基因缺失疫苗。1完成了GX0101株MDV的全基因组序列分析自然重组病毒GX0101在致病性、免疫原性、横向传播能力等方面具有独特的生物学活性。为了对GX0101进一步的分子病毒学研究，本研究利用GX0101的BAC克隆结合高通量测序技术完成了对其全基因组的序列分析。GX0101全基因组长178101bp,其基因组的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS区分别长12758bp、113572bp、12741bp、12700bp、11695bp、13134bp。GX0101全基因组仅含有一个REV-LTR重组片段，位于其基因组US区的SORF1中，SORF2基因前267bp碱基处。与rMd5不同，GX0101含有一个SORF2基因。通过与已发表的近10株MDV的比较,发现GX0101与英国分离株C12/130的两个不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。除了GX0101比其它毒株多出REV-LTR片段外，在经比较的190个开放阅读框（Open reading frame，ORF）中，不同毒株间发生不同程度变异的有77个。在这77个ORFs中， GX0101与pC12/130-10、pC12/130-15两个克隆呈100%同源的ORF分别有50个和47个，但与RB1B、Md5、GA、814和CVI988等毒株却只有7-27个ORFs呈现100%同源性。GX0101基因组TRS区的MDV97.3-97.6开放阅读框中，有5个连续的217bp碱基的重复，显着多于其它不同毒株的拷贝数。GX0101基因组的IRS区的86.2-86.4开放阅读框中，存在3个相同的217bp的重复序列，而其它MDV仅含有1-2拷贝的重复。GX0101的全基因组序列的比较分析，将有助于阐明与MDV致病性、传播性相关的基因，也有助于揭示不同地域间MDV的遗传变异和演化关系。2构建了meq基因缺失性疫苗候选株SC9-1，在SPF鸡实验中显示出比国内外最广泛应用的CVI988/Rispens有更好的保护性免疫力重组病毒GX0101meq表现出良好的保护性免疫作用，但基因组中带有卡纳霉素抗性基因，不符合农业转基因生物安全条例，因此不能作为疫苗使用。本研究设计的“对flp重组酶的部分诱导结合多重筛选”的方法，敲除掉GX0101meq中的卡那霉素抗性基因，筛选到具有良好复制能力的SC9-1（GX0101meq kana）株MDV。将SC9-1株MDV接种SPF鸡和含有MDV母源抗体的海兰褐蛋鸡，既没有致肿瘤性，也没有呈现免疫抑制、生长迟缓等任何致病性，而且能够为免疫鸡提供比CVI988/Rispens更好的保护性免疫。多次重复SC9-1株MDV对SPF鸡的免疫保护试验，以500PFU/只的剂量感染MDV超强毒rMd5，SC9-1均提供100%的免疫保护，显着高于CVI988/Rispens的免疫保护（保护率80-90%）。将SC9-1感染性克隆DNA通过肌肉注射1日龄SPF鸡，14天后能从鸡的体内分离到SC9-1病毒。为进一步探讨SC9-1的BAC质粒作为DNA疫苗提供思路。SC9-1株MDV基因缺失疫苗已获得农业部环境释放的审批书，并在3000只海兰褐蛋鸡完成了6个月的环境释放试验，并且持续观察6个月，不仅符合农业转基因生物安全，而且呈现很好的免疫保护效果，是一株理想的新型疫苗株，并且已经转让给北京翎羽生物科技有限公司进行后续相关的生产性试验。制备的中试产品证明SC9-1能提供比国内外最广泛应用的CVI988/Rispens株疫苗更好的保护性免疫力3对GX0101和GX0101LTR混合感染鸡群后连续病毒鉴别定量跟踪试验证明，REV-LTR插入片段使GX0101提高横向传播性，是其成为流行毒株的竞争性选择压优势为了模拟自然感染传播模式，比较并证实GX0101相对于其突变株GX0101LTR在鸡群横向传播上的竞争性选择压优势,本研究比较研究了能够对GX0101和GX0101LTR病毒基因组作鉴别性定量的双重荧光定量PCR的引物、探针和反应体系,并且成功的用于动态比较鸡群共感染以上两种病毒后在连续传代过程中不同病毒病毒血症。结果表明，将GX0101、GX0101LTR同等剂量感染SPF鸡后，第一代用于接触感染的空白SPF鸡在接触感染14天时即可检测到感染GX0101，而在接触感染28天时才能检测到感染GX0101LTR；而第二代用于接触感染的鸡在接触感染21、28天均能检测到感染GX0101，在28天时仅有一只鸡检测到GX0101LTR；同样第三代用于接触感染的鸡在与第二代鸡接触感染21、28天均能检测到感染GX0101，而没有检测到GX0101LTR。将GX0101显着低于GX0101LTR（100PFU/只的GX0101和2000PFU/只的GX0101LTR）的病毒共感染SPF鸡群，同一个隔离罩饲养进行接触感染传播。连续2次传代后，虽然在一部分接触感染病毒的鸡（6/10）中仍能够检出GX0101LTR，甚至在个别鸡仍为优势毒株，但是接触感染病毒的鸡全部能够检出带有REV-LTR的GX0101,并且部分鸡（4/10）仅能检出GX0101，不能检出GX0101LTR。以上结果证明了在鸡群内自然感染和传播过程中，带有REV-LTR的GX0101相对于敲除其REV-LTR的GX0101LTR株在横向传播性上显示出明显的竞争性选择压优势。这可以解释为什么在鸡群中发生率很低的MDV与REV间的基因重组产生的整合有REV-LTR的GX0101能从极低的比例演变为从鸡群中易于分离到的流行株的生物学机制。4敲除GX0101株SORF2基因的生物学活性比较表明SORF2基因表达产物与MDV不同株的横向传播性密切相关REV-LTR片段具有真核启动子和增强子活性，能够增强位于其插入位点后的MDV基因的表达。GX0101基因组中的REV-LTR片段位于SORF2基因上游,其对SORF2基因的转录表达都可能有很大影响，为了深入研究重组病毒GX0101的SORF2基因功能，本研究在感染性克隆GX0101-BAC的基础上构建了SORF2基因缺失株GX0101sorf2。试验结果表明SORF2基因并非MDV复制以及致肿瘤必需基因，敲除掉SORF2基因的GX0101sorf2在细胞培养与GX0101的复制能力相同。与GX0101相比，GX0101sorf2对鸡的致死率以及致肿瘤率下降，但是差异不显着。GX0101sorf2横向传播的感染率低于GX0101。GX0101中的REV-LTR片段插入增强SORF2蛋白的表达，表明GX0101具有较强的横向传播能力可能与SORF2蛋白的大量表达这一分子机制相关。5插入ALV-LTR的重组MDV的构建及其生物学活性的比较研究ALV与REV一样同属于禽反转录病毒，在我国鸡群中普遍存在MDV与ALV的共感染。为了研究ALV-LTR片段在GX0101基因组重组位点上的稳定性，以及ALV-LTR片段的插入对MDV生物学活性的影响，并以此为模型研究ALV与MDV的重组病毒。本研究利用基于链霉素负筛选系统的同源重组方法将ALV-J中国分离株NX0101的LTR片段完全等位取代bac-GX0101的REV-LTR片段，构建了含有ALV-LTR片段的重组病毒GX0101-ALV-LTR。GX0101-ALV-LTR在细胞培养上具有与GX0101相似的复制能力，在细胞上连续传代20代，通过PCR验证，ALV-LTR都能在GX0101-ALV-LTR的基因组中稳定存在。将GX0101-ALV-LTR接种1日龄SPF鸡，接种后6-8周，PCR验证ALV-LTR能在GX0101-ALV-LTR基因组中稳定存在。通过接触感染的病毒基因组中ALV-LTR依然能够稳定遗传。攻毒90天，GX0101-ALV-LTR的死亡率和肿瘤率分别为55%和20%。相比GX0101LTR，间接免疫荧光以及Western Blot试验显示，GX0101-ALV-LTR的SORF2蛋白表达量显着增加；Northern Blot试验显示GX0101-ALV-LTR的SORF2、US1、US10基因转录量显着增加。GX0101-ALV-LTR是国内外第一株整合进ALV来源LTR的重组MDV,证实整合进MDV同一位点的ALV-LTR片段能与插入的REV-LTR片段一样稳定遗传，并显示类似的生物学特性。6用基因芯片技术比较分析了LTR插入片段对重组MDV中不同基因表达水平的影响利用定制的Agilent表达谱芯片，分析比较了带有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101LTR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR在感染CEF细胞上的病毒不同基因的表达水平。结果表明，在GX0101与GX0101LTR病毒差异表达显着的基因中（P<0.05），75个MDV基因GX0101的转录水平显着增高，其中上调倍数大于10倍的共14个基因，而位于REV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上调倍数多达30倍以上，其中SORF2基因上调最为显着，高达399倍；GX0101的UL38基因转录降低，下调倍数为8.3倍。GX0101-ALV-LTR与GX0101非常类似，与GX0101LTR相比，同样位于ALV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上调倍数多达30倍以上，SORF2基因上调最为显着；GX0101-ALV-LTR的UL38基因转录下调倍数为6.7倍。利用Northern Blot以及Western Blot试验证实了插入LTR片段的重组病毒SORF2的转录子及表达蛋白均显着升高。这些比较研究结果将有助于进一步分析LTR插入片段赋予重组MDV显着升高的横向传播性究竟与MDV的那些基因表达产物相关。7用基因芯片技术比较分析了LTR插入片段对重组MDV感染的细胞基因组不同基因转录水平的影响利用定制的Agilent表达谱芯片，分析比较了带有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101LTR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR对感染的CEF细胞基因组不同基因的表达水平的影响。对鸡41765个基因的表达差异进行了分析，结果显示，感染GX0101的CEF细胞基因与感染GX0101LTR相比，转录显着增高的有12个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST1024a11（GeneBank NO. BU288902.1）、SKOR2（GeneBank NO. XM001233569.2）上调倍数分别为190倍、165倍；转录显着降低的基因有4个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST445i1（GeneBank NO. CR390488.1）下调倍数为105倍。感染GX0101-ALV-LTR的CEF细胞基因与感染GX0101LTR相比，转录显着增高的有5个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST1024a11（GeneBank NO. BU288902.1）、SKOR2（GeneBank NO. XM001233569.2）上调倍数分别为203倍、83倍；转录水平下降基因的下调倍数均小于20倍。通过基因芯片表达谱筛选出的显着差异基因有助于进一步研究插入LTR片段的重组MDV病毒不同的生物学活性与宿主基因转录水平的相关性。本研究不仅进一步通过模拟自然感染模式证明REV-LTR插入片段显着提高了病毒GX0101在鸡群中的横向传播性，是其从极少数的突变株变为流行株的流行病学机制，也部分阐明了REV-LTR提高GX0101横向传播性的分子机制。还利用BAC克隆技术将GX0101改造成了一株保护免疫力优于CVI988/Rispens的新的疫苗候选株。
丁家波,李延鹏,杨明,李中明,孙爱军,崔治中[5]（2009）在《马立克氏病毒1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性的影响》文中指出构建了针对1.8-kb mRNA基因簇潜在阅读框的RNA干扰质粒pP（1.8-kb-RNAi）。将该质粒与包含其上游双向启动子的质粒pP（pp38）-CAT和pP（1.8-kb）-CAT共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）和MDV rMd5感染的CEF（rMd5-CEF）,48 h后,通过测定转染细胞裂解液中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的活性确定1.8-kb mRNA被干扰后对双向启动子活性的影响。结果显示,利用pP（1.8-kb-RNAi）质粒干扰1.8-kb mRNA,可以使其上游双向启动子两个方向的活性均显着下降（P<0.01）,其中1.8-kb mRNA方向下跌29.5%,pp38方向下跌25.0%。本研究结果证明了1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性有增强作用。
李继松[6]（2009）在《鸡马立克氏病病毒超强毒L-ZY株细菌人工染色体的构建》文中认为鸡马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒（MDV）引起的淋巴细胞肿瘤性疾病,在全世界范围内曾给养鸡业造成极大的经济损失。从20世纪50年代开始至今人们依次用火鸡疱疹病毒（HVT）、HVT与MDV血清Ⅱ型联用、MDV血清Ⅰ型弱毒株疫苗来接种雏鸡,获得了很好的免疫保护,使该病得到了很好的控制。但是到20世纪90年代后期,新出现的MDV超超强毒已经能够突破疫苗的免疫保护屏障,在免疫鸡群中引发MD。MDV L-ZY毒株是2006在我国东北地区分离的MDV超强毒株,可导致70%HVT免疫鸡群发生MD,与近年在国内分离的几个超强毒株亲缘关系较近,具有一定的地方流行性和代表性。超强毒株的出现为人们防控MD带来了新的挑战,研究MDV的致病机理和疫苗免疫保护机理对于防控MD有着非常重要的意义。MDV是严格的细胞结合毒,难于对病毒直接进行基因水平上的操作,最近出现的细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome,BAC）技术成功地解决了这一难题,本研究就是利用BAC技术构建MDV超强毒L-ZY毒株细菌人工染色体感染性克隆。首先,利用黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（GPT）基因表达盒,带有细菌人工染色体基本基因功能序列（pBeloBAC11,7.5kb）及MDV Us2区左右同源臂成功构建了含有两个相同序列方向loxP位点的MDV重组病毒转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11,并且两个相同序列方向loxP位点分别位于BAC-gpt核心序列两侧,以保证选择标记基因和BAC序列在不需要时进行删除。转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11经酶切、PCR鉴定和两个loxP位点间序列的剪切测试完全正确。利用同源重组的方法,运用磷酸钙转染技术,将提取并纯化的转移载体与MDV感染CEF细胞的总DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞（CEF）,待启动病毒感染后,利用GPT加压筛选标记,通过改进的加压筛选方法,经过6轮的加压筛选富集并获得了Us2区插入miniF核心序列的L-ZY BAC重组病毒。适时提取L-ZY BAC重组病毒感染细胞基因组总DNA,将其电转入DH10B感受态细胞中,获得L-ZY BAC（鸡马立克氏病病毒L-ZY株全基因组细菌人工染色体）,经过PCR、凝胶电泳鉴定总共获得21个阳性克隆。将提取纯化的L-ZY BAC21转染次代CEF细胞,再次启动了病毒感染,产生了MDV特异性病毒蚀斑,拯救出了纯系重组病毒——derived-MDV LZY21。本研究成功构建了MDV血清Ⅰ型超强毒L-ZY株细菌人工染色体,从而完善了MDV细菌人工染色体反向遗传操作系统技术平台,为研究MDV的致瘤机制、潜伏机制、基因功能以及新型MDV疫苗的开发奠定了良好的基础。
孙爱军[7]（2009）在《马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究》文中研究说明马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）是α类疱疹病毒,其基因组为174kb的双股DNA。对于未经免疫的鸡群,有很高的传染性和致肿瘤性。鸡在感染MDV后除了造成死亡外,耐过鸡可终身带毒并长期排毒。因而,在鸡场里和周围环境中该病毒长期存在。禽网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosis,REV）是一类C型反转录病毒,基因组是8kb的单股正链RNA,其基因组结构类似于一个完整的转座子,这是鸡的另一种致肿瘤病毒。张志等（2004）等首次从患鸡的抗凝血中分离到整合进REV-LTR片段的天然MDV野毒株GX0101和GD0202,这表明在自然感染的条件下,REV除了能与MDV共感染同一只家禽外,还能整合到MDV的基因组中,本研究将进一步阐明MDV这种重组野毒株致病性是否发生变化,特别是这种重组作用是否会增强MDV的传染性或在体内的复制能力,外源片段的的插入对病毒的致病性,特别是其生物学特性产生了怎样的影响。在以上背景下,本研究比较了天然重组野毒株GX0101对鸡的致病性,并将其构建成感染性细菌人工染色体。在此基础上将插入片段REV-LTR敲除再进一步研究其生物学特性。同时,对MDV的两个致瘤基因1.8kb mRNA及ICP4基因进行了相关研究。不仅积累了大量的数据而且提出并验证了新的观点。1天然重组野毒株GX0101的致病性研究分别选用海蓝褐公鸡和SPF鸡进行GX0101毒株的致病性测定。1日龄免疫HVT疫苗后于5日龄分别接种野毒株GX0101及超强毒株rMd5,每天观察记录死亡并逐只剖检记录发生肿瘤情况。试验结果显示,GX0101株病毒对海蓝褐公鸡的生长抑制作用要比rMd5株弱。而且GX0101株病毒对已经有HVT疫苗免疫的海蓝褐公鸡的致死率只有44%要显着低于rMd5株的70%（P<0.01）,而且它的致肿瘤率只有16%显着低于rMd5株的36%（P<0.05）, GX0101株病毒对已免有HVT疫苗的SPF鸡的致死率只有28.24%要显着低于rMd5株的64.63%（P<0.01）,而且它的致肿瘤率只有7.06%显着低于rMd5株的19.51%（P<0.05）,该结果表明GX0101株病毒的致病性要低于强毒株rMd5株。张志（2004）和庄国庆（2006）分别在SPF鸡中做了人工感染试验,结果显示GX0101毒株的致病性要强于强毒株GA株。因此,GX0101株的致病性应是介于强毒GA与超强毒rMd5间的一株病毒。由此看来,GX0101的致病性并不是使其成为流行毒株的竞争优势。2带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101的BAC感染性克隆的构建及其致病性比较2.1带有MDV基因组US2片段作为同源臂的转基因BAC载体的构建MDV的US2区两侧的同源臂用于同源重组时将BAC载体插入MDV基因组,其中2.1kb的同源臂来自质粒pDS-pHAI,4.0kb同源臂来自质粒pUS2-Partial-F,通过限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ的双酶切作用,及T4DNA Ligation连接,成功构建重组转基因载体质粒pDS-pHAI-US2。2.2 GX0101 BAC感染性克隆的构建及其拯救利用磷酸钙或脂质体转染技术,将转移载体pDSpHAI-US2与MDV GX0101感染CEF细胞的总DNA共感染鸡胚成纤维细胞。待出现细胞病变时,将其传至已加有霉酚酸-黄嘌呤-次黄嘌呤选择培养基的原代CEF上,经四轮筛选、富集重组病毒后,提取重组病毒感染CEF细胞的总DNA,电转化大肠杆菌DH10B。次日,挑取阳性克隆。经酶切及PCR鉴定后,提取BAC DNA转染CEF细胞,再次启动了病毒感染,产生了MDV特异性病毒蚀斑,拯救出了重组病毒;进一步研究表明重组病毒bac-GX0101与亲本毒GX0101在体外CEF单层上的生物学特性相似。2.3 GX0101感染性克隆的致病性比较将BAC克隆毒bac-GX0101与亲本毒GX0101接种1日龄SPF鸡,动物实验结果表明bac-GX0101毒株与亲本GX0101毒株对机体的生长性能等方面的影响没有差异,而且bac-GX0101毒株仍然保留着很好的免疫抑制功能及致肿瘤能力。该感染性克隆bac-GX0101为研究该重组野毒株中REV-LTR插入片段及其他基因的生物学功能提供了有用的技术平台。3敲除REV-LTR的感染性克隆的构建及其生物学特性比较3. 1 MDV天然重组野毒株GX0101中LTR序列的敲除MDV和REV间的自然重组的机率是很低的,在我们近几年分离到的十多个野毒株中,却有两个是重组病毒,说明这一重组过程一定有某种选择竞争性优势。为了阐明天然重组插入的REV-LTR究竟能给原始的MDV带来什么生物学特性变化,对基因组做相应的突变是必经的步骤。将GX0101构建成感染性细菌人工染色体,由于我们可以比较方便地对感染性克隆质粒GX0101-BAC基因组进行修饰,如定点敲除重组野毒株中某个基因或基因片段。这就可以用其作为研究该株MDV的特定基因或基因片段与致病性或其他生物学活性关系的一个新的技术平台。本研究利用Red/ET介导的突变技术,用卡那霉素抗性基因代替要敲除的LTR序列。设计引物,以质粒PKD13为模板,扩增卡那霉素抗性基因。这对引物3’端20个碱基来源于卡那霉素抗性基因,用来扩增该抗性基因,5’端50个碱基来源于MDV,用来同源重组,上下游引物5’端的这50个碱基来源于MDV基因组,分别位于要敲除的LTR序列的两端。卡那霉素抗性基因两端FRT位点是重组酶Flpe的识别位点。卡那霉素抗性基因取代LTR序列后,用0.1%的阿拉伯糖诱导表达Flpe重组酶,从而将卡那霉素抗性基因去除。利用脂质体转染技术,拯出重组病毒,命名为bac-GX0101△LTR。3.2整合进GX0101基因组中的REV-LTR序列的生物学特性研究在5日龄时,分别接种bac-GX0101及bac-GX0101△LTR于1日龄免疫HVT疫苗的SPF鸡,无论是bac-GX0101还是bac-GX0101△LTR,感染SPF鸡后,对生长性能和对NDV、AIV（H9-）灭活疫苗免疫后HI抗体反应均呈现出不同程度的抑制作用。相对而言,bac-GX0101△LTR对SPF鸡的致病作用低于bac-GX0101;斑点杂交检测羽毛囊中的MDV基因组DNA说明,与接种bac-GX0101毒株的同笼饲养的未攻毒鸡的MDV基因组的检出时间和接种bac-GX0101△LTR毒株的同笼饲养的未攻毒鸡的MDV基因组的检出时间相比要早一周,并且检出率也要高。接种bac-GX0101毒株和bac-GX0101△LTR毒株的鸡群在100天内的死亡率分别是28.13%和43.75%;出现肿瘤的比率是9.3%和12.5%。这充分说明REV-LTR的插入不是增强GX0101毒株的致病性和致肿瘤能力而是增强了GX0101毒株的横向传播能力,从而使GX0101毒株具有一定的竞争优势,成为流行毒株。4 MDV中1.8-kb mRNA基因的潜在阅读框A和C的敲除及其功能研究为了研究马立克氏病毒（MDV）1.8kb mRNA中潜在阅读框的功能,利用Red/ET技术将1.8kb mRNA中潜在阅读框（A+C）敲除,并成功转染出病毒bac-GX0101△（A+C）,同时将bac-GX0101△（A+C）与bac-GX0101分别感染CEF后,转染包含MDV上游双向启动子的质粒pP（pp38）-CAT和pP（1.8-kb）-CAT,48h后,通过测定转染细胞裂解液中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的活性确定MDV 1.8-kb mRNA中潜在阅读框对双向启动子活性的影响。结果显示,1.8kb mRNA中潜在阅读框（A+C）的缺失可以使其上游双向启动子两个方向的活性均显着下降（P<0.01）。本研究结果证明了1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性具有增强作用。将bac-GX0101△（A+C）和bac-GX0101毒株感染SPF鸡,动物试验结果表明,GX0101毒株缺失1.8kbmRNA后,对鸡群的增重影响较轻。且对NDV和AIV灭活疫苗免疫后HI抗体滴度均高于bac-GX0101感染组, bac-GX0101△（A+C）感染的鸡只肿瘤出现时间比bac-GX0101晚22d,说明仅仅敲掉开放阅读框A和C并不能消除其致瘤性。5 MDV中ICP4基因的敲除及其致病性比较本文利用Red/ET介导的突变技术,将ICP4基因敲除,拯救出重组病毒bac-GX0101△ICP4。分别将bac-GX0101△ICP4和bac-GX0101接种SPF鸡,动物试验结果表明,GX0101毒株缺失ICP4基因后,对NDV和AIV灭活疫苗免疫后HI抗体滴度低于对照组,且与bac-GX0101的差异不显着（P>0.05）,且鸡群在感染bac-GX0101△ICP4毒株后58d检测到内脏肿瘤,说明ICP4基因并不直接参与肿瘤的形成。
丁家波,李延鹏,杨明,李中明,孙爱军,崔治中[8]（2008）在《马立克氏病毒1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性的影响》文中研究说明为了研究马立克氏病毒（MDV）1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性的影响,本文构建了针对1.8-kb mRNA基因簇潜在阅读框的RNA干扰质粒pP（1.8-kb-RNAi）。将该质粒与包含其上游双向启动子的质粒pP（pp38）-CAT和pP（1.8-kb）-CAT共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）和MDV rMd5感染的CEF（rMd5-CEF）,48h·后,通过测定转染细胞裂解液中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的活性确定1.8-kb mRNA被干扰后对双向启动子活性的影响。结果显示,利用pP（1.8-kb-RNAi）质粒干扰1.8-kb mRNA,可以使其上游双向启动子两个方向的活性均显着下降（P<0.01）,其中1.8-kb mRNA方向下跌29.5 %,pp38方向下跌25.0%。本研究结果证明了1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性有增强作用。
刘明亮[9]（2008）在《鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因的真核表达及其特异性单克隆抗体的研制》文中研究指明根据Genbank发表资料,设计了一对引物,应用PCR方法扩增出鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因,将PCR产物克隆到pGEM-T easy载体,经限制性酶切分析和测序证实扩增到的pp38基因序列完全正确。用BamHⅠ和PstⅠ酶将该基因片段从pGEM-T easy载体切下,回收目的DNA片段并与杆状病毒转座载体pFastBac 1连接,筛选出重组转座载体pFastBac 1- pp38,转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后,获得重组穿梭质粒rBacmid-pp38;将重组质粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得了含有鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因的重组杆状病毒rBacmid- pp38 （ r pp38 ）。重组病毒感染Sf9细胞后,用IFA方法对细胞表达产物进行检测,结果表明:构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38蛋白。将表达鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38蛋白的昆虫细胞免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。用丙酮乙醇固定液固定的感染了鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B的鸡成纤维细胞CEF,通过间接免疫荧光试验（IFA）检测杂交瘤细胞培养上清,结果筛选出1株分泌抗MDV-PP38蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株,命名为pp38-2F6,经2次亚克隆后,100%杂交瘤细胞保持了分泌抗体的能力。间接免疫荧光试验证明,这一株单克隆抗体能与MDV-RB1B以及MDV-CVI988感染的CEF反应,应用捕获ELISA方法进行的亚类鉴定结果表明:单抗2F6为IgG2b,此单抗将可以广泛用于体外表达系统表达pp38基因的鉴定和功能的深入研究。
乔丽平[10]（2007）在《鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病病毒后3号染色体微卫星不稳定性的研究》文中认为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）广泛存在于人类肿瘤的基因组中。鸡马立克氏病（MD）是鸡的一种危害最严重的病毒所致的肿瘤性疾病，目前国内外鲜有关于鸡马立克肿瘤发生后宿主基因组的微卫星不稳定性的报道，其他家畜肿瘤上也没有宿主基因组MSI的研究报告。通过检测鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病超强毒RBlB株后，鸡三号染色体上的基因组微卫星不稳定性情况，旨在发现是否存在与鸡马立克氏病发生相关的宿主基因组改变，为从宿主的角度研究鸡马立克肿瘤发生和发展的生物学提供基础研究资料。在本实验中应用27个SPF鸡胚，培育鸡胚成纤维细胞，来自同一鸡胚个体的成纤维细胞一半接种马立克氏病超强毒RBIB株，另一半不接毒，作为对照。分别提取培养细胞的基因组DNA，选取鸡三号染色体上27个微卫星标记，分别采用聚合酶链式反应、PAGE电泳、银染等技术检测基因组微卫星不稳定性。结果，27个微卫星位点中有20个出现微卫星不稳定性，平均变化频率为工6。30％，变化频率最高的为ABRl41、MCW259、ABR426（25.93％）；没有检测到杂合性缺失。24例鸡胚有两个或两个以上位点出现基因组变化。本研究首次发现鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病病毒后3号染色体上存在多位点的微卫星不稳定性。感染马立克氏病病毒后CEF可出现多个微卫星位点的改变，提示MDV感染CEF早期可能会整合到宿主的多个位点引起基因组的变化。以PCR、电泳和银染为基础的微卫星技术可以快速、有效地检测出染色体内部基因组的不稳定性，这为动物肿瘤疾病的研究提供了一个很好的癌基因研究模式。
二、马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的部分功能（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的部分功能（论文提纲范文）
（1）miRNA和MDV原癌基因Meq在鸡马立克氏病肿瘤转化过程中作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 引言 |
| 本研究的目的与意义 |
| 总体试验设计与技术路线 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 马立克氏病概述 |
| 1.1.1 马立克氏病病毒 |
| 1.1.2 马立克氏病感染阶段 |
| 1.1.3 马立克氏病流行与防控情况 |
| 1.1.4 马立克氏病研究进展 |
| 1.2 miRNA概述 |
| 1.2.1 miRNA生成与作用机制 |
| 1.2.2 miRNA与癌症 |
| 1.2.3 miRNA与马立克氏病 |
| 1.2.4 miR-219、miR-130和miR-140研究进展 |
| 1.3 DNA甲基化概述 |
| 1.3.1 DNA甲基化检测方法 |
| 1.3.2 肿瘤中miRNA的异常表达与DNA甲基化 |
| 1.3.3 马立克氏病的遗传抗性与DNA甲基化 |
| 第二章 gga-miR-219b和Meq在马立克氏病肿瘤转化过程中作用机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验样本 |
| 2.2.2 主要试剂及药品 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 主要试剂配置 |
| 2.2.5 试验方法与流程 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 miRNA靶基因生物学预测 |
| 2.3.2 gga-miR-219b和候选靶基因BCL11B在MDV引发的肿瘤化和未感染组织中的表达量 |
| 2.3.3 双荧光素酶报告基因试验 |
| 2.3.4 gga-miR-219b对MSB1细胞中靶基因BCL11B表达的影响 |
| 2.3.5 gga-miR-219b对MSB1细胞特性的影响 |
| 2.3.6 干扰靶基因BCL11B表达的siRNA筛选 |
| 2.3.7 BCL11B干扰对MSB1细胞特性的影响 |
| 2.3.8 gga-miR-219b和BCL11B干扰对MDV原癌基因Meq表达的影响 |
| 2.3.9 Meq干扰对MSB1细胞特性的影响 |
| 2.3.10 Meq干扰对BCL11B基因表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 gga-miR-219b和靶基因BCL11B在马立克氏病肿瘤转化过程中的作用机制 |
| 2.4.2 Meq基因在马立克氏病肿瘤转化过程中的作用机制 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 gga-miR-130b-3p在马立克氏病肿瘤转化过程中作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验样本 |
| 3.2.2 主要试剂及药品 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂配置 |
| 3.2.5 试验方法与流程 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 gga-miR-130b-3p在MDV引发的肿瘤化和未感染组织中的表达量 |
| 3.3.2 肿瘤化和未感染脾脏中gga-miR-130b-3p编码基因上游的甲基化水平 |
| 3.3.3 甲基化转移酶和去甲基化相关酶在肿瘤化和未感染脾脏中的差异表达 |
| 3.3.4 gga-miR-130b-3p对MSB1细胞特性的影响 |
| 3.3.5 gga-miR-130b-3p对MDV原癌基因Meq表达量的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 gga-miR-140-3p在马立克氏病肿瘤转化过程中作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试验样本 |
| 4.2.2 主要试剂及药品 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 主要试剂配置 |
| 4.2.5 试验方法与流程 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 gga-miR-140-3p在MDV引发的肿瘤化和未感染组织中的表达量 |
| 4.3.2 gga-miR-140-3p对MSB1细胞增殖的影响 |
| 4.3.3 gga-miR-140-3p对MSB1细胞迁移的影响 |
| 4.3.4 gga-miR-140-3p对侵袭相关基因表达的影响 |
| 4.3.5 gga-miR-140-3p对MDV原癌基因Meq表达量的影响 |
| 4.3.6 gga-miR-219b、gga-miR-130b-3p和gga-miR-140-3p预测靶基因之间的互作关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（2）马立克氏病毒pp38基因对Toll样受体通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 1 马立克氏病的研究进展 |
| 2 马立克氏病病毒基因组 |
| 2.1 病毒分类 |
| 2.2 MDV的形态学特征 |
| 2.3 MDV的分子特征 |
| 3 流行病学 |
| 4 临床症状 |
| 5 发病机制 |
| 5.1 早期溶细胞期 |
| 5.2 潜伏期 |
| 5.3 晚期溶细胞和免疫抑制期 |
| 5.4 增殖期 |
| 6 免疫应答机制 |
| 6.1 非特异性防御机制 |
| 6.2 适应性免疫应答 |
| 6.3 抗体的作用 |
| 6.4 细胞介导的免疫应答作用 |
| 7 抗马立克氏病疫苗 |
| 8 生物安全 |
| 9 马立克氏病病毒致肿瘤基因pp38的研究 |
| 10 Toll样受体在免疫应答中的作用 |
| 10.1 TLRs的简介 |
| 10.2 TLRs信号通路及相关细胞因子 |
| 11 研究的目的和意义 |
| 研究内容一 马立克氏病pp38蛋白真核表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌种与细胞 |
| 1.2 载体与主要试剂 |
| 1.3 培养基与试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CVI988株与RB1B株基因组总DNA的提取 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 PCR扩增CV1988株与RB1B株pp38基因 |
| 2.4 PCR产物的回收纯化 |
| 2.5 酶切 |
| 2.6 酶切回收纯化 |
| 2.7 连接 |
| 2.8 E.coli DH5α感受态的制备 |
| 2.9 转化 |
| 2.10 阳性克隆筛选鉴定 |
| 2.11 阳性重组质粒转染CEF细胞 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 |
| 2.13 Western blot鉴定重组质粒的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 MDV pp38基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 pp38重组质粒的筛选和酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒pCMV-pp38-Flag中pp38基因测序结果 |
| 3.4 转染细胞中pp38表达的检测 |
| 3.5 Western blot中重组质粒的表达 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 疫苗株与强毒株pp38蛋白对Toll样受体信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组质粒中量提取 |
| 2.2 重组质粒转染CEF细胞 |
| 2.3 poly(I:C)刺激 |
| 2.4 RNA提取 |
| 2.5 反转录 |
| 2.6 Real-time PCR |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MyD88非依赖途径相关基因表达情况 |
| 3.1.1 pp38对TLR3表达的抑制作用 |
| 3.1.2 TRIF途径的相对表达量 |
| 3.1.3 IRIF3的相对表达量 |
| 3.1.4 IKKα NF-κB的相对表达量 |
| 3.2 MyD88依赖途径相关因子的表达情况 |
| 3.3 其他Toll样受体的表达情况 |
| 3.3.1 TLR2的相对表达量 |
| 3.3.2 TLR7的相对表达量 |
| 3.3.3 TLR15的相对表达量 |
| 3.3.4 TLR4、TLR21的相对表达量 |
| 3.4 其他细胞因子及免疫活性因子的检测 |
| 3.4.1 IL-6、IL-12及TNF-α的表达情况 |
| 3.4.2 MDA5通路相关因子 |
| 3.4.3 PKR的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 pp38对MyD88非依赖途径的抑制作用 |
| 4.2 pp38对MyD88依赖途径的影响 |
| 4.3 病毒致病力对TLRs表达量的影响 |
| 4.4 pp38对其他一些细胞因子的影响 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）共表达不同外源基因的重组弱毒Ⅰ型马立克氏病毒的构建和生物学特性比较（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 马立克氏病（MD）的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 发病机理及病理变化 |
| 1.2 MDV 分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 MDV 基因组结构 |
| 1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因 |
| 1.2.3 MDV 的基因及相关蛋白 |
| 1.3 DNA 片段克隆的载体系统 |
| 1.3.1 质粒(plasmid) |
| 1.3.2 粘粒 |
| 1.3.3 BAC 的优势及其发展 |
| 1.4 MD 的防制 |
| 1.4.1 免疫机理 |
| 1.4.2 疫苗研究进展 |
| 1.4.3 目前 MDV 疫苗的种类 |
| 1.4.3.1 常规致弱疫苗 |
| 1.4.3.2 新型疫苗 |
| 1.4.3.3 重组活载体疫苗 |
| 1.5 研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常规分子克隆试剂 |
| 2.1.2 试剂准备： |
| 2.1.3 单、多克隆抗体 |
| 2.1.4 相关表达载体 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 相关疫苗及抗原 |
| 2.1.7 实验动物 |
| 2.1.8 相关病毒及菌种(H9N2 和 NDV) |
| 2.2 常规试验操作方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
| 2.2.2 常规 PCR |
| 2.2.3 PCR 产物的纯化回收 |
| 2.2.4 PCR 产物与 Vector 的连接反应 |
| 2.2.5 DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.2.7 质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.8 质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.2.9 质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.10 AIV-H9N2 或 NDV 的鸡胚培养 |
| 2.2.11 病毒 RNA 的提取以及反转录 |
| 2.2.12 MDV 的拯救、鉴定 |
| 2.2.13 MDV 的 IFA 鉴定 |
| 2.2.14 MDV 的增殖、定量 |
| 2.2.15 MDV 的定量 |
| 2.2.16 MDV 病血的测定 |
| 2.2.17 MDV BAC 质粒的大量制备 |
| 2.2.18 MDV DNA 的提取 |
| 2.2.19 电转化感受态细胞的制备 |
| 2.2.20 MDV BAC 质粒的电转化 |
| 2.2.21 重组蛋白的纯化以及 SDS-PAGE 蛋白质电泳 |
| 2.2.22 淋巴细胞的分离以及 DNA 的提取 |
| 2.2.23 ELISA |
| 2.2.24 地高辛标记探针的合成 |
| 2.2.25 血凝血抑试验 |
| 2.2.26 间接免疫荧光 (IFA) |
| 2.2.27 Southern blot |
| 2.2.28 Western blot |
| 2.3 实时荧光绝对定量强毒株 SDWJ1302 不同感染阶段在组织中的含量和分布 |
| 2.3.1 引物设计与合成 |
| 2.3.2 SDWJ1302 病毒培养 |
| 2.3.3 病毒 DNA 提取 |
| 2.3.4 阳性标准品的制备 |
| 2.3.4.1 Ovo 基因 PCR 扩增 |
| 2.3.4.2 管家基因的纯化 |
| 2.3.4.3 连接与转化 |
| 2.3.4.4 质粒 DNA 的提取 |
| 2.3.4.5 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定 |
| 2.3.5 标准品的获取与定量（紫外分光光度法） |
| 2.3.6 标准曲线的制备 |
| 2.3.7 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的建立 |
| 2.3.8 MDV 感染试验，样品采集和 DNA 提取 |
| 2.3.9 实时定量 PCR |
| 2.3.10 敏感性、特异性和重复性试验 |
| 2.3.11 SYBR Green q-PCR 与常规病毒血症检测方法比较灵敏度 |
| 2.3.12 检测样品 MDVDNA 载量的定量 |
| 2.3.13 数据分析 |
| 2.4 以 GX0101 构建 meq 基因缺失共表达 H9N2-NA 和 NDV-F 重组马立克病毒及其生物学特性的比较 |
| 2.4.1 RT-PCR |
| 2.4.2 样品的 RNA 提取与 RT-PCR |
| 2.4.3 基因扩增产物的回收与纯化 |
| 2.4.4 质粒构建 |
| 2.4.5 质粒 DNA 的提取 |
| 2.4.6 质粒转染 |
| 2.4.7 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.4.8 MZC13NA/F 构建 |
| 2.4.9 meq 基因缺失株的拯救 |
| 2.4.10 MZC13NA/F 病毒感染细胞 |
| 2.4.11 DNA 印记杂交 |
| 2.4.12 NA, F 和 pp38 基因的 mRNA 分析 |
| 2.4.13 病毒感染细胞的 IFA |
| 2.4.14 ELISA |
| 2.4.15 Western blot |
| 2.5 以 GX0101 构建 meq 基因缺失共表达 H9N2-HA 和-NA 重组马立克病毒及其生物学特性的比较 |
| 2.5.1 AIV-H9N2 病毒鸡胚扩增 |
| 2.5.2 鼠抗 H9N2 NA 蛋白高免血清的制备 |
| 2.5.3 真核 HA 和 NA 共表达质粒的构建 |
| 2.5.3.1 基因扩增产物的回收与纯化 |
| 2.5.3.2 质粒构建 |
| 2.5.3.3 构建 HA 和 NA 共表达盒 |
| 2.5.3.4 质粒DNA的提取 |
| 2.5.4 质粒转染 |
| 2.5.5 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5.6 共表达质粒诱导雏鸡抗体反应 |
| 2.5.7 构建重组马立克病毒 MZC12HA/NA |
| 2.5.8 meq 基因缺失株的拯救 |
| 2.5.9 MZC12HA/NA 病毒感染细胞 |
| 2.5.10 DNA 印记杂交 |
| 2.5.11 HA, NA 和 pp38 基因的 mRNA 分析 |
| 2.5.12 病毒感染细胞的 IFA |
| 2.5.13 ELISA |
| 2.5.14 Western blot |
| 2.5.15 重组病毒在体内的复制 |
| 2.5.16 重组病毒和 H9N2 灭活苗对有母源抗体的海兰褐鸡体的抗体水平影响 |
| 2.3.17 攻毒保护实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 实时荧光绝对定量强毒株 SDWJ1302 不同感染阶段在组织中的含量和分布 |
| 3.1.1 目标 Meq 和 ovo 基因的获得 |
| 3.1.2 与 vector 连接，转化获得标准质粒 |
| 3.1.3 Q-PCR 的标准曲线 |
| 3.1.4 Q-PCR 的灵敏度 |
| 3.1.5 Q-PCR 的特异性 |
| 3.1.6 Q-PCR 的重复性 |
| 3.1.7 SYBR Green Q-PCR 与常规病毒血症灵敏度比较 |
| 3.1.8 羽毛囊和组织中 MDV 基因组的定量 |
| 3.2 以 GX0101 构建 meq 基因缺失共表达 H9N2-NA 和 NDV-F 重组马立克病毒及其生物学特性的比较 |
| 3.2.1 AIV-NA 或 NDV-F 的表达取决于 pp38/pp24 二聚体的存在 |
| 3.2.2 MZC13NA/F 的传代，纯化与验证 |
| 3.2.3 重组 MZC13NA/F 特性 |
| 3.2.4 实时定量 RT-PCR 检测感染不同 rMDV 的 CEF 中的 NA 和 F 基因启动子活性的比较 |
| 3.2.5 重组 NA 或 F 蛋白表达的检测 |
| 3.2.6 在 MZC13NA/F 感染的细胞比较 F, NA 和 pp38 蛋白的表达 |
| 3.3 以 GX0101 构建 meq 基因缺失共表达 H9N2-HA 和-NA 重组马立克病毒及其生物学特性的比较 |
| 3.3.1 pET28-NA 质粒的酶切鉴定: |
| 3.3.3 重组真核共表达载体的酶切鉴定 |
| 3.3.4 HA 和 NA 蛋白的间接免疫荧光检测 |
| 3.3.5 动物免疫保护试验 |
| 3.3.6 MZC12HA/NA 的传代，纯化与验证 |
| 3.3.7 重组 MZC12HA/NA 特性 |
| 3.3.8 实时定量 RT-PCR 检测感染不同 rMDV 的 CEF 中的 HA 和 NA 基因启动子活性的比较 |
| 3.3.9 重组 NA 或 F 蛋白表达的检测 |
| 3.3.10 在 MZC12HA/NA 感染的细胞比较 F, NA 和 pp38 蛋白的表达 |
| 3.3.11 重组病毒在 SPF 鸡体内的复制 |
| 3.3.12 重组病毒免疫有母源抗体的海兰褐后抗体水平的动态变化 |
| 3.3.13 重组病毒和 H9N2 灭活苗对有母源抗体的海兰褐鸡体的抗体水平影响 |
| 3.3.14 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究（论文提纲范文）
| 符号说明及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克氏病病毒（MDV）的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 病理生物学 |
| 1.1.4 诊断技术 |
| 1.2 MDV 分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 MDV 基因组结构 |
| 1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因 |
| 1.3 禽反转录病毒与 MDV 基因重组的研究进展 |
| 1.3.1 MDV 与 REV 间的基因重组 |
| 1.3.2 MDV 与 ALV 间的基因重组 |
| 1.3.3 REV 与 MDV 基因重组的机制 |
| 1.3.4 带有 REV-LTR 的重组 MDV 野毒株 GX0101 流行病学意义 |
| 1.4 BAC 技术和同源重组技术在 MDV 研究中的应用 |
| 1.4.1 细菌人工染色体载体系统(BAC) |
| 1.4.2 利用 BAC 构建 MDV 感染性克隆 |
| 1.4.3 基于 MDV BAC 感染性克隆的同源重组技术 |
| 1.5 基因芯片技术在 MDV 研究中的应用 |
| 1.5.1 基因芯片的简介 |
| 1.5.2 基因芯片的应用 |
| 1.6 MD 疫苗研究进展 |
| 1.6.1 常规致弱疫苗 |
| 1.6.2 新型基因工程疫苗 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常规分子克隆试剂 |
| 2.1.2 细胞培养相关试剂 |
| 2.1.3 荧光定量相关试剂 |
| 2.1.4 多克隆抗体制备相关试剂 |
| 2.1.5 Agilent 表达谱芯片相关试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 相关疫苗及抗原 |
| 2.1.8 相关病毒及菌种 |
| 2.1.9 病毒增殖与鉴定相关试验材料 |
| 2.2 常规试验操作方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
| 2.2.2 MDV 的拯救、鉴定 |
| 2.2.3 MDV 的增殖、定量 |
| 2.2.4 MDVBAC 质粒的大量制备及电转化 |
| 2.2.5 重组蛋白的纯化以及SDS-PAGE 蛋白质电泳 |
| 2.2.6 淋巴细胞的分离以及DNA 的提取 |
| 2.2.7 病毒RNA 的提取以及反转录 |
| 2.3 自然重组马立克氏病毒 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析 |
| 2.3.1 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 质粒的制备 |
| 2.3.2 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 的测序 |
| 2.3.3 GX0101 的全基因组分析 |
| 2.4 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较研究 |
| 2.4.1 利用同源重组技术构建 SC9-1(GX0101Δmeq kana)株 MDV |
| 2.4.2 利用同源重组技术构建SC9-2(GX0101 meq kana BAC)株MDV |
| 2.4.3 SC9-1、SC9-2 株MDV 的拯救、鉴定 |
| 2.4.4 SC9-1、SC9-2 株MDV 在细胞上的复制水平 |
| 2.4.5 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的安全性 |
| 2.4.6 SC9-1 株MDV 在鸡体内的增殖水平 |
| 2.4.7 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的免疫保护效果 |
| 2.4.8 SC9-1 株MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果 |
| 2.4.9 SC9-1 株MDV 对SPF 鸡感染低剂量rMd5 的免疫保护效果 |
| 2.5 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析 |
| 2.5.1 用于区分MDVGX0101 和GX0101 LTR 的荧光定量PCR 探针设计 |
| 2.5.2 双重荧光定量PCR 探针标准曲线的制备 |
| 2.5.3 接种相同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 2.5.4 接种不同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 2.6 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性比较 |
| 2.6.1 鼠抗MDVSORF2 蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.6.2 敲除SORF2 基因的重组病毒GX0101Δsorf2 的构建 |
| 2.6.3 间接免疫荧光试验鉴定重组病毒GX0101Δsorf238 |
| 2.6.4 Western blot 对重组病毒GX0101Δsorf2 以及SORF2 蛋白特异性鉴定 |
| 2.6.5 GX0101Δsorf2 在CEF 细胞上的复制能力的检测 |
| 2.6.6 GX0101Δsorf2 的致病性试验 |
| 2.6.7 GX0101Δsorf2 在鸡体内的的病毒血症的检测 |
| 2.6.8 GX0101Δsorf2 对SPF 鸡体液免疫应答的影响 |
| 2.6.9 GX0101Δsorf2 和GX0101 横向传播能力比较 |
| 2.7 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较研究 |
| 2.7.1 插入ALV-LTR 片段的重组MDV 的构建 |
| 2.7.2 重组MDVGX0101-ALV-LTR 的拯救 |
| 2.7.3 GX0101-ALV-LTR 在细胞上的复制能力 |
| 2.7.4 间接免疫荧光鉴定GX0101-ALV-LTR SORF2 蛋白的表达 |
| 2.7.5 GX0101-ALV-LTR 在CEF 细胞培养的稳定性鉴定 |
| 2.7.6 GX0101-ALV-LTR 的致病性检测及鸡体内的稳定性鉴定 |
| 2.8 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响 |
| 2.8.1 不同CEF 细胞感染不同重组病毒的总RNA 提取 |
| 2.8.2 样品的RNA 的放大和荧光标记 |
| 2.8.3 Agilent 表达谱芯片杂交 |
| 2.8.4 Agilent 表达谱芯片扫描 |
| 2.8.5 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测 |
| 2.8.6 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析 |
| 2.8.7 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 对宿主基因表达的差异性分析 |
| 2.8.8 GX0101 重组REV-LTR 片段对其重组位点后的基因转录水平的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析 |
| 3.1.1 GX0101 的基因组结构以及与其它不同株 MDV 的系统进化关系 |
| 3.1.2 从 GX0101 全基因组水平比较分析 REV-LTR 插入片段 |
| 3.1.3 相对其它毒株 GX0101 基因组中缺失的片段 |
| 3.1.4 相对其它毒株 GX0101 基因组中增加的片段 |
| 3.1.5 GX0101 基因组的开放阅读框和单核苷酸多态性 |
| 3.1.6 GX0101 与英国分离株 C12/130 感染性克隆的基因组差异比较 |
| 3.2 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较 |
| 3.2.1 SC9-1、SC9-2 疫苗候选株的构建和鉴定 |
| 3.2.2 SC9-1、SC9-2 株 MDV 拯救鉴定结果 |
| 3.2.3 SC9-1、SC9-2 株 MDV 在细胞上的复制能力 |
| 3.2.4 SC9-1 株 MDV 在鸡体内的增殖水平 |
| 3.2.5 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的安全性 |
| 3.2.6 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的免疫保护效果 |
| 3.2.7 SC9-1 株 MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果 |
| 3.2.8 SC9-1 株 MDV 对 SPF 鸡感染低剂量 rMd5 的免疫保护效果 |
| 3.2.9 SC9-1 疫苗候选株中试产品与 CVI988/Rispens 疫苗的保护性免疫力 |
| 3.3 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析 |
| 3.3.1 区分 MDV GX0101 和 GX0101 LTR 的荧光定量 PCR 探针具有良好的特异性 |
| 3.3.2 双重荧光定量 PCR 探针标准曲线的制备 |
| 3.3.3 接种相同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 3.3.4 接种不同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 3.4 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性的研究 |
| 3.4.1 SORF2 融合目的蛋白的表达纯化及分析鉴定 |
| 3.4.2 间接免疫荧光(IFA)鉴定高效价多克隆抗体特异性 |
| 3.4.3 GX0101Δsorf2 的 PCR 鉴定结果 |
| 3.4.4 间接免疫荧光鉴定 GX0101Δsorf2 的结果 |
| 3.4.5 Western blot 对重组病毒 GX0101 sorf2 以及 SORF2 蛋白的特异性鉴定 |
| 3.4.6 GX0101Δsorf2 在 CEF 细胞上的复制能力 |
| 3.4.7 GX0101Δsorf2 与亲本病毒 bac-GX0101 在鸡体内的病毒血症比较 |
| 3.4.8 GX0101Δsorf2 对 SPF 鸡的致病性 |
| 3.4.9 GX0101Δsorf2 对鸡体体液免疫应答的影响 |
| 3.4.10 GX0101Δsorf2 对鸡体重的影响 |
| 3.4.11 GX0101Δsorf2 和 GX0101 横向传播能力的比较 |
| 3.5 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较 |
| 3.5.1 不同重组 BAC 克隆质粒的 PCR 鉴定 |
| 3.5.2 拯救的重组病毒 GX0101-ALV-LTR 在细胞培养上形成的病毒蚀斑 |
| 3.5.3 插入 ALV-LTR 片段对重组 MDV SORF2 基因的转录和表达影响 |
| 3.5.4 GX0101-ALV-LTR 在细胞上复制性能 |
| 3.5.5 GX0101-ALV-LTR 基因组中 ALV-LTR 片段稳定性的鉴定 |
| 3.5.6 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡体重的影响 |
| 3.5.7 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡抗体水平的影响 |
| 3.5.8 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡的致死率和致肿瘤率 |
| 3.6 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响 |
| 3.6.1 样品总 RNA 的提取和质检结果 |
| 3.6.2 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测结果 |
| 3.6.3 Agilent 表达谱芯片扫描数据归一化结果 |
| 3.6.4 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析结果 |
| 3.6.5 感染 GX0101、GX0101-ALV-LTR、GX0101 LTR 鸡的显着差异表达基因的分析结果 |
| 3.6.6 Northern blot 技术对重组病毒 SORF2、US1、US10 基因的鉴定结果 |
| 3.6.7 荧光定量 PCR 检测重组病毒 SORF2、US1、US10 基因表达结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）马立克氏病毒1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 RNAi质粒的构建 |
| 1.3 重组质粒的转染 |
| 1.4 CAT ELISA试剂盒的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA干扰质粒的构建和鉴定 |
| 2.2 RNA转染细胞裂解物上清中CAT活性的检测结果 |
| 3 讨论 |
（6）鸡马立克氏病病毒超强毒L-ZY株细菌人工染色体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 MDV研究综述 |
| 1.1.1 MD和MDV |
| 1.1.2 MDV Ⅰ型病毒的致病机理 |
| 1.1.3 MDV Ⅰ型病毒主要毒力基因的功能 |
| 1.2 细菌人工染色体技术与疱疹病毒基因功能研究 |
| 1.3 Cre/loxP重组酶修饰系统 |
| 1.3.1 Cre/loxP重组酶修饰系统简介 |
| 1.3.2 Cre/loxP重组方式 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 MDVL-ZY株细菌人工染色体重组病毒转移载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌种、病毒与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 马立克氏病超强毒株L-ZY株的培养 |
| 2.2.2 L-ZY重组病毒转移载体同源臂及加压筛选标记基因的PCR扩增 |
| 2.2.3 BAC载体基本功能基因片段的制备 |
| 2.2.4 pUAloxPB质粒构建 |
| 2.2.5 pUAloxPB-gpt质粒构建 |
| 2.2.6 重组病毒转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11的构建 |
| 2.2.7 pUAloxPB-gpt-BAC11载体loxP位点体外功能鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 转移载体同源臂及gtp筛选标记基因的鉴定结果 |
| 2.3.2 pUAloxPB质粒鉴定结果 |
| 2.3.3 pUAloxPB-gpt质粒构建及鉴定 |
| 2.3.4 重组病毒转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11的鉴定 |
| 2.3.5 pUAloxPB-gpt-BAC11两个loxP位点体外功能鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 pUAloxPB-gpt-BAC11重组病毒转移载体的通用性 |
| 2.4.2 BAC载体基本功能基因的完整性是确保BAC形成的重要环节 |
| 第三章 MDV L-ZY细菌人工染色体重组病毒的获得 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 电转化转移载体质粒pUAloxPB-gpt-BAC11到宿主菌DH10B |
| 3.2.2 转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11质粒的提取和纯化 |
| 3.2.3 转染用MDV L-ZY感染细胞总DNA的制备 |
| 3.2.4 转移载体质粒与Total-DNA的共转染 |
| 3.2.5 重组病毒rv-MDVL-ZY的初步筛选和富集 |
| 3.2.6 重组病毒rv-MDVL-ZY的纯化 |
| 3.2.7 重组病毒rv-MDVL-ZY的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 转移载体与病毒感染细胞总DNA的共转染获得重组病毒 |
| 3.3.2 重组病毒BAC功能区的PCR鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 MDV基因组的完整性对于启动病毒的感染至关重要 |
| 3.4.2 用磷酸钙法转染是得到重组病毒的关键 |
| 3.4.3 用gpt做筛选标记是获得重组病毒的关键 |
| 第四章 BAC分子克隆化病毒的获得及感染性BAC的筛选 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 电转化分子克隆化病毒感受态细菌DH10B的制备 |
| 4.2.2 环化重组病毒细胞总DNA的提取 |
| 4.2.3 电转化筛选MDV L-ZYBAC |
| 4.2.4 MDV L-ZYBAC的初步鉴定 |
| 4.2.5 MDV L-ZY BAC质粒的提取和纯化 |
| 4.2.6 MDV L-ZYBAC中BAC-gpt功能序列的PCR鉴定 |
| 4.2.7 L-ZYBAC中MDV病毒基因组的PCR鉴定 |
| 4.2.8 转染用MDV L-ZYBAC DNA的提取和纯化 |
| 4.2.9 CEF载体总DNA的制备 |
| 4.2.10 将L-ZYBAC-DNA转染进CEF |
| 4.2.11 拯救重组病毒BAC-derived MDVL-ZY |
| 4.2.12 拯救重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的鉴定 |
| 4.2.13 重组病毒、野生病毒与拯救的重组病毒在体外生长特性的比较 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MDV L-ZYBAC的初步鉴定结果 |
| 4.3.2 MDV L-ZY BAC的病毒基因组的PCR鉴定结果 |
| 4.3.4 重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的拯救 |
| 4.3.5 重组病毒rv-MDVL-ZY、野生病毒wt-MDVL-ZY与拯救的重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的病毒生长曲线的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 适时提取病毒环化的基因组DNA是获得MDV BAC的关键 |
| 4.4.2 电转条件的优化是获得MDVBAC的关键 |
| 4.4.3 L-ZY BAC DNA的浓度和纯度是重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的拯救的关键 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 马立克氏病病毒(MDV)研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 发病机理及病理变化 |
| 1.1.4 诊断技术 |
| 1.1.5 疾病防制策略 |
| 1.2 马立克氏病病毒的致病型 |
| 1.3 马立克氏病病毒的基因组结构 |
| 1.4 禽反转录病毒与DNA病毒间的基因重组 |
| 1.4.1 病毒的变异方式 |
| 1.4.2 MDV 与REV 间的基因重组 |
| 1.4.3 MDV 与ALV 间的基因重组 |
| 1.4.4 禽反转录病毒与DNA病毒间的基因重组的发生机制 |
| 1.5 不同病毒间遗传重组的流行病学意义 |
| 1.6 DNA 片段克隆的载体系统 |
| 1.6.1 质粒 |
| 1.6.2 粘粒 |
| 1.6.3 BAC 的优势及其发展 |
| 1.7 操纵MDV 基因：依靠细菌人工染色体新技术 |
| 1.7.1 RecA 蛋白介导的同源重组 |
| 1.7.2 RecE/T 蛋白介导的同源重组 |
| 1.8 本研究的意义 |
| 2 一株整合有 REV 长末端重复序列的 MDV 的致病性研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 蛋鸡、SPF 鸡和SPF 动物设施 |
| 2.1.1.2 病毒与鸡胚 |
| 2.1.1.3 疫苗 |
| 2.1.1.4 主要仪器 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
| 2.1.2.2 病毒的增殖与定量 |
| 2.1.2.3 MDV 人工攻毒 |
| 2.1.2.4 NDV 和AIV 油乳灭活苗的免疫和免疫反应的测定 |
| 2.1.2.5 MDV 感染对体重的影响 |
| 2.1.2.6 接种 MDV 的海蓝褐公鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.1.2.7 MDV 感染影响免疫器官发育的比较方法 |
| 2.1.2.8 病理学检测 |
| 2.1.2.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GX0101 毒株感染对鸡生长性能的影响 |
| 2.2.1.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
| 2.2.1.2 对SPF 鸡的影响 |
| 2.2.2 GX0101 毒株感染对NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 2.2.2.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
| 2.2.2.2 对SPF 鸡的影响 |
| 2.2.3 GX0101 毒株感染对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 2.2.3.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
| 2.2.3.2 对SPF 鸡的影响 |
| 2.2.4 GX0101 毒株感染对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 2.2.4.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
| 2.2.4.2 对SPF 鸡的影响 |
| 2.2.5 GX0101 毒株感染后对中枢免疫器官的影响 |
| 2.2.6 接种 MDV 的鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.2.6.1 对海蓝褐公鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.2.6.2 对SPF 鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.3 讨论 |
| 3 带有 REV-LTR 片段的 MDV 野毒株 GX0101 的BAC 克隆的构建及拯救病毒的致病性分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 病毒 |
| 3.1.1.2 相关试剂 |
| 3.1.1.3 动物及疫苗 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 构建感染性 BAC 分子克隆化病毒的技术路线 |
| 3.1.2.2 重组转基因载体质粒 pDS-pHAI-US2 的构建 |
| 3.1.2.3 GX0101-BAC 克隆的构建及鉴定 |
| 3.1.2.4 重组病毒的拯救及间接免疫荧光试验 |
| 3.1.2.5 BAC 克隆毒bac-GX0101 与亲本毒GX0101 致病性比较 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 质粒 pDS-pHAI-US2 |
| 3.2.2 GX0101-BAC 克隆的鉴定 |
| 3.2.3 拯救的重组病毒的鉴定 |
| 3.2.4 IFA 检测重组病毒bac-GX0101 |
| 3.2.5 对增重的影响 |
| 3.2.6 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 3.2.7 对AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 3.2.8 对AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 3.2.9 致肿瘤性以及死亡率 |
| 3.2.10 GX0101、bac-GX0101 株感染对 SPF 鸡的病理组织学检测 |
| 3.3 讨论 |
| 4 马立克氏病病毒野毒株 GX0101 的 LTR 序列敲除及其生物学特性比较 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 细胞与病毒 |
| 4.1.1.2 相关试剂 |
| 4.1.1.3 动物及疫苗 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 卡那霉素抗性基因的扩增 |
| 4.1.2.2 REV-LTR 序列的敲除 |
| 4.1.2.3 GX0101△LT R-BAC DNA 的鉴定 |
| 4.1.2.4 PCR产物序列的比较与分析 |
| 4.1.2.5 GX0101△LT R-BAC DNA 的提取 |
| 4.1.2.6 重组病毒的拯救 |
| 4.1.2.7 间接免疫荧光法（IFA）检测拯救的重组病毒bac-GX0101△LTR |
| 4.1.2.8 MDV 毒人工感染方法 |
| 4.1.2.9 MDV 感染对体重的影响 |
| 4.1.2.10 对 NDV 和 AIV 油乳灭活苗的免疫后的免疫抑制性的比较 |
| 4.1.2.11 斑点杂交检测 bac-GX0101 毒株与 bac-GX0101△LTR 毒株的横向传播能力 |
| 4.1.2.12 病毒血症的检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 卡那霉素的特异性扩增 |
| 4.2.2 敲除GX0101 株中整合的REV-LTR 序列 |
| 4.2.3 PCR 产物的序列测定与分析 |
| 4.2.4 拯救病毒 bac-GX0101△LTR |
| 4.2.5 对增重的影响 |
| 4.2.6 对 NDV 疫苗免疫抗体反应的抑制作用 |
| 4.2.7 对 AIV-H9 疫苗免疫抗体反应的抑制作用 |
| 4.2.8 间接免疫荧光法(IFA)检测 MDV 病毒血症水平 |
| 4.2.9 MDV-pp38 核酸探针灵敏度及特异性检测 |
| 4.2.10 斑点分子杂交检测感染鸡的羽毛囊中的 MDV |
| 4.2.11 bac-GX0101 毒株与bac-GX0101△LTR 毒株横向传播能力的比较 |
| 4.2.12 两株 MDV 诱发鸡的死亡率和肿瘤发生率比较 |
| 4.3 讨论 |
| 5 马立克氏病病毒 ICP4 基因功能的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 细胞与病毒 |
| 5.1.1.2 相关试剂 |
| 5.1.1.3 动物及疫苗 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 卡那霉素抗性基因的扩增 |
| 5.1.2.2 ICP4 基因的敲除 |
| 5.1.2.3 GX0101 △ICP4 -BAC DNA 的鉴定 |
| 5.1.2.4 PCR 产物序列的比较与分析 |
| 5.1.2.5 GX0101△ICP4 -BAC DNA 的提取 |
| 5.1.2.6 重组病毒的拯救 |
| 5.1.2.7 间接免疫荧光法（IFA）检测拯救的重组病毒bac-GX0101△ICP4 |
| 5.1.2.8 bac-GX0101 △ICP4 与bac-GX0101 致病性比较 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 敲除MDV 毒株中的ICP4 基因 |
| 5.2.2 PCR 产物的序列测定与分析 |
| 5.2.3 拯救bac-GX0101△ICP4 |
| 5.2.4 IFA |
| 5.2.5 对增重的影响 |
| 5.2.6 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 5.2.7 对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 5.2.8 对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 5.2.9 致死率与致肿瘤性 |
| 5.3 讨论 |
| 6 马立克氏病毒1.8-kb mRNA 基因的潜在阅读框A和C的敲除及其功能研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.1.1 病毒 |
| 6.1.1.2 相关试剂 |
| 6.1.1.3 动物及疫苗 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 GX0101△(A+C) -BAC的构建 |
| 6.1.2.2 GX0101△(A+C) -BAC DNA 的鉴定 |
| 6.1.2.3 GX0101 △(A+C) -BAC DNA 拯救病毒生长特性的测定 |
| 6.1.2.4 ORF(A+C)对双向启动子活性的影响 |
| 6.1.2.5 bac-GX0101△(A+C) 与bac-GX0101 致病性比较 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 1.8kb-m RNA 中ORF（A+C）缺失株的构建 |
| 6.2.3 1.8kb-mRNA 中 ORF(A+C)对双向启动子活性的影响 |
| 6.2.4 对增重的影响 |
| 6.2.5 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 6.2.6 对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 6.2.7 对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 6.2.8 致肿瘤性 |
| 6.3 讨论 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 读博士学位期间发表、录用(或起草)论文 |
（9）鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因的真核表达及其特异性单克隆抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 研究内容 |
| 第一章 鸡马立克氏病病毒超强毒株R818 pp38 基因在昆虫细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 抗鸡马立克氏病病毒超强毒株R818 pp38 蛋白特异性单克隆抗体的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 成果小结 |
| 致谢 |
（10）鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病病毒后3号染色体微卫星不稳定性的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文中所引部分缩略语 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 鸡马立克氏病的病原学特点 |
| 1 鸡马立克氏病的病原学特点 |
| 1.1 鸡马立克氏病病毒毒株分类 |
| 1.2 鸡马立克氏病病毒毒力变化趋势 |
| 1.3 鸡马立克氏病病毒的分子生物学研究 |
| 2 MD的发病机制 |
| 第二章 微卫星不稳定性及其在肿瘤上的研究 |
| 1 微卫星 |
| 1.1 微卫星的构成 |
| 1.2 微卫星的特点 |
| 1.3 微卫星DNA的检测方法及应用 |
| 1.4 微卫星的功能 |
| 2 微卫星不稳定性 |
| 2.1 概念 |
| 2.2 微卫星不稳定性产生的原因 |
| 3 DNA错配修复系统 |
| 3.1 DNA错配修复系统及其相关基因 |
| 3.2 DNA错配修复系统与肿瘤发生的关系 |
| 4 微卫星不稳定性在肿瘤学上的应用研究 |
| 4.1 HNPCC微卫星不稳定性方面的研究 |
| 4.2 胃癌微卫星不稳定性方面的研究 |
| 4.3 其他肿瘤微卫星不稳定性方面的研究 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 鸡胚成纤维细胞的培养及病毒感染 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验步骤 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病病毒后三号染色体微卫星不稳定性的研究 |
| 1 试验材料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 基因组DNA的抽提 |
| 2.3 微卫星位点的选择及引物合成 |
| 2.4 PCR扩增 |
| 2.5 琼脂糖电泳检测 |
| 2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 |
| 2.7 银染 |
| 2.8 结果判断标准 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 部分微卫星位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 |
| 3.2 电泳结果统计 |
| 4 讨论 |
| 致谢 |
| 附录 试验中配液 |
四、马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的部分功能（论文参考文献）
- [1]miRNA和MDV原癌基因Meq在鸡马立克氏病肿瘤转化过程中作用机制研究[D]. 赵春芳. 中国农业大学, 2018(12)
- [2]马立克氏病毒pp38基因对Toll样受体通路的影响[D]. 苏瑞雪. 扬州大学, 2017(01)
- [3]共表达不同外源基因的重组弱毒Ⅰ型马立克氏病毒的构建和生物学特性比较[D]. 张振杰. 山东农业大学, 2014(11)
- [4]重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究[D]. 苏帅. 山东农业大学, 2013(05)
- [5]马立克氏病毒1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性的影响[J]. 丁家波,李延鹏,杨明,李中明,孙爱军,崔治中. 中国兽医学报, 2009(11)
- [6]鸡马立克氏病病毒超强毒L-ZY株细菌人工染色体的构建[D]. 李继松. 中国农业科学院, 2009(11)
- [7]马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究[D]. 孙爱军. 山东农业大学, 2009(03)
- [8]马立克氏病毒1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性的影响[A]. 丁家波,李延鹏,杨明,李中明,孙爱军,崔治中. 首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集（2008）, 2008
- [9]鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因的真核表达及其特异性单克隆抗体的研制[D]. 刘明亮. 扬州大学, 2008(02)
- [10]鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病病毒后3号染色体微卫星不稳定性的研究[D]. 乔丽平. 南京农业大学, 2007(05)