一、利用序列特异性DNA亲和层析分离纯化一种前列腺细胞核蛋白（论文文献综述）
周欣[1]（2020）在《鸡卵黄免疫球蛋白Fab片段的制备及其抗炎活性研究》文中认为炎症是一种针对感染或损伤的适应性免疫反应。适度的炎症反应对机体是有益的,但当发生失调慢性炎症反应时,会引起一系列慢性疾病（癌症,动脉粥样硬化,类风湿关节炎等）。免疫球蛋白G（Ig G）是一种从健康哺乳动物血液中获得的抗体,在脂多糖/植物凝集素诱导的细胞模型系统中表现出显着的抗炎症效果。鸡蛋黄来源卵黄免疫球蛋白（IgY）在结构和Ig G功能上相似,但是IgY比Ig G获取的原材料简单,产量高,具有对哺乳动物抗原有很高的亲和力以及不与类风湿因子反应等特点。其IgY粗提物广泛用于免疫活性和抗炎症活性中。然而IgY的Fc片段不能激活哺乳动物体系相应的免疫调控机制,提高了IgY成为哺乳动物过敏原的风险。目前用来分离纯化Fab和Fc片段方法常常多种色谱柱的联合使用,方法昂贵复杂且费时。因此本论文在研究两种蛋白酶酶解IgY活性片段的基础上,提出了一种高效,绿色环保的Fab片段分离纯化方法,制备高纯度Fab片段。比较Fab片段和IgY结构的差异,进一步阐述Fab片段和IgY在LPS（脂多糖）诱导的RAW264.5炎症模型中的抗炎症功效。研究内容结果如下:第一,本章研究了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分解IgY得到Fab以及Fc片段的酶解条件。当IgY:木瓜蛋白酶质量比为25,半胱氨酸浓度为100 m M,酶解时间为5 h时,IgY的转化率能达到96.8%。通过anti-Fab和anti-Fc免疫印迹分析,表明IgY在木瓜蛋白酶的作用下主要分解成双链的Fab（45 k Da）片段、单链的Fab片段（20 k Da）、双链的Fc片段（60 k Da）以及单链的Fc片段（30 k Da）。当IgY:胃蛋白酶质量比为40,酶解时间为1 h时,IgY能全部水解成Fab片段。经DEAE FF色谱柱处理后,得到纯度97.8%,得率为5.3/100 mg IgY的Fab样品。综上,胃蛋白酶酶解能产生Fab片段,但是纯度与得率更好。而木瓜蛋白酶酶解IgY可得到Fab和Fc两种活性片段,但还需要进一步分离纯化。第二,本研究建立了一种木瓜蛋白酶酶解制备Fab和Fc片段的绿色,高效分离纯化方法。采用45%饱和硫酸铵处理IgY木瓜蛋白酶酶解物,去除位于20k Da附近小分子量肽。随后将含有Fab和Fc片段的混合溶液上样到DEAE-Sepharose离子交换柱上,用10 m M Tris-HCl缓冲液（p H7.6）将Fab片段洗脱出来。然后含有0.21 M Na Cl的10 m MTris-HCl缓冲液（p H7.6）能将与DEAE Sepharose结合的Fc片段洗脱出来。WB和MS分析的结果表明,该方法得到了高纯度Fab和Fc片段。SDS-PAGE分析表明Fab和Fc片段的纯度分别为88.7%和90.1%。第三,IgY及Fab片段的蛋白构象与理化性质研究。CD光谱分析表明经过酶解处理,Fab片段蛋白二级结构的β折叠上升,无规卷曲减少,说明Fab片段结构更加有序。FTIR光谱表明,Fab片段在1396 cm-1和1099 cm-1处糖链振动峰强度增加,表明IgY酶解后,蛋白的相对糖含量增加,Fab片段被包埋的糖链结构暴露。同时,糖链的暴露使得蛋白的疏水性基团向分子内包埋,提高了Fab片段的内源性荧光,降低了紫外吸收强度。因此Fab片段的表面疏水性更低。最后,对Fab片段和IgY的物理性质进行分析,发现Fab片段比IgY具有更低的分子量（44 k Da）,更低的粒径分布（4.152±0.473 nm）,以及更多的表面负电荷。第四,建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究IgY及Fab片段抗炎活性效果。结果表明,LPS刺激炎症模型建立成功后,RAW264.7细胞活性显着升高,IgY和Fab片段对巨噬细胞均没有毒性作用,并且能提高巨噬细胞的活性。研究发现只有Fab片段对LPS诱导的细胞活性的异常增加有显着的抑制作用。50-400μg/m L范围的Fab和IgY都能显着降巨噬细胞TNF-α,IL-6和IL-10因子的表达,且两种不同样品处理没有显着差异,各因子最高能下调69.7%,77.1%和46.1%。同时IgY和Fab片段都能通过NO/i NOS和PGE2/COX-2途径调节炎症反应。且当Fab片段的用量为400μg/m L时,抗炎效果最佳。第五,建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究Fab片段发挥抗炎活性的信号通路。结果表明,在50-400μg/m L浓度范围内,Fab处理能通过NF-κB和MAPK两条信号通路来调节炎症反应。其中400μg/m L的Fab片段作用效果最显着,能将低52.7%的p65核转移,以及42.2%（p38）,41.5%（ERK1）,33.2%（ERK2）,44.2%（JNK1）和39.6%（JNK2）MAPK相关蛋白的磷酸化。Fab片段能够显着抑制TLR4和αVβ3 m RNA的表达量,分别最大下调44.4%和76.1%,表明Fab片段可以同时与巨噬细胞表面的TLR4受体和αVβ3作用,从而抑制激活NF-κB和MAPK两条信号通路。此外通过激光共聚焦分析,表明,αVβ3介导的免疫调节过程,可能涉及到Fab的胞吞介导机制。
窦琳霞[2]（2020）在《RNA加工因子CPSF6的表达纯化及PQBP1在剪接体组装过程中的作用研究》文中研究说明前体mRNA的3’非翻译区（3’-untranslated region,3’UTR）通过选择不同的加工位点进行切割和多聚腺苷酸（poly A）合成产生长短不一的多种mRNA亚型的过程称为选择性多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation,APA）。这一过程需要多个mRNA上的顺式作用元件和反式作用蛋白因子相互协同完成。其中切割因子I（cleavage factor I,CFIm）复合物识别poly A位点上游UGUA基序并招募其他加工因子,是APA的位点选择的关键决定因素之一。为了对CFIm复合物的功能进行深入研究,我们对其组成蛋白CPSF6（又称CFIm68）进行了重组表达。然而由于CPSF6蛋白序列含有特殊的脯氨酸富集区域,在大肠杆菌表达系统中我们无法获得全长有功能的重组蛋白。为了克服这个困难,本研究构建了Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统对CPSF6蛋白进行体外表达,免疫印迹检测显示Sf9细胞感染重组杆状病毒后可成功表达出全长His-CPSF6融合蛋白,并且经过进一步的蛋白变复性和纯化可以获得高纯度的融合蛋白。该重组蛋白在体外GST pull-down实验中可以与其相互作用蛋白CPSF5结合,表明本研究获得的重组CPSF6保有其生物学活性可以用于后续的生化分析。多聚谷氨酰胺结合蛋白1（polyglutamine binding protein 1,PQBP1）是X连锁智力发育障碍的致病基因,它编码的蛋白能与多种剪接因子结合,参与前体mRNA选择性剪接的调控,但其具体的分子机制仍不清楚。文献报导以及本实验室前期研究中提示PQBP1可能为剪接体激活复合物NTC complex的组分。为了进一步探究PQBP1与剪接体不同复合物的关系,解析它在选择性剪接中的调节作用,本研究首先通过体外pull-down assay探究了PQBP1与NTC complex核心组分PRPF19蛋白的相互作用关系,随后构建了含有MS2茎环结构的mRNA剪接底物,并利用He La细胞制备核提取物,用于体外分离剪接反应中不同阶段的复合体。实验结果显示,该剪接底物结合核提取物中的蛋白复合体并通过MBP-MS2结合蛋白被分离。本研究成功构建了剪接体体外组装和分离体系,为后续研究PQBP1具体是哪一阶段剪接体复合物的组成成分以及它是如何影响剪接体组装等一系列科学问题打下了坚实的基础。
束王慧[3]（2020）在《鲟鱼抗炎多肽的制备与鉴定及其作用机制研究》文中研究表明鲟鱼（Acipenser）是一类极具生物和经济重要性的鱼类。鲟鱼肉具有最佳的膳食蛋白质和必需氨基酸,是生物活性肽的良好来源,可用于功能食品的开发。目前,鲟鱼多肽的生物活性研究鲜有报道。本文运用可控酶解技术制备鲟鱼酶解产物,对抗炎多肽进行分离纯化、结构鉴定及活性验证,并通过脂多糖（LPS）诱导RAW264.7巨噬细胞构建的体外炎症模型初步探究鲟鱼抗炎多肽的抗炎机理。主要研究结果如下:（1）采用可控酶解技术（单酶水解）、膜分离法及Sephadex G-15凝胶层析进行鲟鱼抗炎多肽的制备,以NO释放量为筛选评价指标。制备鲟鱼抗炎肽的最佳用酶为胃蛋白酶,初步分级得到的<3 kDa超滤组分具有较好的抗炎活性,进一步凝胶层析纯化后的鲟鱼抗炎多肽NO抑制率显着高于鲟鱼酶解产物（p<0.05）。凝胶层析建立方法为:柱规格1.2 cm×70 cm,流速1.0 mL/min,上样量75 mg,6 min/管收集,280 nm检测。氨基酸分析发现,该肽中富含大量疏水性氨基酸及Phe、Tyr等芳香族氨基酸。（2）通过体外化学方法初步评价鲟鱼抗炎多肽的抗氧化潜能。鲟鱼抗炎多肽具有较强的抗氧化活性,两种自由基清除能力（DPPH、ABTS）的IC50值分别为293.0、282.2μg/mL。构建LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型,进一步探究鲟鱼抗炎多肽的抗炎机理。结果表明:鲟鱼抗炎多肽在浓度0.1250.5 mg/mL范围内呈剂量依赖性降低炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α的分泌。Western Blot分析发现鲟鱼抗炎多肽能够降低ERK、JNK、p38及IκBα磷酸化水平,抑制细胞质中p65向细胞核的转移,提示鲟鱼抗炎多肽下调MAPK及NF-κB信号通路发挥抗炎作用。（3）通过离子层析（SP-650M）、疏水层析（ODS）对鲟鱼抗炎多肽进一步纯化,并通过LC-MS/MS鉴定高活性肽组分,对所得肽序进行合成并活性验证。得到三条具有抗炎潜能的多肽,其氨基酸序列为:Lys-Ile-Trp-His-His-Thr-Phe（KIWHHTF）;Val-His-Tyr-Ala-Gly-Thr-Val-Asp-Tyr（VHYAGTVDY）;His-Leu-Asp-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gln-Glu（HLDDALRGQE）,分别来自于肌动蛋白、肌球蛋白及肌球蛋白,均为首次报道。这三种多肽能显着提高LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中SOD活力,并基于无细胞毒害作用的基础上,浓度50μM时,有效抑制炎症模型中NO、IL-1β和IL-6的分泌,下调MAPK信号通路发挥抗炎调控作用。
牛焕民[4]（2019）在《溶酶体介导肿瘤获得性耐药的机制及大环双联苄类化合物的干预作用和靶点分析》文中研究说明肿瘤的复发和耐药是临床治疗失败的主要因素,针对中晚期复发转移的肿瘤患者,化疗、免疫治疗等是临床的治疗策略。但药物治疗后的耐药、特别是化疗药物产生的多药耐药（Multidrug resistance,MDR）一直是困扰临床治疗的重大难题。MDR的机制复杂,主要有:药泵蛋白高表达、凋亡机制变化、代谢重编程的改变等。针对耐药机制的研究已有深入报道,但能够应用于临床的有效策略并不多。因此寻找新的治疗策略、降低药物的毒副反应依然是目前亟待解决的问题。我们对易产生骨转移的前列腺癌细胞PC3及多西他赛（Docetexal,Doc）诱导的多药耐药细胞PC3/Doc进行了基因表达差异谱分析,通过Gene Ontology（GO）分析发现,耐药细胞代谢途径变化明显,其中以细胞器溶酶体相关基因的变化最为显着。因此本论文重点探讨了溶酶体在多药耐药中的作用、化疗药物对溶酶体的调控机制,并筛选对溶酶体有调控作用的小分子化合物,包括有一定前期研究基础的天然双联苄类化合物,以及筛选分析靶向溶酶体的双联苄化合物RDN（the aminomethylated derivative of Riccardin D）的作用靶点和克服多药耐药的机制。论文研究利用组学数据、The Cancer Genome Atlas（TCGA）大数据平台,以及液相色谱、蛋白质谱等技术对溶酶体相关的耐药关键基因的作用进行了细致分析,确定新的耐药机制及潜在的治疗靶标,并根据靶标进行新药的筛选。为临床肿瘤治疗、克服耐药提供新的实验依据。第一部分:TFE3促进溶酶体代谢重编程参与肿瘤的多药耐药一、耐药细胞发生代谢重编程,其中以溶酶体的变化最为显着,更新加快且活性增加1、PC3/Doc耐药细胞中溶酶体更新加快、数目显着增加前列腺癌细胞PC3细胞及其多药耐药细胞PC3/Doc的基因表达差异谱芯片结果显示,耐药细胞中溶酶体相关基因变化明显。透射电镜和Lyso-tracker的免疫荧光结果显示,耐药细胞中溶酶体、自噬溶酶体的数目显着增加,线粒体的数目也显着增加。通过qPCR和Western blotting对溶酶体的marker基因进行分析,结果表明,溶酶体相关的膜蛋白 1（lysosomal-associated membrane protein 1,LAMP1）、溶酶体相关的膜蛋白 2（lysosomal-associated membrane protein 2,LAMP2）、溶酶体钙离子通道蛋白1（Mucolipin,MCOLN1）、溶酶体囊泡分选蛋白 18（vacuole protein sorting,VPS18）、溶酶体内的组织蛋白酶 B（cathepsin B,CTSB）、组织蛋白酶 D（cathepsin D,CTSD）、组织蛋白酶 L（cathepsin L,CTSL）以及溶酶体离子通道蛋白 ATP6V1H（ATPase,H+transporting,lysosomal 50/57kDa,V1 subunit H,ATP6V1H）的表达显着增加;同时初级溶酶体的marker蛋白RAB5水平在耐药细胞中也显着提高,表明溶酶体在耐药细胞中更新增加。另外,自噬溶酶体的marker如ATG5、LC3B的表达也呈上升趋势,确定耐药细胞中溶酶体的更新速率、数目显着增加。2、耐药细胞中溶酶体活性增加为了检测耐药细胞中溶酶体数目的增加,是否伴随着活性加强,我们利用酶活性分析,检测溶酶体酸性鞘磷脂（acid sphingomyelinase,ASM）的活性。结果显示,耐药细胞PC3/Doc中ASM的活性显着高于亲本细胞PC3。同时溶酶体内的组织蛋白酶B的活性形式在耐药细胞中也明显升高,进一步证实耐药细胞溶酶体的代谢旺盛。3、不同作用机制和靶点的临床化疗药物都可促进溶酶体代谢为明确溶酶体在耐药过程中的变化是否具有普遍性,我们进一步检测了多株耐药细胞系:鼠源前列腺癌细胞RM1及其Doc诱导的多药耐药细胞株RM1/Doc;肺癌细胞H460及其紫杉醇（paclitaxel,Tax）诱导的多药耐药细胞H460/Tax;人口腔上皮细胞癌细胞KB及其长春新碱（vincristine,VCR）诱导的多药耐药细胞KB/VCR。Lyso-Tracker染色结果显示,虽然药物不同,耐药的肿瘤细胞不同,但所有耐药细胞中溶酶体的数目都呈现不同程度的增加,表明多种化疗药物均可促进溶酶体代谢。为了进一步证实溶酶体在多药耐药中的变化,我们构建异种移植小鼠荷瘤模型,经过化疗药物多西他赛（Doc）,长春新碱（vincristine,VCR）,依托泊苷（etoposide,VP16）以及阿霉素（Doxorubicin,Dox）的两次化疗后,诱导成功小鼠耐药模型。qPCR和免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）结果表明,这些化疗药物都不同程度的诱导LAMP2、VPS18、ATP6V1H和CTSL的表达,证实化疗药物促进肿瘤细胞发生代谢重编程、促进溶酶体代谢,使得溶酶体在获得性多药耐药的过程中呈现更新增加、代谢增强的趋势。4、溶酶体相关基因高表达与多种肿瘤的预后呈负相关我们利用TCGA数据库确定耐药细胞溶酶体增加是否具有临床意义。数据分析发现,溶酶体相关的基因如LAMP2、ATP6V1H、CTSL、VPS18的高表达与常见肿瘤的预后均无正相关,且普遍存在明显的负相关。如LAMP2高表达与乳腺癌、膀胱癌呈负相关,CTSL高表达与肺癌呈负相关,VPS18高表达与膀胱癌、肺癌、结直肠癌呈负相关等。因此溶酶体增加与患者预后呈现负相关。提示其可以作为潜在的预后指标及治疗靶点。二、多西他赛通过激活Transcription factor E3（TFE3）促进溶酶体基因的表达和溶酶体的生成转录因子 microphthalmia-transcription factor E（MiT/TFE）家族成员,特别是TFEB、TFE3在调控溶酶体生成中的重要作用格外引人注目,相关研究已经证实TFEB、TFE3通过调控大多数溶酶体相关基因表达而控制溶酶体的生物合成。通常TFEB、TFE3磷酸化滞留在胞质中,而脱磷酸化后入核、发挥转录因子的功能,促进溶酶体相关基因的表达从而调控溶酶体的生成。我们首先确定耐药细胞中溶酶体的增加的机制是否与TFEB、TFE3有关。1、化疗药物能够激活TFE3,促进溶酶体生成1)多西他赛显着激活TFEB、TFE3而促进溶酶体生成由于化疗药物处理后溶酶体的数量和活性均显着增加,我们首先分析Doc是否在发挥抗肿瘤作用的同时能够激活TFEB、TFE3,从而调控溶酶体代谢。Western blotting的结果表明,在前列腺癌耐药细胞株中,TFE3多以低磷酸化的形式存在。利用siRNA下调TFEB或TFE3的表达,Lyso-Tracker的结果显示,下调TFEB或下调TFE3都可明显降低耐药细胞溶酶体的荧光强度。qPCR结果显示,下调TFEB或TFE3,耐药细胞中LAMP1、LAMP2、VPS18以及CTSB的表达均降低,证实TFEB或TFE3调控耐药细胞溶酶体代谢,似乎TFE3的作用更明显。为了进一步明确TFE3是否在药物应答过程中具有更突出的作用,PC3细胞经过Doc处理后,可促进TFEB、TFE3的入核,且TFE3的入核更为明显,且随着药物作用时间的延长,二者的入核进一步增加,且TFE3更为显着。另外,293T细胞过表达TFEB、TFE3,并经Doc处理后,明显诱导TFEB、TFE3的入核,且TFE3的入核蓄积更为显着,表明耐药细胞中TFE3可能发挥更为重要的作用。2)多种化疗药物诱导的耐药过程伴随TFE3的活化耐药动物模型的免疫组化染色结果也显示,TFE3也在阿霉素、长春新碱、VP16等化疗药物诱导的耐药肿瘤组织中入核显着增加,具有普遍性,进一步证实TFE3可能在获得性耐药的产生过程中发挥更为重要的作用。2、多西他赛通过激活钙调磷酸酶促进TFE3的入核激活新近研究指出,多西他赛Doc可通过诱导反应活性氧ROS的产生,促进TFEB的入核。首先我们检测了 PC3及耐药细胞PC3/Doc中ROS的水平,发现耐药细胞中ROS显着低于亲本细胞,表明耐药细胞中ROS并非是调控TFE3的关键因素。mTOR、Akt等激酶的失活可导致TFEB、TFE3的脱磷酸而入核活化。Western blotting结果显示,调控TFE3的几个重要激酶在耐药细胞中多以活性形式存在,p-mTORC1表达升高,p-AKT,p-GSK3β无显着变化,并无降低趋势,因此耐药细胞中激酶可能不是TFE3脱磷酸的关键调控因子。我们随后分析耐药细胞中磷酸酶是否活化导致TFE3的脱磷酸激活。酶活性检测结果显示,钙调磷酸酶（Calcineurin,CaN）在耐药细胞中活性增高,钙调磷酸酶抑制剂FK520可抑制钙调磷酸酶活性、可部分逆转TFE3的脱磷酸入核。因此化疗药物不抑制有关细胞增殖存活的激酶信号,而磷酸酶CaN的活性增强是TFE3活化的机制之一,尚存在其它调控机制。三、溶酶体膜定位的药泵蛋白MRP2通过脱靶机制介导多西他赛耐药1、TFE3促进化疗的多药耐药化疗药物通过激活TFE3而促进溶酶体的生成,我们首先确定TFE3的驱动作用是否直接参与了化疗耐药。耐药细胞PC3/Doc中TFE3、TFEB高表达,而降低TFE3或TFEB的表达都可增加耐药细胞对化疗药物Doc、Dox的敏感性,且下调TFE3后增敏效果更为突显。在亲本细胞PC3中过表达TFE3或TFEB均增加细胞对化疗药的耐受,其中TFE3的高表达对化疗药物的耐受更为明显。2、TFE3可能通过调控溶酶体而参与耐药由于TFE3高表达对多种药物产生耐受,而药泵蛋白是不依赖于药物结构而介导多药耐药的的重要机制,因此我们首先分析TFE3是否通过影响细胞的药物蓄积参与耐药。药物在细胞内的蓄积实验结果显示,耐药细胞内药物蓄积明显减少,但过表达TFE3或降低TFE3均不影响细胞对药物的蓄积能力,表明TFE3参与化疗耐药,但并不通过细胞膜药泵蛋白介导的耐药机制。TFE3作为上游关键因子可能通过调控溶酶体而增加肿瘤的耐药。3、化疗药物滞留于溶酶体中导致脱靶耐药溶酶体参与耐药的主要机制是通过滞留阳离子药物于溶酶体中,例如Dox,顺铂等被滞留于溶酶体,导致药物脱离原有靶点（如Dox和顺铂均为DNA损伤药物,主要在细胞核发挥作用）,进而产生脱靶耐药。我们首先确定耐药细胞旺盛的溶酶体是否可滞留Doc、Dox而导致脱靶耐药。通过分离细胞器,利用液相色谱层析技术分析Doc在细胞中的分布。结果显示,Doc主要分布在亲本细胞PC3的细胞胞液,而耐药细胞PC3/Doc中,Doc在细胞胞液内的浓度远低于PC3,而且Doc在耐药细胞溶酶体的蓄积显着增加。同样,Dox主要分布在细胞核,在溶酶体内也有分布,在耐药细胞溶酶体内的蓄积显着高于敏感细胞的溶酶体。因此耐药细胞溶酶体增多导致药物滞留其中而产生脱靶耐药的作用。4、耐药细胞药泵蛋白MRP2高表达且可定位于溶酶体膜而介导化疗药物的滞留于溶酶体中导致脱靶耐药1)MRP2在耐药细胞中高表达并参与化疗耐受药泵蛋白是产生药物蓄积的主要机制。基因表达差异谱结果显示,前列腺癌耐药细胞PC3/Doc中多种药泵蛋白呈现不同程度的表达上调,如ABC41、ABCA12、ABCB1,ABCG2等。经qPCR、流式细胞分析药泵膜蛋白的表达,虽然ABCB1基因在耐药细胞高表达,但其蛋白产物P-gp并无表达（与文献一致,前列腺癌PC3细胞不表达P-gp）,最后确定多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein2,MRP2）（基因为ABCC2）的蛋白表达上调明显,而且Doc也是MRP2的底物。免疫荧光显示,MRP2主要在胞质中高表达。而下调MRP2可显着增加耐药细胞对化疗药物的敏感性。2)MRP2可定位在溶酶体膜由于MRP2在胞质中高表达,我们利用激光共聚焦确定其细胞定位。结果表明,MRP2在细胞胞液中分布广泛且可以和溶酶体的膜蛋白LAMP2共定位,提示MRP2可定位于溶酶体。通过分离溶酶体进一步证实MRP2可定位于溶酶体。3)TFE3调控MRP2的表达MRP2属质子泵的跨膜蛋白且可定位于溶酶体膜,而根据文献报道,TFE3的靶基因中富集最显着的为溶酶体质子泵蛋白,我们进一步分析TFE3促进溶酶体介导的耐药是否通过调控MRP2的表达和定位来完成药物在溶酶体的蓄积。我们首先分析TFE3对MRP2是否具有调控作用。结果显示,降低TFE3可以部分逆转Doc、Dox诱导的ABCC2以及ABCB1的表达,而过表达TFE3可以增加Doc、Dox诱导的ABCC2以及ABCB1的表达。Western blotting检测结果显示,MRP2也可定位在溶酶体,且受TFE3的调控,过表达TFE3可以增加MRP2在溶酶体的表达以及溶酶体特异性标志蛋白LAMP2、RAB7的表达,伴随着增加Dox在溶酶体的蓄积、减少其在胞液的含量。因此,TFE3可以通过增加溶酶体的表达以及MRP2的表达和溶酶体定位,进而影响药物在细胞内的分布,导致脱靶耐药。第二部分双联苄化合物RDN靶向溶酶体分子靶点的分析及逆转耐药的作用机制在第一部分的研究中,我们已经明确多数的化疗药物可以激活TFEB或TFE3,进而通过溶酶体介导肿瘤的多药耐药。为此我们以前期筛选并确定药效和毒性的潜力双联苄类化合物为基础,进一步筛选并确定可调控或靶向“TFEB/TFE3-溶酶体-多药耐药”通路的小分子化合物。双联苄化合物Riccardin D的氨甲基衍生物Riccardin D-N（RDN）是我们前期筛选的带有阳离子的化合物,可以靶向溶酶体,引起溶酶体的通透,介导细胞死亡,但其作用机制及靶标不详。我们首先分析RDN对耐药细胞溶酶体的影响以及对逆转耐药的药效;其次确定RDN引起溶酶体通透,诱导DNA损伤的作用机制;最后通过对RDN进行标签修饰,利用IP/MS筛选出RDN的分子靶标VPS18,并对其功能进行了初步分析。一、双联苄化合物RDN与溶酶体靶向药物具有逆转耐药作用1、耐药细胞对靶向溶酶体的化合物更敏感针对耐药细胞中溶酶体增多的表型,我们分析耐药细胞对溶酶体靶向药物的应答。与PC3细胞相比,耐药细胞PC3/Doc对Doc耐受,但对靶向溶酶体的小分子化合物RDN、羟基氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）以及盐霉素（salinomycin,SAL）更为敏感,在相同的浓度下,RDN更易诱导耐药细胞凋亡。另外,RDN在较低浓度（2μM）时即可明显损伤耐药细胞的溶酶体,而SAL（15μM）、HCQ（25μM）则需要较高浓度,提示RDN可能具有更好的应用前景。2、针对同一细胞器的双靶点药物具有明显协同作用药物增敏及合成致死效应是目前,克服单一用药效果差、用药量高、毒副作用大等缺点的一种策略。针对耐药细胞以溶酶体为主的代谢变化明显的特点。我们对一些溶酶体靶向（RDN、SAL、HCQ、Dox）和线粒体靶向（Syrosingopine,Syr、metformin,Met、2-Deoxy-D-glucose,2-DG、BPTES）的小分子化合物进行了联合应用筛选。通过对联用药物的CI（combinatory index）曲线（CI<1,代表有协同作用,值越小协同作用越强）分析,我们发现针对同一细胞器的靶点化合物普遍具有协同作用,而针对不同细胞器的靶点化合物之间的协同效果不理想。其中Syr与Met、BPTES与Syr、RDN与SAL这三对组合具有显着的协同作用。其中Syr与Met联用效果在16年Science的一篇文献中已有报道。本文着重分析了RDN与SAL的联用效果。BPTES与Syr的联用相关工作目前也在进行。3、RDN与SAL具有协同增效作用,并显着降低SAL毒副作用体外的CI曲线分析,RDN与SAL具有显着的协同作用,为进一步验证两者的协同逆转肿瘤多药耐药作用及临床应用前景。我们构建异种移植瘤耐药动物模型。结果显示,针对耐药肿瘤模型,Doc（5 mg/kg）的治疗效果差,且毒性大（小鼠实验期间出现死亡,且肝肾功指标增高）。而RDN（20 mg/kg）和SAL（10 mg/kg）具有抑制肿瘤的作用,但SAL的副作用较大（小鼠实验期间出现死亡,且肝肾功指标增高）。而两者的低剂量的联用（10 mg/kg RDN与1 mg/kg SAL）可显着抑制肿瘤增长（瘤体积明显减小、活体成像荧光强度最弱、Ki67阳性率最低）,同时降低SAL的毒副作用（小鼠体重与对照无差异,肝肾功指标明显改善）。二、双联苄化合物RDN诱导溶酶体通透、促进CTSB入核并介导BRCA1的降解而诱导肿瘤细胞凋亡前期我们已经确定RDN可以靶向溶酶体,通过引起溶酶体的通透,介导细胞死亡,但其作用机制及靶标不详。为此我们进行了进一步的研究。1、RDN阻断自噬体和溶酶体的融合,诱导耐药细胞溶酶体通透溶酶体酸性鞘磷脂酶（ASM）不仅可以反应溶酶体的活性,同时也可以代表溶酶体膜的稳定性。我们首先分析RDN对ASM的影响,结果显示,RDN显着降低耐药细胞ASM的活性。进一步利用GFP-RFP-LC3质粒进行荧光分析,发现RDN和溶酶体靶向药物羟基氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）作用相似,可引起溶酶体通透,阻断自噬体和溶酶体的融合。Western blotting的结果显示,自噬标志物LC3BII/LC3B Ⅰ的转换显着增加,自噬受体P62累积。结合前期数据,确定RDN可阻断自噬体与溶酶体的融合,诱导耐药细胞溶酶体通透。2、RDN促进CTSB入核而加剧DNA损伤我们前期已确定RDN可通过诱导DNA损伤,引起细胞凋亡。进一步分析RDN诱导DNA损伤的机制时发现,RDN处理细胞后,从溶酶体释放的CTSB可定位到细胞核。而CTSB的抑制剂可以部分逆转RDN诱导的DNA损伤及细胞凋亡,表明CTSB是介导RDN诱导DNA损伤的关键因子之一。3、RDN介导的CTSB入核可促进BRCA1降解CTSB作为酶蛋白入核可促进DNA损伤,我们随后分析其与DNA损伤修复的关联。Western blotting结果显示,RDN可降低损伤修复蛋白BRCA1的表达,而过表达CTSB可降低BRCA1水平、显着加强DNA损伤标志蛋白γ-H2AX、凋亡水平增加（PARP的剪切增加）。为验证CTSB在核内的功能依赖于其酶活功能,我们构建了 CTSB的278和298两个酶活位点双突变的质粒（ΔCTSB）,该突变CTSB不影响CTSB的前体表达,但其成熟的活性形式消失,对BRCA1、γ-H2AX、PARP几乎无影响。4、CTSB的入核机制依赖于核信号斑由于CTSB没有经典的核定位信号,其如何定位在细胞核内研究较少。根据最新的文献报道,CTSB在成熟过程中,可形成信号斑,介导其入核。为此我们构建了其信号斑缺失的截断质粒（CTSB-ΔNLS-GFP）。免疫荧光结果显示,在293T中过表达CTSB-GFP,经RDN处理后可促进CTSB的入核,而CTSB-ΔNLS-GFP在RDN刺激的情况下无法入核。Western blotting结果进一步证实,表达CTSB-ΔNLS-GFP后,RDN引起的BRCA1的降解、DNA的损伤均得到缓解,表明CTSB介导的BRCA1的降解依赖于其核定位信号斑。三、双联苄化合物RDN的分子靶标及机制研究1、RDN可直接靶向溶酶体VPS18蛋白1)RDN-Bio探针的制备及活性检测为了明确RDN的作用靶标,我们通过化学方法对RDN进行了 Biotin的标签修饰,得到RDN-Bio探针化合物。MTT结果显示,带有Biotin标签的小分子探针化合物RDN-Bio可浓度依赖的抑制耐药细胞存活,且其抑制活性优于RDN。激光共聚焦检测发现,RDN-Bio可与溶酶体实现很好的共定位,表明RDN及RDN-Bio是具有良好抑制作用的溶酶体靶向化合物。2)筛选确定RDN的作用靶标是VPS18我们通过IP/MS方法筛选分析RDN可能结合的目标蛋白。耐药细胞经Biotin、RDN-Bio处理后,通过免疫共沉淀实验发现在RDN-Bio处理组中100KD左右的位置发现一条特异性条带。对条带进行蛋白质谱分析,发现溶酶体Vacuolar protein sorting-associated protein 18（VPS 1 8）可能是 RDN 的作用靶标。利用免疫共沉淀实验进行验证,结果表明,RDN-Bio可与VPS18紧密结合,并且阻断VPS18和VPS16的结合,即阻断VPS核心复合物的组装。由于VPS核心复合物介导溶酶体与自噬体的融合,此结果证实RDN可阻断自噬溶酶体的融合与成熟。3)RDN结合VPS18的RING结构域并阻断VPS核心复合物的组装为了明确RDN和VPS18的结合位点,我们分别构建VPS18的结构域截短突变质粒（VPS18A1-Flag,VPS18Δ2-Flag,VPS18Δ3-Flag,VPS1 8Δ4-Flag,VPS18Δ5）,CO-IP实验结果表明,RDN-Bio结合在VPS18的RING结构域。2、VPS18在多种肿瘤中高表达,并与不良预后及耐药有关1)VPS18在多种肿瘤组织中高表达VPS18在疾病中的作用少有研究报道,为了明确VPS18是否具有临床意义、是否可以作为肿瘤治疗的分子靶标,我们收集了不同肿瘤患者的癌组织与癌旁组织（前列腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌）,通过qPCR及免疫组化分析其表达情况。结果显示,VPS18在前列腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌的表达显着高于癌旁组织。2)VPS18与肿瘤患者的预后成负相关利用TCGA数据库进行分析,结果显示,VPS18高表达与多种肿瘤的不良预后相关,包括膀胱癌、肺癌、结直肠癌。而VPS其他家族成员如VPS11、VPS16、VPS33A,除了 VPS16与膀胱癌患者的预后成正相关外,其他则无相关性,提示VPS18可作为预后的检测指标,具有临床应用潜力。3)VPS18参与化疗耐受VPS18作为RDN的靶标,且在多种常见恶性肿瘤中高表达,我们进一步分析VPS18是否与耐药有关。Western blotting的结果显示,VPS18在前列腺癌耐药细胞PC3/Doc、肺癌耐药细胞H460/Tax以及膀胱癌耐药细胞J82/Doc中的表达都明显上调,而VPS16只在PC3/Doc中上调明显。分析前期构建的耐药动物模型的瘤组织发现,VSP18也都呈现不同程度的上调。MTT的结果表明,过表达VPS18可以增加细胞对化疗药物的耐受,而下调VPS18则可增加细胞对化疗药的敏感性。因此VPS18与肿瘤的预后、化疗耐药有关,其病理作用机制尚需进一步研究。3、TFE3可转录调控VPS18的表达1)VPS18作为VPS-C核心复合物的关键组分,其在肿瘤及耐药细胞的高表达是否与TFE3有关。qPCR的结果显示,VPS18受TFE3的转录调控,过表达TFE3可明显上调VPS18的表达,表明VPS18是TFE3的下游调控基因,这也与之前其他课题组筛选结果相一致。2)VPS18影响溶酶体的成熟。Lyso-Tracker染色结果显示,下调VPS18会导致溶酶体的数目减少。Western blotting结果显示下调VPS18,显着降低LAMP2、下调CTSB的活性形式,但不影响RAB5的表达。RFP-GFP-LC3双荧光报告基因的染色结果发现,下调VPS18可阻断雷帕霉素诱导的自噬溶酶体的形成。因此,VPS18与溶酶体的成熟及通透有关。第三部分双联苄化合物地钱素M诱导耐药细胞衰老并调控衰老的炎性分泌表型在第一部分的研究中,我们已经明确多数的化疗药物可以激活TFEB或TFE3,进而通过溶酶体介导肿瘤的多药耐药,为此我们以前期筛选并确定药效和毒性的潜力双联苄类化合物为基础,进一步筛选并确定可调控或靶向“TFEB/TFE3-溶酶体-多药耐药”通路的小分子化合物。在第二部分的研究中我们已经明确溶酶体靶向的双联苄化合物RDN可以通过靶向VPS18,引起溶酶体通透,释放CTSB入核,加剧DNA损伤,进而诱导细胞凋亡。同时,在对双联苄的筛选过程中,我们惊喜的发现双联苄化合物地钱素M（Marchantin M,Mar-M）可显着降低TFEB的表达,而且低浓度下可以通过诱导耐药细胞衰老的机制克服耐药。衰老相关的分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）由促炎细胞因子、生长因子、趋化因子和基质重塑酶等组成,它们通过旁分泌的方式对微环境产生影响:既可募集免疫细胞用于清除衰老细胞、发挥抑癌作用;同时分泌的促炎因子、水解酶也可导致邻近组织细胞的增殖、侵袭转移等,促进肿瘤恶化。我们前期已证实Mar-M具有显着的抗炎作用,抑制IL1、IL6、TNF-alpha等。因此,我们首先明确Mar-M促进耐药细胞衰老的作用及机制、是否抑制SASP的表达分泌,以确定其是否能成为潜力药物用于克服耐药、降低肿瘤的复发转移。一、双联苄化合物地钱素M显着降低耐药细胞TFEB,促进耐药细胞的凋亡和衰老1、地钱素M显着抑制耐药细胞TFEB,诱导耐药细胞的凋亡和衰老筛选对耐药细胞有应答的化疗药物、天然小分子化合物的结果显示,多数药物促进TFEB、TFE3的表达和/或活性升高,但地钱素M（Mar-M）显着降低TFEB的表达和入核,并且Mar-M处理后,耐药细胞不仅出现凋亡,而且呈现衰老样表型。通过浓度筛选分析,发现低浓度的Mar-M可显着诱导耐药细胞衰老,优于其他双联苄化合物。二、地钱素M通过抑制蛋白酶体活性诱导耐药细胞衰老1、低浓度Mar-M主要通过p21信号通路引起细胞周期阻滞周期阻滞是细胞衰老的特征之一。Western blotting的结果显示,低浓度Mar-M可明显增加p21、p27的表达,β-gal的染色结果显示,下调p21可逆转Mar-M引起的衰老,而下调p27并无显着的逆转效应。2、低浓度Mar-M通过抑制蛋白酶体,引起DNA损伤,诱导耐药细胞衰老我们前期确定较高浓度Mar-M（10 μM）可抑制蛋白酶体活性、诱导DNA损伤及细胞凋亡。低浓度Mar-M（1μM）是否影响蛋白酶体活性。酶活性测定结果显示,低浓度的Mar-M仍可明显抑制肽基谷胺酰多肽水解酶（Glutamine peptide hydrolases）及胰凝乳样蛋白酶（Chymotrypsin）活性,对蛋白酶体胰蛋白酶（Trypsase）活性影响不大。为进一步明确蛋白酶体在Mar-M诱导的衰老中的重要作用。我们过表达蛋白酶体亚基后观察了 Mar-M诱导的衰老相关表型变化。IF、Western blotting结果显示,低浓度Mar-M可诱导DNA损伤,γ-H2AX的表达增加,而过表达蛋白酶体亚基后可逆转Mar-M引起的DNA损伤。β-gal的染色结果显示,过表达蛋白酶体亚基后可明显逆转Mar-M诱导的细胞衰老。三、地钱素M通过抑制TFEB,进而抑制炎性SASP1、低浓度Mar-M抑制炎性SASP通过低剂量化疗药物诱导肿瘤细胞衰老,是目前肿瘤治疗的新策略。但也存在一些副作用,例如衰老相关分泌因子（SASP）的表达。特别是其中的炎性因子在诱导肿瘤的复发转移中起到了重要作用。我们前期已证实Mar-M具有显着的抗炎作用,抑制IL1、IL6、TNF-alpha等。因此我们首先检测了低浓度Mar-M在诱导耐药细胞衰老的同时,是否仍具有抗炎的作用。我们收取PC3/Doc加Mar-M和Dox处理5天后的上清进行QAH-INF-1芯片检测。蛋白芯片显示,Mar-M组与对照组相比,炎症因子IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8呈下调趋势,而Dox组,炎性细胞因子IL-1α,IL-1β,IL-6上调明显。同时我们通过qPCR进行了进一步的验证,低浓度Mar-M在转录水平即可抑制炎性因子的表达。以上结果表明,相比于传统的化疗药物,Mar-M在诱导耐药细胞衰老的同时,也可抑制炎性SASP的分泌,提示Mar-M具有更好的应用前景。2、低浓度Mar-M通过抑制TFEB的表达抑制SASP的分泌跟据最新的文献报道,TFEB可以参与炎症反应,调控炎症因子的表达。而我们前期的筛选数据也表明Mar-M可明显抑制TFEB的表达。于是我们猜想Mar-M调控炎性SASP的下调是否是通过TFEB介导的。在耐药细胞中下调TFEB,发现IL-1α,IL-1β,IL-6的表达均有所下调。表明TFEB对耐药细胞的炎性因子有直接的调控作用。低浓度Mar-M可明显抑制TFEB的表达,对TFE3的表达无明显的影响。IF的结果进一步证实低浓度Mar-M可抑制TFEB的入核。为进一步证实Mar-M调控SASP的表达是依赖于TFEB的,我们在293T中过表达TFEB可部分逆转Mar-M引起的炎性因子的下调。3、Mar-M可抑制SASP的旁分泌效应、具有抑制肿瘤复发转移的潜力为进一步验证Mar-M的应用潜力,我们进行了体内的药效学验证。我们首先构建了可以用于体内验证旁分泌效应的动物模型。简述如下,我们首先在小鼠的左腋下种植RM 1/Doc细胞,成瘤后分别给予Mar-M和Dox连续给药两周后停药,将每组的小鼠分成三部分进行后续实验。第一部分,小鼠停药后,取瘤组织进行冰冻切片,进行衰老染色,用于验证Mar-M在体内诱导衰老的效果。第二部分,在小鼠右侧腋下接种RM 1/Doc-Luc细胞。10天后进行活体成像检测。用于验证Mar-M对SASP引起的促肿瘤增殖的影响。第三部分,不做任何处理,继续检测老鼠体重与生存状况。1)Mar-M在体内仍能诱导耐药细胞衰老。对Mar-M和Dox处理后的瘤块进行衰老染色,结果显示,Mar-M在体内仍能诱导耐药细胞衰老。2)Mar-M在体内仍可抑制炎性SASP,进而抑制其旁分泌促肿瘤增殖的作用。对Mar-M和Dox处理后小鼠的血清进行Elisa分析发现,Mar-M在体内仍能明显抑制炎性因子IL-1α,IL-1β,IL-6的表达,而Dox组的表达明显上调。活体成像显示,在Mar-M处理组,右侧腋下接种的RM 1/Doc-Luc细胞荧光强度明显降低,成瘤能力减弱,对瘤块进行进一步的Ki67染色发现,其阳性着色也明显减少。而Dox处理组,无论是荧光强度还是Ki67阳性率都明显增强。以上结果表明,Mar-M在体内仍可抑制SASP的表达,进而抑制其旁分泌效应,具有抑制肿瘤复发转移的潜力。3)Mar-M能明显延长小鼠的生存。体重的分析检测发现,Dox处理组小鼠的体重随着给药次数的延长,体重明显下降。表明其存在明显的毒副作用。而Mar-M处理组与对照体重无明显差异。提示Mar-M的毒副作用较小。生存分析显示相比于对照组和Dox处理组,Mar-M可以明显的延长小鼠的存活时间。以上结果提示Mar-M具有更好的临床应用前景,可作为逆转肿瘤耐药的候选潜力化合物。第四部分结论、创新点及不足之处一、论文的结论1、溶酶体代谢重编程是获得性耐药的机制之一（1）化疗药物通过激活MiT/TFE家族成员、特别是TFE3活化,促进溶酶体的更新与合成而参与肿瘤多药耐药。（2）耐药细胞中,多西他赛滞留于溶酶体导致脱靶耐药。（3）MRP2是TFE3的下游靶基因之一,而耐药细胞高表达的MRP2可定位于溶酶体,从而改变多西他赛在细胞内的定位产生耐药。2、溶酶体靶向药物能够显着克服获得性耐药（1）RDN通过靶向VPS18逆转耐药。（2）VPS18在多种肿瘤及耐药细胞中高表达并与预后成负相关,可作为一种新的肿瘤治疗靶点。（3）RDN与SAL具有明显的协同抗肿瘤作用,降低药物的毒副作用。（4）Mar-M能下调耐药细胞TFEB的表达和活化,抑制溶酶体更新和合成。（5）低浓度Mar-M通过抑制蛋白酶体活性、诱导DNA损伤从而诱导耐药细胞衰老,逆转耐药,且毒副作用小。（6）低浓度Mar-M通过抑制炎性SASP的表达,抑制其旁分泌效应,降低肿瘤的复发转移,延长小鼠的生存期。二、论文的创新性（1）首次报道TFE3及调控的溶酶体重编程参与多种化疗耐药。（2）首次报道多西他赛Doc可以被溶酶体滞留,导致脱靶耐药。（3）首次报道TFE3可调控MRP2,而MRP2可定位在溶酶体膜上进而影响药物的亚细胞定位,导致脱靶耐药。（4）首次报道双联苄化合物RDN的分子靶点为VPS18,并确定RING结构域是RDN与之结合的区域。（5）首次报道VPS18在多种肿瘤中高表达,可作为肿瘤治疗的新靶点及预后指标。（6）首次报道Mar-M能下调TFEB,通过抑制SASP的表达,抑制其旁分泌的负面效应。三、论文的不足之处（1）TFE3调控MRP2的分子机制不清,但相关工作正在进行。（2）VPS18的生理及病理功能需进一步研究。（3）Mar-M调控TFEB的分子机制需进一步研究。
刘薇[5]（2017）在《药用真菌凝集素AAL/GL和AAL2/NL的功能研究》文中提出第一部分凝集素AAL/GL抗肿瘤机理研究凝集素是一种糖结合蛋白,多种凝集素具有显着的抗肿瘤作用,其能引起细胞发生凋亡或自噬引起的细胞死亡（Li et al.,2011;Liu et al.,2010c;Ouyang et al.,2014）。但是凝集素引起的凋亡及自噬间的关系很少有报道。凝集素AAL/GL（Agrocybe aegerita lectin）是从茶树菇中分离纯化的能特异性结合半乳糖的凝集素,并且前期的研究表明其通过引起细胞发生凋亡从而发挥抗肿瘤的作用（Zhao et al.,2003）。本研究中,我们发现AAL/GL不仅能引起肝癌细胞发生凋亡,并且也能引起其发生自噬。通过Western Blot检测发现AAL/GL处理肝癌细胞后,细胞内的LC3-Ⅱ显着增加,并且具有时间和药物浓度依赖性,说明AAL/GL能引起肿瘤细胞发生自噬,为了进一步证明此结果,我们将EGFP-LC3质粒转染至Huh7细胞,AAL/GL处理后,细胞出现绿色斑块,这是由于细胞发生自噬生成LC3-Ⅱ所引起的结果。吖啶橙染色实验可以观察到自噬小泡的形成,并且电镜下也可以清晰的看见细胞经AAL/GL处理后形成许多自噬小泡,这些结果都充分说明AAL/GL可以引起肝癌细胞发生自噬。进一步研究表明AAL/GL引起的凋亡和自噬之间存在关联:用自噬抑制剂CQ（chloroquine）或3-MA（3-Methyladenine）处理肝癌细胞,用AnnexinV/PI检测细胞凋亡,结果表明当AAL/GL引起的肝癌细胞自噬被抑制时,细胞凋亡增加,说明AAL/GL引起的自噬起到保护肿瘤细胞的作用。为了研究AAL/GL是否能引起体内肿瘤细胞发生自噬,我们通过从小鼠脾脏注射H22细胞构建了原位肝癌模型,Western Blot和电镜结果表明AAL/GL处理后肝癌细胞发生自噬,AAL/GL和CQ协同处理后肝癌细胞自噬程度减弱,AAL/GL和CQ协同处理能增强AAL/GL体内抗肿瘤作用,大大增加荷瘤老鼠的生命期。说明AAL/GL引起的体内肝癌细胞的自噬同样是起到保护肿瘤的作用。我们的结果表明自噬抑制剂与AAL/GL在抗肿瘤方面起到协同作用。自噬抑制剂可能是一些既能引起细胞自噬又能引起细胞凋亡的抗肿瘤药物很好的协同剂,提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性,有助于抗肿瘤研究的发展。第二部分O-GlcNAc修饰蛋白的富集与鉴定蛋白O-GlcNAc修饰是一种普遍的转录后修饰,是单个N-乙酰葡萄糖胺以O-糖苷键与蛋白的丝氨酸或苏氨酸的羟基连接。O-GlcNAc修饰的蛋白主要分布于细胞核,细胞质和线粒体中。O-GlcNAc修饰只由两种高度保守的酶调节,即OGT（O-GlcNAc transferase）和 OGA（O-GlcNAcase）。O-GlcNAc 修饰和磷酸化修饰有相互作用,并且能调节许多细胞过程,包括转录,细胞周期,神经发育和新生多肽链的稳定性（Hart et al.,2007;Hart et al.,2011;Zhu et al.,2015）。O-GlcNAc修饰的失调会导致许多疾病,包括心血管疾病,肿瘤,神经退行性疾病,糖尿病（Bond and Hanover,2015）。然而,O-GlcNAc修饰的鉴定是O-GlcNAc修饰研究的主要瓶颈。本研究中,我们主要用两种方法富集组织样品中O-GlcNAc修饰肽段,进而用Orbitrap Fusion Mass Spectrometer（Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA）的HCD/ETD模式对样品进行分析。一种是用凝集素富集的方法。AAL2/NL是茶树菇中鉴定到的能高特异性结合以GlcNAc结尾的糖链的凝集素。糖芯片分析和SPR实验表明AAL2/NL对GlcNAc的亲和力远高于WGA对GlcNAc的亲和力,WGA是一种最常用于O-GlcNAc修饰鉴定的凝集素。实验室前期的结果表明Sepharose 4B-AAL2/NL和POROS-AAL2/NL可以从简单混合肽样品中富集O-GlcNAc修饰的标肽。随后,我们设计两步弱亲和法富集、鉴定小鼠肝脏组织中O-GlcNAc修饰肽段:通过Sepharose 4B-AAL2/NL富集O-GlcNAc修饰蛋白,通过胰酶酶解、PNGAses F处理除去N糖、凝集素除杂后,肽段再用POROS-AAL2/NL亲和层析柱富集O-GlcNAc修饰的肽段,然后用HCD/ETD质谱碎裂模式检测样品。我们总共鉴定到20个O-GlcNAc修饰的蛋白,27个O-GlcNAc修饰位点。其中17个蛋白,21个位点是新鉴定到的。这些结果说明AAL2/NL可以用与O-GlcNAc修饰大规模鉴定。为了提高AAL2/NL对GlcNAc亲和力及特异性,实验室余国军博士将AAL2/NL二聚化,成功表达纯化了 AAL2/NL的二聚体（简称Di-AAL2）用于O-GlcNAc 修饰研究。ITC 和 SPR 结果表明,Di-AAL2 与 AAL2/NL 对 GlcNAc亲和力相当。Di-AAL2可以从O-GlcNAc修饰标肽和BSA酶解肽段混合样中有效富集标肽。随后我们用POROS-Di-AAL2富集小鼠肝脏O-GlcNAc修饰肽段,分别收集穿透拖尾部分和洗脱部分的样品,HCD/ETD质谱检测结果表明O-GlcNAc修饰肽段主要被富集在穿透拖尾部分,并且多次上样可以提高O-GlcNAc修饰肽段的富集效率,减少样品的复杂性,有助于质谱分析。多次实验后,我们在小鼠肝脏和蛋白样品中共鉴定到121个O-GlcNAc修饰的蛋白,191条O-GlcNAc修饰肽段序列,237个O-GlcNAc修饰位点（197个是确定的位点）,其中95个蛋白是新鉴定到的。这些结果说明Di-AAL2可以用于O-GlcNAc修饰大规模鉴定。用Di-AAL2富集正常大鼠肝脏、心脏中O-GlcNAc修饰肽段,质谱结果显示正常肝脏和心脏中分别鉴定到43个O-GlcNAc修饰蛋白,56个确切的O-GlcNAc修饰位点和34个O-GlcNAc修饰蛋白,39个确切的O-GlcNAc修饰位点。另一种是用超滤管的方法（filter aided sample preparation,FASP）富集样品中O-GlcNAc修饰的肽段,先将CTD110.6与样品4℃孵育,然后用超滤管截留CTD110.6及与其结合的O-GlcNAc修饰肽段,GlcNAc释放O-GlcNAc修饰的肽段,最后用HCD/ETD质谱碎裂模式进行分析,结果显示正常肝脏和心脏分别鉴定到72个,16个O-GlcNAc修饰蛋白,结果有待进一步手动校正及生物信息学分析。我们鉴定的O-GlcNAc修饰蛋白及位点绝大部分都是没有被报道过的,并且我们的两种凝集素都是第一次用于O-GlcNAc修饰鉴定,并且在肝脏中鉴定到大量O-GlcNAc修饰蛋白说明这两种凝集素可以作为新的O-GlcNAc修饰蛋白研究策略,对于组织样本的O-GlcNAc修饰鉴定具有重要意义。
郑一超[6]（2014）在《LSD1对胃癌发生发展的调控机制及小分子抑制剂干预研究》文中研究指明表观遗传学是指在DNA序列不变的前提下基因表达或细胞表型的可遗传变化，主要包括DNA甲基化，组蛋白共价修饰，染色质重塑，基因沉默和RNA编辑。其中，组蛋白修饰涉及许多生理生物化学过程，可通过调控染色质结构而激活或抑制基因表达。LSD1（Histone Lysine Specific Demethylase1,组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1）是2004年确认的第一个组蛋白去甲基化酶，可去除组蛋白H3K4、H3K9和非组蛋白底物赖氨酸的甲基而调控其生物学功能。LSD1在多种肿瘤中高表达，用LSD1抑制剂或RNAi降低LSD1活性或表达量可抑制肿瘤生长。因此，获得高效、低毒、高选择性LSD1抑制剂是目前抗肿瘤药物研究热点。LSD1作为MAO-A/B（Monoamine Oxidase A/B，单胺氧化酶A/B）同源蛋白，以FAD（Flavin Adenine Dinucletide，黄素腺嘌呤二核苷酸）作为辅酶发挥其生物学功能。因此，许多通过与FAD相互作用而抑制MAO活性的化合物亦可抑制LSD1活性，如2-PCPA（Tranylcypromine，苯环丙胺）。2010年有报道利用Click反应合成含三氮唑的MAO-A抑制剂，因此我们推测含1,2,3-三氮唑小分子MAO-A抑制剂对LSD1亦具有一定抑制活性。与此同时，二硫代甲酸酯类化合物由于其广泛的抗菌和抗肿瘤活性亦吸引我们的注意力。因此，本课题利用Click反应和药物设计中拼合原理，将1,2,3-三氮唑和氨基二硫代甲酸酯两个活性片段拼合在一个分子之中，设计并合成了一类含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯类化合物，检测其对LSD1抑制活性，对其进行衍生化，获得高效、高选择性LSD1抑制剂，并深入研究其体外、体内对肿瘤细胞增殖的抑制作用，抗肿瘤转移和侵袭作用及作用机制。我们的研究结果和主要发现包括：1) LSD1抑制剂筛选平台的建立及LSD1抑制剂的设计与合成；我们首先利用分子生物学方法构建了LSD1原核表达载体，并利用基因工程原核表达、分离纯化出LSD1重组蛋白；同时为进行选择性筛选，我们亦分离纯化了LSD1的另一同源蛋白LSD2。由于LSD1、LSD2去甲基化过程中可生成一分子过氧化氢，本研究使用荧光探针Amplex Red定量检测LSD1、LSD2作用于组蛋白底物过程中生成过氧化氢，定量判断LSD1、LSD2活性及我们设计合成的小分子化合物对其活性抑制作用，建立筛选平台。同时开展了1,2,3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯类LSD1抑制剂研究。通过对设计、合成69个化合物活性筛选和生物活性评价以及构效关系分析，发现一类具有全新结构的LSD1抑制剂，其中活性最好的是化合物30，其对LSD1抑制活性IC50为2.11μM。因此，以下研究以化合物30为主要研究对象开展。2) LSD1抑制剂在重组蛋白水平对LSD1活性的调控作用及其选择性研究；我们通过体外酶活性筛选实验证实：LSD1抑制剂化合物30可特异性作用于LSD1，而对LSD2抑制活性较弱，对MAO-A/B无抑制活性。通过稀释法和透析法研究发现，化合物30可通过非共价键与LSD1呈可逆性结合并抑制LSD1活性。酶动力学实验揭示化合物30可能竞争性作用于LSD1辅酶FAD所在活性口袋，可能是通过将FAD挤出LSD1活性中心调节LSD1活性；另一方面，化合物30亦有可能作用于LSD1别构区，通过改变酶构象将辅酶FAD“挤出”LSD1从而调节酶活性。分子对接及分子动力学模拟实验进一步预测化合物30是LSD1辅酶FAD竞争性抑制剂，化合物30可通过与LSD1形成分子间氢键占据FAD所在空穴位置，进而抑制FAD与LSD1的结合和活性。3) LSD1抑制剂在细胞水平对LSD1抑制活性、抑制肿瘤细胞增殖作用及其整体动物水平生物活性评价；胃癌细胞MGC-803中，我们发现LSD1选择性抑制剂化合物30可上调底物H3K4me1、H3K4me2和H3K9me2表达量，并特异性抑制LSD1高表达胃癌细胞系MGC-803、HGC-27细胞增殖，而对LSD1低表达胃黏膜正常细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC-7901增殖无明显抑制作用。同时，化合物30可诱导MGC-803细胞凋亡并将细胞周期阻滞于G2/M期。整体动物水平实验显示，化合物30可抑制人胃癌MGC-803裸鼠皮下移植瘤生长，并显示出较低毒副作用。4) LSD1抑制剂抑制胃癌细胞转移和侵袭作用及其作用机制研究；划痕实验及transwell实验证实，在低于最低诱导细胞凋亡浓度下，化合物30可抑制细胞转移和侵袭。免疫共沉淀实验显示，化合物30可通过抑制LSD1与snai1相互作用，激活E-Cadherin启动子，上调EMT标志蛋白E-Cadherin表达。化合物30同时可抑制间质细胞标志蛋白N-Cadherin表达，从而抑制肿瘤细胞转移和侵袭。进一步Elisa实验证实，LSD1抑制剂化合物30可抑制MGC-803中TGF β1（Transforming Growth Factor beta1，转化生长因子β1）表达，因此，我们推测化合物30通过调节LSD1活性及抑制TGF β1表达，抑制肿瘤细胞EMT（epithelial-mesenchymal transition，上皮-间质细胞转变）过程，最终抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。5)胃癌细胞MGC-803及胃黏膜上皮细胞GES-1中TGF β1对LSD1调控及作用机制；TGF β超家族是一类结构相似但功能不同的肽类物质，其中TGF β1含量最高并在癌症发生与发展中发挥重要作用。在正常组织中TGF β1扮演着抑癌基因作用，抑制肿瘤生长；而在肿瘤组织中，随着肿瘤的恶化，TGF β1可促进肿瘤生长。本课题研究发现胃癌细胞MGC-803中，不同浓度TGF β1可时间依赖性上调LSD1表达。分别应用ERK抑制剂tangeretin，NF-κB抑制剂bay11-7085，p300抑制剂C646与TGF β1联用均可抑制TGF β1诱导的LSD1过表达，提示TGF-β1对LSD1的表达调控依赖上述ERK，NF-κB及p300调控通路。由于p300能够作用于LSD1启动子，我们应用萤光双报告基因实验进一步证实ERK、NF-κB、p300在TGF β1诱导LSD1表达上调过程中对LSD1启动子活性的调节作用，因此推测TGF β1可能通过激活ERK使其磷酸化，进而激活NF-κB使其亚基p65入核并被磷酸化，从而招募转录因子p300作用于LSD1启动子区，激活LSD1启动子并时间依赖性上调LSD1表达。而对正常胃黏膜上皮细胞GES-1，TGF β1可失活ERK，从而阻断NF-κB激活，抑制p65的磷酸化，对LSD1表达无影响。通过上述研究工作，本课题共合成69个含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯类化合物。并对其开展了LSD1活性筛选和评价，对化合物30开展了重点研究。化合物30可逆性抑制LSD1活性，选择性抑制LSD1高表达胃细胞系MGC-803和HGC-27增殖，并可通过抑制细胞EMT过程抑制肿瘤细胞转移和侵袭。进一步研究发现，胃癌细胞MGC-803中TGF β1激活ERK，NF-κB信号通路，招募p300激活LSD1启动子，上调LSD1表达。而胃黏膜上皮细胞中，TGF β1对LSD1表达无调节作用。本研究首次报道可同时抑制肿瘤细胞增殖及转移的选择性LSD1抑制剂。同时揭示了胃癌细胞MGC-803及正常胃黏膜上皮细胞GES-1中TGF β1对LSD1调控作用机制，为以LSD1为靶点抗肿瘤药物的开发及揭示肿瘤恶性增殖的分子机制提供重要理论和实验依据。
宋学东[7]（2014）在《一、PLCε抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 二、HepaCAM对前列腺癌细胞生物学功能影响及机制探讨》文中指出目的：1.构建PLCε原核表达系统。表达、分离纯化PLCε蛋白并鉴定。2.制备兔抗PLCε蛋白抗血清，进一步分离纯化验证其特异性，并初步在膀胱癌中应用。方法：1.应用RT-PCR从人膀胱癌细胞cDNA中克隆出氨基端PLCε基因，将此氨基端PLCε片段连接至pGEX-6P-1原核表达载体上，构建原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε。2.将原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达GST-PLCε重组蛋白，通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白，鉴定所纯化的重组蛋白。3．将纯化的GST-PLCε重组蛋白免疫家兔，制备家兔抗PLCε的抗血清，经蛋白A抗体纯化系统分离纯化抗血清，ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。4.利用制备的PLCε抗血清包被ELISA板，制备快速PLCε蛋白血清检测ELISA试剂盒，检测30例膀胱癌患者与6例正常人血清中PLCε蛋白的表达情况，初步探索PLCε抗血清在膀胱癌中应用。结果：1．经RT-PCR、基因重组、酶切及测序验证原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε构建成功，通过GST亲和层析系统分离纯化，得到GST-PLCε重组蛋白。2.将纯化后的GST-PLCε重组蛋白免疫家兔，经纯化获得抗血清；ELISA效价1:16000以上；Western blot结果显示，该抗血清与原核表达的GST-PLCε重组蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。3.制备的抗血清包被的ELISA可以检测到血清中PLCε蛋白的表达，膀胱癌患者血清中PLCε为5.62±2.79ng/ml高于正常对照组2.53±0.42ng/ml（P＜0.05）,差异具有统计学意义。结论：成功构建PGEX-6P-1/PLCε原核表达系统，纯化获得了较高纯度的GST-PLCε重组蛋白，并以重组蛋白为免疫原，制备了兔抗PLCε的抗血清，初步用于膀胱癌的血清学检测。PLCε的抗血清的获得为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础，同时也为开发快速检测膀胱癌诊断试剂盒提供了实验数据。目的：1.探讨HepaCAM基因在前列腺组织及细胞株中的表达，分析其表达与各临床病理参数的相关性。2.利用腺病毒载体，过表达HepaCAM基因，检测其对人前列腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移等生物学功能的影响及机制探讨。方法：1.应用RT-PCR和Western blot等技术，检测前列腺细胞株RWPE-1,LNCap, DU145及PC3中HepaCAM基因的表达。应用IHC技术检测75例前列腺组织中HepaCAM蛋白的表达情况，统计学分析其表达与各临床病理参数的相关性。2.应用WST-8试验、FCM、划痕试验及Transwell等实验技术检测HepaCAM对前列癌LNCap, DU145和PC3细胞株增殖、凋亡、侵袭和转移的影响。应用Western blot检测HepaCAM、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9和GAPDH等相关蛋白水平的表达。3.应用细胞免疫荧光、RT-PCR和Western blot等技术，检测过表达HepaCAM后前列腺癌LNCap细胞中AR的mRNA和蛋白水平的影响。应用Western blot和ELISA技术检测HepaCAM对其胞质及分泌型PSA的影响。应用EGF处理细胞后，Western blot检测HepaCAM对癌细胞P-ERK及t-ERK等蛋白表达的影响。结果：1. HepaCAM基因在LNCap, DU145和PC3细胞中表达缺失，在前列腺癌组织中的表达与BPH及正常前列腺组织相比显着降低，且与前列腺癌各临床参数间均无相关性。2. HepaCAM基因能够抑制前列腺癌LNCap, DU145和PC3细胞的增殖，诱导细胞凋亡，降低癌细胞侵袭及转移。体外过表达HepaCAM后能够降低Bcl-2、MMP2和MMP9的表达，增加Bax的表达水平。3.细胞免疫荧光及Western blot结果显示，HepaCAM可以抑制前列腺癌LNCap的AR核转移，降低AR的表达。Western blot和ELISA检测PSA表达明显下降。HepaCAM可以阻滞ERK的磷酸化表达水平。结论:在前列腺癌中HepaCAM低表达，过表达HepaCAM可以抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭与转移，诱导细胞凋亡。相关分子机制可能是HepaCAM抑制前列腺癌AR的核转位和ERK磷酸化来实现的。因此，HepaCAM基因缺失对临床判断前列腺癌的发生发展有指导意义，为肿瘤的生物治疗提供新的分子靶点。
郭传亮[8]（2013）在《多能干细胞关键转录因子Nanog和Oct4的RNA结合蛋白的鉴定和研究》文中进行了进一步梳理多能干细胞有一种独特的特性就是它们可以进行自我更新并且可以分化成所有细胞类型。多能干细胞干性维持机制一直是科学家们研究的热点,之前的研究主要集中在转录因子如何与下游靶基因相互作用从而调控一系列多能性基因和分化基因的表达这一方向,这些转录因子包括Oct4,Nanog,Sox2。他们组成了控制多能干细胞转录调控网络的转录复合体中心。这个转录调控复合体跟其他的转录因子在维持多能干细胞多潜能性方面共同起着基础性的调控作用。随着研究的进行,人们发现转录后调控过程对于真核基因的表达有着更强烈的影响,这一过程通过特异性针对mRNA的方式调控着mRNA代谢的每一个阶段,包括选择性剪切,核转运,mRNA代谢,细胞分裂,定位和翻译等步骤。另外值得注意的是,在早期胚胎发育过程中通常是没有转录行为发生的,而细胞分裂、细胞命运决定等细胞内一系列重要决定也是在早期胚胎发育过程中做出的。正是由于这个原因,早期胚胎发育过程和干细胞自我更新过程中基因的表达调控主要依赖于转录后水平调控来进行的。我们的研究正是从转录后水平调控入手探讨调控多能干细胞多能性维持和分化基因表达的可能性机制,在转录后调控中mRNA代谢是由一系列RNA结合蛋白与靶基因mRNA相互作用实现的。因此我们选择Nanog这个多能干细胞关键转录因子作为我们的研究对象,通过鉴定和验证Nanog的RNA结合蛋白,并分析这些RNA结合蛋白对于多能干细胞多能性维持的功能性作用,继而分析它们的RNA结合蛋白是怎样通过转录后调控来控制Nanog的mRNA代谢过程的。同时我们也初步鉴定了与Oct4相互作用的RNA结合蛋白,为以后研究Oct4转录后调控网络奠定基础。我们首先用体外链霉素标签亲和层析技术分离了Nanog和Oct4的RNA结合蛋白,并且用高效液相色谱和质谱鉴定出了Nanog 118个Nanog的RNA结合蛋白和114个Oct4的RNA结合蛋白。继而又重点从Nanog RNA结合蛋白中根据功能和肽段匹配分值筛选出8个最可信的RNA结合蛋白做进一步验证和功能研究,Western Blot验证8个候选RNA结合蛋白证明与质谱鉴定出的结果是一致的,RNA免疫共沉淀验证这些候选RNA结合蛋白确定在细胞内部也与Nanog RNA有相互作用关系,我们还用体内分离RNA结合蛋白的方法即MS2-Bio TRAP亲和纯化技术来获取与Nanog mRNA在细胞内部相互作用的RNA结合蛋白,之后对体内方法获取的RNA结合蛋白进行Western Blot验证初步证实了其中确实含有体外方法鉴定得到的候选RNA结合蛋白。其中我们挑选了2个在RNA免疫共沉淀验证中被认为与Nanog RNA结合能力最强的RNA结合蛋白YBX1和ILF3作为对多能干细胞多潜能性维持是否有功能性调节作用的关键基因进行验证,我们采用了RNA干扰的方法降低YBX1和ILF3基因表达量,分析它们对小鼠多能干细胞多潜能性基因和分化基因表达的影响,结果证明干扰YBX1和ILF3基因表达会明显降低小鼠多能干细胞多潜能性基因的表达量,同时可能会导致多能干细胞向中胚层分化,之后ILF3干扰细胞的全基因组芯片研究表明表达量变化明显的基因很多都是关键转录因子Nanog,Oct4,Sox2靶向结合的基因,因此我们推测干扰ILF3可能对转录因子Nanog,Oct4,Sox2的下游靶向作用基因的影响很大,同时在一定程度上也说明了转录因子的上游调控元件可能是通过调节转录因子的表达继而控制下游基因的表达的。而根据之前研究提出的结论,Nanog是由Oct4和Sox2转录因子调控的,我们的研究发现ILF3作为Nanog的上游调控因子（RNA结合蛋白）,同时还是Oct4和Sox2的下游靶基因,因此我们推测Oct4和Sox2可能是通过调控ILF3的表达间接控制Nanog基因表达的。
王艺[9]（2011）在《肺泡巨噬细胞膜核仁素在大鼠内毒素肺损伤中作用及机制研究》文中指出背景和目的:急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是临床常见的呼吸系统急危重症之一,感染是该病的主要诱因,革兰氏阴性杆菌感染致ALI,主要是由于内毒素（Endotoxin）的主要成分脂多糖（Lipopolysacharide,LPS）活化炎性细胞释放大量炎症细胞因子所致。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AMs）是呼吸道的重要防线,亦是LPS的主要效应细胞。研究其LPS致伤作用的信号通路及阻断效应,对帮助了解ALI的发生机制,寻找ALI治疗的新靶位,具有重要的理论和实际意义。核仁素是一种穿梭蛋白,它可以自由穿梭于细胞核、细胞浆和细胞膜之间,它参与了细胞周期的调节,并在病原微生物的感染和自身免疫系统疾病中也发挥一定的作用。核仁素可以帮助病原微生物粘附于宿主细胞并进入宿主细胞,这使核仁素成为抗微生物感染的新的治疗靶点。目前,有研究报道,在外周血的单核细胞THP-1细胞膜表面也有核仁素表达和分布,并参与了LPS诱导的炎症因子TNF-α和IL-6的产生和释放,其具体的信号传导途径尚未阐明。AMs是来源于外周血的单核细胞,核仁素在其细胞膜表面是否有表达,以及是否参与了LPS对AMs的激活尚未见文献报道。本研究旨在通过检测大鼠肺泡巨噬细胞膜表面核仁素的表达分布变化,观察膜核仁素与LPS的相互作用,探讨膜核仁素在LPS激活AMs中的作用,初步阐明其在LPS致急性肺损伤中的作用及机制。方法:1.检测大鼠肺泡巨噬细胞膜核仁素的表达采用支气管肺泡灌洗法分离获得大鼠肺泡巨噬细胞。应用免疫荧光激光共聚焦法及流式细胞术检测大鼠肺泡巨噬细胞膜表面核仁素的表达。2.观察肺泡巨噬细胞膜核仁素与LPS相互作用应用亲和层析法,制备LPS的亲和层析柱,分离纯化与LPS结合的肺泡巨噬细胞膜结合蛋白。ELISA法检测LPS与核仁素的结合反应。采用双重免疫荧光法,用FITC标记的LPS以及Cy3标记的核仁素抗体共同孵育肺泡巨噬细胞,观察二者在细胞内的共定位情况。流式细胞术分析核仁素抗体对肺泡巨噬细胞结合LPS的影响。3.LPS诱导下肺泡巨噬细胞核仁素的基因和膜蛋白表达变化用RT-PCR和Western blot的方法分别检测LPS诱导下肺泡巨噬细胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白在不同时相点上的表达变化。用RT-PCR和Western blot法分别检测不同浓度的LPS诱导下肺泡巨噬细胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白的表达变化。4.体外转染核仁素RNAi表达载体对LPS激活肺泡巨噬细胞作用的实验研究分离、培养大鼠肺泡巨噬细胞,在LPS刺激前予以转染pBS-U6.C23shRNA。免疫荧光及激光共聚焦观察LPS内化入肺泡巨噬细胞情况。Western blot检测膜核仁素蛋白表达。EMSA检测肺泡巨噬细胞NF-κB活性。ELISA检测培养上清液中TNF-α和IL-6表达。5.体内转染核仁素RNAi表达载体对LPS肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞活化的影响SD大鼠麻醉后行气管插管,气管内滴入pBS-U6.C23shRNA,对照组滴入pBS-U6.controlshRNA,48h后予以尾静脉注射LPS,复制急性肺损伤模型。取左下肺行HE染色。肺泡灌洗分离培养肺泡巨噬细胞,Western blot检测肺泡巨噬细胞膜核仁素蛋白表达;EMSA检测肺泡巨噬细胞NF-κB活性;ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6表达。结果1.成功分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,免疫荧光染色和流式细胞术均观察到大鼠肺泡巨噬细胞膜表面有核仁素表达。2.通过亲和层析法分离纯化得到LPS膜结合蛋白核仁素,膜核仁素可以与LPS直接结合,ELISA检测显示二者的结合反应呈浓度依赖性增加。同时,运用双重荧光共定位法观察到核仁素与LPS 1h后共定位于细胞膜上,4h后共定位于细胞浆内,流式细胞术检测发现抗核仁素的抗体显着抑制了LPS与肺泡巨噬细胞结合。3.正常未受刺激的细胞即可见核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表达。1ug/ml的LPS刺激肺泡巨噬细胞,1h后核仁素的mRNA表达开始升高,4h达到高峰,随后逐渐减弱;膜核仁素的蛋白表达2h开始升高,8h达到高峰,12h后逐渐下降。用不同浓度的LPS刺激肺泡巨噬细胞,实验组核仁素的mRNA和膜核仁素蛋白表达显着高于对照组（P<0.01）,而且随着LPS浓度的增加,其表达呈浓度依赖性增强,当LPS浓度达到100ug/ml时,继续增加LPS的浓度,核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表达不再增加。4.LPS刺激后的未转染及转染pBS-U6.controlshRNA对照组的细胞膜核仁素蛋白的表达、LPS的内化、NF-κB的活性以及上清液中TNF-α和IL-6的含量均较未刺激细胞增强（P<0.01） ;转染pBS-U6.C23shRNA组的细胞与未转染组及转染pBS-U6.controlshRNA组相比,以上指标均明显降低（P<0.01）。5.气道内转染pBS-U6.C23shRNA或pBS-U6.controlshRNA 48h后,大鼠生长状态良好。LPS肺损伤模型建立后行肺泡灌洗,与对照组相比,未转染组和转染pBS-U6.controlshRNA组的肺病理损伤、肺泡巨噬细胞膜核仁素的蛋白表达、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量均显着升高（P<0.01） ;转染pBS-U6.C23shRNA组肺泡巨噬细胞膜核仁素的蛋白表达明显下调,干扰效果达72%;肺病理损伤评分、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量均明显低于未转染组和转染pBS-U6.controlshRNA组（P<0.01）。结论:1.正常大鼠肺泡巨噬细胞膜表面表达有核仁素,LPS可以增强核仁素mRNA和膜核仁素蛋白的表达。2.肺泡巨噬细胞膜核仁素可能是LPS的一种新的膜结合受体,它参与了LPS的内化。3.膜核仁素协助LPS进入细胞内后,可以激活核转录因子,诱导炎症因子TNF-α和IL-6的产生和释放,膜核仁素参与了LPS致伤作用的信号传导。4.气管内滴入法可以安全有效转染pBS-U6.C23shRNA,降低肺泡巨噬细胞膜核仁素蛋白表达,减弱核因子活性,减少TNF-α和IL-6的生成,减轻肺损伤。
刘田[10]（2009）在《亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因克隆、分离纯化和性质表征》文中研究表明β-N-乙酰己糖胺酶（EC 3.2.1.52）广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,负责水解多种糖复合物中以β-糖苷键连接的β-N-乙酰葡萄糖胺和β-N-乙酰半乳糖胺。昆虫β-N-乙酰己糖胺酶由多个基因编码,参与几丁质降解、N-糖基化修饰、糖复合物降解以及配子结合等生理过程。几丁质是由β-N-乙酰-D-葡萄糖胺（β-N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc）以β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖。由于几丁质是昆虫重要的结构组分但在高等动植物体内没有分布,因此如果昆虫体内存在专一性参与几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶,那么对该酶的选择性抑制将为农业害虫防治提供新的思路。本研究旨在鉴定农业害虫亚洲玉米螟体内专一性参与几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶,为绿色农药的开发提供新的理论参考;同时对该酶性质和机理的表征也能够扩展对于β-N-乙酰己糖胺酶乃至糖基水解酶的认识。论文的主要研究工作包括:（一）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列及转录水平研究（1）根据已知昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的保守片段设计引物,采用RT-PCR及RACE的方法从亚洲玉米螟五龄幼虫总RNA中获得编码β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列（OfHEXl）,全长为2593 bp,编码594个氨基酸,Genbank登录号为DQ887769.1;（2）通过与已知晶体结构的β-N-乙酰己糖胺酶进行多重序列比对发现,Glu355、Asp240、His294、Asp354、Tyr450和Trp424等关键氨基酸残基在OfHEXl编码的氨基酸序列中均保守。OfHEXl编码的氨基酸序列与植物、鸟类和哺乳动物的β-N-乙酰己糖胺酶的一致性均为30%左右,但是与其它昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的同源性在27%-76%之间。系统树分析显示,昆虫β-N-乙酰己糖胺酶可分为4个分支,推测分别对应不同的生理功能。OfHEXl属于分支Ⅳ,其同源性在48%-76%之间。该分支中的部分成员在几丁质降解过程中发挥作用。（3）利用RT-PCR和Real-time PCR两种方法研究OfHEXl在亚洲玉米螟不同生长发育时期的转录水平。发现OfHEXl在昆虫蜕皮、成蛹和羽化等生长发育时期其转录水平上调。推测OfHEXl参与其变态过程中的几丁质降解。（二）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的纯化采用SOURCE30Q阴离子交换层析、CHT羟基磷灰石层析、MonoQ阴离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析等4步柱层析方法,从亚洲玉米螟五龄幼虫中分离纯化了β-N-乙酰己糖胺酶（OfHexl）,产量为0.47 mg/300头幼虫,活力回收率为19.67%,纯化倍数为1468倍。纯化后的OfHexl经SDS-PAGE分析为单一条带,经高分辨率凝胶过滤层析分析为单峰。（三）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的生物化学性质表征（1） OfHexl的分子量和组成方式。在变性条件下,SDS-PAGE和MOLDI-TOF MS测定其分子量分别为68 kDa和67.0±0.3 kDa。非变性条件下,凝胶过滤层析确定其分子量为128 kDa。该酶是以同源二聚体的形式存在并以非共价的形式结合。实验测定一对二硫键的连接方式为Cys36-Cys55。根据理论和实测分子量的差异推算每个亚基上存在1-2个N-糖基化修饰。（2） OfHexl的等电点为4.7。（3）通过肽指纹图谱结合串联质谱确定了OfHexl部分氨基酸序列,证实该酶是由OfHEXl编码的。（四）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质表征（1） OfHexl的最适pH为7,最适温度为30℃。（2） OfHexl的最适底物为天然底物几丁二糖（（GlcNAc）2）,其kcat/Km值为3069s-1mM-1。该酶水解（GlcNAc）2的效率为已知β-N-乙酰己糖胺酶中最高,但是不能水解N-糖链底物GnGn-PA。OfHexl对于糖苷配基具有选择性,水解速率比MU-β-GlcNAc/MU-β-GalNAc为1.53,MU-β-GlcNAc/MU-β-GlcNAc-6-SO4-为156.7。OfHexl的水解产物为β-构型且不能水解不含乙酰氨基的底物MU-β-Glc,说明该酶遵循底物辅助保留机理（substrate-assisted retaining mechanism）。OfHexl水解几丁寡糖（（GlcNAc）n）的速率随（GlcNAc）n聚合度的升高而显着降低,说明该酶是典型的外切糖基水解酶。OfHexl水解pNP-β-（GlcNAc）3的初始产物为GlcNAc,说明该酶是从糖链的非还原端开始作用的。（4）与植物和人β-N-乙酰己糖胺酶相比,OfHexl对底物浓度的变化更敏感。经验证,天然底物（GlcNAc）2对其的抑制遵循双底物结合机理,其底物抑制常数Kis值为69μM。OfHexl不仅能被糖基水解酶20家族抑制剂2-ADN抑制,而且也能被糖基水解酶18家族抑制剂allosamidin抑制,Ki值分别为3.5μM和3.2μM。证实allosamidin能够选择性抑制OfHexl,而对高等动植物β-N-乙酰己糖胺酶基本无效。综上,本研究获得了编码亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列以及天然形式的酶。从该酶编码基因特征,转录水平和底物谱可以判断该酶是专一性参与昆虫几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶。同时,该酶的组成方式、特殊的底物谱以及allosamidin独特的抑制谱也扩展了对β-N-乙酰己糖胺酶的认识。
二、利用序列特异性DNA亲和层析分离纯化一种前列腺细胞核蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用序列特异性DNA亲和层析分离纯化一种前列腺细胞核蛋白（论文提纲范文）
（1）鸡卵黄免疫球蛋白Fab片段的制备及其抗炎活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 IgY的结构与活性片段 |
| 2 Fab和Fc片段的制备 |
| 2.1 IgY的酶解方式 |
| 2.2.1 木瓜蛋白酶酶解 |
| 2.2.2 胃蛋白酶酶解 |
| 2.2 Fab片段和Fc片段的分离纯化 |
| 2.2.1 盐析 |
| 2.2.2 超滤法 |
| 2.2.3 色谱法 |
| 2.2.4 Gradiflow技术 |
| 3 IgY及其Fab片段抗炎症活性研究 |
| 3.1 炎症的形成机理 |
| 3.2 巨噬细胞的免疫调节 |
| 3.3 哺乳动物免疫球蛋白IVIg和巨噬细胞的相互作用 |
| 3.3.1 IVIg与巨噬细胞的膜表面受体的相互作用 |
| 3.3.2 血红素加氧酶-1通路 |
| 3.3.3 IVIg毒中和作用 |
| 3.4 Fab的抗炎症活性研究 |
| 3.5 IgY的应用研究进展 |
| 4 选题意义 |
| 5 研究内容 |
| 第二章 两种蛋白酶酶解制备IgY活性片段研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 IgY的制备 |
| 1.3.2 IgY的表征 |
| 1.3.2 蛋白质的木瓜蛋白酶酶解条件优化 |
| 1.3.3 胃蛋白酶酶解条件优化 |
| 1.3.4 Western blotting试验 |
| 1.3.5 胃蛋白酶解制备Fab片段的分离纯化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 IgY非还原型SDS-PAGE电泳图 |
| 2.2 SEC-HPLC分析IgY样品纯度 |
| 2.3 木瓜蛋白酶酶解条件优化 |
| 2.3.1 IgY和木瓜蛋白酶用量比 |
| 2.3.2 半胱氨酸的用量 |
| 2.3.3 酶解时间 |
| 2.3.4 酶解条件的优化 |
| 2.4 胃蛋白酶酶解条件优化 |
| 2.4.1 IgY与胃蛋白酶质量比对酶解效率的影响 |
| 2.4.2 酶解时间对酶解效率的影响 |
| 2.5 酶解溶液的western blotting分析 |
| 2.6 胃蛋白酶解制备Fab片段的分离纯化 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 IgY木瓜蛋白酶酶解Fab片段的分离纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 酶解溶液的制备 |
| 1.3.2 IgY酶解溶液的超滤浓缩 |
| 1.3.3 硫酸铵和氯化钠盐析对木瓜蛋白酶酶解溶液的影响 |
| 1.3.4 阴离子交换色谱柱分离IgY木瓜蛋白酶酶解片段 |
| 1.3.5 SDS-PAGE分析 |
| 1.3.6 蛋白质浓度测定 |
| 1.3.7 Western blotting分析 |
| 1.3.8 MALDI-TOF/TOF MS分析 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 超滤对IgY木瓜蛋白酶酶解片段的影响 |
| 2.2 盐析对IgY木瓜蛋白酶酶解溶液的影响 |
| 2.3 阴离子交换色谱柱分离IgY木瓜蛋白酶酶解片段 |
| 2.3.1 离子强度对阴离子交换色谱柱分离效果的影响 |
| 2.3.2 pH值对阴离子交换色谱柱分离效果的影响 |
| 2.3.3 IgY木瓜蛋白酶酶解片段的分离纯化 |
| 2.3.4 MALDI-TOF/TOF MS定性未知片段 |
| 2.4 IgY酶解片段纯度和得率计算 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 IgY及 Fab片段的蛋白构象与理化性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 傅里叶变换红外光谱(FTIR) |
| 1.2.2 圆二色谱(CD)分析 |
| 1.2.3 差示扫描量热分析(DSC) |
| 1.2.4 紫外可见(UV-Vis)光谱扫描 |
| 1.2.5 内源性荧光光谱分析 |
| 1.2.6 表面疏水性的测定 |
| 1.2.7 分子排阻色谱分析(SEC-HPLC) |
| 1.2.8 动态光散射(DLS)粒径分析 |
| 1.2.9 Zeta电位测定 |
| 1.2.10 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 傅里叶变换红外光谱分析 |
| 2.2 圆二色谱分析 |
| 2.3 差示扫描量热分析 |
| 2.4 荧光光谱分析 |
| 2.5 紫外光谱分析 |
| 2.6 蛋白质表面疏水性 |
| 2.7 蛋白质的SEC-HPLC分析 |
| 2.8 粒径分布 |
| 2.9 蛋白表面电荷分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 IgY及 Fab片段对脂多糖诱导RAW264.7 细胞的炎症的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞活性的测定 |
| 1.2.3 炎症因子的测定 |
| 1.2.4 RT-PCR分析 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RAW264.7巨噬细胞培养 |
| 2.2 细胞活性的测定 |
| 2.3 LPS诱导炎症细胞的活性 |
| 2.4 一氧化氮(NO)的测定 |
| 2.5 前列腺素E2(PGE2)含量的测定 |
| 2.6 COX-2 mRNA表达 |
| 2.7 iNOS mRNA的表达 |
| 2.8 TNF-α含量的测定 |
| 2.9 IL-6含量的测定 |
| 2.10 IL-10含量的测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 Fab片段对NF-κB和 MAPK信号通路关键蛋白的调控 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞活性测定 |
| 1.2.3 qRT-PCR |
| 1.2.4 NF-κB和 MAPKs通路调节蛋白检测 |
| 1.2.5 激光共聚焦分析 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞活性的测定 |
| 2.2 qRT-PCR |
| 2.3 激光共聚焦分析 |
| 2.4 NF-κB和 MAKPs调节蛋白检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（2）RNA加工因子CPSF6的表达纯化及PQBP1在剪接体组装过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 前体mRNA选择性剪接的研究概述 |
| 1.2.1 选择性剪接的定义及分子机制 |
| 1.2.2 选择性剪接的调控机制 |
| 1.2.3 选择性剪接的生物学意义 |
| 1.2.4 选择性剪接与人类疾病 |
| 1.3 PQBP1 分子研究概述 |
| 1.3.1 Renpenning综合征与PQBP1 |
| 1.3.2 PQBP1 的发现及分子结构 |
| 1.3.3 PQBP1 分子的主要功能研究 |
| 1.3.4 PQBP1 分子的研究展望 |
| 第二章 RNA加工因子CPSF6 的表达纯化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 质粒的构建 |
| 2.2.2 Sf9 细胞的培养 |
| 2.2.3 重组杆状病毒的构建 |
| 2.2.4 收获P1 病毒株 |
| 2.2.5 重组杆状病毒的扩增 |
| 2.2.6 融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.7 融合蛋白的原核表达纯化 |
| 2.2.8 亲和作用检测蛋白相互作用(GST pull-down) |
| 2.2.9 Western Blotting免疫印迹 |
| 2.3 实验结果和讨论 |
| 2.3.1 RNA加工因子CPSF6 的原核表达出现截短 |
| 2.3.2 密码子优化后的RNA加工因子CPSF6 仍无法获得全长蛋白 |
| 2.3.3 重组杆状病毒载体p Fast Bac-CPSF6 及重组杆粒Bac-CPSF6 构建 |
| 2.3.4 重组杆状病毒BV-CPSF6 P1 病毒株的获得 |
| 2.3.5 融合蛋白His-CPSF6的Western Blot鉴定 |
| 2.3.6 融合蛋白His-CPSF6 的大量表达及纯化 |
| 2.3.7 融合蛋白His-CPSF6 生物学活性的鉴定 |
| 2.3.8 结果讨论 |
| 第三章 PQBP1 在剪接体组装过程中的作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 细胞total RNA提取、c DNA合成 |
| 3.2.2 质粒的构建 |
| 3.2.3 融合蛋白的表达纯化 |
| 3.2.4 融合蛋白浓度测定 |
| 3.2.5 蛋白质-蛋白质相互作用 |
| 3.2.6 细胞培养 |
| 3.2.7 细胞转染 |
| 3.2.8 细胞总蛋白提取和Western Blotting免疫印迹 |
| 3.2.9 地高辛标记RNA的体外合成和纯化 |
| 3.2.10 RNA结合蛋白MBP-MS2 融合蛋白的纯化 |
| 3.2.11 HeLa细胞核蛋白的提取 |
| 3.2.12 剪接体的体外组装 |
| 3.2.13 非变性琼脂糖凝胶电泳及Nortern Blot印迹 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 探究PQBP1 与剪接体激活因子PRPF19 间的互作关系 |
| 3.3.2 地高辛标记剪接底物的合成及鉴定 |
| 3.3.3 RNA结合蛋白MBP-MS2 融合蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.4 MBP-MS2 融合蛋白的功能验证 |
| 3.3.5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）鲟鱼抗炎多肽的制备与鉴定及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 淡水鱼开发利用的研究进展 |
| 1.1.1 鲟鱼概述 |
| 1.2 食源性抗炎活性肽的研究进展 |
| 1.2.1 制备方法 |
| 1.2.2 分离纯化 |
| 1.2.3 结构鉴定 |
| 1.3 抗炎肽机制的研究进展 |
| 1.3.1 NF-κB通路 |
| 1.3.2 MAPK通路 |
| 1.3.3 JAK/STAT通路 |
| 1.4 本课题研究意义及内容 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.5 课题来源 |
| 第二章 鲟鱼抗炎肽的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 鲟鱼肌肉基本组成 |
| 2.3.2 蛋白酶活力的测定 |
| 2.3.3 细胞活力 |
| 2.3.4 NO释放量的测定 |
| 2.3.5 鲟鱼酶解物的制备 |
| 2.3.6 超滤 |
| 2.3.7 凝胶层析法分离纯化 |
| 2.3.8 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 鲟鱼肌肉基本组成 |
| 2.4.2 蛋白酶酶活力 |
| 2.4.3 五种鲟鱼酶解物抗炎活性的比较 |
| 2.4.4 超滤后各组分的抗炎活性比较 |
| 2.4.5 凝胶层析后各组分的抗炎活性比较 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 鲟鱼抗炎多肽的抗氧化及抗炎活性初步研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 DPPH及 ABTS自由基的测定 |
| 3.3.2 构建LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞炎症模型 |
| 3.3.3 NO释放量的测定 |
| 3.3.4 炎症因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)的测定 |
| 3.3.5 Western Blot-MAPK信号通路 |
| 3.3.6 Western Blot-NF-κB信号通路 |
| 3.3.7 数据统计与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 鲟鱼抗炎多肽的抗氧化活性 |
| 3.4.2 LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞建立炎症模型 |
| 3.4.3 鲟鱼抗炎多肽对LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞后炎症因子分泌的影响 |
| 3.4.4 鲟鱼抗炎多肽对LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞后MAPK信号通路的影响 |
| 3.4.5 鲟鱼抗炎多肽对LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞后NF-κB信号通路的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 鲟鱼抗炎多肽的结构鉴定及合成肽的活性评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 离子交换层析法分离纯化鲟鱼抗炎多肽 |
| 4.3.2 疏水层析法分离纯化鲟鱼抗炎肽 |
| 4.3.3 LC-MS/MS鉴定肽序 |
| 4.3.4 细胞活力及NO释放量的测定 |
| 4.3.5 炎症因子(IL-6、IL-1β和 TNF-α)测定 |
| 4.3.6 SOD活性的测定 |
| 4.3.7 Western Blot-MAPK信号通路 |
| 4.3.8 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 离子交换层析后各组分的抗炎活性 |
| 4.4.2 疏水层析后各组分的抗炎活性 |
| 4.4.3 活性组分的肽序鉴定 |
| 4.4.4 合成肽对RAW264.7 巨噬细胞活力及NO释放量的影响 |
| 4.4.5 合成肽对LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞后炎症因子分泌的影响 |
| 4.4.6 合成肽对LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞后SOD活性的影响 |
| 4.4.7 合成肽对LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞后MAPK信号通路的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生阶段取得的学术成绩 |
（4）溶酶体介导肿瘤获得性耐药的机制及大环双联苄类化合物的干预作用和靶点分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 肿瘤的多药耐药 |
| 2 溶酶体介导的肿瘤多药耐药 |
| 3 MiT/TFE家族蛋白与溶酶体的调控 |
| 4 靶向溶酶体途径逆转肿瘤多药耐药的策略 |
| 5 天然小分子抗肿瘤药物 |
| 第一部分 TFE3介导的溶酶体代谢重编程参与多西紫杉醇诱导的多药耐药 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 双联苄化合物RDN靶向溶酶体分子靶点的分析及逆转耐药的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 双联苄化合物地钱素M下调MiT/TFE家族TFEB并调控耐药细胞的衰老分泌表型 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 结论和讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表(待发表)学术论文目录 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）药用真菌凝集素AAL/GL和AAL2/NL的功能研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 凝集素抗肿瘤研究 |
| 1.2 茶树菇凝集素AAL/GL的研究 |
| 1.3 茶树菇凝集素AAL2/NL的研究 |
| 1.4 肿瘤中的凋亡与自噬 |
| 1.5 蛋白的糖基化修饰 |
| 1.6 O-GlcNAc修饰研究进展 |
| 1.6.1 O-GlcNAc修饰的性质 |
| 1.6.2 O-GlcNAc修饰与癌症 |
| 1.6.3 O-GlcNAc修饰与神经退行性疾病 |
| 1.6.4 O-GlcNAc修饰与糖尿病 |
| 1.6.5 O-GlcNAc修饰与磷酸化修饰 |
| 1.6.6 O-GlcNAc修饰与泛素化修饰 |
| 1.6.7 O-GlcNAc修饰与其他转录后修饰 |
| 1.6.8 O-GlcNAc修饰鉴定 |
| 第二部分 凝集素AAL/GL抗肿瘤机理研究 |
| 第二章 凝集素AAL/GL引起肝癌细胞发生自噬与凋亡间关系的研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料和溶液配方 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 半乳糖凝集素Sepharose 6B亲和层析柱制备 |
| 2.2.2 茶树菇总蛋白Yt提取 |
| 2.2.3 凝集素AAL/GL的纯化 |
| 2.2.4 MUTAAL63,MUTAAL144,MUTAAL59原核表达及纯化 |
| 2.2.5 Western Blot |
| 2.2.6 细胞活性实验 |
| 2.2.7 台盼蓝实验 |
| 2.2.8 细胞凋亡实验 |
| 2.2.9 吖啶橙染色实验 |
| 2.2.10 电镜检测细胞自噬 |
| 2.2.11 细胞转染 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 AAL/GL对肝癌细胞HepG2及肝脏正常细胞HL-7702细胞的杀伤作用 |
| 2.3.2 AAL/GL通过引起Huh7肝癌细胞发生凋亡抑制其增殖 |
| 2.3.3 AAL/GL可引起贴壁细胞Huh7肝癌细胞发生自噬 |
| 2.3.4 AAL/GL通过引起小鼠悬浮肝癌细胞H22发生凋亡抑制其增殖 |
| 2.3.5 AAL/GL可引起小鼠悬浮肝癌细胞H22发生自噬 |
| 2.3.6 AAL/GL引起Huh7肝癌细胞自噬与凋亡的相互作用 |
| 2.3.7 AAL/GL引起H22肝癌细胞自噬与凋亡的相互作用 |
| 2.3.8 AAL/GL体内抗肿瘤研究 |
| 2.3.9 AAL/GL的突变体MUTAAL144,MUTAAL63,MUTAAL59引起H22细胞自噬检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三部分 O-GlcNAc修饰蛋白的富集与鉴定 |
| 第三章 凝集素AAL2/NL用于O-GlcNAc修饰蛋白富集与鉴定的研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料与溶液配方 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 溶液配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Sepharose 6B-GlcNAc亲和柱的制备 |
| 3.2.2 凝集素AAL2/NL的纯化 |
| 3.2.3 Sepharose 4B-AAL2/NL亲和柱的制备 |
| 3.2.4 POROS-AAL2/NL亲和柱的制备 |
| 3.2.5 SPR检测AAL2/NL,WGA与糖配体的亲和力 |
| 3.2.6 PNGases F纯化 |
| 3.2.7 BABl/c雄性小鼠肝脏组织核质分离 |
| 3.2.8 蛋白质胰酶酶解 |
| 3.2.9 肽段脱盐 |
| 3.2.10 肽段预处理 |
| 3.2.11 肝脏核蛋白分离 |
| 3.2.12 POROS-AAL2/NL层析柱富集复杂样品中O-GlcNAc修饰肽段 |
| 3.2.13 Nest Group公司脱盐柱脱盐 |
| 3.2.14 样品质谱检测及数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AAL2/NL对GlcNAc的亲和力高于WGA |
| 3.3.2 Sepharose 4B-AAL2/NL富集O-GlcNAc修饰蛋白 |
| 3.3.3 POROS-AAL2/NL富集O-GlcNAc修饰肽段 |
| 3.3.4 鉴定到的O-GlcNAc修饰蛋白 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 AAL2/NL与WGA对GlcNAc亲和力的比较 |
| 3.4.2 肝脏组织中鉴定的O-GlcNAc修饰蛋白 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 凝集素Di-AAL2用于O-GlcNAc修饰鉴定的研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料与溶液配方 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 溶液配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 凝集素Di-AAL2纯化 |
| 4.2.2 小麦胚芽粗液提取 |
| 4.2.3 凝集素WGA的天然分离与纯化 |
| 4.2.4 凝血实验 |
| 4.2.5 SPR实验 |
| 4.2.6 MALDI-TOF-MS实验检测简单样品中O-GlcNAc修饰标肽 |
| 4.2.7 POROS-Di-AAL2从简单样品中富集O-GlcNAc修饰的标肽 |
| 4.2.8 样品制备 |
| 4.2.9 POROS-Di-AAL2富集复杂样品中O-GlcNAc修饰肽段 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 O-GlcNAc修饰的标肽的质量检测 |
| 4.3.2 Di-AAL2与GlcNAc结合特性检测 |
| 4.3.3 POROS-Di-AAL2亲和层析柱富集简单样品中的O-GlcNAc修饰标肽 |
| 4.3.4 凝集素WGA纯化 |
| 4.3.5 POROS-Di-AAL2富集小鼠肝脏O-GlcNAc修饰的蛋白 |
| 4.3.6 POROS-Di-AAL2富集大鼠组织中O-GlcNAc修饰的蛋白 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 Di-AAL2对GlcNAc亲和力及特异性 |
| 4.4.2 Di-AAL2富集组织样品中O-GlcNAc修饰肽段 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 抗体CTD110.6用与O-GlcNAc修饰富集及鉴定 |
| 引言 |
| 5.1 实验材料与溶液配方 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 溶液配方 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 超滤管富集O-GlcNAc修饰标肽 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 O-GlcNAc修饰抗体CTD110.6糖谱分析 |
| 5.3.2 正常大鼠组织O-GlcNAc修饰蛋白鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（6）LSD1对胃癌发生发展的调控机制及小分子抑制剂干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 图和附表清单 |
| 符号说明 |
| 1 前言 |
| 1.1 什么是表观遗传学？ |
| 1.2 染色质的结构 |
| 1.3 DNA 的甲基化 |
| 1.4 组蛋白的修饰 |
| 1.4.1 组蛋白的乙酰化 |
| 1.4.2 组蛋白精氨酸的甲基化 |
| 1.4.3 组蛋白赖氨酸的甲基化 |
| 1.5 含有 JmjC 结构域的去甲基化酶 |
| 1.5.1 JmjC 家族成员与肿瘤关系 |
| 1.5.2 JmjC 家族组蛋白去甲基化酶抑制剂 |
| 1.6 组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（1Histone lysine specific demethylase 1,LSD1） |
| 1.6.1 LSD1 的结构和功能 |
| 1.6.2 LSD1 去甲基化的机制 |
| 1.6.3 LSD1 在肿瘤中的功能和作用 |
| 1.6.4 LSD1 抑制剂 |
| 1.7 点击化学在表观遗传学靶点药物设计中的应用 |
| 1.8 转化生长因子 TGF β1、上皮细胞-间质细胞转换与表观遗传学修饰蛋白 |
| 1.8.1 什么是转化生长因子 TGF β1 |
| 1.8.2 上皮细胞-间质细胞转换（EMT） |
| 1.8.3 TGF β与 EMT |
| 1.8.4 EMT 与组蛋白表观遗传学修饰 |
| 1.8.5 TGF β诱导 EMT 过程中的表观遗传学修饰 |
| 1.9 NF-κB 信号通路 |
| 1.10 本论文的主要研究目的和内容 |
| 参考文献 |
| 2 LSD1、LSD2 抑制剂筛选平台的建立及 LSD1 抑制剂的设计和合成 |
| 引言 |
| 2.1 LSD1 的原核表达和纯化 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.2 LSD2 的原核表达和纯化 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 基于荧光的 LSD1 抑制剂筛选模型的建立 |
| 2.3.1 实验原理 |
| 2.3.2 实验材料 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.3.4 实验结果 |
| 2.4 基于荧光检测的 LSD2 抑制剂筛选模型建立 |
| 2.4.1 实验原理 |
| 2.4.2 实验材料 |
| 2.4.3 实验方法 |
| 2.4.4 实验结果 |
| 2.5 LSD1 抑制剂的设计与合成 |
| 2.5.0 实验仪器 |
| 2.5.1 1,2,3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯衍生物合成方案设计 |
| 2.5.2 1,2,3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯衍生物合成 |
| 2.5.3 1,2,3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯衍生物合成和数据表征 |
| 2.5.4 1,2,3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯衍生物合成小结 |
| 2.6 LSD1 抑制剂的 LSD 抑制活性评价及构效关系讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 3 新型 LSD1 抑制剂蛋白水平选择性及其作用机理研究 |
| 引言 |
| 3.1 新型 LSD1 抑制剂在重组蛋白水平选择性研究 |
| 3.1.1 化合物对 LSD2 抑制活性评价 |
| 3.1.2 化合物对 MAO-A、B 抑制活性评价 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 新型 LSD1 抑制剂对 LSD1 活性的可逆性研究 |
| 3.2.1 实验原理 |
| 3.2.2 实验材料和方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 新型 LSD1 抑制剂对 LSD1 底物及辅酶竞争性研究 |
| 3.3.1 实验原理 |
| 3.3.2 实验材料和方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 新型 LSD1 抑制剂对与 LSD1 亲和力研究 |
| 3.4.1 实验原理和方法 |
| 3.4.2 实验结果 |
| 3.5 计算机模拟化合物 30 与 LSD1 的相互作用 |
| 3.5.1 分子对接及分子动力学的原理、方法和结果 |
| 3.5.2 分子对接及分子动力学模拟方法 |
| 3.5.3 分子对接和分子动力学模拟结果 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 4 新型 LSD1 抑制剂细胞水平活性分析及其体内、体外抗肿瘤作用研究 |
| 引言 |
| 4.1 新型 LSD1 抑制剂细胞水平去甲基化活性分析 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 新型 LSD1 抑制剂对胃癌细胞生长抑制作用及分析 |
| 4.2.1 实验材料和方法 |
| 4.2.2 实验结果 |
| 4.3 LSD1 knockdown 对胃癌细胞 MGC-803 增殖作用研究 |
| 4.3.1 实验原理 |
| 4.3.2 实验材料和方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 新型 LSD1 抑制剂对胃癌细胞 MGC-803 周期作用研究 |
| 4.4.1 实验原理 |
| 4.4.2 实验材料和方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.5 新型 LSD1 抑制剂体对胃癌细胞 MGC-803 细胞形态学研究 |
| 4.5.1 实验原理 |
| 4.5.2 实验材料和方法 |
| 4.5.3 实验结果 |
| 4.6 新型 LSD1 抑制剂体对胃癌细胞 MGC-803 凋亡作用研究 |
| 4.6.1 实验原理 |
| 4.6.2 实验材料和方法 |
| 4.6.3 实验结果 |
| 4.7 新型 LSD1 抑制剂急性毒性研究 |
| 4.7.1 实验原理 |
| 4.7.2 实验材料和方法 |
| 4.7.3 实验结果 |
| 4.8 新型 LSD1 抑制剂体内抗肿瘤活性研究 |
| 4.8.1 实验材料与方法 |
| 4.8.2 实验结果 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 5 新型 LSD1 抑制剂对胃癌细胞系 MGC-803 转移和侵袭作用研究 |
| 引言 |
| 5.1 新型 LSD1 抑制剂抑制肿瘤细胞的转移 |
| 5.1.1 实验原理 |
| 5.1.2 实验材料和方法 |
| 5.1.3 实验结果 |
| 5.2 新型 LSD1 抑制剂抑制肿瘤细胞侵袭 |
| 5.2.1 实验原理 |
| 5.2.2 实验材料和方法 |
| 5.2.3 实验结果 |
| 5.3 新型 LSD1 抑制剂抑制肿瘤细胞上皮-间质转化 |
| 5.3.1 实验目的 |
| 5.3.2 免疫共沉淀实验原理和方法 |
| 5.3.3 实验结果 |
| 5.4 新型 LSD1 抑制剂抑制 MGC-803 中 TGF β1 的表达 |
| 5.4.1 实验背景和原理 |
| 5.4.2 实验材料和实验方法 |
| 5.4.3 实验结果 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 6 TGF β1 在胃癌细胞 MGC-803 及胃黏膜上皮细胞 GES-1 中对LSD1 调控作用及其作用机制研究 |
| 引言 |
| 6.1 MGC-803 中 TGF β1 促进 LSD1 的表达 |
| 6.1.1 实验原理和目的 |
| 6.1.2 实验材料 |
| 6.1.3 实验方法 |
| 6.1.4 实验结果 |
| 6.2 MGC-803 中 ERK 磷酸化介导 TGF β1 激活 NF-κB 诱导 LSD1 过表达 |
| 6.2.1 实验设计原理和目的 |
| 6.2.2 实验材料 |
| 6.2.3 实验方法和设计 |
| 6.2.4 实验结果 |
| 6.3 MGC-803 中 TGF β1 激活 NF-κB 并使其磷酸化，促进 p300 对 LSD1的转录调控 |
| 6.3.1 实验设计原理和目的 |
| 6.3.2 实验材料与方法 |
| 6.3.3 实验结果 |
| 6.4 MGC-803 中 TGF β1 激活 LSD1 启动子 |
| 6.4.1 实验设计原理和目的 |
| 6.4.2 实验材料与方法 |
| 6.4.3 实验结果 |
| 6.5 GES-1 中 TGF β1 对 LSD1 的表达无影响 |
| 6.5.1 实验原理和目的 |
| 6.5.2 实验材料和方法 |
| 6.5.3 实验结果 |
| 6.6 GES-1 中 ERK 磷酸化介导 TGF β1 激活 NF-κB 从而诱导 LSD1 过表达 |
| 6.6.1 实验设计原理和目的 |
| 6.6.2 实验材料，实验方法和设计 |
| 6.6.3 实验结果 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附图 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）一、PLCε抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 二、HepaCAM对前列腺癌细胞生物学功能影响及机制探讨（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 一、PLCε 抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PLCε原核表达系统的构建、纯化及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 PLCε抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 二、HepaCAM 对前列腺癌细胞生物学功能影响及机制探讨 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 HepaCAM 基因在前列腺癌中的表达及与各临床病理参数的相关性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HepaCAM 对人前列腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移等生物学功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 HepaCAM 对前列腺癌细胞 AR 表达与核转位及 ERK 磷酸化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（8）多能干细胞关键转录因子Nanog和Oct4的RNA结合蛋白的鉴定和研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 蛋白-RNA相互作用展望 |
| 第一章 多能干细胞关键因子Nanog的RNA结合蛋白的鉴定和研究 |
| 第一节 体外方法分离,鉴定并验证多能干细胞关键因子Nanog的RNA结合蛋白 |
| 1.Nanog mRNA[3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)序列]的获得 |
| 1.1.设计Nanog mRNA的3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)序列 |
| 1.2.获取Nanog mRNA[3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)]对应的DNA序列 |
| 1.2.1.实验材料 |
| 1.2.2.实验方法 |
| 1.2.3.实验结果 |
| 1.3.Nanog3’UTR(N-3)和Nanog5’UTR(N-5)目的序列的纯化 |
| 1.3.1.实验材料 |
| 1.3.2.实验方法 |
| 1.3.3.实验结果 |
| 1.4.Nanog mRNA[3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)序列]的获取 |
| 1.4.1.实验材料 |
| 1.4.2.实验方法 |
| 1.4.3.实验结果 |
| 2.分离获得与Nanog mRNA相互作用的RNA结合蛋白 |
| 2.1.实验材料 |
| 2.2.实验方法 |
| 2.3.实验结果 |
| 3.质谱鉴定得到Nanog的候选RNA结合蛋白 |
| 3.1.实验材料 |
| 3.2.实验方法 |
| 3.3.实验结果 |
| 4.对鉴定获得的Nanog候选RNA结合蛋白进行验证 |
| 4.1.筛选6-10个最佳候选RNA结合蛋白进行进一步验证 |
| 4.2.Western Blot验证所筛选的8个RNA结合蛋白进行 |
| 4.2.1.实验材料 |
| 4.2.2.实验方法 |
| 4.2.3.实验结果 |
| 4.3.RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation)方法验证8个候选RNA结合蛋白 |
| 4.3.1.实验材料 |
| 4.3.2.实验方法 |
| 4.3.3.实验结果 |
| 5.对Nanog关键RNA结合蛋白YBX-1和ILF3进行功能性分析 |
| 5.1.分析关键RNA结合蛋白YBX-1和ILF3 对多能干细胞多潜能性基因的调控作用 |
| 5.1.1.降低YBX-1和ILF3 的表达,分析它们对多能干细胞多能性相关基因的影响 |
| 5.2.分析关键RNA结合蛋白YBX-1和ILF3 对多能干细胞分化基因的调控作用 |
| 5.2.1.实验材料 |
| 5.2.2.实验方法 |
| 5.2.3.实验结果 |
| 6.全基因组表达谱芯片分析ILF3降低表达后对上下游基因的调控作用 |
| 6.1.对 ILF3 KD(Knock Down)的多能干细胞进行全基因组表达谱芯片分析 |
| 6.1.1.实验材料 |
| 6.1.2.实验方法 |
| 6.2.分析降低ILF3基因表达对上下游基因的调控作用 |
| 第二节 体内方法获取,鉴定并验证多能干细胞关键因子Nanog的RNA结合蛋白 |
| 1.体内方法分离Nanog的RNA结合蛋白 |
| 1.1.Nanog-Luciferase-stem loops载体构建 |
| 1.1.1.实验材料 |
| 1.1.2.实验方法 |
| 1.1.3.实验结果 |
| 1.2.Nanog-stem loops和MS2-HTBH共表达小鼠多能干细胞的建立 |
| 1.3.生物素标记性MS2-BioTRAP亲和纯化技术(MS2 in vivo Biotin Tagged RNA Affinity Purification)分离Nanog的RNA结合蛋白 |
| 1.3.1.实验材料 |
| 1.3.2.实验方法 |
| 2.Western Blot验证体外方法获得的候选RNA结合蛋白是否在细胞内与Nanog mRNA有相互作用 |
| 2.1.实验材料 |
| 2.2.实验方法 |
| 2.3.实验结果 |
| 第三节 多能干细胞关键因子Nanog的RNA结合蛋白的鉴定和研究总结 |
| 第二章 多能干细胞关键因子Oct4的RNA结合蛋白的鉴定和研究 |
| 第一节 体外方法获取,鉴定并验证多能干细胞关键因子Oct4的RNA结合蛋白 |
| 1.Oct4 mRNA[3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)序列]的获取 |
| 1.1.设计Oct4 mRNA的3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)序列 |
| 1.2.Oct4 mRNA[3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)]对应DNA序列的获取 |
| 1.2.1.实验材料 |
| 1.2.2.实验方法 |
| 1.2.3.实验结果 |
| 1.3.Oct4 3’UTR(O-3)和Oct4 5’UTR(O-5)目的序列的纯化 |
| 1.3.1.实验材料 |
| 1.3.2.实验方法 |
| 1.3.3.实验结果 |
| 1.4.Oct4 mRNA[3’和5’非翻译区(Untranslated Regions-UTR)序列]的获得 |
| 1.4.1.实验材料 |
| 1.4.2.实验方法 |
| 1.4.3.实验结果 |
| 2.体外方法分离与Oct4的mRNA相互作用的RNA结合蛋白 |
| 2.1.实验材料 |
| 2.2.实验方法 |
| 2.3.实验结果 |
| 3.质谱鉴定所获得的Oct4 的RNA结合蛋白 |
| 3.1.实验材料 |
| 3.2.实验方法 |
| 3.3.实验结果 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（9）肺泡巨噬细胞膜核仁素在大鼠内毒素肺损伤中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠肺泡巨噬细胞膜核仁素与LPS 相互作用及机制研究 |
| 分题一 大鼠肺泡巨噬细胞的分离、培养、鉴定及膜核仁素的表达检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 大鼠肺泡巨噬细胞膜核仁素在LPS 内化中的作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题三 LPS 刺激对大鼠肺泡巨噬细胞膜核仁素表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 核仁素RNAi 对LPS 肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞活化的影响 |
| 分题一 体外转染核仁素shRNA 表达载体对LPS 激活大鼠肺泡巨噬细胞的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 气管内滴入核仁素shRNA 表达载体对LPS 肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞活化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞膜表面核仁素的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因克隆、分离纯化和性质表征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 亚洲玉米螟 |
| 1.2 几丁质 |
| 1.2.1 几丁质的结构 |
| 1.2.2 几丁质在昆虫体内的分布 |
| 1.3 几丁质的降解 |
| 1.3.1 细菌几丁质降解系统 |
| 1.3.2 昆虫几丁质降解系统 |
| 1.4 β-N-乙酰己糖胺酶 |
| 1.4.1 3家族β-N-乙酰己糖胺酶 |
| 1.4.2 84家族β-N-乙酰己糖胺酶 |
| 1.4.3 20家族β-N-乙酰己糖胺酶 |
| 1.4.4 β-N-乙酰己糖胺酶的结构和催化机理 |
| 1.4.5 β-N-乙酰己糖胺酶的抑制剂 |
| 1.5 本论文的选题依据和研究内容 |
| 1.5.1 选题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶基因克隆及转录水平研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 亚洲玉米螟的人工饲养 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶基因OfHEXl的克隆 |
| 2.2.4 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶基因转录水平分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶基因OfHEXl |
| 2.3.2 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶基因OfHEXl的生物信息学分析 |
| 2.3.3 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶基因OfHEXl转录水平研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的分离纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 蛋白定性、定量方法与酶活测定方法 |
| 3.2.2 幼虫的饲养、处理以及酶的粗提 |
| 3.2.3 小分子杂质的去除 |
| 3.2.4 SOURCE30Q阴离子交换层析 |
| 3.2.5 CHT羟基磷灰石层析 |
| 3.2.6 MonoQ阴离子交换层析 |
| 3.2.7 Superdex200凝胶过滤层析 |
| 3.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.2.9 几丁质亲和层析 |
| 3.2.10 产物类似物亲和层析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 纯化策略 |
| 3.3.2 常规分离纯化流程 |
| 3.3.3 亲和层析探索 |
| 3.4 小结 |
| 4 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶蛋白的性质鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 分子量测定 |
| 4.2.2 二硫键分析 |
| 4.2.3 等电点测定 |
| 4.2.4 糖基化分析 |
| 4.2.5 肽质量指纹图谱及氨基酸序列测定 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 OfHexl的分子量和组成方式 |
| 4.3.2 二聚体之间的相互作用力 |
| 4.3.3 二硫键分析 |
| 4.3.4 等电点测定 |
| 4.3.5 糖基化分析 |
| 4.3.6 氨基酸序列测定 |
| 4.4 小结 |
| 5 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质表征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 温度和pH值对酶活力的影响 |
| 5.2.2 金属离子和EDTA对酶活力的影响 |
| 5.2.3 底物选择性,水解模式和催化动力学 |
| 5.2.4 特定氨基酸的化学修饰 |
| 5.2.5 抑制剂对酶活力的影响 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 酶催化的最适条件 |
| 5.3.2 OfHexl的底物谱 |
| 5.3.3 OfHexl的作用机理 |
| 5.3.4 OfHexl的抑制及机理 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的底物谱和生理功能 |
| 5.4.2 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的作用机理 |
| 5.4.3 亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的小分子抑制剂 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点摘要 |
| 参考文献 |
| 附录A 质谱法测定氨基酸序列 |
| 附录B OfHEXl的cDNA序列与编码的氨基酸序列 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 攻读博士学位期间专利申请授权情况 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、利用序列特异性DNA亲和层析分离纯化一种前列腺细胞核蛋白（论文参考文献）
- [1]鸡卵黄免疫球蛋白Fab片段的制备及其抗炎活性研究[D]. 周欣. 华中农业大学, 2020(02)
- [2]RNA加工因子CPSF6的表达纯化及PQBP1在剪接体组装过程中的作用研究[D]. 窦琳霞. 东南大学, 2020
- [3]鲟鱼抗炎多肽的制备与鉴定及其作用机制研究[D]. 束王慧. 江苏大学, 2020(02)
- [4]溶酶体介导肿瘤获得性耐药的机制及大环双联苄类化合物的干预作用和靶点分析[D]. 牛焕民. 山东大学, 2019(02)
- [5]药用真菌凝集素AAL/GL和AAL2/NL的功能研究[D]. 刘薇. 武汉大学, 2017(06)
- [6]LSD1对胃癌发生发展的调控机制及小分子抑制剂干预研究[D]. 郑一超. 郑州大学, 2014(02)
- [7]一、PLCε抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 二、HepaCAM对前列腺癌细胞生物学功能影响及机制探讨[D]. 宋学东. 重庆医科大学, 2014(02)
- [8]多能干细胞关键转录因子Nanog和Oct4的RNA结合蛋白的鉴定和研究[D]. 郭传亮. 上海交通大学, 2013(05)
- [9]肺泡巨噬细胞膜核仁素在大鼠内毒素肺损伤中作用及机制研究[D]. 王艺. 第三军医大学, 2011(12)
- [10]亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因克隆、分离纯化和性质表征[D]. 刘田. 大连理工大学, 2009(11)