一、O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对小鼠免疫保护作用的实验研究（论文文献综述）
赵金龙[1]（2019）在《DHEA对小鼠抵抗大肠杆菌O157:H7感染的影响及其机制研究》文中研究指明大肠杆菌O157:H7（E.coli O157:H7）在自然界广泛存在。随着畜禽集约化养殖模式的不断发展,畜禽感染E.coli O157:H7非常普遍,这给畜禽养殖业带来了较大的经济损失。大肠杆菌多宿主、多途径传播等一些特点,导致E.coli O157:H7感染已成为一个全球性的公共卫生问题。脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone,DHEA）作为机体血液循环中含量最丰富的类固醇物质,因其独特的生物学功能而被认为是具有多向性的“激素缓冲剂”。目前,对DHEA生物学功能的研究主要集中于其对机体代谢、中枢神经系统、氧化应激等方面,有关DHEA对细菌感染的动物免疫机能的影响及其相关机制方面的研究报道甚少。因而,本试验选用小鼠作为研究对象,在探讨DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠免疫功能的调节作用之上,通过体外阐明DHEA对E.coli O157:H7感染的原代腹腔巨噬细胞炎症反应的缓解效应及其机制;研究旨在揭示DHEA对小鼠抵抗细菌感染、缓解炎症的确切作用及相关通路间的“对话”关系。研究结果将为揭示DHEA对机体免疫功能的影响提供重要的理论依据,同时对保障畜禽和人类健康具有一定的指导性意义。1 DHEA对小鼠抵抗E.coli O157:H7感染的研究本实验以ICR小鼠为研究对象,在建立E.coli O157:H7感染小鼠模型基础之上,探讨DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠存活情况、免疫指数、组织病理学变化等方面的影响,以期揭示DHEA对小鼠抗E.coli O157:H7感染能力的影响。小鼠腹腔注射E.coli O157:H7探讨小鼠对E.coli O157:H7的耐受性,以便确定E.coli O157:H7对小鼠的半数致死量。小鼠灌胃3周不同浓度的DHEA后腹腔注射LD50的E.coli O157:H7,一周后采集血清、脾脏、小肠等组织,待测。利用稀释涂布平板法测定小鼠腹腔液细菌浓度;HE染色观察小鼠小肠组织病理学变化;试剂盒检测乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性。结果表明,E.coli O157:H7对小鼠的LD50为2.3×108CFU。LD50的E.coli O157:H7感染导致小鼠小肠组织出现肠绒毛断裂、脱落、出血等病理学变化,而DHEA处理能够降低E.coli O157:H7感染所致的损伤、提高小鼠成活率,并呈现出明显的剂量依赖性。此外,2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理可显着提高小鼠脾脏免疫指数、脾脏中乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性,并显着降低小鼠腹腔液细菌浓度（P<0.05）。以上结果提示,DHEA处理可调节脾脏免疫功能、清除感染细菌,提高小鼠的成活率。2 DHEA对小鼠抵抗E.coli O157:H7感染作用的机制研究本试验以E.coli O157:H7感染的小鼠为研究对象,探讨DHEA对炎症介质和细胞因子产生的影响及其可能的信号转导机制,旨在揭示DHEA抵抗E.coli O157:H7感染生物化学机制。小鼠灌胃DHEA并用LD50的E.coli O157:H7感染,试验结束后采样、待测。试剂盒检测脾脏和血清中iNOS活性和NO含量;Real-time PCR法检测脾脏细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-4和IL-10 mRNA表达水平;酶联免疫吸附法测定脾脏和血清中IFN-γ和IL-4含量;Western blot法检测脾脏MAPK和NF-κB蛋白表达水平。结果表明,0.2 mg/kg DHEA处理可显着降低血清中iNOS活性（P<0.05）,2 mg/kg DHEA处理可显着降低血清中NO含量（P<0.05）。2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理均可显着降低脾脏中iNOS活性（P<0.01）以及TNF-α、IL-1β和IFN-γmRNA表达水平（P<0.05）;4 mg/kg DHEA处理可显着降低脾脏IL-6mRNA表达水平（P<0.05）。2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理可显着升高脾脏IL-4 mRNA表达水平（P<0.05）,4 mg/kg DHEA处理可显着升高脾脏IL-10 mRNA表达水平（P<0.05）。2 mg/kg DHEA处理可极显着降低脾脏IFN-γ含量（P<0.01）,而2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理可显着升高血清IL-4含量（P<0.05）。此外,2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理均可显着降低脾脏中p-p38 MAPK蛋白表达水平（P<0.05）,而对p-ERK1/2和p-JNK1/2蛋白水平没有显着性影响（P>0.05）;2 mg/kg和4 mg/kg DHEA处理均可极显着降低p-IκB-α和细胞核内NF-κB蛋白水平,升高胞质中IκB-α和NF-κB蛋白水平（P<0.01）。以上结果提示,DHEA可降低炎性介质和促炎因子的表达、促进抗炎因子的表达而缓解E.coli O157:H7诱发的炎性反应,且这种效应可能是通过抑制p38 MAPK和NF-κB的表达而实现的。3 DHEA调节小鼠原代腹腔巨噬细胞抗E.coli O157:H7感染的作用及其机制研究本试验以ICR小鼠原代腹腔巨噬细胞为研究对象,探讨DHEA对E.coli O157:H7引起的炎症反应的调节作用及其信号转导机制。试验首先分析E coli O157:H7对小鼠原代腹腔巨噬细胞损伤的时间效应,以确定DHEA的处理浓度和E.coli O157:H7作用时间。稀释涂布平板法检测小鼠原代腹腔巨噬细胞的吞噬能力;酶联免疫吸附法测定细胞培养液中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 含量;Western blot 法分析 iNOS、COX-2、p38 MAPK和NF-κB蛋白表达水平。结果表明,100 μmol·L-1的DHEA显着降低小鼠原代腹腔巨噬细胞活力（P<0.05）。E.coli O157:H7感染细胞3 h时产生显着性损伤,且一定浓度的DHEA预处理可显着缓解E.coli O157:H7诱发的损伤（P<0.05）;但当E.coli O157:H7感染细胞4 h时产生DHEA处理无法缓解的严重损伤。不同浓度的DHEA处理对细胞的吞噬能力没有显着影响（P>0.05）。0.1μmol·L-1 DHEA处理极显着降低细胞培养液中TNF-α和IL-1β的含量（P<0.01）,而0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1 DHEA均能显着降低细胞培养液中IL-6的含量（P<0.05）。0.1μmol·L-1和10 μmol·L-1 DHEA处理均能显着降低细胞iNOS和COX-2蛋白水平（P<0.05）。0.1 μmol·L-1和10 μmol·L-1 DHEA具有与SB203580（p38 MAPK特异性抑制剂）相似的生物学作用,其均可显着降低p-p38 MAPK蛋白水平、显着升高IκB-α蛋白水平（P<0.05）;0.1μmol·L-1-10 μmol·L-1 DHEA均能显着降低p-IκB-α和细胞核中NF-κB蛋白水平,并显着抑制细胞质中NF-κB的减少（P<0.05）。以上结果提示,DHEA通过下调p38 MAPK和NF-κB活化而降低E.coli O157:H7诱导的小鼠原代腹腔巨噬细胞炎性因子的过度产生,最终表现为缓解炎症的发展。结果提示,DHEA可提高E.coli O157:H7感染小鼠脾指数、降低腹腔菌体浓度、减轻小肠组织的病理损伤,整体上表现为提高E.coli O157:H7感染小鼠的成活率。DHEA可降低iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介质的过度产生,同时促进抗炎因子IL-4和IL-10的分泌,从而缓解E.coli O157:H7感染导致的炎症损伤。DHEA通过抑制p38 MAPK蛋白活化而阻断NF-κB的活化入核,进而调节炎性因子的表达以缓解过度的炎症反应,最终实现对E.coli O157:H7感染小鼠的保护效应。
俱雄[2]（2016）在《大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达及免疫原性分析》文中指出大肠埃希菌为革兰氏阴性菌,广泛存在于自然界中,可引起人和动物感染,是一种重要的人畜共患病源菌。OmpC蛋白是大肠埃希菌主要的外膜蛋白,实验发现OmpC蛋白具有很好的免疫原性,能有效抵抗大肠埃希菌类疾病的感染,在疫苗上有很好的应用前景。本试验利用分子生物学方法构建了大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达菌株;采用正交试验设计优化OmpC重组菌株最佳培养条件及最佳蛋白诱导表达条件;包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶方法获得高纯度的OmpC蛋白;通过免疫小鼠获得多克隆抗体,并进行小鼠攻毒大肠埃希菌肠道致病菌的免疫保护作用研究;同时,对OmpC蛋白进行生物信息学分析与重组表位的设计。主要研究结果如下:（1）原核表达菌株的构建:利用分子克隆方法构建OmpC重组质粒,通过SDSPAGE蛋白电泳证实OmpC蛋白成功表达。（2）OmpC蛋白诱导表达条件优化:正交试验确定表达菌最佳培养条件为:葡萄糖浓度0,转速230r/min,装液量50mL;最佳的蛋白诱导条件为:加IPTG时菌液OD600值0.8,加IPTG终浓度0.3mmol/L,诱导时间8h,诱导温度32℃。（3）OmpC蛋白多克隆抗体制备:Westernblotting检测OmpC抗血清具有很好的特异性,ELISA法证实OmpC抗血清效价达到1:6400倍。（4）OmpC蛋白免疫原性分析:通过免疫小鼠OmpC蛋白,攻毒大肠埃希菌肠道致病菌,结果显示其免疫保护率达到63.64%。（5）OmpC蛋白生物信息学分析与表位疫苗设计:研究发现OmpC蛋白在不同种细菌间存在较高的同源性,可能具有交叉免疫保护作用;1-21位氨基酸可能为信号肽位置,无跨膜结构并定位于细胞膜外;存在5个优势B细胞表位,1个CTL表位,1个Th细胞表位;并重组拼接设计获得OmpC蛋白表位疫苗。
张桃[3]（2016）在《牛源致病性大肠杆菌O157:H7的分离鉴定及对其小鼠疾病模型的中药治疗效果》文中研究指明目的:研究新疆肉牛主产区健康牛群中大肠杆菌O157:H7的携带状况及致病力,分离菌株建立动物疾病模型,并用白头翁汤及郁金散对其进行防治。方法:1、在新疆伊犁地区、阿勒泰地区、塔城地区的牛场采集健康牛的423份新鲜牛粪样本,增菌后用SMAC平板和MUG实验进行筛选,再用PCR方法和生化试验鉴定;对分离鉴定到的E.Coli O157:H7用PCR方法检测其Stx1、Stx2、eae A、tccp和Hly等基因携带情况;用鉴定到的菌株EC肉汤增菌后腹腔注射进行动物攻毒实验,确定分离菌株的致病性。2、再对健康昆明系小鼠进行分组,分别灌服不同浓度的E.Coli O157:H7菌液,按改良寇氏法计算出该菌株对小鼠的LD50,建立动物疾病模型。3、对健康昆明系小鼠随机进行分组,根据小鼠的体重按照高、中、低剂量灌服中药,观察检测小鼠在用药期间临床症状、脾脏系数及血清中TNF-α、IL-17水平的变化,从而确立中药组方的安全性和对免疫作用的影响。4、实验动物感染E.Coli O157:H7 12 h后用白头翁汤、郁金散进行治疗,从临床症状、脾脏系数及血清中TNF-α、IL-17水平的变化,分析中药组方治疗动物感染E.Coli O157:H7后,其免疫作用以及抑菌和抗炎的作用。结果:1、新疆伊犁地区的85份粪样中鉴定出1株E.coli O157:H7,检出率为1.176%;而这株菌同时携带被检测的5种毒力基因（Stx1、Stx2、eae A、tccp、Hly）;新疆塔城与阿勒泰地区的检出率为0%。攻毒实验所有的实验动物于24 h内全部死亡。2、本实验成功建立E.coli O157:H7感染的动物疾病模型,菌株LD50为1.0×105 cfu/m L。3、动物在服用不同浓度的白头翁汤及郁金散后脾脏系数无统计学意义（P>0.05）;5 d与1 d相比,郁金散低剂量组显着降低TNF-ɑ的分泌量（P<0.05）,其余组极显着地降低（P<0.01）;白头翁汤高、低剂量组及郁金散高、中剂量组能显着地降低IL-17的分泌量（P<0.05）;其余剂量组则极显着降低（P<0.01）。4、感染E.Coli O157:H7后灌服白头翁汤、郁金散,5 d与1 d相比,感染小鼠的TNF-ɑ与IL-17均降低到感染前范围内（P<0.05）。结论:新疆伊犁地区有牛群携带致病性大肠杆菌O157:H7,从分离到的菌株对小白鼠致病性实验结果发现,这株菌对人有很强的潜在致病性,并成功建立动物疾病模型。实验证明白头翁汤及郁金散无毒副作用,用两组方进行治疗,结果发现两组方的常规剂量组具有降低感染E.Coli O157:H7对机体损伤的作用,具有较强的抗炎能力。
赵明礼[4]（2013）在《牛源性致病性大肠杆菌的分离鉴定及E.coli O157:H7生物学特性研究》文中提出大肠埃希氏菌（Escherichia coli），俗称大肠杆菌，埃希氏菌属，属于肠杆菌科（Enterobacterriaceae）。绝大多数是温血动物肠道中占优势的兼性厌氧寄居菌群，在正常情况下对动物机体不具有致病能力。但后来研究发现，不同的血清型对机体的致病能力有所不同，O157:H7血清型是大肠杆菌的主要血清型，是与人类的出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征相关，E.coli O157:H7是牛、羊等反刍动物无症状携带的，由于O157:H7的感染剂量低、致病性强和严重的临床症状，使其感染已成为一个全球性广泛关注的公共卫生问题，本课题是对不同地区的临床上发生肺炎、腹泻、胸膜炎及腹膜炎的病例，采取的病料进行细菌的分离鉴定，其中较为严重的是黑龙江某牛场，存栏成年母牛3000头，2011年10月末陆续开始产犊，第一产犊牛生后13天开始出现水样腹泻，成活13个月不等的犊牛，陆续开始出现死亡现象，剖检可见肠黏膜出血，脾脏肿大，肝、肾实质变性。对病死牛采集病料对其进行实验室诊断、药敏实验、致病性实验、毒力实验及毒力基因的检测。实验结果表明：生化结果显示对葡萄糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蕈糖、果糖、硝酸盐、卫矛醇和靛基质为阳性；对棉子糖、山梨醇、VP、蔗糖、H2S和枸橼酸盐为阴性；利用PCR的方法，确定为引起牛发病的病原为肠出血性E.coli O157:H7；采用Kirby-Bauer法分析E.coli O157:H7分离菌株的敏感特性，对庆大霉素、卡那霉素和氯霉素等有较高的敏感性，对青霉素、四环素和氨苄西林等有较强的耐药性，对环丙沙星、链霉素和利福平等有中等耐药程度；致病性实验结果表明肠出血性大肠杆菌O157:H7有较强的致病性；毒力试验结果表明：E.coliO157:H7的半数致死量（LD50）为7.9×107CFU，最小致死量（MLD）为5.0×106CFU；采用PCR法对E.coli O157:H7分离菌株进行毒力基因的检测，检测到有eaeA、stx1和hly基因的存在。安徽牛场（A1菌株）和山东牛场（S1菌株）分离出的病原菌经PCR鉴定均为大肠埃希氏菌，A1菌株的生化结果显示：对葡萄糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蕈糖、果糖、硝酸盐、山梨醇、卫矛醇和靛基质为阳性；棉子糖、VP、蔗糖、H2S和枸橼酸盐为阴性。药敏试验结果显示：对头孢他啶、丁胺卡那霉素、妥布霉素、头孢哌酮以及呋喃妥因有较高的敏感性；但是对红霉素、头孢噻腭以及氧氟沙星、利福平有轻微的耐药性；对环丙沙星、氯霉素以及四环素等抗生素有较强的耐药性。致病性实验结果表明有一定的致病性；S1菌株的生化结果显示：对葡萄糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蕈糖、果糖、硝酸盐、山梨醇、蔗糖、卫矛醇和靛基质为阳性；棉子糖、VP、H2S和枸橼酸盐为阴性；药敏试验结果显示：对氯霉素、链霉素、诺氟沙星以及红霉素等抗生素有很强的耐药性；对头孢哌酮、丁胺卡那霉素有较强的敏感性；对头孢他啶、妥布霉素的耐药程度较低；对呋喃妥因没有表现出明显的敏感性，处于中介；致病性实验结果表明有一定的致病性。
叶青[5]（2012）在《EHEC O157：H7的分离、鉴定及对小鼠致病性》文中认为肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC）0157:H7是一种重要的动物源性致病菌,易引起婴幼儿及老人腹泻、出血性结肠炎（HC）、血栓形成性血小板减少性紫癜（TTP）及溶血性尿毒综合征（HUS）等严重并发症,部分HUS病例可致死亡。该菌长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中,牛是主要的贮存宿主。该菌造成幼龄动物腹泻,并污染畜禽产品及水源和农作物等,给农牧业带来巨大的损失,也对人们的健康构成巨大威胁。1.大肠杆菌0157：H7的检测和分离从南京各个地区采集新鲜样品420份,其中粪便样品350份,蔬菜50份,肉类10份,牛奶10份,增菌后,免疫磁珠富集,涂布筛选性培养基,菌株在改良山梨醇-麦康凯培养基（CT-SMAC）培养后菌落呈圆形、表面湿润、半透明样,挑取可疑菌落进行rfbE/fliC二重PCR,同时用0157和H7诊断血清做玻片凝集试验进行鉴定。结果成功分离到5株出血性大肠杆菌0157：H7。所采集样品的肠出血性大肠杆菌0157：H7检出率分别为8%、2%、0%、2%、2%。革兰氏染色为阴性杆菌,并且有1株迟缓性发酵山梨醇麦康凯培养基。2.大肠杆菌0157：H7分离株的鉴定设计毒力因子stx1、stx2、eae、hlyA和tccp相应引物,针对已分离的0157：H7菌株进行PCR鉴定,并进行生化试验和药敏试验。毒力基因检测显示：其中4株毒力因子表型为stx1-stx2+eae+hlyA+tccp+,另有一株表现型为stx1+stx2+eae+hlyA+tccp+,各菌tccp基因均为阳性,但携带的重复片段数量有差异。不同牛场的分离菌株的耐药性差异较大,其中6≠}对氨苄青霉素、卡那霉素、先锋V、链霉素有强的耐药性。3.大肠杆菌0157：H7分离株的小鼠致病性通过灌胃攻毒方式研究血性大肠杆菌0157：H7对BALB/C小鼠致病性：选用八周龄小鼠,用链霉素处理小鼠,再分别以1×1010CFU同剂量口服接种经PBS洗涤的五株0157：H7分离株全菌,对感染后小鼠的临床症状和存活情况进行观察,结果显示：小鼠感染各分离菌后体内排菌时间分别为7、9、13、13、15d,存活率分别为40%、50%、60%、20%、50%。本研究为动物感染模型的构建打下了基础。
王燕琴,朱建勇,胡永浩[6]（2011）在《两种不同抗原制备方法对大肠杆菌O157:H7单克隆抗体亚类的影响》文中认为单克隆抗体技术已深入到医学和生物学的各个领域,成为一种必不可少的工具,具有极为重要的理论研究价值和实用价值。据报道,全菌抗原的主要抗原位点是脂多糖（LPS）,刺激机体产生的IgG抗体主要针对脂多糖,故不同血清型间无交叉保护作用;而提纯的外膜蛋白（OMP）作为抗原刺激机体产生的
赵攀登[7]（2010）在《EHEC O157：H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护及人工感染牛羊试验》文中提出肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC） O157:H7是一种重要的动物源性致病菌,易引起婴幼儿及老人腹泻、出血性结肠炎（HC）、血栓形成性血小板减少性紫癜（TTP）及溶血性尿毒综合征（HUS）等严重并发症,部分HUS病例可致死亡。该菌长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中,牛是其主要的贮存宿主,造成幼龄动物腹泻,并污染畜禽产品及水源和农作物等,给农牧业带来巨大的损失,也对人们的健康构成巨大威胁。自首次于美国发现因该菌引起的食物中毒以来,疫情不断扩散蔓延,在多个国家相继引起暴发流行,我国于2000年也发生暴发流行,危害程度可能是迄今为止最严重的一次。目前还没有理想的疫苗能够防治该菌引起的感染。研制能够减少宿主动物排菌的疫苗,以减少传染源对人类健康的威胁是该领域的主要研究方向。1. O157:H7pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒的构建和融合蛋白的表达采用PCR方法获得目的基因tir-tccp,构建pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒。转化E.coli BL21（DE3）后IPTG诱导,超声破菌后SDS-PAGE检测目的蛋白主要存在于上清,表明Tir-Tccp蛋白以可溶形式表达。Western blot鉴定目的蛋白具有良好的反应原性。2.肠出血性大肠杆菌O157:H7Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护性研究研究不同浓度的O157:H7Intimin和Tir-Tccp蛋白对接受1×1010CFU O157:H7小鼠的免疫保护作用。将Intimin和Tir-Tccp蛋白和佐剂充分乳化后,通过背部和腹部皮肤皮下多点注射的方式免疫小鼠,对照组注射等量的PBS。共免疫两次,间隔14d,末次免疫后的14d攻毒O157:H71×1010CFU/只。在每次免疫后的14d通过断尾采血,用间接ELISA检测血清抗体。攻毒后,观察小鼠精神状态,记录死亡数并检测排菌。ELISA结果表明,Tir-Tccp蛋白诱导小鼠产生IgG抗体水平明显升高,而Intimin诱导产生的IgG抗体升高不明显。攻毒后,两个免疫组小鼠均死亡1只,存活14只,存活率为93.3%；对照组小鼠死亡4只,存活6只,存活率为60%。免疫组在攻毒后6d,粪便中检测不到0157：H7；而对照组在攻毒后13d仍有较高的排菌量。本实验表明紧密素和Tir-Tccp蛋白对小鼠起到了有效的免疫保护性作用,能够减少0157：H7在小鼠体内的定植。3.肠出血性大肠杆菌0157：H7感染牛羊试验以1×1010CFU/只EHEC O157:H7的剂量通过灌胃方式攻毒动物,检测牛、羊的粪便排菌量和排菌时间。攻毒前,所有动物饮用5g/L的链霉素溶液3d,目的是增强0157：H7在肠道内的定植。攻毒前所有动物禁水、禁食12h,攻毒后12h恢复饮水、饮食。攻毒后给予所有动物0.5g/L的链霉素溶液。攻毒后的24h开始检测粪便的排菌量。结果显示,牛最长排菌时间为17d,最高排菌量达5×105CFU;羊最长排菌时间达13d,最高排菌量为1×10SCFU。本实验对EHEC O157:H7主要宿主的排菌时间和粪便排菌量做了初步研究,为探索EHEC O157:H7感染宿主机制和用于疫苗效力评价及动物模型的建立奠定了基础。
呼锐[8]（2010）在《大肠杆菌OmpA蛋白的表达及免疫保护作用》文中进行了进一步梳理奶牛乳房炎是由多种非特定的病原微生物引起奶牛的常见病,是危害奶牛业的主要疾病之一。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌,约91%以上的病例是由这三种菌引起,其中肠杆菌群性乳房炎发病率高达33.6%,在临床分离的肠杆菌群（coliforms）中大肠杆菌占76.1%。传统的抗生素治疗常常因为耐药性的产生而疗效不佳,同时造成严重的乳中抗生素残留而危害人类健康。因此,近些年来人们开始研究和开发有效的免疫制剂来防制乳房炎。研究表明,外膜蛋白A（OmpA）是普遍存在于革兰氏阴性菌表面的蛋白,在细菌生命活动中发挥至关重要的作用,它可以作为细菌的黏附素和侵袭素,参与生物膜的形成,也可作为多种噬菌体的受体,是先天免疫系统的重要靶位。但有关OmpA的免疫原性和免疫保护作用的研究未见报导。本研究将OmpA蛋白进行原核表达,并制备免疫原免疫接种小鼠,研究其对不同大肠杆菌以及志贺氏菌、克雷伯氏菌攻毒的免疫保护作用,为进一步研究肠杆菌群性奶牛乳房炎基因工程疫苗提供参考。本研究采用PCR方法对大肠杆菌308-2、C83919、O157、J96、2002-1菌株及克雷伯氏菌、志贺氏菌的ompA基因进行扩增和序列分析。然后,构建重组质粒ompA-pET,将其转化至大肠杆菌Rosetta中高效表达,并采用Ni2+树脂纯化表达的融合蛋白OmpA。将纯化的OmpA蛋白与弗氏佐剂等体积乳化后免疫小鼠,每只小鼠每次免疫100μg表达蛋白,并以PBS与佐剂乳化物为对照。初次免疫3周后进行二次免疫,二免后2周用大肠杆菌C83919、O157、J96、2002-1菌株及克雷伯氏菌、志贺氏菌攻毒,观察一周并记录结果。同时,分别在初次免疫的第0,7,14,21,28,35,42,49,56天对各组小鼠采血,用间接ELISA方法对获得血清进行抗体效价检测;分离小鼠脾脏淋巴细胞,通过Elispot的方法检测淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的能力。结果显示,各菌株的ompA基因序列与Genbank核苷酸序列（GeneID: 7437746）的同源性分别为308-2:99.9%;C83919:100%;O157:99.9%;J96:97.7%;2002-1:96.0%;志贺氏菌:94.6%;克雷伯氏菌:86.5%。表达的重组OmpA蛋白以全菌血清为一抗经经Wsetern blot检测可得到清晰且分子量正确的条带。免疫小鼠二次免疫2周后血清OmpA抗体效价可达1:64 000。免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL- 4的斑点形成细胞数（SFC）与对照组相比显着升高（p < 0.05）,攻毒1周后,免疫组对不同细菌的免疫保护性都较高。以上结果表明,重组OmpA蛋白可作为疫苗的候选抗原。
洪杰华[9]（2010）在《EHEC O157主要毒素基因克隆表达及单克隆抗体制备与鉴定》文中认为肠出血性大肠杆菌（EHEC）是一种重要的食源性病原菌,自1975年被首次分离接着被确认为致病菌以来,世界各地包括中国在内都有不同规模的暴发流行,可引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎（HC）、溶血性尿毒综合征（HUS）、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）等全身性并发症。O157是EHEC的代表菌株,其主要毒力特征之一是引起肠上皮细胞出现黏附与脱落（attaching and effacing, AE）损伤,编码AE损伤的基因都位于细菌染色体上LEE致病岛内,其中最重要的就是eae基因,编码一个被称为紧密素的外膜蛋白。EHEC O157另外一个毒力因子是由插入到染色体上的原噬菌体编码的志贺毒素（Stx）,它能使感染机体器官发生病理变化,或者继发其他的临床症状甚至引起死亡。大量研究证明,紧密素和志贺毒素Stx是可以用于开发疫苗以预防EHEC感染的重要免疫原。本试验利用PCR技术从大肠杆菌EDL933全基因组中克隆了Stx1B、Stx2B、eae三段基因,经序列分析,结果与参考序列同源性达99%以上。将产物克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-Stx1B、pGEX-Stx2B、pGEX-eae,转入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达量分别约占菌体总蛋白的27%、27.7%和19.5%,且均主要以包涵体形式表达,通过切胶的方法纯化目的蛋白。纯化蛋白免疫BABL/c小鼠,利用细胞融合技术,经间接ELISA筛选和3次细胞亚克隆,Stx1B、Stx2B、eae分别获得5、5、2株杂交瘤细胞,分别命名为1G11、2H8、1B10、3A6、4B1;1B3、4B4、2C3、3D1、1C2;2D4、3B4。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定,2D4为IgM,其他均为IgG类抗体。12株杂交瘤细胞染色体数为103±5,明显多于SP2/0骨髓瘤细胞65～75条。Western blotting表明1G11、2H8、1B10,1B3、4B4、2C3,2D4、3B4与相应的GST-Stx1B、GST-Stx2B、GST-eae融合蛋白反应均能产生特异性条带,而与空载体诱导后的GST标签蛋白不反应。制备了1G11、2H8腹水单抗,采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化后,经SDS-PAGE电泳分析IgG重链和轻链区带明显,几乎没有杂带。ELISA叠加试验可知,1G11、2H8、1B10抗同一抗原表位,1B3、4B4、2C3抗同一抗原表位,2D4、3B4抗不同的抗原表位。12株杂交瘤细胞在体外连续传代3个月和冻存后再复苏均不影响抗体分泌的稳定性;与沙门菌、大肠杆菌、牛结核杆菌、李氏杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应。亲和力分析表明,1G11、2H8、1B10,1B3、4B4、2C3,2D4、3B4 8株单抗的亲和常数均在107～109M-1之间,亲和力较高,为这些单抗敏感、稳定和快捷的检测应用提供了必要的保证。总之,12株单抗的成功制备为EHEC O157病原的快速、特异性诊断提供了诊断试剂,同时也为该病致病机理和特异性治疗的进一步研究提供物质基础,为成功研制O157疫苗积累了数据。
李丽[10]（2009）在《大肠杆菌O157：H7多重PCR检测和溶血素蛋白的表达及其免疫原性分析》文中研究表明1.大肠杆菌O157：H7多重PCR方法检测自肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7基因组扩增O157抗原基因rfbE和H7标志性基因fliC建立了二重PCR,扩增EHEC主要毒力因子志贺氏毒素1 （shiga toxin 1 stx1）、志贺氏毒素2 （shiga toxin 2 stx2）、溶血素（haemolysin hly）建立了三重PCR；并对其敏感性、特异性、重复性进行判定。结果显示二重PCR成功扩增812bp、609bp目的片段,三重PCR成功扩增593bp、484bp、319bp目的片段；所建立的二个多重PCR敏感性、特异性、重复性都很好。运用所建立的多重PCR对奶牛场63份粪便进行临床检测,其中4份为O157：H7阳性,阳性率为6.3%。经测序比较,与GenBank中公布的参考株EDL933序列（NC002655.2）同源性为99%。2.大肠杆菌O157：H7溶血素（hly）部分基因片段的克隆表达参照GenBank中大肠杆菌O157：H7（参考株EDL933）hly基因序列设计一对特异性引物,用PCR方法扩增hly部分基因,得到1732bp的片段,然后克隆到pMD18-T载体中,经测序比较,与GenBank中公布的序列（登录号X79839.1）核苷酸同源性为99%。从T载体中切下目的片段后,定向克隆到pET-32a（+）中,转化E.coli BL21（DE3）,经诱导后,进行SDS-PAGE试验,证明获得81kD融合蛋白,目的基因高效表达；免疫转印鉴定呈阳性,hly部分基因片段体外成功表达。并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白,纯化后蛋白纯度可达90%。3.大肠杆菌O157：H7溶血素蛋白BALB/C小鼠免疫试验通过基因工程技术成功表达的大肠杆菌O157：H7溶血素蛋白,与弗氏佐剂混合,免疫10只BALB/C小鼠,同时做6只试验对照组。三免后用100倍最小致死量的参考大肠杆菌O157：H7菌（100×109CFU）灌胃攻菌。结果对照组全部死亡,实验组保护率为60%。试验证实体外表达的大肠杆菌O157：H7的溶血素蛋白具有免疫原性,在抵抗大肠杆菌O157：H7的攻击中起到一定的保护作用。
二、O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对小鼠免疫保护作用的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对小鼠免疫保护作用的实验研究（论文提纲范文）
（1）DHEA对小鼠抵抗大肠杆菌O157:H7感染的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文部分缩写中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 肠出血性大肠杆菌研究进展 |
| 1 EHEC O157:H7的起源与进化 |
| 2 EHEC O157:H7病原学 |
| 2.1 形态学与培养特性 |
| 2.2 生化特性 |
| 2.3 抗逆性 |
| 3 EHEC O157:H7流行病学 |
| 3.1 传染源 |
| 3.2 传播途径 |
| 3.3 易感人群 |
| 3.4 全球流行现状 |
| 4 EHEC O157:H7的致病机理 |
| 4.1 志贺毒素 |
| 4.2 LEE致病岛 |
| 4.3 质粒pO157 |
| 5 EHEC O157:H7的防控 |
| 参考文献 |
| 第二章 脱氢表雄酮生物学功能研究进展 |
| 1 脱氢表雄酮的发现 |
| 2 DHEA的合成、代谢与分布 |
| 2.1 肾上腺中DHEA的合成与代谢 |
| 2.2 脑部DHEA的合成与代谢 |
| 3 DHEA的生物学功能研究进展 |
| 3.1 DHEA对营养物质代谢的影响 |
| 3.2 DHEA对机体免疫功能的影响 |
| 3.3 DHEA与抗衰老作用 |
| 3.4 DHEA对神经系统的影响 |
| 3.5 DHEA对心血管系统的影响 |
| 3.6 DHEA对骨质代谢的影响 |
| 参考文献 |
| 第三章 NF-κB与MAPK信号通路及其与炎症的关系 |
| 1 NF-κB信号通路及其与炎症关系研究进展 |
| 1.1 NF-κB信号通路 |
| 1.2 NF-κB信号通路的激活机制 |
| 1.3 NF-κB与免疫的关系 |
| 2 MAPK信号通路研究进展及其与炎症的关系 |
| 2.1 MAPK信号通路概述 |
| 2.2 MAPK通路的调节 |
| 2.3 MAPK与炎症反应的关系 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 DHEA对小鼠抵抗E. coli O157:H7感染的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 E.coli O157:H7致病力测定 |
| 1.5 试验动物分组与处理 |
| 1.6 样品采集 |
| 1.7 小肠的病理组织学观察 |
| 1.8 脾脏指数的测定 |
| 1.9 乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)活性测定 |
| 1.10 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 E.coli O157:H7感染小鼠半数致死量(LD_(50)) |
| 2.2 DHEA灌胃对小鼠体增重和采食量的影响 |
| 2.3 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠死亡率的影响 |
| 2.4 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠体增重的影响 |
| 2.5 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠腹腔液细菌浓度的影响 |
| 2.6 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠小肠组织病理学变化的影响 |
| 2.7 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠脾脏免疫指数的影响 |
| 2.8 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠脾脏中LDH和ACP活性的影响 |
| 3. 讨论与小结 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 DHEA对小鼠抵抗E.coli O157:H7感染作用的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 试验动物及处理 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 脾脏iNOS活性的测定 |
| 1.5 血清NO含量和iNOS活性的测定 |
| 1.6 脾脏中细胞因子mRNA表达分析 |
| 1.6.1 总RNA提取 |
| 1.6.2 反转录 |
| 1.6.3 引物设计合成 |
| 1.6.4 Real-Time PCR |
| 1.7 脾脏和血清中细胞因子含量的测定 |
| 1.8 MAPK和NF-κB通路蛋白表达分析 |
| 1.9 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠脾脏iNOS活性的影响 |
| 2.2 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠血清NO含量和iNOS活性的影响 |
| 2.3 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠脾脏细胞因子表达的影响 |
| 2.4 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠组织中IFN-γ和IL-4含量的影响 |
| 2.5 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠MAPK和NF-κB通路的影响 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 DHEA调节小鼠原代腹腔巨噬细胞抗E.coli O157:H7感染的作用及其机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 小鼠原代腹腔巨噬细胞的分离、培养 |
| 1.5 DHEA对小鼠原代腹腔巨噬细胞相对活力的影响 |
| 1.6 DHEA对E.coli O157:H7感染的小鼠原代腹腔巨噬细胞损伤的影响 |
| 1.7 DHEA对E.coli O157:H7感染的小鼠原代腹腔巨噬细胞噬菌作用的影响 |
| 1.8 小鼠原代腹腔巨噬细胞培养上清中细胞因子含量分析 |
| 1.9 小鼠原代腹腔巨噬细胞iNOS和COX-2蛋白表达分析 |
| 1.10 p38 MAPK和NF-κB通路蛋白表达分析 |
| 1.11 SB203580对小鼠原代腹腔巨噬细胞相对活力的影响 |
| 1.12 SB203580对小鼠原代腹腔巨噬细胞培养上清中细胞因子含量的影响 |
| 1.13 SB203580对小鼠原代腹腔巨噬细胞p38 MAPK和NF-κB通路蛋白表达影响分析 |
| 1.14 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DHEA对小鼠腹腔巨噬细胞相对活力的影响 |
| 2.2 DHEA对E.coli O157:H7感染小鼠腹腔巨噬细胞损伤的保护效应 |
| 2.3 DHEA对E.coli O157:H7感染的小鼠腹腔巨噬细胞噬菌作用的影响 |
| 2.4 DHEA对E.coli O157:H7感染的腹腔巨噬细胞细胞因子分泌的影响 |
| 2.5 DHEA对iNOS和COX-2表达的影响 |
| 2.6 DHEA对E.coli O157:H7感染腹腔巨噬细胞p38 MAPK和NF-κB通路的影响 |
| 2.7 SB203580对小鼠腹腔巨噬细胞相对活力的影响 |
| 2.8 SB203580对小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.9 DHEA或SB203580对E.coli O157:H7感染的腹腔巨噬细胞p38 MAPK和NF-κB通路的影响 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（2）大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大肠埃希菌概述 |
| 1.2 大肠埃希菌致病机理 |
| 1.2.1 产肠毒素大肠埃希菌（ETEC） |
| 1.2.2 产类志贺毒素大肠埃希菌（SLTEC） |
| 1.2.3 肠道致病性大肠埃希菌（EPEC） |
| 1.2.4 败血性大肠埃希菌（SEPEC） |
| 1.2.5 尿道致病性大肠埃希菌（UPEC） |
| 1.3 大肠埃希菌疾病的防治 |
| 1.3.1 抗生素治疗 |
| 1.3.2 中药与预防性防治 |
| 1.3.3 疫苗治疗 |
| 1.4 大肠埃希菌外膜蛋白OMPC研究 |
| 1.5 论文研究思路及意义 |
| 1.5.1 研究思路 |
| 1.5.2 本文研究意义 |
| 第2章 大肠埃希菌外膜蛋白OmpC原核载体构建与诱导表达条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 试验菌株及质粒 |
| 2.2.2 试验试剂及相关酶类 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 常用试剂配置 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 全基因组DNA提取 |
| 2.3.3 PCR扩增 |
| 2.3.4 PCR产物回收 |
| 2.3.5 PCR产物双酶切 |
| 2.3.6 质粒DNA提取 |
| 2.3.7 质粒双酶切 |
| 2.3.8 感受态细胞制备 |
| 2.3.9 检测感受态细胞DH5α 活力 |
| 2.3.10 PCR产物与载体连接 |
| 2.3.11 转化连接产物 |
| 2.3.12 诱导克隆菌表达 |
| 2.3.13 蛋白电泳 |
| 2.3.14 最佳菌种培养条件正交实验 |
| 2.3.15 最佳蛋白诱导表达条件正交实验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 大肠埃希菌OmpC蛋白基因PCR扩增结果 |
| 2.4.2 pET-32a质粒载体的提取与检测 |
| 2.4.3 OmpC蛋白重组质粒的构建 |
| 2.4.4 重组蛋白表达检测 |
| 2.4.5 OmpC表达菌株最适培养条件的正交试验 |
| 2.4.6 OmpC表达菌诱导条件正交试验 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 2.5.1 讨论 |
| 2.5.2 小结 |
| 第3章 大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的免疫保护作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 试验菌株及动物 |
| 3.2.2 相关试剂及酶 |
| 3.2.3 主要试验设备 |
| 3.2.4 常用试剂配置 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 OmpC蛋白纯化 |
| 3.3.2 蛋白冻干保存 |
| 3.3.3 蛋白质复性 |
| 3.3.4 小鼠一抗血清的制备 |
| 3.3.5 Western blotting效价测定 |
| 3.3.6 ELASA效价测定 |
| 3.3.7 攻毒小鼠进行免疫评价 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.4.2 重组蛋白的复性 |
| 3.4.3 重组蛋白小鼠多克隆抗体的制备 |
| 3.4.4 OmpC蛋白的免疫保护作用 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 3.5.1 讨论 |
| 3.5.2 小结 |
| 第4章 大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的生物信息学分析及表位疫苗的重组设计 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 OmpC蛋白进化关系分析 |
| 4.3.2 OmpC理化性质分析 |
| 4.3.3 OmpC蛋白信号肽及跨膜结构预测 |
| 4.3.4 OmpC蛋白二级、三级结构预测 |
| 4.3.5 OmpC蛋白B细胞表位预测 |
| 4.3.6 OmpC蛋白T细胞表位预测 |
| 4.3.7 串联表位的重组 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间学术成果 |
| 致谢 |
（3）牛源致病性大肠杆菌O157:H7的分离鉴定及对其小鼠疾病模型的中药治疗效果（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肠出血性大肠杆菌O157: H7的概况 |
| 1.2 大肠杆菌O157: H7毒力因子及致病机制 |
| 1.3 大肠杆菌病的治疗 |
| 1.4 炎症机制及炎症因子 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 牛源大肠杆菌O157: H7分离与鉴定及其毒力基因检测 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 牛源致病性大肠杆菌O157: H7感染小鼠疾病模型的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 复方中草药对实验动物药物安全性试验的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 中药对感染大肠杆菌O157: H7小鼠治疗效果的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 谢辞 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）牛源性致病性大肠杆菌的分离鉴定及E.coli O157:H7生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 大肠杆菌的病原学特征 |
| 1.1.1 形态与培养特性 |
| 1.1.2 生化特性 |
| 1.1.3 抵抗性 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.3 流行特征 |
| 1.4 致病机制 |
| 1.4.1 LEE 毒力岛 |
| 1.4.2 志贺毒素 |
| 1.4.3 大质粒(po157) |
| 1.5 临床表现 |
| 1.6 大肠杆菌的检测方法 |
| 1.6.1 分离培养法 |
| 1.6.2 聚合酶链式反应(PCR)技术 |
| 1.6.3 酶免疫分析技术 |
| 1.6.4 免疫磁珠分离（IMS） |
| 1.6.5 血清学的诊断 |
| 1.7 大肠杆菌的耐药性现状 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病料的采集 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 菌株 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.1.7 药敏纸片 |
| 2.1.8 引物设计与合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 细菌的分离培养 |
| 2.2.3 分离菌株 A1、S1 和 H1 的生化试验 |
| 2.2.4 分离菌株 A1、S1 和 H1 的 PCR 鉴定 |
| 2.2.5 大肠杆菌 O157:H7 的 PCR 血清型的鉴定 |
| 2.2.6 分离菌株 A1、S1 和 H1 的致病性试验 |
| 2.2.7 分离菌株 A1、S1 和 H1 的药敏试验 |
| 2.2.8 大肠杆菌 O157：H7 的毒力试验 |
| 2.2.9 大肠杆菌 O157：H7 毒力基因的检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 细菌的培养特征 |
| 3.2 分离菌株 A1、S1 和 H1 革兰氏染色和镜检结果 |
| 3.3 分离菌株 A1、S1 和 H1 的生化实验结果 |
| 3.4 大肠杆菌的 PCR 鉴定结果 |
| 3.5 大肠杆菌 O157：H7 的 PCR 血清型的鉴定结果 |
| 3.6 分离菌株 A1、S1 和 H1 的药敏试验结果 |
| 3.7 分离菌株 A1、S1 和 H1 的致病性试验结果 |
| 3.8 大肠杆菌 O157：H7 的毒力试验结果 |
| 3.9 大肠杆菌 O157：H7 的毒力基因检测结果 |
| 3.9.1 毒力基因 stx1 的检测结果 |
| 3.9.2 毒力基因 eaeA 的检测结果 |
| 3.9.3 毒力基因 hly 的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌鉴定性分析 |
| 4.2 大肠杆菌血清型分析 |
| 4.3 大肠杆菌致病性分析 |
| 4.4 大肠杆菌耐药性分析 |
| 4.5 大肠杆菌 O157：H7 的毒力性分析 |
| 4.6 大肠杆菌 O157：H7 的毒力基因分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）EHEC O157：H7的分离、鉴定及对小鼠致病性（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 病原学 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 传染源 |
| 3.2 传播途径 |
| 3.3 易感人群 |
| 4 临床症状与病理变化 |
| 5 致病机理 |
| 6 毒力因子及黏附因子 |
| 6.1 志贺毒素 |
| 6.2 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP) |
| 6.3 溶血素(haemolysins hlys) |
| 6.4 紧密素(intimin) |
| 7 检测技术和研究进展 |
| 7.1 常规鉴定方法 |
| 7.2 免疫学检测方法 |
| 7.3 分子生物学检测 |
| 8 防治策略 |
| 8.1 多糖结合疫苗 |
| 8.2 亚单位疫苗 |
| 8.3 转基因植物疫苗 |
| 8.4 细菌ghost疫苗 |
| 8.5 减毒活菌苗 |
| 8.6 重组载体活菌苗 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 大肠杆菌O157:H7的检测和分离 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品和菌株 |
| 1.2 培养基及试剂 |
| 1.3 仪器和试剂 |
| 1.4 引物的设计与合成 |
| 1.5 样品检测与细菌分离 |
| 1.6 二重PCR鉴定O157:H7 |
| 1.7 血清学鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养特性 |
| 2.2 细菌形态学观察 |
| 2.3 阳性EHEC O157:H7的鉴定 |
| 2.4 出血性大肠杆菌O157:H7的分离 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第二章 大肠杆菌O157:H7分离株的鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品和菌株 |
| 1.2 仪器及试剂 |
| 1.3 引物的设计与合成 |
| 1.4 毒力因子的鉴定 |
| 1.5 临床阳性样品的生化试验和药敏试验 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第三章 大肠杆菌O157:H7分离株的小鼠致病性 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 试剂及实验动物 |
| 1.3 菌液制备 |
| 1.3.1 实验动物分组及预处理 |
| 1.3.2 细菌计数 |
| 1.3.3 动物分组和处理 |
| 1.4 粪便收集处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状 |
| 2.2 小鼠存活率 |
| 2.3 攻毒后排菌情况检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 常用试剂配制 |
| 致谢 |
（6）两种不同抗原制备方法对大肠杆菌O157:H7单克隆抗体亚类的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 全菌抗原的制备 |
| 1.2 OMP的提取 |
| 1.3 动物免疫 |
| 1.4 免疫小鼠抗体效价的测定 |
| 1.5 单克隆抗体的制备 |
| 1.6 抗体亚类的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠抗体效价的测定结果 (见表2、表3) |
| 2.2 抗体亚类的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
（7）EHEC O157：H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护及人工感染牛羊试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 病原学 |
| 3 流行病学 |
| 4 临床特征与病理变化 |
| 5 致病因子 |
| 5.1 外膜蛋白 |
| 5.2 LPS |
| 5.3 紧密粘附素(Intimin) |
| 5.4 转位紧密粘附素受体(Tir) |
| 5.5 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP) |
| 5.6 菌毛 |
| 5.7 ToxB |
| 5.8 EspS蛋白 |
| 5.9 志贺毒素 |
| 5.10 溶血素 |
| 6 致病机理 |
| 7 检测方法 |
| 7.1 细菌分离法 |
| 7.2 免疫学方法 |
| 7.3 分子生物学方法 |
| 7.4 生物传感技术 |
| 7.5 基因芯片技术 |
| 8 防治策略 |
| 8.1 亚单位疫苗 |
| 8.2 多糖结合疫苗 |
| 8.3 细菌ghost疫苗 |
| 8.4 转基因植物疫苗 |
| 8.5 核酸疫苗 |
| 8.6 重组活载体疫苗 |
| 8.7 减毒活菌疫苗 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 O157：H7 pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒的构建和融合蛋白的表达 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 tir-tccp基因的克隆 |
| 1.4 PCR扩增产物的回收 |
| 1.5 目的片段tir-tccp的T-A克隆与鉴定 |
| 1.6 pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒的构建 |
| 1.7 Western blot鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的片段的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒pCold Ⅰ-tir-tccp的酶切鉴定 |
| 2.3 基因序列分析 |
| 2.4 重组蛋白的表达及表达形式的鉴定 |
| 2.5 重组蛋白的纯化及Western blotting |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第二章 肠出血性大肠杆菌O157：H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 菌种和实验动物 |
| 1.4 重组蛋白的诱导与纯化 |
| 1.5 小鼠的免疫保护性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的诱导及纯化 |
| 2.2 免疫后血清中特异性抗体的检测 |
| 2.3 小鼠存活率 |
| 2.4 攻毒后排菌情况检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 肠出血性大肠杆菌O157：H7感染牛羊试验 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂及实验动物 |
| 1.2 攻毒前动物的处理 |
| 1.3 免疫磁珠分离细菌 |
| 1.4 重PCR鉴定O157：H7 |
| 1.5 菌液制备 |
| 1.6 动物分组和处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 攻毒前PCR检测粪便结果 |
| 2.2 动物粪便排菌结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 常用试剂配制 |
| 致谢 |
（8）大肠杆菌OmpA蛋白的表达及免疫保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳房炎的治疗 |
| 1.2 肠杆菌群奶牛乳房炎疫苗的研究进展 |
| 1.3 大肠杆菌OMPA 蛋白的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 试验结果 |
| 3.1 对不同菌株OMPA 基因的扩增及序列分析 |
| 3.2 大肠杆菌OMPA 基因T/A 克隆结果 |
| 3.3 OMPA 基因重组表达载体鉴定结果 |
| 3.4 重组蛋白OMPA 的表达结果 |
| 3.5 WSETERN BLOT 检测结果 |
| 3.6 重组OMPA 蛋白免疫水平检测 |
| 3.7 重组蛋白的免疫保护结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（9）EHEC O157主要毒素基因克隆表达及单克隆抗体制备与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 EHEC O157 研究进展 |
| 1.1.1 EHEC O157 概述 |
| 1.1.2 EHEC O157 病原学 |
| 1.1.3 EHEC O157 传播途径 |
| 1.1.4 EHEC O157 流行特征 |
| 1.1.5 EHEC O157 临床症状 |
| 1.2 EHEC O157 致病机理 |
| 1.3 EHEC O157 主要毒力因子及其致病作用 |
| 1.3.1 志贺毒素（Stx） |
| 1.3.2 eae 基因及其编码的紧密素 |
| 1.3.3 chuA 基因 |
| 1.3.4 pO157 质粒及其编码的肠溶血素 |
| 1.3.5 外膜蛋白（OMP） |
| 1.3.6 脂多糖（LPS） |
| 1.3.7 其他毒力相关因子 |
| 1.4 EHEC O157 疫苗研究进展 |
| 1.4.1 Stx 类毒素疫苗 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 |
| 1.4.3 结合疫苗 |
| 1.4.4 减毒活菌疫苗 |
| 1.4.5 核酸疫苗 |
| 1.4.6 单克隆抗体 |
| 1.4.7 细菌ghost 疫苗 |
| 1.4.8 转基因植物疫苗 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种与载体 |
| 2.1.3 工具酶和试剂盒 |
| 2.1.4 其他相关试剂 |
| 2.1.5 标准参照物 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.1.7 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因原核表达载体构建 |
| 2.2.2 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.2.4 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.5 单克隆抗体的大量制备 |
| 2.2.6 单克隆抗体的部分特性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR 扩增 Stx1B、Stx2B 及 eae 结果 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒的PCR 和酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒的序列测定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与鉴定 |
| 3.3.1 重组融合蛋白的诱导表达 |
| 3.3.2 纯化后融合蛋白浓度 |
| 3.4 单克隆抗体的制备 |
| 3.4.1 间接ELISA 方法的建立 |
| 3.4.3 细胞融合 |
| 3.4.4 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.5 单克隆抗体特性的鉴定 |
| 3.5.1 杂交瘤细胞株的一般特性 |
| 3.5.2 单克隆抗体腹水的纯化 |
| 3.5.3 单克隆抗体免疫印迹检测结果 |
| 3.5.4 单克隆抗体染色体计数结果 |
| 3.5.5 单克隆抗体亲和常数测定结果 |
| 3.5.6 单克隆抗体识别抗原表位的初步分析结果 |
| 3.5.7 单克隆抗体稳定性检测结果 |
| 3.5.8 单克隆抗体特异性分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒的构建及诱导表达 |
| 4.1.1 Stx 及eae 抗原的选择 |
| 4.1.2 原核表达载体的选择 |
| 4.1.3 宿主表达菌的选择 |
| 4.1.4 表达条件的常规优化 |
| 4.2 单克隆抗体的制备 |
| 4.2.1 抗原制备 |
| 4.2.2 实验动物的选择 |
| 4.2.3 细胞融合与筛选 |
| 4.2.4 杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.2.5 污染的预防和排除 |
| 4.3 单克隆抗体的生物学特性 |
| 4.3.1 单克隆抗体效价 |
| 4.3.2 细胞的冻存与复苏 |
| 4.3.3 腹水的纯化 |
| 4.3.4 单克隆抗体特异性分析 |
| 4.3.5 亲和常数的测定 |
| 4.3.6 抗原表位初步分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）大肠杆菌O157：H7多重PCR检测和溶血素蛋白的表达及其免疫原性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 病原学 |
| 3 流行病学 |
| 4 临床症状与病理变化 |
| 5 致病机理 |
| 6 粘附因子及毒力因子 |
| 7 检测技术与研究进展 |
| 8 防治策略 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 大肠杆菌O157:H7多重PCR检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 大肠杆菌O157:H7溶血素(hly)部分基因片段的克隆表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 大肠杆菌O157:H7溶血素蛋白BALB/C小鼠免疫试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录:常用试剂的配制 |
| 致谢 |
四、O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对小鼠免疫保护作用的实验研究（论文参考文献）
- [1]DHEA对小鼠抵抗大肠杆菌O157:H7感染的影响及其机制研究[D]. 赵金龙. 南京农业大学, 2019(08)
- [2]大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达及免疫原性分析[D]. 俱雄. 陕西理工学院, 2016(08)
- [3]牛源致病性大肠杆菌O157:H7的分离鉴定及对其小鼠疾病模型的中药治疗效果[D]. 张桃. 新疆农业大学, 2016(03)
- [4]牛源性致病性大肠杆菌的分离鉴定及E.coli O157:H7生物学特性研究[D]. 赵明礼. 东北农业大学, 2013(10)
- [5]EHEC O157：H7的分离、鉴定及对小鼠致病性[D]. 叶青. 南京农业大学, 2012(01)
- [6]两种不同抗原制备方法对大肠杆菌O157:H7单克隆抗体亚类的影响[J]. 王燕琴,朱建勇,胡永浩. 黑龙江畜牧兽医, 2011(19)
- [7]EHEC O157：H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护及人工感染牛羊试验[D]. 赵攀登. 南京农业大学, 2010(06)
- [8]大肠杆菌OmpA蛋白的表达及免疫保护作用[D]. 呼锐. 黑龙江八一农垦大学, 2010(09)
- [9]EHEC O157主要毒素基因克隆表达及单克隆抗体制备与鉴定[D]. 洪杰华. 东北农业大学, 2010(05)
- [10]大肠杆菌O157：H7多重PCR检测和溶血素蛋白的表达及其免疫原性分析[D]. 李丽. 南京农业大学, 2009(S1)