一、凝血酶受体激活肽和凝血酶对人成纤维细胞释放TGF-β和VEGF的影响（论文文献综述）
贺波[1]（2021）在《不同离心条件所制富血小板纤维蛋白对糖尿病大鼠创面愈合作用比较》文中认为背景:富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）作为新一代血小板制品,因其制作简单、具有独特三维纤维网状结构、能够携带多种促生长因子、不含富血小板血浆所需的抗凝剂等优点,被用于多种领域。随着PRF的逐步发展,越来越多的研究者专注于如何获得结构更加稳定,使用更加方便,生物学效能更加出色的富血小板纤维蛋白,逐渐衍生出了基于不同相对离心力及离心时间条件下制得的多种PRF。不同的PRF制品所含的生长因子量及多种生物学性能也存在着差异。目的:观察比较不同离心条件下制得的富血小板纤维蛋白在生长因子释放能力、内部纤维蛋白结构、对成纤维细胞生长作用影响、对糖尿病大鼠创面愈合作用的影响。方法:1.富血小板纤维蛋白生物学性能比较:采用心脏采血法获得SD大鼠全血,分别以708 g 12 min、208 g 14 min、208 g 8 min三种离心程序获得富白细胞PRF（L-PRF）、高级PRF（A-PRF）、高级PRF+（A-PRF+）。将其制得到PRF膜片后,置于DMEM/F12培养基中,分别于1 h、6 h、1 d、3 d、5 d收集培养基,采用ELISA法检测培养基中的血小板衍生生长因子（PDGF-AB）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）浓度;使用扫描电镜观察上述不同PRF的内部纤维蛋白网状结构、细胞成分。2.富血小板纤维蛋白对细胞生长的影响:取SD大鼠背部皮肤分离、培养获得皮肤成纤维细胞,将细胞分为L-PRF组、A-PRF组、A-PRF+组、空白组,分别以L-PRF、A-PRF、A-PRF+条件培养基和10%FBS培养基培养,CCK-8细胞增殖实验检测细胞增殖能力、Transwell小室实验检测细胞迁移能力。3.富血小板纤维蛋白对糖尿病大鼠创面愈合作用的观察:选取健康状况良好的SD大鼠注射链脲佐菌素（STZ）制作糖尿病大鼠模型。使用直径1cm的皮肤开孔器在大鼠左右背部皮肤各开一孔,分为空白对照组、L-PRF组、A-PRF组、A-PRF+组,将上述PRF制作方法制得的纤维蛋白置于创面内,观察第5天、第9天、第14天创面愈合情况并测量记录,进行HE染色、苦味酸-天狼星红染色、CD31免疫组化染色。结果:我们发现,以208 g 8 min离心条件制得的A-PRF+拥有更利于生长因子释放的三维环境;ELISA结果表明,A-PRF、A-PRF+培养基目标生长因子总体释放水平高于L-PRF培养基;在细胞实验中,A-PRF+条件培养基在细胞增殖、细胞迁移能力都更为出色;在创面愈合实验中,A-PRF+表现出更为突出的促愈合作用、促进胶原生长及成熟、促新生血管生长的作用。结论:综上所述,以208 g 8 min离心制得的A-PRF+拥有更为出色的三维网状纤维蛋白结构,能够更加有效的促进糖尿病大鼠创面愈合。
芮顺利[2]（2021）在《血小板来源的外泌体对糖尿病创面的治疗及机制研究》文中研究指明第一部分 不同激活剂对PRP分泌的外泌体质量和数量的研究目的:选择最佳的PRP激活剂,以获得高质量的外泌体用于下一步的研究方法:（1）使用不同的激活剂（葡萄糖酸钙,凝血酶或两者共同）激活PRP后,收集PRG,进行HE染色观察纤维蛋白分布,上清通过梯度超速离心法获得外泌体。（2）通过TEM,Nanoflow和Western blot比较和分析不同组间外泌体的数量,质量,体积大小和生长因子含量方面的差异。结果:（1）凝血酶激活PRP速度远远大于葡萄糖酸钙,联合使用凝血酶和葡萄糖酸钙效果优于单一使用激活剂;（2）通过TEM,Nanoflow,Western blot检测确定各组间沉淀物为外泌体;（3）TEM,Nanoflow,Western blot结果表明葡萄糖酸钙和凝血酶混合液可以激活PRP释放最高浓度的外泌体,且外泌体所含生长因子（VEGF,PDGFBB,b FGF,TGF-β）浓度最高。结论:葡萄糖酸钙和凝血酶混合液优于单一激活剂,可以激活PRP释放高浓度和高质量的外泌体。第二部分 血小板来源外泌体对2型糖尿病鼠创面的治疗和机制的研究目的:我们前期研究证实PRP中含有大量生长因子,可促进糖尿病足患者创面愈合,但其机制尚不清楚。研究表明,激活后的血小板会释放大量的外泌体。外泌体在细胞间通信中发挥着重要作用,具有良好的应用前景。本研究旨在研究血小板来源的外泌体对2型糖尿病鼠创面的影响和机制的探究。方法:1.外泌体的分离和鉴定:使用梯度超离心法从PRP中分离外泌体。采用TEM、Nanoflow和WB鉴定外泌体。2.动物实验:采用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠建立全层皮肤创伤模型。将大鼠随机分为对照组和PRP-Exos组,每组10只。PRP-Exos分散注射于创面边缘,对照组注射等量的PBS。观察并评价PRP-Exos对炎症反应和创面愈合的影响。通过HE染色、免疫荧光和免疫组化对组织进行组织学分析。3.细胞学实验:采用HUVECs、HDF进行细胞学分析。通过免疫荧光、CCK8、transwell、tube formation、Western blot分析细胞外泌体摄取、细胞迁移、细胞增殖,并利用信号通路抑制剂来进一步验证外泌体对细胞信号通路的影响。结果:动物实验结果显示,与对照组相比,PRP-Exos能显着促进皮肤创面愈合（p<0.05）。HE染色、Masson染色、免疫组化、免疫荧光结果显示,与对照组相比,PRP-Exos促进了创面愈合,增加了胶原沉积,改善了创面基质构成,同时新生了较多的皮肤附属物,有助于无瘢痕创面的形成。细胞学实验表明,PRP-Exos可刺激HDF和HUVEC的增殖和迁移,且呈剂量依赖性,最佳剂量为50ug/ml。此外,与空白对照组和抑制剂组相比,PRP-Exos处理组显着激活Akt信号通路,促进HDFⅠ型胶原、Ⅲ型胶原生成、抑制α-SMA蛋白的表达（p<0.05）。结论:我们的实验结果表明,血小板源性外泌体可能通过激活Akt信号通路促进糖尿病鼠创面的愈合,同时改善创面重塑,为未来治疗糖尿病创面提供了新的方法。
徐芳芳[3]（2021）在《高盐饮食大鼠血清中THBS1的改变及其在内皮功能损伤中的作用和机制研究》文中认为背景近年来,随着生活水平的提高和生活方式的改变,心脑血管疾病已成为严重危害人类健康的首要危险因素。而高盐饮食是心脑血管疾病的重要危险因素之一。因盐摄入过多,全球每年约有165万人群死于心血管疾病。越来越多的证据表明,高盐饮食会损害血管反应性,周围血管阻力的调节和一氧化氮（Nitric oxide,NO）的合成,其对心血管、脑血管、肾小球毛细血管、肠系膜阻力血管的损伤是近些年的研究热点。血小板反应蛋白（Thrombospondin-1,THBS1）最初被定义为第一个天然抗血管生成剂,近年来发现它也是一个分泌型的多功能糖蛋白。THBS1能够调节血管生成以及细胞的增殖,凋亡,迁移和黏附,参与维持血管系统和体内稳态。在多种生理和病理过程中均发挥重要作用,包括血栓形成,血管生成,肿瘤发生,炎症,细胞凋亡和纤维化。通过与细胞膜表面受体相互作用,THBS1抑制细胞内NO信号,比如抑制内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）的活化和磷酸化,减少NO的生成。NO是血管内皮细胞（Endothelial cell,EC）分泌的重要血管舒张剂,由e NOS催化生成。NO具有多种重要功能,尤其在血管张力的维持,血压的调节和炎症反应的抑制等方面发挥重要作用。钙库操纵钙内流（Store-operated calcium entry,SOCE）是调节EC中钙离子浓度的重要途径。高盐刺激能诱导体内NO生物利用度下降,进而导致EC功能障碍,血管舒张功能减弱。然而,THBS1在高盐饮食诱导的EC功能障碍和血管损害的机制仍未完全阐明。基于以上背景,本课题拟探讨两个研究主题:1.关键蛋白及相关信号通路在高盐饮食对心血管疾病的损伤中的作用及机制;2.THBS1在高盐饮食大鼠内皮功能损伤中的作用及机制。目的1.探讨高盐饮食大鼠血清中关键的差异表达蛋白质（Differentially expressed proteins,DEPs）及其相关信号通路;2.验证高盐饮食诱导的THBS1的表达改变以及其在肠系膜血管内皮细胞（Mesenteric artery endothelial cells,MAECs）对高盐反应中的作用和机制,为高盐饮食引起的血管损伤提供一个新的潜在分子机制。方法1.血清收集对SD大鼠分为两组:对照组（普通饮食组,0.4%Na Cl）和高盐饮食组（4%Na Cl）,喂养4周。无菌条件下,抽取腹主静脉血,分离血清。2.蛋白质标记对照组肽段标记的是同种键标签113、114、115和116,而高盐饮食组为117、118、119和121。3.高p H的HPLC分级通过缓冲液A和缓冲液B（98%ACN,p H 10）形成的线性梯度以700μL/min的流速分离肽。4.液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析由流动相A（0.1%FA,H2O）和流动相B（0.08%FA,80%ACN）形成的线性梯度以600 n L/min的流速分离,随后将分离的肽放入质谱仪中检测。5.数据库检索和生物信息学分析我们使用Proteome Discover软件搜索uniprot-rattus+norvegicus.20180702＿36089.fasta数据库。随后进行基因本体论（Gene ontology,GO）分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）途径分析,以鉴定目标肽段富集的具有显着性统计学差异的信号通路。6.免疫组化和蛋白质免疫印迹实验检测THBS1,eNOS,转化生子因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）,Orai1,Orai2,Orai3的表达。7.肠系膜阻力动脉（Mesenteric resistance artery,MRA）张力测定分别用乙酰胆碱和硝普钠检测MRA内皮依赖性和内皮非依赖性舒张。8.原代MAECs培养和鉴定使用0.2%I型胶原酶消化、提取细胞,随后使用VWF（EC标记性蛋白）对原代培养的细胞进行鉴定。9.原代MAECs转染细胞被转染四种小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）序列,分别是scrambled si RNA,Thbs1 si RNA,Orai1 si RNA和Orai2 si RNA。10.MAECs中NO含量测定使用DAF-FM DA（NO荧光指示剂）检测各组细胞内NO含量,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光强度。11.激光共聚焦检测Smad4入核激光共聚焦显微镜观察Smad4在细胞内的分布情况。12.细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)测定用钙离子成像系统检测原代MAECs的钙库操纵钙内流（SOCE）情况。13.统计分析数据以均值±标准误表示。用Graph Pad Prism（v8.3.0.538）软件制作统计图。双因素方差分析或t检验等统计方法用于分析数据之间的差异。P<0.05被认为有统计学差异。结果1.高盐饮食组和普通饮食组大鼠之间有111种血清蛋白质的浓度存在显着差异:其中65个蛋白质明显上调,46个蛋白质明显下调;THBS1的差异倍数（Fold change,FC）为1.5,即表达显着上调。2.THBS1在高盐饮食大鼠血清和血管内皮中高表达;3.与对照组相比,高盐饮食大鼠的MRA内皮依赖性显着减弱,而对内皮非依赖性舒张无影响;4.高盐诱导MAECs中THBS1表达上调而e NOS表达下调;5.THBS1明显抑制MAECs中e NOS表达和NO生成,以及MRA的内皮依赖性舒张;6.THBS1是高盐环境中e NOS下调的原因;7.TGF-β1活化诱导Smad4入核,导致高盐环境中THBS1表达增多;8.THBS1抑制MAECs中Orai1和Orai2的蛋白表达,以及SOCE的大小,而且Orai1和Orai2的敲低能显着抑制e NOS蛋白表达,NO释放以及SOCE;9.高盐诱导MAECs中Orai1和Orai2表达下调,而对Orai3的蛋白表达无明显影响。结论本研究有效地使用了iTRAQ技术进行蛋白质鉴定和定量,筛选出与血管内皮功能障碍密切相关的蛋白质（比如THBS1）。随后,我们验证了高盐饮食会引起THBS1表达和分泌的升高,并且THBS1的变化与高盐饮食大鼠中内皮依赖性血管舒张功能受损有关。在体外实验,我们进一步证明了THBS1在MAECs对高盐刺激的反应中的重要作用,即通过激活TGF-β1和下游的Smad4入核,高盐上调细胞内THBS1的表达,而THBS1的改变又介导了Orai通道蛋白的表达下调和SOCE减弱,导致eNOS表达和NO生成减少,引起内皮细胞功能障碍。
陈岚[4]（2020）在《医用钛表面纳米结构及功能元素的免疫应答研究》文中研究指明钛及钛合金具有良好的生物相容性和优异的理化性能,是医用植入体的首选材料。临床应用中,植入体仍存在与骨组织结合时间过长及结合不良导致的植入失效。随着研究的不断深入,生物材料引起的宿主固有免疫反应,尤其是巨噬细胞的极化状态（M1和M2型）和炎性分泌功能,会直接影其骨整合效果。生物材料表面改性调控巨噬细胞的免疫学行为,进而促进与骨组织快速的整合,具有重要的科学意义。论文工作以钛材料为基体,采用水热技术构建表面纳米结构薄膜,研究纳米结构对巨噬细胞免疫行为的影响及相关分子生物学机制;采用等离子体浸没离子注入技术在钛表面引入ds区元素铜、锌和银,探查其对巨噬细胞免疫行为的影响,阐述相关分子生物学机制;此外,论文还探究改性材料与巨噬细胞和小鼠骨髓间充质干细胞（m BMSCs,下文简称为干细胞）之间的影响规律和作用机制。论文的主要研究内容和结果有:1.以钛材料为基体,采用水热技术构建不同形貌的纳米结构薄膜。纳米结构薄膜具有相同的物相组成和相似的化学性质,但其表面弹性模量存在显着性差异:样品的表面弹性模量和纳米结构的长径比三次方成反比和纳米簇密度成正比。在细胞力的作用下,不同表面弹性模量的纳米结构发生弯曲变形,并对细胞产生反向作用力。力的大小与纳米结构的表面弹性模量呈正比。纳米结构的拉扯作用,影响巨噬细胞在样品表面的粘附和铺展,并通过FAK-NF-κB信号通路调节巨噬细胞的免疫学反应。2.采用等离子体浸没离子注入（PIII）技术,以钛材料为基体,构建含ds区元素铜、锌和银的表面。注入样品表现出良好的抗菌和抗炎效果,且随着金属价电子数的增加(Cu2+、Zn2+和Ag),样品可促进巨噬细胞产生活性氧（ROS）,激活PGE2信号通路,促进M2型巨噬细胞极化,提高其抗炎效果。另外,巨噬细胞和干细胞通过PGE2的旁分泌作用互相调节,进一步提高样品表面的抗炎效果和促成骨分化作用。3.采用PIII技术,在钛材料表面注入不同含量的银。银注入（Ag-PIII）样品表面Ag NPs和Ti基底可形成微电池对,其数量随着银含量增加而增多,可消耗细菌和细胞膜间隙质子（H+）,一方面,干扰细菌ATP合成,杀死细菌;另一方面,刺激巨噬细胞产生ROS,通过激活PGE2信号通路,促进巨噬细胞朝M2型极化,提高样品的抗炎效果。另外,巨噬细胞和干细胞通过PGE2旁分泌作用互相调节,进一步提高样品表面巨噬细胞的抗炎效果,促进干细胞的成骨分化。
张骏[5]（2020）在《FGF-2慢病毒载体介导的人羊膜间充质干细胞复合兔自体富血小板血浆促进腱—骨愈合的实验研究》文中提出目的:（1）探索不同浓度的FGF-2溶液对人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）向韧带和骨诱导的效果。（2）探究FGF-2慢病毒载体转染后的hAMSCs复合兔自体富血小板血浆（Platelet rich plasma,PRP）促进腱-骨愈合的可行性。方法:（1）通过酶消化法（2次胰酶消化,1次II型胶原酶消化）提取hAMSCs,连续传代培养,显微镜下观察hAMSCs的细胞形态,hAMSCs传至第三代（P3代hAMSCs）可用于后续实验;通过免疫荧光和流式细胞术对P3代hAMSCs进行鉴定。（2）用不同浓度（0,10,20,40 ng/ml）的FGF-2溶液对P3代hAMSCs进行诱导,CCK8法检测不同浓度的FGF-2溶液对hAMSCs增殖的影响;诱导14天后,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同浓度的FGF-2溶液诱导后的hAMSCs韧带和成骨相关基因的表达情况;Western Blot/免疫荧光检测不同浓度的FGF-2溶液诱导后的hAMSCs韧带和成骨相关蛋白的表达;天狼猩红染色检测不同浓度的FGF-2溶液诱导后的hAMSCs胶原表达情况。通过FGF-2慢病毒载体转染P3代hAMSCs,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,qRT-PCR和Western Blot检测病毒的转染效率。（3）通过两次离心法制备兔自体PRP,并用牛凝血酶/Cacl2将PRP激活。（4）制备兔关节外腱-骨愈合模型:用3%戊巴比妥钠对新西兰大白兔进行麻醉（按0.5mL/kg的剂量）,麻醉后进行备皮、消毒铺巾,在左后腿跟骨处向上切开皮肤,充分暴露跟腱,取一约2cm长的跟腱备用。在右侧胫骨上端内侧逐层切开皮肤,充分暴露胫骨上端,距胫骨上端约2cm处用口腔钻钻一直径为2.5mm的骨隧道,将取下的跟腱移植到骨隧道里,跟腱的两端分别留约0.5cm,并将其固定在周围的软组织上,以便术后取材和生物力学检测。跟腱移植到骨隧道固定后分别做以下处理:第一组:未做特殊处理（对照组）;第二组:在骨隧道里注射自体激活的PRP（PRP组）;第三组:将自体PRP与hAMSCs混合并激活后注射到骨隧道里（PRP+hAMSCs组）;第四组:将自体PRP与FGF-2慢病毒载体转染的hAMSCs混合并激活后注射到骨隧道里（PRP+FGF-2-hAMSCs组）。逐层缝合切口,再次消毒,术后连续7天肌肉注青霉素20万U/只预防感染。术后3个月处死动物,取胫骨-移植物复合物进行大体观察、组织学检测（HE染色、番红固绿染色、甲苯胺蓝染色、Masson三色染色、天狼猩红染色）、影像学检测、生物力学检测观察腱-骨愈合情况。结果:（1）原代hAMSCs呈圆形或椭圆形贴壁生长,经过传代培养后逐渐呈涡旋状贴壁生长。免疫荧光结果提示:P3代hAMSCs高表达波形蛋白,不表达Cytokeratin 19（CK19）;流式细胞术结果提示:P3代hAMSCs高表达间充质干细胞的表型分子CD44、CD73、CD90、CD105,几乎不表达CD19、CD34、CD45、CD11B、HLA-DR。（2）不同浓度的FGF-2溶液诱导hAMSCs后,CCK8结果提示:各组细胞增殖均呈S型曲线,10 ng/ml的FGF-2诱导组细胞增殖速度较对照组未见明显变化,而20 ng/ml和40 ng/ml的FGF-2诱导组其增殖能力较对照组明显提高,其中以40ng/ml最为明显。诱导后14天,qRT-PCR结果提示:不同浓度的FGF-2诱导组韧带和成骨相关基因表达明显上调,其中10 ng/ml的FGF-2诱导组韧带和成骨相关基因上调最明显;Western Blot/免疫荧光结果提示:不同浓度的FGF-2诱导组韧带和成骨相关蛋白表达明显上调,其中10 ng/ml的FGF-2诱导组韧带和成骨相关蛋白上调最明显;天狼猩红染色结果提示:各组细胞均可见胶原的分泌,胶原主要围绕着细胞核在细胞浆中分泌,对照组可见少量的胶原分泌,不同浓度的FGF-2诱导组胶原分泌明显高于对照组,其中10 ng/ml的FGF-2诱导组其胶原分泌最大,成网状排列。将FGF-2慢病毒载体以最适感染复数（MOI=50）转染P3代hAMSCs,24h后可见慢病毒转染组和空载质粒组有绿色荧光蛋白的表达,96h后绿色荧光蛋白的表达最强烈且稳定,未转染组在各个时间点均未见绿色荧光蛋白的表达;qRT-PCR和Western Blot结果提示:慢病毒转染组其FGF-2mRNA和蛋白的表达水平明显高于空载质粒组和未转染组（P<0.05）,而空载质粒组和未转染组FGF-2 mRNA和蛋白的表达水平无统计学差异（P>0.05）。（3）将兔耳源静脉血第一次离心后,全血分三层,上层为血浆层、中间层为PRP层、下层为细胞层（红细胞）。将上层的血浆、中间的PRP及下层的细胞上面2mm转移至新的离心管再次离心后,PRP沉积在离心管的底部。将第二次离心后上面3/4的血浆去掉,保留下面1/4的PRP。此时的PRP是液体状,其内的各种生长因子含量少且活性较低。加入激活剂后（牛凝血酶/Cacl2）,可将活性较低的PRP激活,使其由液体状变为凝胶状,此时的PRP具有较强的生物学活性,其内的大量生长因子被激活。（4）术后3个月,对照组移植物与骨隧道之间可见明显的间隙,并且骨隧道周围能够见到异常增生的组织;PRP组和PRP+hAMSCs组移植物和骨隧道之间的间隙较对照组有逐渐缩窄的趋势,但是其骨隧道周围组织的颜色和光泽较正常组织有明显的差别;PRP+FGF-2-hAMSCs组移植物和骨隧道之间的间隙几乎消失,骨隧道周围的色泽接近于正常的组织。组织学检测结果提示:PRP+FGF-2-hAMSCs组移植物和骨隧道之间几乎看不到间隙,无炎性细胞的存在,可见新生的纤维软骨,并且还可以看到大量排列整齐的胶原纤维,其腱-骨愈合情况优于其他各组。影像学结果提示:各组骨隧道均可见新生骨痂的形成,PRP+FGF-2-hAMSCs组其骨隧道直径较其他各组均明显降低。生物力学检测结果提示:PRP+FGF-2-hAMSCs组其力学强度明显高于其他各组。结论:（1）成功分离培养hAMSCs。（2）通过两次离心法成功制备了兔自体PRP。（3）FGF-2慢病毒载体介导的hAMSCs复合兔自体PRP能够促进兔腱-骨愈合。
张昭远[6]（2020）在《定制化富血小板血浆及其在肌腱病修复中的应用》文中认为目的:优化富白细胞富血小板血浆（L-PRP）和纯富血小板血浆（P-PRP）的离心方案,并观察通过不同血小板膜受体选择性激活的富血小板血浆释放的生长因子对肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、分化的影响,初步探究其机制。方法:取76例志愿者外周血样（45 mL）与5mL输血用枸橼酸钠注射液混匀,采用两次离心法制备L-PRP。计算并比较实验组A（12例,400×g、10 min,1100×g、10 min）、实验组B（27例,800×g、10min,1100×g、10 min）及对照组（37例,1360×g、10 min,1360×g、10 min）离心方案的L-PRP血小板富集系数及回收率和白细胞富集系数。将此离心方案应用于大鼠PRP的制备,计算大鼠PRP的血小板富集系数及回收率。探索并调整P-PRP的第一次离心及第二次离心的离心力及离心时间,并取28例志愿者外周血（45 mL+5mL输血用枸橼酸钠注射液）验证研究过程中获得的最适宜的P-PRP的离心条件:260g、10min,360g、15min。大鼠肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞在37℃、5%CO2环境下分别加入由TFLLR-NH2（PAR-1组）、AYPGK-NH2（PAR-4组）和凝血酶（凝血酶组）激活PRP后离心提取的上清液。通过细胞增殖实验检测各组肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖能力;通过细胞迁移试验观察各组肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞的迁移能力;通过q PCR检测各组肌腱干细胞干性（Oct-4、Nanog）和分化（腱系分化:Scx;非腱系分化:PPARγ、Sox9、Collagen II、Runx2、Collagen Iα1、DCN、TNC）相关基因的表达水平。通过油红O、茜素红S染色,观察各组肌腱干细胞成脂、成骨的分化情况。结果:剔除异常血样后（血小板回收率高于100%或出现白色血栓）,剩余55例纳入统计分析,其中实验组A 10例,实验组B 21例,对照组24例。实验组B血小板富集系数和血小板回收率显着高于实验组A和对照组,差异有统计学意义;实验组A和对照组的组间比较差异无统计学意义。实验组A、B和对照组的白细胞富集系数差异没有统计学意义。260g、10min,360g、15min条件下制备的P-PRP,血小板回收率为52.30±15.72%,血小板富集系数为5.230±1.572,白细胞富集系数为1.145±0.650。与凝血酶组相比,PAR-1组对肌腱干细胞进而血管内皮细胞的增殖和迁移有显着地促进作用,而PAR-4的作用则正相反;4天后,各组的肌腱干细胞的增殖趋势减弱。通过PAR1激活的PRP对促进肌腱干细胞成脂、成软骨分化的趋势明显,且成脂分化的趋势在较早期（7天）即可表现出来;通过PAR4激活的PRP具有较强的保持肌腱干细胞干性的作用;同时,凝血酶激活的PRP也可表现出抑制肌腱干细胞正常分化的趋势。并且,14天后,PAR1组的肌腱干细胞的油红O染色呈阳性。结论:两次离心法（800×g、10 min,1100×g、10 min）是一种较为理想且可行的L-PRP制备方案;两次离心法（260×g、10 min,360×g、15 min）是一种较为理想且可行的P-PRP制备方案。在肌腱损伤后的24-48小时（早期）,可以注射通过PAR1受体选择性激活血小板的PRP,以促进血管增生和肌腱干细胞增殖、迁移;在肌腱损伤后5-6周（晚期）,可以注射通过PAR4受体选择性激活血小板的PRP,可抑制血管增生并抑制肌腱干细胞分化,避免肌腱病的发生。
刘建疆[7]（2020）在《皮瓣术后即刻注射PRP对SD大鼠狭长窄蒂皮瓣成活的影响》文中指出目的 探索皮瓣术后即刻注射PRP对SD大鼠狭长窄蒂皮瓣成活的影响。方法 36只SD雄性大鼠被随机分组,设立PRP组、PPP组和对照组,每组12只。每组大鼠静脉采血6ml,分别检测血小板计数值,PRP组和PPP组血样分别采取Landersberg法制备PRP和PPP,制作产品分别再次进行血小板计数分析。大鼠背部建立狭长窄蒂皮瓣的动物模型,皮瓣原位移植后PRP组皮瓣内注射PRP,PPP组注射同体积PPP,对照组大鼠注射等量氯化钙溶液,术后即刻、1d、3d、5d、.7d切取皮瓣远端部分组织,均分为两份,一份行HE染色、CD34及TGF-βR免疫组化分析,另一份存放-80℃冰箱,ELISA试验测定皮瓣组织中CD34含量。术后7d计算皮瓣成活率,对不同时间皮瓣内MVD及TGF-βR半定量分析,术后7d心脏采血6ml后处死所有大鼠,ELISA法测定各组大鼠全血中TGF-β1及VEGF的浓度。所得数值进行统计学分析。结果三组大鼠血小板计数差异无意义（F=1.032,P>0.05）,PRP及PPP制备前后血样中血小板计数经配对t检验,差异有意义（t=282.56,t=38.84,P<0.05）。术后 7d 皮瓣成活率分别为（86.67±2.80）%、（64.17±3.79）%、（61.75±2.60）%,差异有意义（F=234.70,P<0.05）。MVD值、CD34及TGF-βR定量分析得出,在三组皮瓣中,二者均呈现先增高至峰值后又回落的趋势,TGF-βR术后三天到达高峰,CD34及MVD值5d达到达峰值。与PPP及对照组相比,在不同时间点,MVD、TGF-βR及CD34定量分析PRP组均明显增高,差异有意义,PPP组与对照组之间差异无意义。术后7d血TGF-β1及VEGF表达,PRP组仍然呈现显着差异,另外两组差异无意义。结论 PRP可通过促进内源性TGF-β和VEGF的表达,诱导血管新生,加快伤口愈合,促进狭长窄蒂皮瓣的成活。
李园媛[8]（2020）在《水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究》文中认为目的:通过水提法制备水蛭提取液,分别采用凝血酶间接检测提取液中水蛭素含量（根据2015版药典）和高分辨液质联用QE技术检测提取液成分,以确定水蛭提取液的主要成分。通过观察水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma RB）WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响,验证水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞生长和侵袭的作用。通过水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor VEGF）、缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a HIF-1a）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9 MMP-9）的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（Phosphatidylinositol 3kinase/Protein Kinae B PI3K/AKT）通路的影响,阐明水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞可能的分子机制。通过观察水蛭提取液对人脐静脉内皮细胞（Human Vascular endothelial cells HUVEC）的活性影响及表达VEGF和血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 VEGFR2）的影响,以此来研究水蛭提取液抑制肿瘤血管生成的潜能。方法:1.水蛭提取液的制备和检测:水提法制备水蛭提取液,并利用凝血酶间接测定水蛭素的含量;高分辨液质联用-QE技术分析水蛭的主要成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 将WERI-RB-1细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 以0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响; 以2个实验浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞凋亡的影响; transwell侵袭实验检测2个实验浓度对WERI-RB-1细胞侵袭作用的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Elisa实验检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,RT-PCR检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a和MMP-9 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Western Blot检测蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a、MMP-9、PI3K、人磷酸化AKT蛋白（Human phosphorylated AKT protein p-AKT）蛋白含量的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 将HUVEC细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,RT-PCR检测水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,Western Blot检测蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2蛋白含量的影响。结果:1.水蛭提取液的制备和检测:根据2015版《中华药典》中使用凝血酶测定水蛭提取液中水蛭素的浓度,经过多次反复提取及测定,水蛭提取液中水蛭素浓度保持相对稳定。高分辨液质联用分析仪-QE分析结果表明:水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 0.04U/ml、0.08U/ml的水蛭提取液组在48h对RB细胞的抑制率分别是9.70%、9.92%,与对照组比较,差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 实验组药物浓度干预的RB细胞主要阻滞在G2/M期。对照组、0.04U/ml水蛭提取液组、0.08U/ml水蛭提取液组处于G2/M期的阳性细胞率（%）分别为3.00±2.32、12.59±5.36、14.79±4.12（对照组与水蛭提取液组比较,P<0.01）。 实验组水蛭提取液浓度均可诱导RB细胞凋亡率上调,以上3组细胞凋亡率依次分别为4.64±2.56、37.91±3.44、33.05±2.25（与对照组比较,P<0.01）。 实验组Transwell下室中移行的、每高倍视野细胞数目均较对照组显着减少,3组检测结果（OD值）依次分别为1.21±4.36、0.44±2.08、0.53±3.42（与对照组比较,P<0.01）。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: Elisa实验结果显示:与对照组比较,0.04U/ml和0.08U/ml2个水蛭提取液浓度培养基上清中VEGF的表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,HIF-1a和MMP-9 m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 0.04U/ml和0.08U/ml水蛭提取液干预WERI-RB-1细胞48h后,细胞的抑制率分别为12.96±1.59、14.81±2.17,与对照组比较差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.水提法提取的水蛭提取液中水蛭素含量相对稳定。水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液通过抑制WERI-RB-1活性、引起周期阻滞、诱导细胞凋亡、抑制细胞侵袭等作用对视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞发挥抑制作用。3.水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞,同时抑制WERI-RB-1细胞中HIF-1a、MMP-9活性。4.水蛭提取液可抑制HUVEC细胞活性,抑制HUVEC细胞表达VEGF、VEGFR2蛋白活性。综上所述,在体外实验中,水蛭提取液在一定程度上可能通过VEGF/PI3K/AKT通路和HIF-1a、MMP-9因子影响WERI-RB-1细胞周期分布、凋亡、侵袭作用,从而发挥抑制RB的作用。同时发现水蛭提取液可能通过抑制VEGF、VEGFR2表达抑制脐静脉内皮细胞。我们的研究结果表明:水蛭提取液对RB细胞具有抑制作用,同时可能对RB血管也有抑制作用。从中医理论上进一步验证了其活血化瘀、其破血消瘕的作用。以上研究结果为开发新型抗肿瘤制剂水蛭提供了一定的临床前研究资料。
洪磊[9]（2020）在《Sema7A调控内皮细胞间质化的机制研究》文中认为在胚胎发育和疾病的发生发展过程中,血管内皮细胞可以发生表型的转变,表现为内皮细胞丢失部分自身的特征,同时获得部分其它细胞特有的表型,例如内皮细胞向平滑肌细胞,成纤维细胞等间质细胞转化,称为内皮细胞间质化（endothelial to mesenchymal transition End MT）。在内皮细胞发生间质化转变的过程中,内皮细胞特异性的标记物例如:血小板内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1 PECAM-1/CD31）,血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cell cadherin VE-Cadherin）表达减弱,间质细胞的标记物例如:平滑肌细胞肌动蛋白-α（alpha-smooth muscle actinα-SMA）,成纤维细胞特异性蛋白（fibroblast-specific protein-1 FSP-1）表达增高。胚胎时期End MT参与组织的生长发育例如:在房室管,心脏瓣膜发育过程中,内皮细胞通过间质化转变形成心脏瓣膜组织。成年后End MT在慢性纤维化过程中发挥着重要的作用,例如心肌纤维化,肾纤维化以及系统性硬化。由内皮细胞间质化转变形成的细胞其生物学特性及功能与正常间质细胞亦有差异。间质化转变而来的细胞分泌细胞外基质功能较强,更容易引起组织纤维化。例如在肺纤维化和肾纤维化过程中间质化转变的内皮细胞分泌细胞外基质以及基质金属蛋白酶的平衡被打破,最终导致组织纤维化。在心血管疾病中,End MT参与了动脉粥样硬化的形成,同时与斑块的不稳定性有关。另外,End MT引起肺动脉管壁重塑导致肺动脉高压。由于End MT是多种疾病的病理基础,寻找引起内皮细胞间质化转变的关键分子对于相关疾病的诊断和治疗具有重要的意义。轴突导向因子家族（Semaphorin）包括一大类分泌性和膜相关性蛋白,最早在免疫细胞中被发现,通过与细胞膜表面受体（plexins以及neuropilins）结合参与神经信号传导。最近发现除了参与神经信号传导,轴突导向因子家族成员还与多种疾病的病理生理改变有关例如:动脉粥样硬化,血管炎症性疾病。Semaphorin7A（Sema7A）与牛痘病毒A39R在序列上有高度同源性,其主要通过与膜受体plexin以及整合素（integrin）结合发挥生物学功能。据报道,Sema7A参与调节嗅觉突触形成,肺纤维化,多发性硬化,T细胞介导的炎症反应以及乳腺癌的发生发展。我们实验室最近报道了Sema7A通过诱导白细胞浸润,单核巨噬细胞粘附,血小板激活以及血管新生而促进动脉粥样硬化斑块的形成。Sema7A可以通过诱导上皮细胞间质化转变促进口腔鳞状细胞癌转移,但是Sema7A在内皮细胞间质化转变中的作用及其机制尚未见报道。本课题提出假说:Sema7A通过TGF/Smad信号通路诱导内皮细胞间质化改变。本研究分为以下五部分:第一部分Semaphorin 7A对内皮细胞功能的影响及在表型转化中的作用目的:探讨Semaphorin 7A在内皮细胞中的功能,以及在细胞表型转化中的作用。方法:我们首先通过慢病毒将Sema7A过表达的质粒转染人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells HUVECs）,构建Sema7A-HUVECs细胞系。再通过高通量测序分析Sema7A过表达后,HUVECs基因表达的改变。结合KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG）数据库,分析Sema7A过表达后,哪些信号通路被激活。通过Gene ontology（GO）富集分析,了解Sema7A过表达后内皮细胞的功能改变。利用显微镜观察Sema7A过表达后细胞形态的变化。鉴于CD31是内皮细胞特异性标志物,我们通过流式细胞术检测Sema7A-HUVECs和转染空白载体的对照组Con335-HUVECs细胞膜表面CD31表达的变化。为了进一步验证Sema7A-HUVECs是否发生表型转变,我们通过实时定量聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction q-PCR）和免疫印迹试验（Western-blot）分别在RNA以及蛋白水平对细胞表面标记物进行检测。结果:正常HUVECs中Sema7A几乎不表达,Sema7A过表达质粒转染后Sema7A表达明显增高。与对照组Con335-HUVECs相比,Sema7A过表达引起1168个基因上调,886个基因下调。其中大多数与End MT以及间质细胞相关的基因在Sema7A-HUVECs中表达增高,内皮细胞相关基因表达降低。镜下:对照组Con335-HUVECs细胞呈椭圆形,分布规律,呈铺路石样排列,Sema7A-HUVECs中部分细胞形态变为细长,触角较多,排列紊乱。流式细胞检测发现Sema7A-HUVECs中CD31+的细胞比例（45.64±2.76%）较Con335-HUVECs（87.48±0.36%）减少约48%。同时q-PCR及Western-blot检测发现Sema7A-HUVECs中CD31,VE-cadherin表达降低,α-SMA,FSP-1表达升高。结论:正常内皮细胞中Sema7A表达量低,Sema7A与内皮细胞的炎症反应,应激刺激,表型转化等改变有关,Sema7A过表达促进内皮细胞间质化转变。第二部分TGF-β2以及TGF/Smad信号通路在Sema7A调节End MT中的机制研究目的:探讨TGF-β2以及TGF/Smad信号通路在Sema7A引起内皮细胞间质化转变中的作用。方法:通过q-PCR检测TGF-β2在Sema7A-HUVECs以及Con335-HUVECs中表达量,利用ELISA检测细胞上清液中TGF-β2浓度。利用基因富集对测序数据进行分析,寻找Sema7A-HUVECs中激活的信号通路。通过检测Smad3蛋白磷酸化水平（pSmad3）来验证TGF/Smad信号通路的变化。最后利用TGF-β2中和抗体T4442以及TGF-β/Smad信号通路阻断剂Oxymatrine,抑制TGF-β2及TGF-β/Smad信号通路在Sema7A-HUVECs中的作用,验证TGF-β2以及TGF-β/Smad信号通路在Sema7A引起内皮细胞间质化过程中的作用。结果:通过q-PCR和ELISA,我们发现了Sema7A过表达后TGF-β2表达增高,与高通量测序结果一致。基因集合富集分析（Gene set enrichment analysis GSEA）显示Sema7A-HUVECs中TGF-β/Smad通路被激活。Smad3磷酸化是TGF-β/Smad信号通路激活的特异性指标,Western-blot结果显示Sema7A过表达后Smad3蛋白发生磷酸化改变,提示TGF-β/Smad通路的活化。相反TGF-β/Smad信号通路阻断剂Oxymatrine以及TGF-β2中和抗体T4442都可以降低Sema7A-HUVECs中Smad3磷酸化水平,提示TGF-β2是Smad3的上游基因。进一步研究发现Oxymatrine以及T4442可以上调Sema7A-HUVECs中CD31表达,降低α-SMA表达,即抑制TGF-β2以及TGF-β/Smad可以减弱Sema7A过表达引起的End MT。结论:TGF-β2以及TGF-β/Smad信号通路在Sema7A引起内皮细胞间质化转变中发挥着关键的作用。第三部分ATF3介导Sema7A以及TGF-β2的机制研究目的:探讨ATF3在Sema7A引起End MT中的作用及分子机制,方法:结合RNA测序数据,我们推测ATF3与Sema7A引起的End MT有关。于是我们分别通过q-PCR,Western-blot在Sema7A-HUVECs中鉴定ATF3表达的变化。通过Chip以及荧光素酶报告基因实验探讨了ATF3与TGF-β2之间的相互作用。最后利用ATF3干扰RNA-ATF3-si RNA,验证ATF3在Sema7A引起End MT中的作用。结果:除了TGF-β2,RNA测序结果显示在Sema7A-HUVECs中ATF3同样明显升高。通过q-PCR以及Western-blot我们验证了Sema7A-HUVECs中ATF3表达的增高。为了探讨ATF3是否能通过TGF-β2调节End MT,我们首先将ATF3-si RNA转入Sema7A-HUVECs,结果显示TGF-β2 RNA以及细胞培养上清液中TGF-β2表达均降低。提示ATF3参与调节TGF-β2的表达。进一步通过Chip-PCR实验利用ATF3抗体沉淀Sema7A-HUVECs DNA片段,结果显示:在ATF3抗体/Sema7A-HUVECs DNA沉淀复合物中可见TGF-β2片段,且与Con335-HUVECs相比,在Sema7AHUVECs中ATF3抗体结合的TGF-β2片段占总体TGF-β2片段的比例增加。荧光素酶报告基因实验显示:转染ATF3过表达质粒促进TGF-β2启动子区的报告基因的荧光强度,而当启动子区域6个碱基突变后,这种改变消失,提示ATF3与TGF-β2的启动子区域相结合,促进其转录。同时我们观察到ATF3过表达并不能上调Sema7AHUVECs中TGF-β1的表达。接着我们探讨了ATF3是否参与Sema7A过表达引起的End MT,通过转染ATF3-si RNA进入Sema7A-HUVECs,我们发现Smad3磷酸化水平降低,提示TGF-β/Smad信号通路被抑制。同样抑制ATF3后CD31表达上调,α-SMA表达下调,提示抑制ATF3后Sema7A过表达引起的End MT减弱。结论:Sema7A过表达上调ATF3,ATF3通过结合在TGF-β2启动子上,促进TGF-β2转录。Sema7A促进ATF3与TGF-β2相结合,最终通过TGF/Smad信号通路诱导End MT。第四部分Integrin-β1在Sema7A诱导End MT中的作用探讨目的:探讨integrin-β1在Sema7A过表达引起End MT中的作用。方法:Integrin-β1是Sema7A在内皮细胞上的受体之一。我们实验室之前报道了,Sema7A通过结合integrin-β1调节内皮细胞功能。我们利用integrin-β1的中和抗体P5D2阻断integrin-β1在Sema7A-HUVECs中的作用后,检测ATF3,TGF-β2以及End MT改变。进一步,我们设计了rescue实验来验证ATF3介导Sema7A/integrin-β1与TGF-β2/Smad之间的信号传导以及End MT。我们通过转染ATF3过表达的质粒进入提前孵育P5D2的Sema7A-HUVECs,来观察内皮细胞表型改变。结果:阻断integrin-β1后,Sema7A-HUVECs中ATF3,TGF-β2以及Smad3磷酸化水平降低。同时CD31表达升高,α-SMA表达降低提示间质化转变减弱。另一方面,ATF3过表达可以逆转由于integrin-β1阻断所引起的TGF-β2以及End MT的减弱,表现为CD31降低,α-SMA表达增高。结论:Sema7A通过integrin-β1-ATF3-TGF-β2引起内皮细胞间质化转变。第五部分Sema7A在扰动流引起的内皮细胞间质化中的作用目的:前期实验发现,颈部动脉部分结扎（partial carotid artery ligation PCL）引起的扰动流（disturb flow d-flow）可以上调内皮细胞Sema7A表达,我们利用Sema7A基因敲除的小鼠,以及PCL模型在体内研究Sema7A在End MT中的作用。方法:首先通过颈动脉部分结扎建立颈部血管扰动流的模型,再利用免疫荧光染色在Sema7A+/+以及Sema7A-/-小鼠颈动脉内膜中检测内皮细胞特异性标记物以及间质细胞特异性标记物的表达。结果:在野生型小鼠PCL模型的颈动脉内膜中,可见CD31/α-SMA,CD31/FSP-1以及VWF/α-SMA共表达的细胞,且CD31,VWF信号连续性中断,表达减弱,提示扰动流诱导血管内膜End MT。而在Sema7A敲除的小鼠中这种共表达的细胞几乎见不到,且相对于野生型小鼠,Sema7A-/-小鼠扰动流处血管内膜CD31表达增高。结论:PCL诱导的扰动流促进血管内皮细胞发生间质化改变,Sema7A参与扰动流引起的End MT。
郑淼[10]（2020）在《基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证糖尿病黄斑水肿的影响和中药水蛭抑制NIH3T3细胞增殖及分子机制》文中认为目的基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证DME黄斑区微血管的影响,同时探究中药水蛭对成纤维细胞增殖的影响及相关机制。方法1.对照、横断面、观察性研究,收集2017.3-2019.3就诊于成都中医药大学附属医院眼科,明确诊断为中重度非增殖期糖尿病性视网膜病变（Non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR）患者75例,其中包括确诊为有临床意义的DME患者36例（36眼）,无DME的NPDR患者39例（39眼）,同期招募健康对照组38例（38眼）。所有观察者均采用国际标准视力表检查最佳矫正视力（Best corrected visual acuity,BCVA）,OCT检查黄斑中心凹厚度（Central mcular thickness,CMT）,OCTA检查中央凹无血管区（Area of the foveal avascular zone,FAZ）面积、黄斑区血管密度（Vessel density,VD）、微血管瘤（Microaneurysms,MAs）个数,并对DR患者进行中医分型研究。2.随机、单盲、前瞻性研究,收集2017.3-2019.3就诊于成都中医药大学附属医院眼科,明确诊断为具有临床意义的DME,中医辨证为阴阳两虚证患者65例,其中包括激光组25例（25眼）,糖网化瘀合剂组19例（19眼）,联合治疗组21例（21眼）,所有患者均于基线和治疗后一个月、三个月、六个月采用国际标准视力表检查BCVA、OCT检查CMT、OCTA检查FAZ面积和黄斑区VD。同期收集具有临床意义的DME阴阳两虚证患者15例,连续服用糖网化瘀合剂15天,分别于服药前和服药后当天行热断层扫描（Thermal texture maps,TTM）检查,研究服药前后双侧眼部热值差值（△T）和头面部不同区位平均热值变化情况。3.体外研究,运用CCK-8、细胞计数法筛选抑制小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3 cells,NIH3T3）增殖的作用药物及作用浓度、作用时间;运用CCK-8、细胞计数、Edu染色法检测中药水蛭对NIH3T3细胞增殖的影响;TUNEL染色检测中药水蛭对NIH3T3细胞凋亡的影响;RT-PCR和Western blot检测中药水蛭对p38MAPK和caspase-3通路相关因子基因和蛋白相对表达影响。结果1.OCTA评估DME黄斑血流灌注（1）.一般情况:所有受试者（平均年龄59.413±2.721岁）,所有患者均为2型糖尿病（糖尿病病程8.8±0.57年;Hb A1c 7.744±1.241%）。（2）.FAZ面积:DME组浅层毛细血管复合丛（Superficial vascular complex,SVC）FAZ面积为（0.55±0.11 mm2）,深层毛细血管复合丛（Deep vascular complex,DVC）FAZ面积为（0.61±0.26 mm2）。与对照组和无DME的NPDR组相比,DME组SVC层FAZ面积扩大（p=0.000***,p=0.009**）,DVC层FAZ面积扩大（p=0.000***,p=0.043*）。与SVC层相比,无DME的NPDR组DVC层FAZ面积扩大（p=0.041#）;DME组和健康对照组DVC层FAZ面积无明显变化（p>0.05）。（3）.黄斑区VD:DME组SVC层黄斑区VD为（46.88±5.41%）,DVC层黄斑区VD为（45.75±6.42%）。与对照组和无DME的NPDR组相比,DME组SVC层黄斑区VD降低（p=0.001**,p=0.032*）,DVC层黄斑区VD降低（p=0.000***,p=0.006**）。与SVC层相比,DME组和无DME的NPDR组DVC层黄斑区VD降低（p=0.019#,p=0.037#）。（4）.MAs个数:DME组SVC层黄斑区MAs个数为（4.21±0.04个）,DVC层黄斑区VD为（8.28±2.61个）。与对照组和无DME的NPDR组相比,DME组SVC层MAs个数增多（p=0.001**,p=0.012*）,DME组DVC层MAs个数增多（p=0.000***,p=0.047*）。与SVC相比,DME组和无DME的NPDR组DVC层MAs个数增多（p=0.027#,p=0.001##）。（5）.中医证型:DME组中阴阳两虚证（44.44%）患者所占比例最高（p=0.007**）。2.基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证糖尿病性黄斑水肿的黄斑区微血管影响（1）.一般情况:所有患者均为2型糖尿病（平均年龄58.036±9.448岁;糖尿病病程8.782±0.582年;Hb A1c 6.918±0.857%）。（2）.FAZ面积:糖网化瘀合剂组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月FAZ面积（mm2）与基线相比,无明显改变（p=0.795,p=0.847,p=0.636）;联合治疗组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月FAZ面积（mm2）与基线相比,无明显改变（p=074,p=0.761,p=0.516）。（3）.黄斑区VD:糖网化瘀合剂组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月黄斑区VD（%）与基线相比,无明显改变（p=0.335,p=0.184,p=0.276）;联合治疗组治疗后一月、治疗后三月、治疗后六月黄斑区VD（%）与基线相比,无明显改变（p=814,p=0.177,p=0.509）。（4）.BCVA:糖网化瘀合剂组治疗后一个月,BCVA较基线改善（p=0.037*）,激光组和联合治疗组无明显改变（p=0.079,p=0.724）;治疗后三个月和六个月,三组BCVA（Log MAR VA）较基线均改善（p<0.05）。（5）.CMT:糖网化瘀合剂组治疗后一个月,CMT较基线下降（p=0.030*）,激光组CMT较基线升高（p=0.042*）,联合治疗组无明显改变（p=0.275）;治疗后三个月和六个月,三组CMT较基线均降低（p<0.05）。（6）.TTM:DME阴阳两虚证患者服用糖网化瘀合剂后双侧眼部热值差值（△T）下降（p=0.001**）,前额、面部、头后上部的温度增加（p=0.031*,p=0.001**,p=0.047*）。3.中药水蛭抑制成纤维细胞增殖及分子机制研究（1）.实验条件筛选:筛选0.006U/ml的中药水蛭作为干预药物及浓度,5天作为药物作用时间。（2）.细胞增殖检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,NIH3T3细胞数量减少（p=0.003**）,吸光度下降（p=0.006**）;Edu阳性细胞染色率降低（p=0.007**）。（3）.细胞凋亡检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,TUNEL阳性细胞染色率升高（p=0.004**）。（4）.p38MAPK通路检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,NIH3T3细胞TGF-β（p=0.030*）、TAK1（p=0.020*）、p38（p=0.000***）基因相对表达下降,TGF-β（p=0.003**）、TAK1（p=0.005**）、p38（p=0.000***）、p-p38（p=0.000***）蛋白相对表达下降。（5）.caspase-3相关通路检测:0.006U/ml中药水蛭干预5天后,caspase-3基因相对表达上调（p=0.043*）;caspase-3蛋白相对表达上调（p=0.000***）。结论1、基于OCTA结果显示DME患者黄斑区微血管结构改变,血流灌注降低。2、基于OCTA结果显示在观察期内糖网化瘀合剂可以维持阴阳两虚证糖尿病黄斑水肿患者的黄斑区微血管结构和血流灌注。3、中药水蛭能够抑制小鼠胚胎成纤维细胞增殖,其机制可能与抑制TGF-β/TAK1/p38MAPK通路活性有关,为中药水蛭进一步开发应用于抗PDR纤维化提供实验依据。
二、凝血酶受体激活肽和凝血酶对人成纤维细胞释放TGF-β和VEGF的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凝血酶受体激活肽和凝血酶对人成纤维细胞释放TGF-β和VEGF的影响（论文提纲范文）
（1）不同离心条件所制富血小板纤维蛋白对糖尿病大鼠创面愈合作用比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不同离心条件的富血小板纤维蛋白制作 |
| 2.2.3 利用扫描电镜观察富血小板纤维蛋白空间结构结构 |
| 2.2.4 富血小板纤维蛋白析出液中生长因子PDGF-AB、TGF-β、VEGF浓度测定 |
| 2.2.5 成纤维细胞的分离与培养 |
| 2.2.6 成纤维细胞的鉴定 |
| 2.2.7 细胞增殖能力检测 |
| 2.2.8 细胞迁移能力检测 |
| 2.2.9 糖尿病大鼠创面模型建立 |
| 2.2.10 组织病理标本染色 |
| 2.2.11 CD31组化染色 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 富血小板纤维蛋白制得 |
| 3.2 扫描电镜结果 |
| 3.3 PRF条件培养基中多种生长因子检测情况 |
| 3.4 成纤维细胞培养与鉴定表现 |
| 3.5 细胞增殖能力比较 |
| 3.6 细胞迁移能力比较 |
| 3.7 创面愈合作用观察 |
| 3.8 组织病理学染色结果 |
| 3.8.1 HE染色 |
| 3.8.2 苦味酸-天狼星红染色 |
| 3.9 免疫组化染色结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 主要英中术语(缩略语)对照表 |
| 综述 富血小板纤维蛋白的发展及其在整形外科中的应用 |
| 参考文献 |
（2）血小板来源的外泌体对糖尿病创面的治疗及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 不同激活剂对PRP分泌的外泌体质和量的研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 血小板来源外泌体促进2型糖尿病大鼠皮肤创面的愈合 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 外泌体在皮肤创面愈合的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文与参加的重要学术会议 |
（3）高盐饮食大鼠血清中THBS1的改变及其在内皮功能损伤中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究一 基于iTRAQ技术分析高盐饮食大鼠血清蛋白组学变化 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 研究二 THBS1在高盐饮食大鼠内皮功能损伤中的作用及机制研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 全文总结 |
| 下一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 钙库操纵钙内流在心血管疾病和肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）医用钛表面纳米结构及功能元素的免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 宿主对生物材料的免疫反应 |
| 1.2.1 宿主对生物材料的非特异性免疫反应 |
| 1.2.2 宿主对生物材料的特异性免疫反应 |
| 1.3 材料表面免疫调节设计 |
| 1.3.1 材料表面主动改性调节免疫 |
| 1.3.2 材料表面被动改性调节免疫 |
| 1.4 医用钛材料 |
| 1.4.1 医用钛材料的基本性质 |
| 1.4.2 医用钛材料的生物学应用及存在的问题 |
| 1.4.3 生物医用钛材料的表面改性 |
| 1.5 论文的研究目的和内容 |
| 第2章 钛表面纳米结构对免疫学行为的调控 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验内容和方法 |
| 2.2.1 样品制备 |
| 2.2.2 表面形貌和成分表征 |
| 2.2.3 物化性能表征 |
| 2.2.4 体外免疫学性能评价 |
| 2.2.5 动物实验 |
| 2.2.6 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果和讨论 |
| 2.3.1 纳米结构的形貌和组成 |
| 2.3.2 纳米结构的理化性能 |
| 2.3.3 纳米结构样品对免疫反应的调控 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 钛表面ds区元素掺杂及其免疫和成骨性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法和内容 |
| 3.2.1 样品制备 |
| 3.2.2 表面形貌和成分表征 |
| 3.2.3 物化性能表征 |
| 3.2.4 抗菌行为测试 |
| 3.2.5 体外免疫学性能评价 |
| 3.2.6 体外成骨活性评价 |
| 3.2.7 体外共培养实验 |
| 3.2.8 动物实验 |
| 3.2.9 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果和讨论 |
| 3.3.1 样品表面形貌和组成 |
| 3.3.2 样品的理化性能 |
| 3.3.3 样品的抗菌性能 |
| 3.3.4 体外免疫学性能评价 |
| 3.3.5 体外成骨活性评价 |
| 3.3.6 动物实验 |
| 3.3.7 PGE2相关信号通路的研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 钛表面银含量对免疫和成骨性能的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法和内容 |
| 4.2.1 样品制备 |
| 4.2.2 表面形貌和成分表征 |
| 4.2.3 物化性能表征 |
| 4.2.4 抗菌行为测试 |
| 4.2.5 体外免疫学性能评价 |
| 4.2.6 体外成骨活性评价 |
| 4.2.7 体外共培养实验 |
| 4.2.8 动物实验 |
| 4.3 实验结果和讨论 |
| 4.3.1 样品表面形貌和组成 |
| 4.3.2 样品的理化性能 |
| 4.3.3 样品的抗菌性能 |
| 4.3.4 体外免疫学性能评价 |
| 4.3.5 体外成骨活性评价 |
| 4.3.6 动物实验 |
| 4.3.7 PGE2相关信号通路的研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 全文总结和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）FGF-2慢病毒载体介导的人羊膜间充质干细胞复合兔自体富血小板血浆促进腱—骨愈合的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人羊膜间充质干细胞的分离培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 不同浓度的FGF-2溶液诱导人羊膜间充质干细胞及FGF-2慢病毒载体转染人羊膜间充质干细胞 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 富血小板血浆的制备及激活 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 FGF-2慢病毒载体介导的人羊膜间充质干细胞复合兔自体富血小板血浆促进腱-骨愈合 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）定制化富血小板血浆及其在肌腱病修复中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 应用不同离心条件优化富血小板血浆制作方案研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 PRP制备方法 |
| 2.1.4 观测指标 |
| 2.1.5 统计学方法 |
| 2.1.6 机构伦理问题 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 L-PRP制备条件探索 |
| 2.2.2 P-PRP制备条件探索 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全血离心后,血小板与白细胞的分布情况 |
| 2.3.2 影响PRP成品质量的重要因素 |
| 2.3.3 离心条件设定 |
| 2.3.4 影响PRP成品质量的其他因素 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 定制化富血小板血浆在肌腱病修复中的应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.1.4 实验器械 |
| 3.1.5 主要液体配制 |
| 3.1.6 qRT-PCR引物设计 |
| 3.1.7 实验分组 |
| 3.1.8 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大鼠PRP血小板回收率及血小板富集系数测试 |
| 3.2.2 大鼠肌腱干细胞的鉴定 |
| 3.2.3 选择性激活血小板释放的细胞因子对肌腱干细胞增殖与迁移的影响 |
| 3.2.4 选择性激活的血小板释放的生长因子对肌腱干细胞分化的影响 |
| 3.2.5 选择性激活的血小板释放的生长因子对人脐静脉内皮细胞增殖与迁移的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（7）皮瓣术后即刻注射PRP对SD大鼠狭长窄蒂皮瓣成活的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验部分 |
| 一、实验目的 |
| 二、实验材料 |
| 实验方法与步骤 |
| 一、实验动物分组 |
| 二、大鼠颈外静脉采血 |
| 三、PRP及PPP制备及血小板计数分析 |
| 四、狭长窄蒂皮瓣模型制作 |
| 五、PRP、PPP注射 |
| 六、术后护理 |
| 七、取材 |
| 八、观察指标 |
| 九、数据采集 |
| 十、统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、血小板计数 |
| 二、大体观察结果 |
| 三、皮瓣成活情况 |
| 四、大鼠皮瓣组织HE染色 |
| 五、皮瓣中CD34及TGF-βR的表达 |
| 六、MVD测定 |
| 七、皮瓣组织内CD34定量分析 |
| 八、TGF-βR半定量分析 |
| 九、全血中TGF-β1及VEGF定量分析 |
| 实验讨论 |
| 一、实验动物的选择 |
| 二、PRP的制备方案 |
| 三、PRP的抗凝与激活 |
| 四、PRP中血小板的浓度 |
| 五、狭长窄带皮瓣的成活机制 |
| 六、CD34与血管新生 |
| 七、PRP与狭长窄带皮瓣 |
| 八、狭长窄蒂皮瓣的研究意义 |
| 九、本研究的不足 |
| 实验结论 |
| 参考文献 |
| 综述 富血小板血浆在整形外科中应用进展 |
| 参考文献 |
| 插图与附表 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文及科研成果 |
| 致谢 |
（8）水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 水蛭提取液的制备和主要成分分析的初步研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法与步骤 |
| 1.2.1 水蛭提取液的制备和含量检测 |
| 1.2.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 水蛭提取液的制备和水蛭素含量测定 |
| 1.3.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液主要成 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 水蛭提取液的制备和检测的初步研究 |
| 1.4.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 第二部分 水蛭提取液对WERI-Rb-1 细胞活性、周期、凋亡、侵袭的影响 |
| 2.1 实验细胞、试剂及配制、仪器设备和耗材 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要实验设备仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养、传代和冻存 |
| 2.2.1 细胞培养和传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 CCK-8法检测水蛭提取液对细胞的活性影响 |
| 2.3.2 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞周期的影响 |
| 2.3.3 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.4 水蛭提取液对 WERI-RB-1 侵袭能力的影响 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 不同浓度药物对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.5.2 流式细胞技术检测药物对细胞周期的影响 |
| 2.5.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡的影响 |
| 2.5.4 transwell 实验检测水蛭提取液对 WER-Rb-1 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.6.2 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞周期的影响 |
| 2.6.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡影响 |
| 2.6.4 细胞凋亡与增殖 |
| 2.6.5 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞侵袭能力的影响 |
| 第三部分 水蛭提取液对WER-Rb-1 细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究 |
| 3.1 实验细胞、试剂、耗材和仪器设备 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要实验设备仪器 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 Elisa 实验检测水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞表达 VEGF 的影响 |
| 3.2.2 HIF-1a、MMP-9、VEGFR2 的实时定量RT-PCR检测 |
| 3.2.3 Western Blot法检测HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白表达 |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Elisa 检测培养基上清中 VEGF 蛋白的表达 |
| 3.4.2 HIF-1a基因表达 |
| 3.4.3 MMP-9基因表达 |
| 3.4.4 Western Blot 检测各组 PI3K 和 p-AKT 蛋白的表达 |
| 3.4.5 Western Blot 检测各组 HIF-1a 和 MMP-9 蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 VEGF、HIF-1a和 MMP-9 在肿瘤生成中的作用 |
| 3.5.2 PI3K/AKT信号通路在肿瘤疾病中的作用 |
| 3.5.3 水蛭素通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9 因子抑制RB细胞 |
| 第四部分 水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响 |
| 4.1 实验细胞、试剂和仪器设备 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验设备仪器 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性的影响 |
| 4.2.2 RT- PCR 检测 VEGF 和 VEGFR2 基因表达 |
| 4.2.3 Western Blot法检测VEGF、VEGFR2 的蛋白表达 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性及抑制率的影响 |
| 4.4.2 VEGFR2基因表达 |
| 4.4.3 VEGF基因表达 |
| 4.4.4 水蛭提取液对 HUVEC 细胞表达 VEGF 和 VEGFR2 蛋白的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 VEGF和 VEGFR2对血管生成的调控 |
| 4.5.2 水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和 VEGFR2的影响 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件 1 文献综述 水蛭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二 文献综述 视网膜母细胞瘤的生物标志物 |
| 参考文献 |
| 附件3 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 附件4 倒置显微镜下细胞形态 |
（9）Sema7A调控内皮细胞间质化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 Semaphorin7A对内皮细胞功能的影响及在表型转化中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 TGF-β2以及TGF/Smad信号通路在Sema7A调节EndMT中的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 ATF3介导Sema7A以及TGF-β2的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 Integrin-β1在Sema7A诱导EndMT中的作用探讨 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 Sema7A在扰动流引起的内皮细胞间质化中的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 研究创新与不足 |
| 参考文献 |
| 综述 内皮细胞间质化:一个前景广阔同时又充满争议的领域 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间学术成果 |
| 致谢 |
（10）基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证糖尿病黄斑水肿的影响和中药水蛭抑制NIH3T3细胞增殖及分子机制（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分:基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证糖尿病黄斑水肿的影响 |
| 引言 |
| 1. 基于OCTA评估糖尿病黄斑水肿的血流灌注 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.2 研究结果 |
| 2. 基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证糖尿病黄斑水肿的影响 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.2 研究结果 |
| 讨论 |
| 1. 消渴目病 |
| 2. 糖网化瘀合剂 |
| 3. OCTA评估DME黄斑微血管情况 |
| 4. OCTA评估糖网化瘀合剂对阴阳两虚DME的影响 |
| 5. 热断层扫描 |
| 结论 |
| 第二部分:中药水蛭抑制成纤维细胞增殖及分子机制 |
| 引言 |
| 材料与仪器 |
| 1 细胞来源 |
| 2 实验药品 |
| 3 相关试剂 |
| 4 实验仪器与耗材 |
| 实验方法 |
| 1 细胞冻存、复苏、培养及传代 |
| 2 实验用药物制备与浓度测定 |
| 3 作用药物及干预条件筛选 |
| 4 中药水蛭对NIH3T3细胞增殖影响检测 |
| 5 中药水蛭对NIH3T3细胞凋亡影响检测 |
| 6 中药水蛭对NIH3T3细胞增殖和凋亡影响的机制 |
| 7 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 NIH3T3细胞培养 |
| 2 中药水蛭标准品作用成分浓度测定 |
| 3 作用药物筛选 |
| 4 中药水蛭干预条件筛选 |
| 5 中药水蛭对NIH3T3细胞增殖影响 |
| 6 中药水蛭对NIH3T3细胞凋亡影响 |
| 7 RT-PCR检测 |
| 8 Western blot检测 |
| 讨论 |
| 1 中药水蛭 |
| 2 实验条件筛选 |
| 3 中药水蛭抑制NIH3T3细胞增殖及机理 |
| 4 中药水蛭诱导NIH3T3细胞凋亡及机理 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件一:综述 光学相干断层扫描血管成像在糖尿病视网膜病变中的应用 |
| 参考文献 |
| 附件二:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 附件三:受试者知情同意书 |
| 附件四:患者基本情况表 |
| 附件五:患者随访情况表(1) |
| 附件五:患者随访情况表(2) |
| 附件六:红外热成像报告 |
四、凝血酶受体激活肽和凝血酶对人成纤维细胞释放TGF-β和VEGF的影响（论文参考文献）
- [1]不同离心条件所制富血小板纤维蛋白对糖尿病大鼠创面愈合作用比较[D]. 贺波. 蚌埠医学院, 2021(01)
- [2]血小板来源的外泌体对糖尿病创面的治疗及机制研究[D]. 芮顺利. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]高盐饮食大鼠血清中THBS1的改变及其在内皮功能损伤中的作用和机制研究[D]. 徐芳芳. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]医用钛表面纳米结构及功能元素的免疫应答研究[D]. 陈岚. 中国科学院大学(中国科学院上海硅酸盐研究所), 2020(03)
- [5]FGF-2慢病毒载体介导的人羊膜间充质干细胞复合兔自体富血小板血浆促进腱—骨愈合的实验研究[D]. 张骏. 遵义医科大学, 2020(12)
- [6]定制化富血小板血浆及其在肌腱病修复中的应用[D]. 张昭远. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]皮瓣术后即刻注射PRP对SD大鼠狭长窄蒂皮瓣成活的影响[D]. 刘建疆. 苏州大学, 2020(02)
- [8]水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究[D]. 李园媛. 成都中医药大学, 2020(01)
- [9]Sema7A调控内皮细胞间质化的机制研究[D]. 洪磊. 苏州大学, 2020(06)
- [10]基于OCTA研究糖网化瘀合剂对阴阳两虚证糖尿病黄斑水肿的影响和中药水蛭抑制NIH3T3细胞增殖及分子机制[D]. 郑淼. 成都中医药大学, 2020(02)