一、RNAi及其在植物研究中的应用（论文文献综述）
周义成[1]（2021）在《复制可控型AcMNPV载体构建及其在粘虫基因功能研究中的应用》文中研究表明苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是目前研究最多的杆状病毒,可感染多种鳞翅目害虫,可高效的携带外源基因进入细胞内表达,具有开发成基因传递载体的潜力,但因其对寄主昆虫具有高致病性,导致难以将其应用于鳞翅目害虫基因功能研究。本研究通过诱导调控表达系统控制AcMNPV复制必须基因的表达来降低其对寄主昆虫的致病性,使其成为携带外源基因进入昆虫细胞进行基因沉默、敲除、过表达和蛋白标记的载体,并使用构建的复制可控型AcMNPV载体在粘虫Mythimna separata中进行基因功能研究。将AcMNPV用作基因功能研究工具首先需要包装病毒,目前杆状病毒常利用Bac-to-Bac系统包装,在哺乳动物中,细菌侵染可介导基因转移至哺乳动物细胞和组织表达。本研究将文献报道的对哺乳动物细胞有侵染性的因子克隆到大肠杆菌中表达,筛选对昆虫细胞具有侵染性的因子,最终筛选到来源于假结核耶尔森氏菌Yersinia pseudotuberculosis的yad A蛋白可提高细菌对sf9细胞的侵染能力,利用表达yad A的细菌介导AcMNPV转移到sf9细胞制备病毒时,表达yad A的菌株介导杆状病毒传递到sf9细胞的效率是普通菌株的4.9倍。为了降低AcMNPV对其寄主的致病性,本研究利用Red重组系统将AcMNPV的复制必须基因ie1敲除,再利用Tet-On 3G系统控制ie1基因表达,此AcMNPV在sf9细胞中存在少量背景复制,但在粘虫体内复制完全不受控制,表明单独使用Tet-On 3G系统控制杆状病毒复制时背景表达水平过高,达不到控制杆状病毒复制的目的。鉴于使用Tet-On 3G系统控制病毒复制时背景表达水平仍然过高,本研究采用多种策略降低Tet-On 3G系统的背景表达水平,一是利用Csy4系统在转录后水平降低Tet-On 3G系统的背景表达水平,另一种策略是构建转基因粘虫将Tet-On 3G基因整合到粘虫基因组中。使用优化后背景表达水平更低的Tet-On 3G-Csy4系统控制AcMNPV的ie1基因表达时,病毒在sf9细胞中的复制可受诱导剂强力霉素Dox调控,将病毒注射粘虫喂食Dox后,从第24h至第48h开始往饲料中添加抗病毒药物abacavir,粘虫感染率可达到60.2%-70.1%,而存活率保持在58.9%-82.2%,在粘虫体内可实现病毒复制可控,病毒可感染粘虫而不杀死粘虫。而在构建转基因粘虫降低背景表达水平的方式中,我们虽成功将Tet-On 3G基因插入到粘虫基因组,但这个转基因品系不能支持ie1基因敲除的病毒复制。为了将复制可控型AcMNPV载体用于粘虫基因功能研究,我们将ds RNA基因表达盒和CRISPR/Cas9系统装载到AcMNPV基因组中,选择粘虫Mschs B基因作为靶标,分别进行基因沉默和敲除实验,但未能检测到靶标基因沉默和敲除。本研究筛选对sf9细胞具有侵染能力的因子,利用细菌介导基因转移至sf9细胞的方式生产杆状病毒,简化了病毒包装流程,降低了生产成本,可为高通量生产杆状病毒提供便利;通过构建复制可控型AcMNPV载体,降低AcMNPV其对寄主的致病性,可携带外源基因进入昆虫体内进行沉默、敲除过表达和蛋白标记等研究,为进一步利用病毒载体进行基因功能研究奠定了基础。
王炳森[2]（2021）在《马铃薯响应青枯菌侵染的蛋白组学分析及StPP1的功能研究》文中研究表明演化ⅡB型青枯菌是我国马铃薯青枯病的主要病原菌类型,能够通过根部定殖来引起马铃薯细菌性枯萎病。青枯菌通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）将Ⅲ型效应蛋白（T3Es）注射进植物体内干扰植物的免疫系统,但是目前对马铃薯青枯菌效应蛋白影响植物免疫的机制报道较少。本研究利用建立的马铃薯接种青枯菌的表型鉴定体系和iTRAQ蛋白质组学方法筛选了青枯菌侵染过程中响应效应蛋白的马铃薯蛋白,并对其中一个基因StPP1进行功能验证,为马铃薯青枯病抗病机制提供理论依据。主要结果如下:1.马铃薯响应青枯菌Ⅲ型效应子的蛋白组学分析马铃薯接种和青枯菌根部定殖实验表明了T3SS突变体菌株完全丧失致病力并且在马铃薯根部的定殖受到限制。基于该表型差异,我们通过iTRAQ方法对接种了野生型和突变体菌株的马铃薯根部进行蛋白组差异分析,结果显示,与接种突变体菌株相比,接种了野生型菌株的马铃薯根部中有11个上调蛋白,10个下调蛋白;q PCR分析的结果表明差异蛋白的蛋白水平与转录水平的表达相关性较小,10个下调表达的蛋白中有4个蛋白（HBP2、HSP22、PP1和TOM20）在转录水平上没有发生变化,说明这4个基因在效应蛋白存在的情况下蛋白水平受到下调,由此推测效应蛋白很可能直接在蛋白层面上对基因表达造成影响;进一步将这4个蛋白与33个核心T3Es共表达,结果显示存在多个效应蛋白能够显着降低其目标蛋白的丰度。利用VIGS体系对10个下调蛋白的烟草同源基因的沉默株系进行青枯病抗性鉴定,共鉴定出4个具有稳定抗性表型差异的基因,其中HBP2,Miraculin和TOM20这三个基因沉默后的烟草青枯病抗性显着下降,而PP1沉默之后烟草的青枯病抗性增强,初步证明这4个基因参与了植物免疫调控。综合上述结果,我们发现蛋白组筛选的HBP2、TOM20和PP1这三个蛋白与青枯病抗性相关而且在转录水平上没有变化,所以我们认为这三个基因是有进一步的研究价值的。2.StPP1与效应蛋白RipAS的互作机制研究通过生物信息学比对,StPP1是一个蛋白磷酸酶,具有保守的磷酸酶活性位点,进一步的体外酶活验证表明StPP1具有磷酸酶活性,且酶活位点突变后,酶活消失。亚细胞定位的结果显示,StPP1在细胞质、细胞核的核质和核仁中均有积累,且其核仁定位依赖于磷酸酶的酶活位点;进一步的马铃薯遗传转化结果显示,StPP1的表达与青枯病抗性水平成负相关;同时还发现StPP1可与马铃薯MAPK家族中的MAPK3,MAPK9和MAPK16直接互作,说明StPP1可能参与了MAPK介导的信号通路,并且负调控马铃薯对青枯病的抗性。以StPP1为诱饵蛋白从效应蛋白酵母文库中进行了潜在互作蛋白的筛选,结果发现效应蛋白RipAS与StPP1在酵母中互作,并利用Co-IP进行了确认;进一步的点突变实验表明二者的互作依赖于StPP1的磷酸酶酶活位点。通过RipAS的蛋白结构检索分析,发现RipAS与蛋白磷酸酶PP2A在蛋白质三级结构上有一定的结构相似性,但酶活检测结果表明RipAS并不具有蛋白磷酸酶活性;突变青枯菌中的效应蛋白RipAS的接种结果显示突变体菌株的致病力显着增强,表明RipAS对于菌株的致病力起到负调控作用。RipAS的亚细胞定位结果显示其主要在核质中表达,与StPP1有共同的定位区域,二者共定位的结果显示StPP1的核仁定位信号消失,该结果与StPP1酶活突变体的单独定位结果一致,我们推测RipAS可能影响StPP1的酶活。但体外蛋白添加实验结果表明,RipAS不能直接抑制StPP1的酶活,也不能影响StPP1的蛋白丰度。综合上述结果,我们推测RipAS作为一个蛋白磷酸酶的结构类似物进入植物体内去影响StPP1在核仁中积累使其无法正常行使功能,有待进一步验证。
朱熙[3]（2021）在《马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究》文中指出丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）级联是真核生物中高度保守的信号转导模式,由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成。该级联途径通过三种激酶依次逐级磷酸化将感知的外源信号放大并传递下去,从而产生应激反应介导细胞增殖、分化和死亡。马铃薯（Solanum tuberosum L.）为世界第四大粮食作物,日益突出的土地干旱和盐碱化问题造成其减产。目前,关于植物MAPK在干旱、盐及渗透胁迫条件下的基因功能研究十分有限。迄今为止,马铃薯StMAPKs基因响应非生物胁迫和植物激素诱导表达模式的系统研究仍未见报道,而且其在马铃薯不同组织和器官中的表达模式也不清楚。本研究主要解析StMAPKs是否介导多种与胁迫相关的信号转导途径,StMAPKs是否在干旱、盐和渗透胁迫下起作用以及其潜在机制。本研究对StMAPKs响应不同非生物胁迫和植物激素处理表达模式行了分析,同时还分析了其在不同组织和器官中的表达模式。从马铃薯“大西洋”中分离得到一个与盐和渗透胁迫相关的StMAPK3功能基因和一个与干旱胁迫相关的StMAPK11功能基因,并通过亚细胞定位、酵母双杂文库筛选、酵母双杂检测互作蛋白、双分子荧光互补、磷酸化蛋白组学,以及对过表达和RNA干扰表达转基因的植株在胁迫下生理指标和光合指标的检测做了研究。取得的主要研究结果如下:1.通过qRT-PCR技术分析了马铃薯15个StMAPKs基因在不同非生物胁迫和植物激素处理以及不同组织和器官中的表达模式。结果表明:马铃薯中15个StMAPKs基因不仅在非生物胁迫和植物激素处理时表达差异显着,而且在不同组织和器官中的特异性表达差异也显着。2.从马铃薯中克隆得到两个促分裂原活化蛋白激酶基因StMAPK3和StMAPK11,其中StMAPK3是与盐和渗透胁迫相关,而StMAPK11与干旱胁迫相关,构建了pCAM35s-GFP-StMAPK3和pCAM35s-GFP-StMAPK11亚细胞定位载体,并在烟草表皮细胞中进行了瞬时表达。结果表明,StMAPK3和StMAPK11均定位于细胞膜和细胞核。3.构建了原核重组表达载体pET28b-StMAPK11,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后,IPTG诱导并纯化StMAPK11重组蛋白,制备兔抗StMAPK11多克隆抗体,Western blot结果显示制备好的抗体可以很好的与StMAPK11蛋白特异性结合。4.分别构建了酵母双杂和双分子荧光互补载体,通过酵母双杂交和双分子荧光互试验验证结果显示,StMAPK3可以与StDof1、StSR2、StACS5、StMEK2和StMAPKK1发生互作,其中StMAPK3与StSR2在细胞核内相互作用。StMAPK11可以与StbZIP2、StPTP1和StVQP9发生互作,其中StMAPK11与StbZIP2在细胞核内相互作用。5.与盐和渗透胁迫相关StMAPK3基因的功能分析。在盐和渗透胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK3植株中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性和脯氨酸含量均增加,在RNA干扰表达植株中,结果相反,而在StMAPK3过表达植株中H2O2和丙二醛（MDA）含量减少,RNA干扰表达植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK3提高了盐和渗透胁迫下植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率,在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因植株相比都不同程度的降低。并且还发现在盐和渗透胁迫下转StMAPK3基因对马铃薯植株的气孔开合度、植株高度、茎粗、鲜重、根长和侧根数都有不同程度的影响。结果表明StMAPK3能明显提高马铃薯植株对盐和渗透胁迫的抗性。6.与干旱胁迫相关StMAPK11基因的功能分析。在干旱胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK11植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中CAT、POD、SOD酶活性和脯氨酸含量均增加,但在RNA干扰表达马铃薯植株中,结果相反,在StMAPK11过表达植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中H2O2和MDA含量减少,但在RNA干扰表达马铃薯植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK11提高了干旱胁迫下马铃薯植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率;在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因相比都不同程度的降低。并且还发现转StMAPK11基因在干旱胁迫下对马铃薯植株的鲜重、干重、根鲜重和根干重都有不同程度的影响。表明StMAPK11能明显提高植株（马铃薯、烟草和拟南芥）对干旱胁迫的抗性。7.对StMAPK3过表达和RNA干扰表达马铃薯植株进行磷酸化蛋白质组学分析共鉴定得到2180种磷酸化蛋白。通过修饰位点定量分析在两组中共同鉴定到的修饰位点2922个,其中差异显着的修饰位点总数78个,显着上调的修饰位点总数49个,显着下调的修饰位点总数29个。通过磷酸化蛋白差异分析两组共鉴定蛋白2023个,其中上调表达蛋白15个,下调表达蛋白14个。利用GO、KEGG、COG数据库对鉴定的磷酸化蛋白质进行功能注释,结果表明这些蛋白质主要在植株生长发育过程,信号转导和代谢途径中发挥相应功能。
胡斌[4]（2021）在《OsMESL基因在水稻叶片衰老及抗病中的功能研究》文中提出籼型杂交稻品种抽穗后期叶片早衰严重制约了水稻产量,揭示叶片衰老的分子机制,不仅为解析叶片早衰问题提供理论基础,同时为创制抗早衰品种提供候选基因。本实验室前期研究发现OsMESL（methyl esterase like）基因（即A12基因）参与了水稻叶片衰老过程。本研究既在本实验室前期研究的基础上,以T-DNA插入纯合突变体osmesl为切入点,通过分子生物学、生理学、遗传学等手段鉴定了一个负调控水稻抽穗后叶片衰老的新基因OsMESL,又在研究的过程中发现,该基因突变后还表现出对细菌性病害白叶枯病及真菌性病害纹枯病和稻瘟病的显着抗性。本研究取得的主要结果如下:1.我们从韩国庆熙大学突变体库购买得到OsMESL基因的纯合T-DNA插入突变体osmesl。对osmesl的研究显示,其在抽穗后表现出叶片持绿的表型,叶绿素含量显着高于野生型（WT）对照中花11（ZH11）,衰老正调控相关基因Osh36、Osl55、OsWRKY42表达量显着低于WT,衰老负调控Marker基因OsDOS表达量显着高于WT。叶绿素降解相关基因OsNOL、OsNYC1、OsNYC4、OsPAO显着低于对照组。osmesl表现出对Me JA诱导离体叶片衰老的延迟。同时,osmesl也表现出暗处理诱导叶片衰老的延迟。互补材料可以回复osmesl表型,干涉材料表现出衰老延迟,超表达材料表现出衰老加快的表型。2.水稻原生质体亚细胞定位实验发现OsMESL定位于细胞膜及叶绿体,利用膜系统酵母双杂交筛选到一个互作蛋白OsBI-1。共定位研究发现OsMESL与OsBI-1在细胞膜部位可以局部共定位。进一步的Bi FC及双分子荧光素酶酶活恢复实验证实,OsMESL可与OsBI-1在体外、体内发生互作。OsBI-1在osmesl中表达量显着升高。与WT相比,OsBI-1的表达在osmesl受到病原菌侵染时,表达量更高。台盼蓝染色结果表明,正常状态下osmesl叶片中细胞死亡率要低于WT,且病原菌诱导的细胞死亡在osmesl中受到抑制。透射电镜结果显示,自噬体在osmesl中较少。激素测定发现,抽穗后osmesl剑叶中IAA含量显着高于WT,但ABA含量无显着差异。同时,与IAA合成相关基因OsYUCCA1、OsYUCCA2、OsYUCCA4、OsYUCCA6表达升高,与IAA转运相关基因OsSAUR39、OsSAUR45表达降低。以上结果说明,osmesl叶片衰老延迟涉及细胞死亡抑制子OsBI-1途径,同时涉及IAA途径。3.对孕穗期osmesl接种白叶枯病菌（Xoo,Xanthomonas oryzae pv.oryzae）和纹枯病菌（R.solani,Rhizoctonia solani）、稻瘟病菌（M.oryzae,Magnaporthe oryzae）发现,osmesl表现出对这三种病害的显着抗性。互补的株系在孕穗期的剑叶病原菌接种实验显示,其对病原菌的感病表型得到回复。同时RNAi干涉材料及OsMESL-Crispr-Cas9材料均表现出对病原菌的抗性。4.利用基于膜系统的酵母双杂交,筛选得到叶绿体定位的硫氧还蛋白OsTrxm。通过酵母中的互作验证实验,及水稻原生质体中的荧光素酶酶活恢复实验、Bi FC及烟草中的免疫共沉淀实验,均证明了二者在体内、体外可以发生互作。通过NBT染色显示:osmesl、RNAi干涉材料叶片在接种病原菌后ROS的含量高于WT。对WT、osmesl、RNAi干涉材料叶片接种病原菌前后进行H2O2定量测定,结果显示osmesl、RNAi中H2O2含量在接菌前后均显着高于WT对照组。osmesl中负调控抗病相关的基因OsWORKY45-1表达量显着低于WT,而正调控抗病的OsPR1b基因表达量显着高于WT。此外,病原菌抗性途径重要激素JA在osmesl中的含量显着高于WT。OsTrxm超表达和Crispr-Cas9材料孕穗期接菌的结果显示:OE株系未表现出对病原菌的抗性,但OsTrxm基因敲除材料表现出对病原菌的显着抗性。以上结果说明,OsMESL通过硫氧还蛋白途径调节了ROS水平,从而调控了对病原菌的抗性。
李中华[5]（2021）在《多组学数据揭示棉花纤维发育转换期的遗传调控机制和重要代谢物》文中进行了进一步梳理棉花是一种重要的经济作物,纤维是其最重要的产物。对棉花纤维发育机制进行研究有助于更好地改良纤维品质。棉花纤维品质的多样性是由多种遗传变异决定的。本研究通过对棉花自然群体材料纤维进行转录组和代谢组分析,揭示了纤维细胞从快速伸长到次生壁合成的转换时期纤维发育的遗传调控网络,同时鉴定到参与该过程的重要代谢物,并验证了与纤维品质显着相关的类黄酮代谢途径基因GhCHS和GhDFR在纤维发育中的功能。主要结果如下:1.GWAS和eQTL整合分析揭示启动棉花纤维次生细胞壁合成的遗传调控机制。本研究对251份棉花自然群体进行了全基因组关联分析（GWAS）,鉴定了28个与异源四倍体棉花纤维品质相关的基因位点。为了研究这些位点的调控作用,对棉花自然群体开花后15天（15 DPA）的纤维进行了转录组测序,鉴定到15330个表达数量性状位点（eQTL）。通过全转录组关联分析（TWAS）,利用近端eQTL和纤维品质GWAS数据优化GWAS结果,获得13个可能影响纤维品质的因果基因。对远端eQTL的分析揭示了棉花两个亚基因组之间存在非对称的遗传调控模式,表现为A亚基因组中大量的基因受到D亚基因组的转录调控。位于D亚基因组上的eQTL热点Hot216调控了962个基因的表达,形成了一个全基因组的遗传调控网络。对Hot216的分析发现,Hot216可能编码了一个KIP相关蛋白KRP6。对Hot216调控的e Gene的分析表明,Hot216主要的功能是调控与细胞壁合成相关基因的表达,从而介导纤维从快速伸长到次生壁合成之间的转换,最终影响纤维长度。本研究构建了棉花15DPA纤维细胞发育的遗传调控网络,提出了纤维细胞伸长过程中次生细胞壁合成的遗传调控机制。2.棉花自然群体代谢组学分析鉴定到纤维品质显着相关代谢物。为了研究代谢物与棉花纤维品质的关系,本研究利用18份遗传和纤维品质差异大的陆地棉材料,取其5个不同发育时期纤维,构建了含有961个代谢物的棉花15DPA纤维特异的二级质谱标签（MS2T）数据库,并对MS2T库中272个代谢物进行了注释。利用MS2T数据库,对279份棉花自然群体15 DPA纤维进行了广泛靶向代谢组测定。对棉花自然群体代谢物变异分析发现,群体纤维中存在丰富的代谢变异。群体代谢物聚类分析发现二倍体棉种与四倍体棉种分为两簇,且陆地棉和海岛棉分为两簇。对有注释信息的代谢物的相关性分析发现,代谢物之间的相关关系非常复杂,但同类代谢物之间的相关性更强。对272个已知代谢物与纤维品质性状的相关性分析发现,氨基酸及氨基酸衍生物,糖类和脂类这三大基础代谢主要与纤维产量性状（单铃重和衣分）正相关。对961个代谢物与纤维品质相关性分析分别鉴定到:97个代谢物与纤维马克隆值显着相关,130个代谢物与纤维断裂比强度显着相关,239个代谢物与纤维长度显着相关。其中香豆素类和黄酮类代谢物与纤维强度和纤维长度的相关性较大。本研究通过对棉花自然群体15 DPA纤维的代谢组分析,揭示了纤维快速伸长到次生壁合成转换时期纤维中代谢物之间的相关性网络,并鉴定到与纤维品质显着相关的代谢物,为开发代谢标记应用于纤维品质改良打下了基础。3.类黄酮合成代谢基因GhCHS和GhDFR下调表达抑制纤维发育。对四倍体陆地棉和海岛棉中类黄酮合成代谢中两个关键基因CHS和DFR的基因家族鉴定发现,CHS在陆地棉和海岛棉染色体上呈非对称性的分布。构建Ca MV35S启动子驱动的GhCHS和GhDFR保守区干涉的载体,转化陆地棉材料YZ1。对纯系干涉材料的纤维品质分析发现:GhCHS干涉系纤维长度变短,马克隆值增高,纤维强度变小,整齐度降低;GhDFR干涉材料马克隆值显着降低（从对照5.6降低到3.0）,纤维强度增大,整齐度降低,整体纤维品质变差。同时GhDFR干涉材料单铃重、籽指、衣指均显着减小。通过切片染色对转基因材料中内源类黄酮物质检测发现,GhCHS和GhDFR干涉系材料中黄酮类化合物含量显着降低。液相质谱测定干涉材料纤维中类黄酮物质含量发现:在纤维发育早期,GhCHS干涉材料中,柚皮素含量显着降低,GhDFR干涉材料中,槲皮素和山奈酚含量升高。这一结果说明棉花纤维中存在着复杂的类黄酮代谢。通过杂交将GhCHS和GhDFR干涉片段导入到棕色棉中发现,含有GhCHS干涉片段的F1植株的纤维颜色显着变浅,含有GhDFR干涉片段的F1植株的纤维颜色变深,GhCHS和GhDFR影响了棕色棉色素形成和沉积。
黄娟娟[6]（2021）在《杨树转录因子PtERF004耐盐胁迫功能分析》文中研究指明杨树（Populus）生长快、适应性强,是我国重要的造林和绿化树种,但在干旱、半干旱、盐碱、荒漠化等脆弱生态区,杨树的生长发育受到了明显的限制。ERF蛋白是植物所特有的并可直接参与植物生长发育及生物与非生物胁迫应答过程的一类转录因子。在前期研究的基础上,本研究以84K杨（P.abla×P.glandulosa）为研究材料,对7个抗逆胁迫相关的杨树ERF基因进行系统生物信息学及表达模式分析,选取序列最短,分子量最小,编码氨基酸最少,热稳定性最强,在根中相对表达量最显着的PtERF004基因进行过表达和抑制表达载体构建及杨树遗传转化,并对其耐盐胁迫功能及与其互作基因的生物学功能进行分析。研究结果如下:（1）对7个PtERFs基因进行系统的生物信息学分析。开放阅读框分析显示7个PtERF基因（PtERF001-PtERF007）的序列长度在400～1500之间,开放阅读框个数为4～12个,均含有最长的开放阅读框ORF1,PtERF004序列最短,编码氨基酸最少;基本理化性质分析显示7个PtERs基因均为热稳定性强的亲水性的可溶性蛋白,不属于跨膜蛋白,且均无信号肽,结构元件均为α-螺旋和无规则卷曲;同源分析表明7个PtERFs基因在拟南芥中的同源基因共有5个;系统进化分析表明,7个PtERFs基因属于ERF-a、ERF-b、ERF-c 3个亚家族,且包含AP2、YRG和RAYD保守域;染色体定位显示7个PtERFs基因分别定位于19条染色体中的第3、2、11、6、18、4、5条染色体上;共线性分析显示PtERF002、PtERF004、PtERF006与全基因组重复事件相关;启动子结构分析表明7个PtERFs启动子区域具有ABRE、LTR、MBS等多种与胁迫相关的顺式调控元件;GO注释分析表明7个PtERFs具有DNA结合和转录调控因子活性,可能参与了植物的胁迫响应过程。（2）通过RT-qPCR分析7个PtERF基因在50m MNa Cl胁迫下的表达模式,结果显示,同一亚家族基因在盐胁迫下表现出相似的表达变化,例如,ERF-c亚家族的PtERF001和PtERF004在根中的表达量变化相似,均在48h时最高,但大多数基因表现出特定的表达模式。通过RNA-Seq对7个基因的表达模式进行了验证,根据表达水平将7个PtERF基因分为2个亚组,其中PtERF003、PtERF004、PtERF005属于一个亚组,其他4个属于另一个亚组;基因表达相关性分析表明PtERF004与PtERF005相关,PtERF002、PtERF003和PtERF007的相关性较强。（3）为进一步揭示ERF转录因子在杨树应答盐胁迫过程中的功能,本研究选取了PtERF004进行过表达和抑制表达载体构建及杨树遗传转化,并对其耐盐功能进行了分析。共获得PtERF004过表达转基因杨树株系（OX）19个和抑制表达转基因杨树株系（RNAi）9个。在正常条件下,与非转基因杨树（WT）相比,OX和RNAi的生根率均变低、株高均变矮,且OX的生根率和株高均小于RNAi;OX的总鲜重和根鲜重均大于WT,而RNAi与WT的差异不显着;OX的根直径、根表面积、根体积、叶面积、叶长、叶宽、气孔宽度均大于WT,而RNAi与WT的类似;OX和RNAi的地上部鲜重、叶片数、主根长、根尖数、叶片长宽比、气孔长与WT的差异不显着;OX的POD活性、SOD活性和MDA含量均与WT相似,但明显低于RNAi;OX、RNAi和WT的CAT活性、叶片相对含水量和叶片电导率均没有显着差异。在盐胁迫条件下,OX的根鲜重、根直径、根表面积、根体积、叶片长宽比大于WT,RNAi与WT差异不显着,其他生长指标均小于WT。OX的POD活性和MDA含量均高于WT和RNAi,而CAT活性则相反。OX和RNAi的叶片相对含水量和叶片电导率没有显着差异。以上结果表明,杨树转录因子PtERF004对盐胁迫较为敏感,且其过量表达可以促进侧根的生长。（4）为鉴定与PtERF004互作的靶基因并分析其耐盐功能,通过RNA-Seq分析了WT和OX的叶片中基因表达水平。结果显示,在盐胁迫（NT+100）处理后,与对照（NT+0）比较,共检测到1175个差异表达基因（DEGs）;在OX vs NT+0中发现288个DEGs,相同的DEGs有129个,且均在OX植株中下调表达;WGCNA分析共鉴定出15个DEGs,其中13个与PtERF004直接共表达;DEGs中共有转录因子7个,其中4个WRKY转录因子（WRKY24、WRKY33、WRKY40、WRKY41）,1个b ZIP（b ZIP14）、1个GRAS、1个NAC（NAC045）,且均在OX抑制表达;启动子结构分析发现NAC045含有1个可与PtERF004结合的DRE元件;酵母单杂交验证表明PtERF004可以与含有DRE元件的NAC045的Promoter1（翻译起始位点上游的-525bp到-197bp）结合;RT-qPCR分析表明NAC045在RNAi中高诱导表达。综上,PtERF004可能通过促进侧根系的生长,提高了杨树对盐胁迫的敏感性。本研究为PtERF004基因的进一步应用及系统揭示ERF转录因子的功能提供理论依据。
魏丰[7]（2021）在《紫云英NCR基因家族发掘分析及其在类菌体分化固氮中的功能研究》文中提出NCR（Nodule specific Cysteine-Rich）是一类富含半胱氨酸的多肽,目前在IRLC（Inverted Repeat-Lacking Clade）豆科和一些合萌属（Aeschynomene spp.）植物中发现。IRLC豆科与根瘤菌形成不定型根瘤,根瘤中的共生菌经历了不可逆的终端分化,这一过程受到根瘤特异性表达的宿主NCR多肽的调控。紫云英也属于IRLC豆科,但相应的NCR家族发掘和功能研究还处于空白阶段。本研究以紫云英-中慢生根瘤菌共生体系为对象,鉴定到一个紫云英中编码NCR多肽的基因大家族。生物信息学分析显示,紫云英NCR家族中含有一类新型多肽,分子量较大,多为阳离子型多肽,具有特异性-3-9-5-类型的保守半胱氨酸基序,与植物防御素极为类似,显示了紫云英NCR家族在进化上的特殊性。表达分析结果表明,紫云英NCR在根瘤中特异性表达。在体外活性测定试验中发现,华癸中慢生根瘤菌对紫云英阳离子和阴离子NCRs表现为不同的应激反应。高浓度紫云英阳离子NCR100引发细菌膜损伤和菌体死亡,而阴离子NCR067促进了细胞增殖和基因组扩增,反映不同类型NCR多肽与根瘤菌的不同相互作用模式,这也预示了共生条件下NCR家族调控类菌体分化的复杂过程。华癸中慢生根瘤菌中诱导表达紫云英阳离子多肽NCR083,导致菌体生长明显受抑制,细胞分裂和肽聚糖合成基因发生显着变化。共生条件下,NCR083组成型表达菌株诱导根瘤异常发育,类菌体早衰,丧失固氮能力。表明根瘤菌/类菌体中可能存在与紫云英NCR083相互作用的靶位点,为深入研究NCR驱动类菌体分化的机制提供新的材料和思路。通过细菌双杂交技术筛选获得与紫云英NCR多肽互作的根瘤菌靶蛋白GroEL3。共生条件下,GroEL3突变体菌株与紫云英形成不固氮无效根瘤,相互作用的紫云英NCR基因转录水平发生改变。这些结果暗示紫云英NCR多肽与华癸根瘤菌GroEL蛋白互作是共生调控的关键节点之一。上述研究结果显示了紫云英NCR家族在进化上的特异性,不同类型NCR多肽在功能上有不同的特点。这有利于加深对IRLC豆科NCR家族在进化上和功能上的多样性的认识,为进一步深入研究和阐明植物NCR多肽对类菌体分化的调控机制提供新的视角和切入点。
侯潞丹[8]（2021）在《一氧化氮调控能量代谢缓解糙皮侧耳热胁迫损伤的研究》文中研究指明我国食用菌产量90%左右来自农业式栽培,设施简陋、环境调控能力差。突发的高温天气引发食用菌产量的降低和品质的下降。解析食用菌对热胁迫的响应机制,可为耐高温菌株的选育寻找分子标识,为抗热栽培技术创新寻找路径。一氧化氮（NO）作为信号分子在植物响应胁迫中发挥重要调控作用,然而NO在食用菌的胁迫响应中的功能及调控机制仍未阐明。本研究以抗高温性能较强的种类糙皮侧耳为材料,探究NO在热胁迫响应中的功能及调控途径,主要研究结果如下:1.NO调控TCA循环及呼吸链,缓解糙皮侧耳热胁迫损伤:（1）外源添加NO供体及清除剂证实了NO降低细胞总呼吸速率,减少TCA循环产物NADH含量及呼吸链上O2-的产生及积累;减少热胁迫下相对离子渗透率及MDA含量。从而缓解热胁迫损伤,促进菌丝热胁迫后恢复生长;（2）RNA-Seq分析表明,热胁迫下KEGG富集到35个受NO特异性调控且与能量代谢相关的DEGs,其中4个在TCA循环中显着性富集,6个与呼吸链相关;（3）外源添加NO供体及清除剂证实了NO显着抑制热胁迫下TCA循环中顺乌头酸酶基因aco及蛋白ACO的表达,诱导呼吸链中交替氧化酶基因aox表达。2.糙皮侧耳aco在热胁迫响应中的功能及调控途径:（1）应用遗传转化技术,构建了aco的过表达及RNAi菌株,验证了糙皮侧耳aco基因的干扰增强了菌丝对热胁迫的耐受性;（2）热胁迫下aco干扰能够促进菌丝内源柠檬酸（citric acid,CA）积累,CA含量的升高进一步诱导交替氧化途径中aox基因的表达,增强菌丝对热胁迫的耐受性。3.糙皮侧耳aox在热胁迫响应中的功能及调控途径:（1）对aox转化菌株不同温度胁迫处理,验证了aox的过表达促进菌丝40℃热胁迫后的恢复生长,提高32℃热处理下菌丝生长速率;（2）通过aox转化菌株不同温度胁迫生理指标及抗氧化酶基因表达的检测,发现不同胁迫温度下aox的调控途径不同:在40℃下,aox过表达后通过降低TCA循环产物NADH含量影响能量代谢,减少ROS的产生及其积累,促进热胁迫后菌丝生长的恢复;在32℃下,aox通过上调关键抗氧化酶基因的表达,加快ROS的清除,加快在热胁迫条件下的菌丝生长。结论:明确了NO缓解糙皮侧耳菌丝热胁迫损伤的关键调控途径;阐明了TCA循环中aco基因在热胁迫响应中的调控机制;解析了交替氧化途径中aox增强菌丝耐热性的调控机制。
陈晨[9]（2021）在《植物挥发性化合物DMNT毒杀小菜蛾的机制解析》文中研究表明小菜蛾是危害农业生产的主要植食昆虫之一,依靠取食甘蓝、包菜和油菜等蔬菜和作物为生。由于其啃食能力强,繁殖周期短等特性容易造成虫害爆发。现有的防治方式不能满足对小菜蛾绿色防治的要求,开发新型天然抗虫方式显得尤为重要。植物在进化的过程中形成了多种抵御食草昆虫侵食的方式,分泌化合物毒杀食草昆虫是一种重要植物防御手段。先前研究表明植物通过合成萜类化合物DMNT间接抵御害虫的侵食,但DMNT的对昆虫有无直接影响尚未明确。本文以鳞翅目害虫小菜蛾为研究对象,探究植物萜类化合物DMNT对小菜蛾的毒杀作用及其机制。主要结果如下:（1）植物萜烯类化合物DMNT显着影响鳞翅目害虫小菜蛾的生长和繁殖。选择性取食试验发现,超表达PEN1基因的拟南芥植株对小菜蛾具有趋赶效果。根据已有文献报道,超表达PEN1基因的拟南芥植株能够产生大量萜烯类化合物DMNT。DMNT体外试验表明,DMNT对小菜蛾幼虫具有直接趋和毒杀作用。（2）DMNT处理能破坏小菜蛾幼虫肠道。对小菜蛾幼虫进行饥饿或饲喂DMNT发现,食用DMNT的幼虫比处于饥饿中的幼虫出现了较早的死亡,表明幼虫是被DMNT毒杀致死而非饥饿致死。幼虫肠道酶活试验发现,脂肪酶酶活显着下调,表明食用DMNT后幼虫肠道消化能力减弱。“Smurf”试验发现,食用DMNT后肠道发生渗漏的幼虫比例显着增加。体式镜下观察围食膜结构发现,食用DMNT后的幼虫肠道内围食膜结构薄而疏松。幼虫肠道HE染色切片发现,在食用DMNT后,幼虫肠道内围食膜糜烂。透射电镜观察肠道横切面得到类似结果。这些结果表明食用DMNT后幼虫肠道内围食膜遭到破坏。（3）DMNT通过下调小菜蛾肠道Mucin like基因表达破坏围食膜结构。RT-PCR分析发现,食用DMNT后幼虫肠道内围食膜合成基因Mucin的表达量显着下降,表明DMNT能够显着抑制Mucin基因的表达。RNAi试验发现,Mucin沉默后幼虫的存活率、体重和化蛹率显着下调,并且肠道内围食膜变薄。这些结果表明DMNT对围食膜的破坏作用是通过抑制Mucin的表达实现的。（4）DMNT毒杀小菜蛾幼虫需要肠道微生物的参与。抗生素的饲喂试验发现,抗生素对幼虫的生长发育无影响,HE染色切片显示幼虫食用抗生素后肠道内围食膜结构完整,因此小菜蛾幼虫肠道内围食膜的完整性的维持不需要肠道微生物存在。同时饲喂抗生素和DMNT试验发现,与喂食DMNT相比,小菜蛾幼虫的存活率和化蛹率显着上调,且HE染色切片显示同时饲喂DMNT和抗生素的幼虫肠道内围食膜结构仍然破损,这些结果表明DMNT对小菜蛾幼虫的毒杀作用不是围食膜破损本身导致的,而是需要肠道微生物的助攻。同时饲喂DMNT和粪肠球菌的革兰氏染色切片显示,在围食膜结构破坏后,粪肠球菌进入肠道细胞内,表明幼虫的死亡是由于细菌攻击肠壁细胞导致的。（5）DMNT对小菜蛾幼虫肠道菌群稳态有显着影响。16S r DNA测序显示,食用DMNT后幼虫肠道内菌群发生了紊乱:变形菌门和厚壁菌门变化较大,其中厚壁菌门中肠球菌属菌群丰度上调85倍。这些结果表明DMNT能够导致幼虫肠道内菌群紊乱。
何弯弯[10]（2021）在《dsRNA分子设计对RNAi抗马铃薯甲虫效率的影响及在质体介导抗虫中的应用》文中指出RNA干扰（RNAi）技术自问世以来,被广泛应用于害虫防治领域中,是一种非常有前景的抗虫策略。针对害虫靶标基因的外源dsRNA被害虫取食后,害虫靶标基因下调,导致害虫生长发育迟缓甚至死亡,最终达到防治目的。但是dsRNA的递送方式、长度,序列和浓度等因素都会影响RNAi的效率。目前,通过植物介导RNAi抗虫在农业生物技术领域也展现出巨大的潜力,而且由于植物质体中缺乏RNAi机制使得dsRNA在其中能稳定积累,具有更强的杀虫效果。马铃薯甲虫是一种国际上公认的马铃薯毁灭性的检疫害虫,上世纪末入侵到中国新疆等地区,对我国马铃薯产业也造成了巨大的危害和损失。前期研究结果显示,该虫对于RNAi比较敏感,通过植物质体介导RNAi抗马铃薯甲虫的策略是有效可行的,但是在这个过程中影响马铃薯甲虫RNAi效率的因素并不清楚。本研究主要探讨dsRNA的长度,dsRNA靶向同一mRNA不同位置以及dsRNA与mRNA的错配率对马铃薯甲虫体内RNAi效率的影响。研究内容包括在体外合成不同长度、具有不同序列的、带有不同突变率dsRNA对马铃薯甲虫进行喂食,然后在马铃薯质体中表达不同长度dsRNA,分析不同长度dsRNA在质体中积累量的差异,及其对马铃薯甲虫杀虫效果的影响。为质体介导RNAi抗虫过程中针对靶标基因的dsRNA设计提供参考和理论依据。主要研究结果如下:1)dsRNA的长度会影响RNAi效率。通过在体外设计不同长度的dsRNA进行喂食实验时发现,与喂食60 bp的dsRNA相比,喂食dsRNA的长度为200 bp及以上时,马铃薯甲虫的RNAi效率更高。然而,当dsRNA的长度在200-700 bp之间时,比较喂食后马铃薯甲虫的存活率、体重变化和基因下调水平没有显着性差别,这表明长度在此区间内的dsRNA所引发的RNAi效率没有显着的差异。不同长度的dsRNAs在体外RNAi效率依次为ds ACT60<ds ACT200≈ds ACT297≈ds ACT400≈ds ACT700。2)dsRNA靶向基因不同位置会影响RNAi效率。通过体外设计针对同一靶标基因的不同位置序列的dsRNA进行喂食时发现,喂食不同序列dsRNA后马铃薯甲虫的存活率出现显着性差异,这表明选择不同靶标位置会影响RNAi效率。分析比较不同序列中潜在的有效siRNA位点发现,其中包含siRNA位点较少的序列所引起的RNAi效率会低于其他位置。3)dsRNA与靶标mRNA之间的错配率低于3%时,对RNAi的效率无显着性影响。通过体外设计并合成不同突变率的dsRNA进行喂食,比较dsRNA突变序列和dsRNA原始序列喂食后马铃薯甲虫的存活率、体重变化和基因下调水平发现均无显着性差异,这些结果表明当dsRNA与靶标mRNA的错配率不超过3%时,并不影响马铃薯甲虫体内RNAi的效率。4)dsRNA的长度会影响在质体中的积累量进而影响抗虫效果。在质体中表达不同长度的dsRNA,通过Northern检测其在质体中的积累量时发现当dsRNA长度在200-700 bp时,随着dsRNA长度的增加在质体中的积累量反而减少,积累量从低到高依次为St-ACT700<St-ACT400<St-ACT297<St-ACT200,其中St-ACT200植株中dsRNA的积累水平约占总RNA的0.6%。将表达不同长度的dsRNA的转质体植物对马铃薯甲虫进行喂食实验时发现,其抗虫效果与其在质体中dsRNA的积累水平呈正相关,dsRNA积累水平越高,对马铃薯甲虫的杀虫效果更好,抗虫效果依次为St-ACT700<StACT400<St-ACT297<St-ACT200。综上所述,我们发现dsRNA分子对RNAi抗马铃薯甲虫效率的一些影响因素,并通过在质体介导RNAi中进行运用,将长度为200-700 bp的dsRNA在马铃薯质体中进行了表达,发现dsRNA的积累量依赖长度而变化,长度越长,积累量越低,抗虫效果越弱,为后续通过质体介导RNAi抗虫的设计奠定了基础,提供了新的思路。
二、RNAi及其在植物研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNAi及其在植物研究中的应用（论文提纲范文）
（1）复制可控型AcMNPV载体构建及其在粘虫基因功能研究中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鳞翅目昆虫基因功能研究现状 |
| 1.2 杆状病毒简介 |
| 1.3 杆状病毒遗传改造方法简介 |
| 1.4 四环素诱导调控系统简介 |
| 1.5 Csy4 系统简介 |
| 1.6 杆状病毒制备方法简介 |
| 1.7 细菌侵染介导基因转移到真核细胞研究 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 1.9 研究内容与技术路线 |
| 第二章 细菌侵染介导基因转移包装杆状病毒 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 侵染因子载体构建 |
| 2.2.5 吞噬体逃逸相关因子克隆 |
| 2.2.6 细菌侵染昆虫细胞效率检测 |
| 2.2.7 构建asd基因敲除DH10Bac菌株 |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细菌侵染效率检测 |
| 2.3.1.1 耶尔森氏菌侵染因子检测 |
| 2.3.1.2 立克次氏体侵染因子检测 |
| 2.3.2 构建asd基因敲除的DH10Bac菌株 |
| 2.3.3 细菌侵染介导基因转移包装AcMNPV |
| 2.3.4 吞噬体逃逸相关因子功能鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 复制可控型AcMNPV载体构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 供试昆虫 |
| 3.2.2 质粒和菌株 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 实验试剂 |
| 3.2.5 构建egt基因敲除的AcMNPV载体 |
| 3.2.6 构建ie1 基因敲除的AcMNPV载体 |
| 3.2.7 构建Tet-On 3G系统控制ie1 基因表达的AcMNPV |
| 3.2.8 检测病毒在粘虫体内复制情况 |
| 3.2.9 利用tTS降低Tet-On 3G系统的背景表达水平 |
| 3.2.10 利用Csy4 降低Tet-On 3G系统的背景表达水平 |
| 3.2.11 利用Tet-On 3G-Csy4 系统控制ie1 基因表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Cre-lox66/77 敲除载体构建 |
| 3.3.2 构建egt基因敲除的AcMNPV载体 |
| 3.3.3 构建Tet-On3G系统控制ie1 基因表达的AcMNPV载体 |
| 3.3.3.1 构建ie1 基因敲除的AcMNPV载体 |
| 3.3.3.2 Tet-On3G系统控制ie1 基因表达的AcMNPV在 sf9 细胞中复制情况 |
| 3.3.3.3 Tet-On3G系统控制ie1 基因表达的AcMNPV在粘虫中复制情况 |
| 3.3.4 利用t TS系统降低Tet-On3G系统的背景表达 |
| 3.3.5 利用Csy4 系统降低Tet-on3G系统背景表达 |
| 3.3.6 利用Tet-On3G-Csy4 系统控制 AcMNPV复制 |
| 3.3.6.1 Tet-On3G-Csy4 系统控制ie1 基因表达的AcMNPV在 sf9 细胞中复制情况 |
| 3.3.6.2 Tet-On3G-Csy4 系统控制ie1 基因表达的AcMNPV在粘虫中复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 转Tet-On3G基因粘虫构建及功能分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 供试昆虫 |
| 4.2.2 质粒和菌株 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 实验试剂 |
| 4.2.5 piggy Bac转座子载体构建 |
| 4.2.6 粘虫胚胎注射 |
| 4.2.7 转基因粘虫鉴定 |
| 4.2.7.1 粘虫DNA检测 |
| 4.2.7.2 PCR鉴定插入位点鉴定 |
| 4.2.7.3 RT-PCR检测Tet-On3G表达情况 |
| 4.2.8 转Tet-On3G基因粘虫功能验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 利用piggy Bac转座子构建转Tet-on3G基因粘虫 |
| 4.3.2 转Tet-On3G基因粘虫鉴定 |
| 4.3.2.1 转Tet-On3G基因粘虫DNA检测 |
| 4.3.2.2 转Tet-On3G基因粘虫m RNA检测 |
| 4.3.2.3 Tet-On3G基因插入位点鉴定 |
| 4.3.3 转Tet-On3G基因粘虫功能验证 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 AcMNPV载体在粘虫基因功能研究中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 供试昆虫 |
| 5.2.2 质粒和菌株 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.2.4 实验试剂 |
| 5.2.5 AcMNPV介导RNAi |
| 5.2.5.1 构建表达dsRNA质粒 |
| 5.2.5.2 在sf9 细胞中质粒介导RNAi效率检测 |
| 5.2.5.3 构建表达dsRNA的 AcMNPV载体 |
| 5.2.5.4 在sf9 细胞中AcMNPV载体介导RNAi效率检测 |
| 5.2.5.5 在粘虫中AcMNPV载体介导RNAi效率检测 |
| 5.2.5.6 统计分析 |
| 5.2.6 AcMNPV介导CRISPR/Cas9 |
| 5.2.6.1 粘虫U6 启动子克隆 |
| 5.2.6.2 粘虫U6 启动子功能验证 |
| 5.2.6.3 Cas9 基因表达盒敲入AcMNPV基因组 |
| 5.2.6.4 Mschs B基因g RNA载体构建 |
| 5.2.6.5 Mschs B基因CRISPR/Cas9 载体构建 |
| 5.2.6.6 AcMNPV载体介导粘虫基因敲除检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 AcMNPV介导RNAi |
| 5.3.1.1 在sf9 细胞中质粒介导RNAi |
| 5.3.1.2 在sf9 细胞中复制可控型AcMNPV载体介导RNAi |
| 5.3.1.3 在粘虫中复制可控型AcMNPV载体介导RNAi |
| 5.3.2 AcMNPV介导CRISPR/Cas9 |
| 5.3.2.1 粘虫U6 启动子克隆 |
| 5.3.2.2 粘虫U6 启动子功能验证 |
| 5.3.2.3 Cas9 基因表达盒敲入AcMNPV基因组 |
| 5.3.2.4 粘虫体内AcMNPV介导基因敲除 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）马铃薯响应青枯菌侵染的蛋白组学分析及StPP1的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 青枯菌的研究进展 |
| 1.1.1 青枯菌的分类 |
| 1.1.2 青枯菌的侵染方式 |
| 1.1.3 青枯菌的致病机理 |
| 1.2 植物与青枯菌互作研究进展 |
| 1.2.1 植物青枯病抗性研究进展 |
| 1.2.2 青枯菌T3Es的研究进展 |
| 1.2.3 马铃薯青枯病抗性的研究进展 |
| 1.2.4 植物蛋白组学在植病互作研究中的应用 |
| 1.3 植物中的蛋白磷酸酶 |
| 1.3.1 蛋白磷酸酶的功能 |
| 1.3.2 PP1 的结构与功能 |
| 1.3.3 蛋白磷酸酶在植物免疫功能上的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 青枯菌菌株 |
| 2.1.3 工程菌株和载体 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆相关实验(PCR,酶切,重组,胶回收,质粒提取) |
| 2.2.2 青枯菌菌株改造 |
| 2.2.3 青枯病抗性鉴定 |
| 2.2.4 GUS染色 |
| 2.2.5 样品制备和蛋白组(iTRAQ法)分析及数据筛选 |
| 2.2.6 病毒诱导的基因沉默(VIGS)分析 |
| 2.2.7 RNA抽提 |
| 2.2.8 c DNA制备 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 农杆菌电击转化 |
| 2.2.11 农杆菌介导的烟草瞬时表达 |
| 2.2.12 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.13 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.14 农杆菌介导的马铃薯的遗传转化 |
| 2.2.15 植物DNA抽提 |
| 2.2.16 酵母双杂交(Y2H)互作验证 |
| 2.2.17 点突变构建-重叠PCR法 |
| 2.2.18 蛋白质原核表达和纯化 |
| 2.2.19 蛋白磷酸酶PP1 的酶活检测 |
| 2.2.20 双分子荧光互补(BiFc) |
| 2.2.21 数据分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 青枯菌Ⅲ型分泌系统的功能鉴定 |
| 3.1.1 青枯菌UW551Ⅲ型分泌系统突变体的构建 |
| 3.1.2 青枯菌T3SS突变体UW551ΔhrcV的表型鉴定 |
| 3.2 马铃薯响应青枯菌侵染的ITRAQ蛋白组分析 |
| 3.2.1 蛋白质鉴定基本信息 |
| 3.2.2 所有鉴定到的蛋白质的GO注释 |
| 3.2.3 差异表达蛋白分析 |
| 3.3 差异表达蛋白在马铃薯根部中的转录水平分析 |
| 3.4 影响下调蛋白丰度的T3ES的筛选 |
| 3.5 对编码下调蛋白的基因抗性相关分析 |
| 3.5.1 通过VIGS沉默编码下调蛋白基因的烟草同源基因 |
| 3.5.2 沉默植株的青枯病抗性鉴定 |
| 3.6 STPP1蛋白磷酸酶酶活鉴定 |
| 3.7 STPP1的亚细胞定位分析 |
| 3.8 STPP1的抗性功能鉴定 |
| 3.8.1 StPP1转基因干涉株系的构建及抗性鉴定 |
| 3.8.2 StPP1转基因超量株系的构建及抗性鉴定 |
| 3.9 STPP1与STMAPK3,STMAPK3和STMAPK16 互作 |
| 3.10 STPP1在青枯菌中互作靶标的筛选及验证 |
| 3.11 RIPAS的功能研究 |
| 3.11.1 RipAS的序列分析 |
| 3.11.2 RipAS的毒力功能验证 |
| 3.12 马铃薯STPP1与RIPAS的互作机制探究 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 植物寄主的根系表型表现为青枯菌定殖的早期症状 |
| 4.2 利用蛋白组学挖掘影响植物免疫的植物基因 |
| 4.3 T3ES在蛋白水平上直接对下调蛋白的丰度产生影响 |
| 4.4 STPP1的免疫调控机制解析 |
| 4.5 RIPAS效应蛋白功能的研究 |
| 4.6 STPP1与RIPAS的互作机制解析 |
| 参考文献 |
| 附录A 本研究所使用到的引物序列 |
| 附录B 马铃薯液体无菌培养方法 |
| 附录C StTOM20,StHSP22,StHBP2,StPP1和33个T3Es的所有共表达结果 |
| 附录D StPP1干涉株系的结薯统计 |
| 附录E 博士期间发表和参与发表的文章 |
| 致谢 |
（3）马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 Abbreviations |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物MAPK级联途径 |
| 1.1.1 植物MAPK级联途径组成 |
| 1.1.2 植物中的MAPKKK |
| 1.1.3 植物中的MAPKK |
| 1.1.4 植物中的MAPK |
| 1.2 植物MAPK级联途径参与植物激素信号转导 |
| 1.2.1 乙烯信号转导 |
| 1.2.2 脱落酸信号转导 |
| 1.2.3 茉莉酸信号转导 |
| 1.2.4 水杨酸信号转导 |
| 1.2.5 生长素信号转导 |
| 1.2.6 油菜素甾醇信号转导 |
| 1.2.7 赤霉素信号转导 |
| 1.3 MAPK级联参与调控植物非生物胁迫 |
| 1.3.1 盐胁迫 |
| 1.3.2 干旱胁迫 |
| 1.3.3 温度胁迫 |
| 1.3.4 氧化应激响应 |
| 1.3.5 臭氧胁迫 |
| 1.3.6 创伤响应 |
| 1.3.7 重金属胁迫 |
| 1.4 植物中磷酸化蛋白组学研究的应用 |
| 1.5 研究内容及目的意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究目的意义 |
| 第二章 马铃薯StMAPKs的差异表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 生化试剂 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 植物材料及处理 |
| 2.1.4.1 非生物胁迫和植物激素处理 |
| 2.1.4.2 马铃薯植株不同组织器官的取样 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 2.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 2.1.5.3 实时荧光定量qRT-RCR分析StMAPKs表达谱 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 非生物胁迫及植物激素处理下的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.2.1.1 脱落酸处理 |
| 2.2.1.2 干旱处理 |
| 2.2.1.3 乙烯处理 |
| 2.2.1.4 赤霉素处理 |
| 2.2.1.5 H_2O_2处理 |
| 2.2.1.6 高温处理 |
| 2.2.1.7 生长素处理 |
| 2.2.1.8 茉莉酸处理 |
| 2.2.1.9 低温处理 |
| 2.2.1.10 NaCl处理 |
| 2.2.1.11 PEG处理 |
| 2.2.1.12 水杨酸处理 |
| 2.2.2 不同组织器官中的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 马铃薯StMAPK3 抗盐和渗透胁迫相关的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生化试剂 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 植物材料及处理 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 3.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 3.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.1.5.5 回收目的片段 |
| 3.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 3.1.5.7 马铃薯StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.1.5.8 酵母双杂试验 |
| 3.1.5.9 双分子荧光互补试验 |
| 3.1.5.10 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 3.1.5.11 盐和渗透胁迫条件下生理指标分析 |
| 3.1.5.12 盐和渗透胁迫条件下生长指标和气孔的分析 |
| 3.1.5.13 盐和渗透胁迫条件下光合指标的分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK3 基因的分离 |
| 3.2.2 载体的构建 |
| 3.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk3 的构建 |
| 3.2.2.3 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.4 酵母双杂表达载体的构建 |
| 3.2.2.5 双分子荧光互补(BiFC)表达载体的构建 |
| 3.2.3 StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.2.4 酵母双杂交筛选与StMAPK3 互作蛋白 |
| 3.2.4.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK3 毒性与自激活检测 |
| 3.2.4.2 StMAPK3 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 3.2.4.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 3.2.5 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 3.2.6 转基因马铃薯的植株的获得与检测 |
| 3.2.7 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生理指标分析 |
| 3.2.8 NaCl、甘露醇和PEG处理下的光合指标分析 |
| 3.2.9 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生长指标及气孔分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 马铃薯StMAPK11 抗旱胁迫相关的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 生化试剂 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 植物材料及处理 |
| 4.1.4.1 马铃薯材料及处理 |
| 4.1.4.2 烟草材料及处理 |
| 4.1.4.3 拟南芥材料及处理 |
| 4.1.5 试验方法 |
| 4.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 4.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 4.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 4.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.5.5 回收目的片段 |
| 4.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 4.1.5.7 马铃薯StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.1.5.8 原核表达马铃薯StMAPK11 蛋白 |
| 4.1.5.9 原核表达马铃薯StMAPK11 重组蛋白抗体制备 |
| 4.1.5.10 Western blot |
| 4.1.5.11 酵母双杂试验 |
| 4.1.5.12 双分子荧光互补试验 |
| 4.1.5.13 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.14 烟草遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.15 拟南芥遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.16 干旱胁迫条件下马铃薯植株生理指标分析 |
| 4.1.5.17 干旱胁迫条件下烟草的生理指标分析 |
| 4.1.5.18 干旱胁迫条件下拟南芥的生理指标分析 |
| 4.1.5.19 干旱胁迫条件下马铃薯植株的生物量和生长指标分析 |
| 4.1.5.20 干旱胁迫条件下光合指标的分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK11 基因的分离 |
| 4.2.2 载体的构建 |
| 4.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk11 的构建 |
| 4.2.2.3 拟南芥和烟草表达载体pART-CAM-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.4 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.5 原核重组表达载体pET28b-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.6 酵母双杂表达载体pGBKT7-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.7 双分子荧光互补(BiFC)试验表达载体的构建 |
| 4.2.3 原核表达StMAPK11 及抗体制备 |
| 4.2.3.1 原核重组StMAPK11 蛋白表达 |
| 4.2.3.2 间接ELISA法检测兔抗StMAPK11 抗血清效价 |
| 4.2.3.3 兔抗StMAPK11 抗血清的Western blot鉴定 |
| 4.2.4 StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.2.5 酵母双杂交筛选与StMAPK11 互作蛋白 |
| 4.2.5.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK11 毒性与自激活检测 |
| 4.2.5.2 StMAPK11 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 4.2.5.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 4.2.6 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 4.2.7 转基因马铃薯植株的获得与检测 |
| 4.2.8 转基因烟草植株的获得与检测 |
| 4.2.9 转基因拟南芥植株获得与检测 |
| 4.2.10 干旱胁迫下的生理指标分析 |
| 4.2.10.1 干旱胁迫下马铃薯植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.2 干旱胁迫下烟草植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.3 干旱胁迫下拟南芥植株的生理指标分析 |
| 4.2.11 干旱胁迫下的光合指标分析 |
| 4.2.12 干旱胁迫下的生长指标及生物量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 马铃薯StMAPK3 磷酸化修饰定量蛋白组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.2.1 总蛋白提取 |
| 5.1.2.2 蛋白质检 |
| 5.1.2.3 蛋白酶解 |
| 5.1.2.4 磷酸化修饰多肽富集 |
| 5.1.2.5 液质检测 |
| 5.1.2.6 蛋白质的鉴定和定量 |
| 5.1.2.7 蛋白质和差异表达蛋白质的功能分析 |
| 5.1.2.8 基序分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 磷酸化蛋白质组学数据质控与鉴定 |
| 5.2.2 磷酸化蛋白功能注释 |
| 5.2.3 磷酸化修饰位点分析 |
| 5.2.4 磷酸化蛋白差异分析 |
| 5.2.5 差异磷酸化蛋白生物信息学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读博士期间发表论文 |
| 导师简介 |
（4）OsMESL基因在水稻叶片衰老及抗病中的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 叶片衰老的研究进展 |
| 1.1.1 叶片衰老类型 |
| 1.1.2 诱导叶片衰老的因素 |
| 1.2 水稻主要病害及植物病原菌侵染机理研究进展 |
| 1.2.1 水稻白叶枯病研究进展 |
| 1.2.2 水稻纹枯病研究进展 |
| 1.2.3 稻瘟病研究进展 |
| 1.2.4 植物病原菌侵染机理研究进展 |
| 1.2.5 植物生长与防御的调控策略 |
| 1.3 OsMESL同源基因研究进展 |
| 1.3.1 OsMESL在拟南芥基因组中的同源基因 |
| 1.3.2 拟南芥中OsMESL同源基因家族研究进展 |
| 1.3.3 OsMESL在其他物种中的同源基因 |
| 1.3.4 OsBI-1 功能研究进展 |
| 1.3.5 硫氧还蛋白研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 水稻材料 |
| 2.2 载体及菌株 |
| 2.3 转化载体构建及遗传转化 |
| 2.4 核酸提取及定量PCR |
| 2.4.1 植物总DNA大量抽提 |
| 2.4.2 RNA提取及定量PCR |
| 2.4.3 RNA的反转录 |
| 2.5 Southern Blotting |
| 2.6 水稻原生质体亚细胞定位分析 |
| 2.7 蛋白互作 |
| 2.7.1 膜系统酵母双杂交筛库及点对点验证 |
| 2.7.2 双分子荧光互补 |
| 2.7.3 荧光素酶酶活恢复实验 |
| 2.7.4 烟草系统Co-IP |
| 2.8 叶绿素含量测定 |
| 2.9 MeJA处理离体叶片 |
| 2.10 台盼蓝染色 |
| 2.11 水稻细胞超微结构透射电镜观察 |
| 2.12 病原菌接种及鉴定,白叶枯病菌细菌生长曲线的绘制 |
| 2.13 活性氧测定 |
| 2.13.1 NBT染色检测超氧阴离子(O_2~-) |
| 2.13.2 H_2O_2定量测定 |
| 2.14 激素含量测定 |
| 2.15 转录组测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 OsMESL在叶片衰老中的功能分析 |
| 3.1.1 T-DNA插入突变体基因型鉴定,超表达、干涉和互补材料的构建及单拷贝株系挑选 |
| 3.1.2 osmesl突变体表现出抽穗后的持绿表型 |
| 3.1.3 互补材料可回复osmesl突变体的表型 |
| 3.1.4 OsMESL超表达、干涉材料叶片的衰老表型分析 |
| 3.1.5 OsMESL亚细胞定位及互作蛋白的筛选、验证 |
| 3.1.5.1 OsMESL亚细胞定位 |
| 3.1.5.2 膜系统酵母双杂交筛库 |
| 3.1.5.3 荧光素酶酶活恢复试验 |
| 3.1.5.4 双分子荧光互补实验 |
| 3.1.6 OsMESL与 OsBI-1 共定位研究 |
| 3.1.7 OsBI-1在osmesl中表达模式及Me JA处理osmesl叶片 |
| 3.1.8 胁迫诱导的细胞死亡在osmesl叶片中显着降低 |
| 3.1.9 osmesl突变体叶片中自噬体数量减少 |
| 3.2 OsMESL基因在水稻抗病中的功能分析 |
| 3.2.1 osmesl表现出对白叶枯病菌、纹枯病菌和稻瘟病菌的显着抗性 |
| 3.2.2 OsMESL基因敲除材料表型鉴定 |
| 3.2.3 osmesl突变体的抗病表型可以通过互补回复 |
| 3.2.4 OsMESL表达模式分析 |
| 3.2.5 RNAi材料表现出与突变体相似的抗病表型 |
| 3.2.6 OsMESL与 OsTrxm互作参与调控细胞ROS水平 |
| 3.2.6.1 OsMESL互作蛋白的筛选及互作验证 |
| 3.2.6.2 OsTrxm基因敲除增强水稻抗病性 |
| 3.2.6.3 OsTrxm蛋白含量在OsMESL表达受阻的植株中降低 |
| 3.2.7 osmesl、RNAi及 OsTrxm-Cas9 突变体中ROS含量升高 |
| 3.2.8 osmesl及 RNAi材料中细菌生长情况分析 |
| 3.2.9 osmesl突变体中JA及抗病相关途径被激活 |
| 3.2.10 转录组结果显示,osmesl中防御途径激活 |
| 4 讨论 |
| 4.1 持绿表型与ROS增加在osmesl突变体中的矛盾探讨 |
| 4.2 OsMESL双重定位的功能探讨 |
| 4.3 osmesl突变体中ROS的积累与广谱抗病性 |
| 4.4 osmesl突变体的抗病过程涉及JA信号途径 |
| 4.5 OsMESL在叶片衰老及植物免疫中的功能探讨 |
| 4.6 OsMESL在水稻中可能的生物学功能讨论 |
| 4.7 关于OsMESL未来工作的一点设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 载体图 |
| 1.1 表达载体p CAMBIA1300S |
| 1.2 表达载体p CAMBIA2301 |
| 附录Ⅱ 组织培养试剂配制与培养基配方 |
| 2.1 相关试剂配制 |
| 2.2 粳稻遗传转化培养基配方 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（5）多组学数据揭示棉花纤维发育转换期的遗传调控机制和重要代谢物（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花纤维发育概述 |
| 1.2 复杂性状的遗传变异解析 |
| 1.2.1 GWAS在植物研究中的应用 |
| 1.2.2 eQTL定位方法 |
| 1.2.3 TWAS的开发及应用 |
| 1.3 代谢组学在植物研究中的应用 |
| 1.3.1 代谢组学概述 |
| 1.3.2 高通量代谢组开发 |
| 1.3.3 代谢组学在植物研究中的应用 |
| 1.3.4 单细胞及亚细胞代谢组 |
| 1.4 类黄酮代谢及木质素与棉花纤维发育 |
| 1.4.1 类黄酮代谢与棉花纤维发育 |
| 1.4.2 木质素与棉花纤维发育 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 GWAS和 eQTL整合解析启动棉花纤维次生细胞壁合成的遗传调控机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 RNA提取和测序 |
| 2.1.3 RNA-Seq数据作图和分析 |
| 2.1.4 基因组SNPs的鉴定 |
| 2.1.5 纤维品质性状的GWAS分析 |
| 2.1.6 表达QTL(eQTL)的鉴定 |
| 2.1.7 TWAS |
| 2.1.8 网络构建 |
| 2.1.9 差异表达基因和GO富集分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 纤维品质性状的GWAS分析 |
| 2.2.2 群体转录组测序和eQTL分析 |
| 2.2.3 纤维品质相关性状的TWAS分析 |
| 2.2.4 eQTL分析揭示不均等的亚基因组转录调控 |
| 2.2.5 eQTL热点和纤维长度调控网络的鉴定 |
| 2.2.6 基因组和转录变异对纤维长度的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 eQTL分析将调控变异与基因转录关联起来 |
| 2.3.2 亚基因间的调控增加了基因转录的调控复杂性 |
| 2.3.3 Hot216 介导的基因调控网络参与植物次生细胞壁的形成 |
| 第三章 棉花自然群体代谢组测定及纤维品质相关代谢物分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料的种植与取样 |
| 3.1.2 代谢组样品的提取与制备 |
| 3.1.3 构建纤维MS2T库的LC-MS的条件与参数 |
| 3.1.4 陆地棉群体15 DPA纤维代谢组的测定 |
| 3.1.5 群体纤维品质测定及数据处理 |
| 3.1.6 代谢组遗传力和CV |
| 3.1.7 聚类、PCA及相关性分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 棉花自然群体代谢组自然变异分析 |
| 3.2.2 15 DPA纤维代谢物相关性分析 |
| 3.2.3 15 DPA纤维代谢物与纤维品质的相关性分析 |
| 3.2.4 纤维品质性状显着相关代谢物分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 15 DPA纤维代谢组分析鉴定到大量纤维品质相关代谢物 |
| 3.3.2 代谢组与多组学的整合解析复杂性状的遗传调控网络 |
| 第四章 类黄酮代谢途径基因GhCHS和 GhDFR在纤维发育中的功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 基因家族鉴定和表达热图分析 |
| 4.1.3 载体构建 |
| 4.1.4 遗传转化与组织培养 |
| 4.1.5 棉花DNA提取和Southern杂交 |
| 4.1.6 总RNA的提取及qRT-PCR基因表达量分析 |
| 4.1.7 纤维品质测定 |
| 4.1.8 类黄酮物质的组织化学染色 |
| 4.1.9 花青素及类黄酮物质含量测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 棉花CHS和 DFR基因家族鉴定和表达模式分析 |
| 4.2.2 GhCHS和 GhDFR干涉转基因棉花材料的创制 |
| 4.2.3 GhCHS和 GhDFR干涉棉花材料表型检测 |
| 4.2.4 干涉GhCHS和 GhDFR表达影响了类黄酮代谢 |
| 4.2.5 GhCHS和 GhDFR参与了棕色棉纤维色素形成 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 GhCHS和 GhDFR在纤维发育中有非常重要的功能 |
| 4.3.2 棉花纤维中存在着复杂的类黄酮代谢 |
| 4.3.3 棕色棉色素成分为类黄酮物质 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（6）杨树转录因子PtERF004耐盐胁迫功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 引言 |
| 第一章 杨树非生物胁迫相关转录因子研究进展 |
| 1.1 非生物胁迫相关转录因子研究进展 |
| 1.1.1 AP2/ERF转录因子研究进展 |
| 1.1.2 其他转录因子研究进展 |
| 1.2 杨树对盐胁迫的适应性研究 |
| 1.2.1 盐胁迫对杨树生长发育的影响 |
| 1.2.2 杨树应答盐胁迫的信号转导途径 |
| 1.3 本文主要研究内容及目的 |
| 1.4 技术路线 |
| 第二章 杨树ERF转录因子耐盐胁迫表达模式分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂、仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PtERF基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2 RNA的提取 |
| 2.2.3 c DNA合成 |
| 2.2.4 RT-qPCR分析 |
| 2.2.5 RNA-Seq分析 |
| 2.2.6 数据统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 序列的获得 |
| 2.3.2 PtERF基因的生物信息学分析 |
| 2.3.3 PtERF基因在盐胁迫条件下的时空表达模式分析 |
| 2.3.4 GO功能注释和富集分析 |
| 2.3.5 KEGG功能注释和富集分析 |
| 2.3.6 基于RNA-Seq的表达模式分析 |
| 2.3.7 表达相关性分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 PtERF004 植物表达载体构建与遗传转化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂、菌株及载体 |
| 3.1.3 培养基配制 |
| 3.1.4 主要药品的配制 |
| 3.1.5 仪器和耗材 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 杨树PtERF004 植物过表达载体的构建 |
| 3.2.2 杨树PtERF004 植物抑制表达载体的构建 |
| 3.2.3 杨树遗传转化 |
| 3.2.4 转基因杨树的鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杨树PtERF004 植物过表达及抑制表达载体构建 |
| 3.3.2 转基因杨树的培育 |
| 3.3.3 转基因杨树的PCR检测 |
| 3.3.4 转基因杨树的RT-qPCR检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 杨树PtERF004 耐盐功能分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 药品的配制 |
| 4.1.4 仪器、耗材及软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PtERF004 基因在转基因杨树中的表达分析 |
| 4.2.2 转基因杨树形态指标测定 |
| 4.2.3 转基因杨树耐盐分析 |
| 4.2.4 转基因杨树生理指标的测定 |
| 4.2.5 ROS相关基因在转基因杨树中的表达分析 |
| 4.2.6 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PtERF004 基因的表达分析 |
| 4.3.2 转基因杨树形态指标分析 |
| 4.3.3 转基因杨树耐盐分析 |
| 4.3.4 转基因杨树的生理指标测定 |
| 4.3.5 ROS相关基因的相对表达水平分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 PtERF004 互作基因鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 主要试剂、菌株及载体 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 RNA测序数据处理与分析方法 |
| 5.2.2 酵母单杂交分析 |
| 5.2.3 NAC045 基因表达量分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 差异表达基因分析 |
| 5.3.2 WGCNA分析 |
| 5.3.3 转录因子分析 |
| 5.3.4 启动子结构分析 |
| 5.3.5 酵母单杂交验证 |
| 5.3.6 NAC045 基因表达量分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 杨树ERF转录因子耐盐胁迫表达模式分析 |
| 6.1.2 杨树PtERF004 耐盐功能分析 |
| 6.1.3 PtERF004 互作基因鉴定 |
| 6.2 主要结论 |
| 6.3 主要创新点 |
| 6.4 不足与展望 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）紫云英NCR基因家族发掘分析及其在类菌体分化固氮中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 豆科植物和根瘤类型 |
| 1.1 豆科植物概述 |
| 1.2 定型与不定型根瘤 |
| 2 类菌体分化研究进展 |
| 2.1 类菌体分化进程 |
| 2.2 NCR家族与类菌体分化调控 |
| 2.3 类菌体分化必需的其它宿主基因 |
| 2.4 根瘤菌对宿主NCR多肽的应答机制 |
| 3 Dual RNA-seq在菌植互作中的应用 |
| 4 研究目的和意义 |
| 5 技术路线 |
| 第二章 紫云英-华癸根瘤菌互作转录组分析 |
| 1 前言 |
| 1.1 豆科植物-根瘤菌共生转录组学研究进展 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 测序质量总体评估 |
| 3.2 华癸根瘤菌7653R基因表达分析 |
| 3.3 紫云英基因表达分析 |
| 3.4 紫云英-根瘤菌权重基因共表达网络分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第三章 紫云英NCR家族的发掘研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 豆科植物中的NCR家族 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 紫云英NCR家族鉴定 |
| 3.2 AsNCR理化性质分析 |
| 3.3 AsNCR进化分析 |
| 3.4 AsNCR序列保守性分析 |
| 3.5 AsNCR多肽抗菌活性预测 |
| 3.6 AsNCR基因差异表达分析 |
| 3.7 AsNCR基因共表达网络分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第四章 紫云英NCR基因功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料质粒和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AsNCR时空表达分析 |
| 3.2 AsNCR多肽体外活性分析 |
| 3.3 AsNCR免疫荧光亚细胞定位 |
| 3.4 AsNCR基因超表达共生表型分析 |
| 3.5 AsNCR基因沉默植株共生表型分析 |
| 3.6 AsNCR组成型表达根瘤菌构建及共生表型分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 第五章 紫云英NCRs互作蛋白筛选和功能分析 |
| 1 前言 |
| 1.1 豆科植物NCR多肽互作蛋白研究 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AsNCR与 M.huakuii7653R伴侣蛋白GroEL相互作用 |
| 3.2 MhGroEL功能分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 全文总结 |
| 本论文创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 紫云英AsNCR多肽理化性质 |
| 附录二 本研究主要引物 |
| 附录三 主要基因及蛋白序列 |
| 附录四 论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）一氧化氮调控能量代谢缓解糙皮侧耳热胁迫损伤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 糙皮侧耳营养价值 |
| 1.2 糙皮侧耳栽培历史及现状 |
| 1.3 环境条件对糙皮侧耳生长发育的影响 |
| 1.4 糙皮侧耳热胁迫响应的研究进展 |
| 1.4.1 转录因子在热胁迫响应中的研究 |
| 1.4.2 功能基因在热胁迫响应中的研究 |
| 1.4.3 信号转导在热胁迫响应中的研究 |
| 1.5 NO信号分子研究进展 |
| 1.5.1 NO的产生及清除 |
| 1.5.2 NO的功能研究进展 |
| 1.5.3 NO的调控途径研究进展 |
| 1.6 食用菌基因功能研究技术 |
| 1.6.1 转录组测序技术 |
| 1.6.2 基因功能验证技术 |
| 1.7 本研究的目的、内容和意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 第二章 NO调控TCA循环及呼吸链缓解糙皮侧耳热胁迫损伤 |
| 2.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.1 实验菌株及培养基 |
| 2.1.2 实验试剂及仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 热胁迫处理 |
| 2.2.2 NO的检测 |
| 2.2.3 ROS的检测 |
| 2.2.4 外源NO的添加实验 |
| 2.2.5 总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.6 菌丝内H_2O_2 含量的测定 |
| 2.2.7 菌丝内MDA含量的测定 |
| 2.2.8 ATP含量检测 |
| 2.2.9 离子渗透率及细胞总呼吸速率的测定 |
| 2.2.10 NAD~+/NADH含量检测 |
| 2.2.11 O2~-产生速率及含量检测 |
| 2.2.12 Western blot |
| 2.2.13 RNA提取和质量检测 |
| 2.2.14 cDNA的制备 |
| 2.2.15 荧光定量PCR(qPCR) |
| 2.2.16 RNA-Seq文库构建及测序 |
| 2.2.17 原始数据质控及转录组组装 |
| 2.2.18 差异表达分析与功能富集 |
| 2.2.19 基因集分析 |
| 2.2.20 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 热胁迫下的表型分析 |
| 2.3.2 热胁迫诱导糙皮侧耳菌丝中NO的积累 |
| 2.3.3 外源NO的添加对热胁迫下菌丝的保护作用 |
| 2.3.4 外源NO抑制热胁迫下菌丝中能量代谢及ROS的产生及积累 |
| 2.3.5 转录组测序数据统计 |
| 2.3.6 样品间相关性分析 |
| 2.3.7 遗传变异数量及分布 |
| 2.3.8 热胁迫及NO响应基因分析 |
| 2.3.9 NO调控热胁迫下菌丝中TCA循环 |
| 2.3.10 NO调控热胁迫下菌丝的氧化还原酶活性及氧化还原过程 |
| 2.3.11 NO影响热胁迫下菌丝的呼吸链中电子传递途径 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 糙皮侧耳aco基因在热胁迫响应中的功能及调控机制 |
| 3.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.1 实验菌株、质粒及培养基 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 aco基因克隆 |
| 3.2.2 aco生物信息学分析 |
| 3.2.3 aco原核表达质粒构建及蛋白纯化 |
| 3.2.4 aco过表达及RNAi质粒构建 |
| 3.2.5 农杆菌感受态的制备 |
| 3.2.6 OE-aco及 RNAi-aco质粒转化农杆菌感受态细胞 |
| 3.2.7 农杆菌介导OE-aco及 RNAi-aco质粒转化糙皮侧耳菌丝 |
| 3.2.8 转化菌株中aco基因表达水平检测 |
| 3.2.9 转化菌株中ACO蛋白表达水平检测 |
| 3.2.10 aco转化菌株对热胁迫抗性检测 |
| 3.2.11 aco转化菌株对H_2O_2 耐受性检测 |
| 3.2.12 aco转化菌株中ACO酶活及柠檬酸(citric acid,CA)含量的检测 |
| 3.2.13 外源添加CA实验 |
| 3.2.14 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 糙皮侧耳aco基因克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.2 糙皮侧耳aco过表达及RNAi质粒构建 |
| 3.3.3 糙皮侧耳转化子的筛选和鉴定 |
| 3.3.4 糙皮侧耳aco转化菌株影响热胁迫后菌丝的恢复生长 |
| 3.3.5 糙皮侧耳aco转化菌株影响菌丝中CA的积累 |
| 3.3.6 外源CA的添加增强了糙皮侧耳菌丝对热胁迫的抗性 |
| 3.3.7 内外源CA含量的升高诱导了aox基因的表达 |
| 3.3.8 NO抑制ACO调控CA含量诱导aox表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 糙皮侧耳aox基因在热胁迫响应中的功能及调控机制 |
| 4.1 实验材料及仪器 |
| 4.1.1 实验菌株、质粒及培养基 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 aox基因克隆 |
| 4.2.2 aox生物信息学分析 |
| 4.2.3 aox过表达及RNAi质粒构建 |
| 4.2.4 农杆菌感受态的制备及质粒转化农杆菌 |
| 4.2.5 农杆菌介导OE-aox及 RNAi-aox质粒转化糙皮侧耳菌丝 |
| 4.2.6 aox转化菌株对热胁迫耐受性检测 |
| 4.2.7 外源添加AOX抑制剂实验 |
| 4.2.8 aox转化菌株对H_2O_2 耐受性检测 |
| 4.2.9 荧光定量PCR |
| 4.2.10 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 糙皮侧耳aox基因克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 糙皮侧耳aox过表达及RNAi质粒构建 |
| 4.3.3 糙皮侧耳aox转化菌株的筛选和鉴定 |
| 4.3.4 aox过表达在40℃热胁迫下减少ROS产生促进菌丝恢复生长 |
| 4.3.5 aox在32℃热处理下的高表达通过促进ROS清除增强菌株耐热性 |
| 4.3.6 aox的诱导表达有助于增强菌丝对H_2O_2 的耐受性 |
| 4.3.7 aox的高表达促进了H_2O_2胁迫下菌丝中抗氧化酶系统基因的表达 |
| 4.3.8 aox在不同温度热胁迫响应中调控途径存在差异 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 有待进一步研究及解决的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）植物挥发性化合物DMNT毒杀小菜蛾的机制解析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植食型昆虫的分类 |
| 1.2 现代化技术对植食昆虫的防治现状 |
| 1.2.1 化学杀虫剂 |
| 1.2.2 植物源杀虫剂 |
| 1.2.3 RNAi技术在农业生产中的应用 |
| 1.2.4 微生物防治 |
| 1.2.5 转基因抗虫技术的应用 |
| 1.3 植物对草食型昆虫的天然防御方式 |
| 1.3.1 间接防御 |
| 1.3.2 直接防御 |
| 1.4 植物天然化合物对微生物的影响 |
| 1.5 脊椎动物与无脊椎动物的先天免疫 |
| 1.6 昆虫的先天免疫 |
| 1.7 昆虫肠道防御系统 |
| 1.7.1 天然物理防御-围食膜 |
| 1.7.2 Duox-ROS防御系统 |
| 1.7.3 Imd免疫通路 |
| 1.8 小菜蛾对农业生产的危害和防治研究 |
| 1.9 研究背景 |
| 1.10 技术路线图 |
| 第二章 DMNT能够驱逐和直接毒杀小菜蛾幼虫 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和昆虫的饲养 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂及试剂配方 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 35Spro:PEN1 转基因拟南芥植株的获得 |
| 2.2.2 35Spro:PEN1 转基因拟南芥纯合植株中PEN1 基因表达量检测 |
| 2.2.3 35Spro:PEN1 转基因拟南芥的生长条件 |
| 2.2.4 35Spro:PEN1 转基因拟南芥对小菜蛾幼虫的气味偏好性选择试验 |
| 2.2.5 小菜蛾幼虫对35Spro:PEN1 转基因拟南芥的强制性取食 |
| 2.2.6 GC-MS(Gas Chromatography and Mass Spectrometry)检测 35Spro:PEN1转基因拟南芥中 DMNT 的含量 |
| 2.2.7 体外化学合成DMNT对小菜蛾幼虫的气味偏好性选择试验 |
| 2.2.8 小菜蛾幼虫强制性取食DMNT试验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 35Spro:PEN1 转基因拟南芥植株阳性苗鉴定 |
| 2.3.2 35Spro:PEN1 转基因拟南芥中PEN1 基因表达量显着上调 |
| 2.3.3 35Spro:PEN1 转基因拟南芥能够驱逐和毒杀小菜蛾幼虫 |
| 2.3.4 挥发性化合物DMNT在35Spro:PEN1 转基因拟南芥中累积 |
| 2.3.5 DMNT能够显着驱赶和抑制小菜蛾幼虫的生长发育 |
| 2.3.6 DMNT对小菜蛾不同龄期幼虫的影响 |
| 2.3.7 DMNT降低小菜蛾幼虫的取食量和排便量 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 DMNT破坏小菜蛾肠道内围食膜屏障 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 试验试剂与配方 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 饥饿试验 |
| 3.2.2 脂肪酶酶活检测 |
| 3.2.3 “Smurf”染料检测幼虫肠道的渗透性 |
| 3.2.4 幼虫食用DMNT后围食膜结构的观察 |
| 3.2.5 幼虫肠道横切片 |
| 3.2.6 qRT-PCR分析 |
| 3.2.7 dsRNA-PxMucin的合成 |
| 3.2.8 dsRNA的饲喂 |
| 3.2.9 RNAseq分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DMNT破坏幼虫肠道完整性 |
| 3.3.2 DMNT破坏幼虫肠道内围食膜结构 |
| 3.3.3 幼虫的转录组分析 |
| 3.3.4 DMNT抑制小菜蛾幼虫肠道内围食膜合成基因PxMucin的表达 |
| 3.3.5 dsRNA-PxMucin的合成 |
| 3.3.6 PxMucin基因沉默后抑制了幼虫的生长发育 |
| 3.3.7 dsRNA-PxMucin脱靶风险较低 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小菜蛾幼虫肠道微生物在DMNT毒杀中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂及配方 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 抗生素处理 |
| 4.2.2 检测抗生素对肠道菌的杀灭效果 |
| 4.2.3 小菜蛾幼虫肠道横切片HE染色 |
| 4.2.4 小菜蛾幼虫肠道横切片革兰氏染色 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抗生素对小菜蛾幼虫生长发育无显着影响 |
| 4.3.2 小菜蛾幼虫肠道内围食膜结构完整性不依赖于肠道微生物 |
| 4.3.3 肠道微生物在DMNT对小菜蛾的致死作用中至关重要 |
| 4.3.4 DMNT对小菜蛾幼虫的致死作用需要肠道微生物的助攻 |
| 4.3.5 围食膜屏障破损后微生物攻击肠道细胞 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 DMNT致使小菜蛾幼虫肠道菌群紊乱 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验试剂及配方 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 16S rDNA测序 |
| 5.2.2 清洁型2 龄幼虫的培养 |
| 5.2.3 小菜蛾幼虫肠道菌的分离与培养 |
| 5.2.4 肠道菌的喂食试验 |
| 5.2.5 DMNT处理后幼虫肠道组织中溶菌酶基因表达量 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PCA(Principal Component Analysis)主成成分分析 |
| 5.3.2 DMNT破坏小菜蛾幼虫肠道内菌群稳态 |
| 5.3.3 DMNT导致幼虫肠道内菌属丰度显着改变 |
| 5.3.4 清洁型2 龄幼虫肠道内大部分微生物被抗生素清除 |
| 5.3.5 肠道微生物帮助DMNT加速小菜蛾幼虫死亡 |
| 5.3.6 DMNT处理后肠道溶菌酶基因表达量降低 |
| 5.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A DMNT 碳普 |
| 附录 B DMNT 氢普 |
| 附录 C pLGNL-35S 载体图谱 |
| 个人简介 |
| 发表论文 |
| 授权专利 |
（10）dsRNA分子设计对RNAi抗马铃薯甲虫效率的影响及在质体介导抗虫中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 RNAi技术及抗虫应用 |
| 1.1.1 RNAi起源与机制 |
| 1.1.2 RNAi抗虫研究 |
| 1.2 RNAi抗虫效率的影响因素 |
| 1.2.1 昆虫种类及发育阶段的影响 |
| 1.2.2 靶标基因特异性的影响 |
| 1.2.3 dsRNA分子长度与序列的影响 |
| 1.2.4 dsRNA分子递送方式与浓度的影响 |
| 1.3 植物介导RNAi抗虫 |
| 1.3.1 植物介导RNAi抗虫研究进展 |
| 1.3.2 植物介导RNAi抗虫影响因素及存在的问题 |
| 1.4 质体介导RNAi抗虫 |
| 1.4.1 质体转化的原理、方法和进展 |
| 1.4.2 质体转化相对与传统核转化的优势 |
| 1.4.3 质体介导RNAi抗虫的进展 |
| 1.5 马铃薯甲虫及其防治 |
| 1.5.1 马铃薯甲虫的分布与危害 |
| 1.5.2 马铃薯甲虫的防治 |
| 1.6 立题依据与研究内容 |
| 第2章 dsRNA长度对RNAi抗马铃薯甲虫效率的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 供试昆虫与植物材料 |
| 2.2.2 仪器设备和试剂耗材 |
| 2.2.3 引物序列 |
| 2.2.4 dsRNA长度设计及合成 |
| 2.2.5 马铃薯甲虫喂食实验 |
| 2.2.6 qRT-PCR检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 凝胶电泳检测不同长度dsACTs的合成 |
| 2.3.2 喂食不同长度dsACTs对马铃薯甲虫存活率的影响 |
| 2.3.3 喂食不同长度dsACTs对马铃薯甲虫体重的影响 |
| 2.3.4 喂食不同长度dsACTs对马铃薯甲虫体内的β-actin表达水平的影响 |
| 2.3.5 喂食不同长度dsACTs马铃薯甲虫的取食情况 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 dsRNA靶向基因不同位置对RNAi抗马铃薯甲虫效率的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 供试昆虫与植物材料 |
| 3.2.2 引物序列 |
| 3.2.3 dsRNA序列的选择及合成 |
| 3.2.4 dsRNA喂食实验 |
| 3.2.5 qRT-PCR检测靶标基因的相对表达水平 |
| 3.2.6 dsRNA序列中有效siRNA位点预测 |
| 3.2.7 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 凝胶电泳检测不同序列dsACTs的体外合成 |
| 3.3.2 喂食不同序列dsACTs对马铃薯甲虫致死率的影响 |
| 3.3.3 喂食不同序列dsACTs对马铃薯甲虫体重的影响 |
| 3.3.4 喂食不同序列dsACTs对马铃薯甲虫体内的β-actin基因表达水平的影响 |
| 3.3.5 喂食不同序列dsACTs对马铃薯甲虫取食状况的影响 |
| 3.3.6 不同序列dsACTs中 siRNA位点预测情况 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 dsRNA与靶标mRNA之间错配率对RNAi抗马铃薯甲虫效率的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 供试昆虫与植物材料 |
| 4.2.2 引物序列 |
| 4.2.3 有效siRNA位点预测及突变位点设计 |
| 4.2.4 dsRNA体外合成 |
| 4.2.5 dsRNA喂食实验 |
| 4.2.6 qRT-PCR检测 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 dsRNA突变引入及设计 |
| 4.3.2 凝胶电泳检测dsRNA突变体体外的合成 |
| 4.3.3 喂食dsACTs突变体对马铃薯甲虫的存活率的影响 |
| 4.3.4 喂食dsACTs突变体对马铃薯甲虫体重的影响 |
| 4.3.5 喂食dsACTs突变体对马铃薯甲虫体内的β-actin基因的表达水平 |
| 4.3.6 喂食dsACTs突变体对马铃薯甲虫取食面积的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 dsRNA长度对质体介导RNAi抗马铃薯甲虫效率的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 马铃薯品种及生长培养条件 |
| 5.2.2 培养基及常用缓冲液、激素 |
| 5.2.3 引物序列 |
| 5.2.4 构建马铃薯质体转化载体 |
| 5.2.5 马铃薯质体转化与筛选 |
| 5.2.6 马铃薯基因组DNA提取及Southern blot验证同质化 |
| 5.2.7 马铃薯植物总RNA提取、纯化、反转录及Northern blot检测dsRNA积累水平 |
| 5.2.8 转基因植物对马铃薯甲虫的抗性测试 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 质体转化载体的构建 |
| 5.3.2 马铃薯质体转化抗性芽的获得 |
| 5.3.3 Southern blot验证抗性芽同质化水平 |
| 5.3.4 Northern blot比较不同长度dsRNA在质体中的积累水平 |
| 5.3.5 Northern blot检测St-ACT200中dsRNA的积累量 |
| 5.3.6 转基因植株表型鉴定 |
| 5.3.7 转基因植株抗虫性试验 |
| 5.3.8 转基因植株上马铃薯甲虫的取食情况 |
| 5.4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、RNAi及其在植物研究中的应用（论文参考文献）
- [1]复制可控型AcMNPV载体构建及其在粘虫基因功能研究中的应用[D]. 周义成. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]马铃薯响应青枯菌侵染的蛋白组学分析及StPP1的功能研究[D]. 王炳森. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究[D]. 朱熙. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [4]OsMESL基因在水稻叶片衰老及抗病中的功能研究[D]. 胡斌. 华中农业大学, 2021(02)
- [5]多组学数据揭示棉花纤维发育转换期的遗传调控机制和重要代谢物[D]. 李中华. 华中农业大学, 2021(02)
- [6]杨树转录因子PtERF004耐盐胁迫功能分析[D]. 黄娟娟. 山西农业大学, 2021
- [7]紫云英NCR基因家族发掘分析及其在类菌体分化固氮中的功能研究[D]. 魏丰. 华中农业大学, 2021(02)
- [8]一氧化氮调控能量代谢缓解糙皮侧耳热胁迫损伤的研究[D]. 侯潞丹. 中国农业科学院, 2021
- [9]植物挥发性化合物DMNT毒杀小菜蛾的机制解析[D]. 陈晨. 安徽农业大学, 2021(01)
- [10]dsRNA分子设计对RNAi抗马铃薯甲虫效率的影响及在质体介导抗虫中的应用[D]. 何弯弯. 湖北大学, 2021(01)