一、分离培养大鼠背根神经节神经元的一种优化培养基（论文文献综述）
林铭雪[1]（2021）在《p38 MAPK通路上调电压门控钠通道Nav1.6在骨癌痛发生中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:基于转录组测序结果分析骨癌痛大鼠背根神经节m RNA表达差异以及相关信号通路的改变。方法:将12只体重150-180g的清洁级雌性SD大鼠随机分为2组:假手术组（Sham组）和骨癌痛组（BCP组）,n=6。Sham组和BCP组大鼠右侧胫骨近端骨髓腔分别注射10μl D-hank’s液或MRMT-1乳腺癌细胞（3×107个/ml）。术前2天与术后4、7、11、14、17、21天分别用Von Frey纤毛测大鼠右后肢机械缩足阈值（mechanical withdraw threshold,MWT）;术后21天影像学观察大鼠胫骨骨质破坏情况;于术后21天取大鼠胫骨进行HE染色观察大鼠骨髓腔的肿瘤细胞浸润情况;同时取背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）进行RNA-Seq,检测m RNA的差异表达情况,并进行GO和KEGG分析,对差异基因可能富集的生物学功能进行分析;采用实时荧光定量PCR（q-PCR）方法验证显着上调及下调的基因表达情况。结果:术后11-21天,BCP组大鼠右后肢MWT明显下降（*P<0.05）,提示大鼠骨癌痛模型构建成功。与Sham组对照,以差异倍数大于1.5倍且FDR（false discovery rate）值小于0.05为条件,RNA-seq筛查到149个表达显着差异的m RNA,上调124个,下调25个,其中Nav1.6与Sham组相比上调22.4倍,位于上调基因前十。富集分析结果表明两组差异表达基因主要集中在细胞信号转导、生物学过程调节、炎症等生理病理过程及相关通路,其中MAPK通路作为重要信号转导通路,是KEGG富集分析中主要富集到的通路之一,与慢性疼痛的发生密切相关。q-PCR结果显示,BCP组与Sham组相比,LOC100911356、Ndst2基因表达升高,而Press29、Epyc、Fcrla基因表达下调,与转录组测序结果一致。结论:SD大鼠胫骨注射MRMT-1乳腺癌细胞可导致骨癌痛发生,其背根神经节中Nav1.6上调与MAPK信号通路发生改变。目的:研究MAPK信号通路对Nav1.6的调控在大鼠骨癌痛发生中的作用。方法:1.为了验证Nav1.6在骨癌痛大鼠中的表达差异,将12只雌性SD大鼠,体重150-180g,随机分为2组:Sham组和BCP组,n=6。建模方法同前,术后21天取大鼠DRG,通过q-PCR、Western Blot及免疫荧光检测大鼠DRG中Nav1.6的表达情况。并进一步研究DRG中Nav1.6敲低是否能缓解骨癌痛的发生,将84只150-180g雌性SD大鼠分为6组（n=14）:Sham组、BCP组、LV-NC组、sh Nav1.6#1组、sh Nav1.6#2组、sh Nav1.6#3组。其中sh Nav1.6#1、sh Nav1.6#2、sh Nav1.6#3组分别于骨癌痛建模术后第7-14d鞘内注射针对Nav1.6基因3个不同靶序列的慢病毒溶液（2×106TU/10μl）,LV-NC组相应的注射空载慢病毒溶液（10μl）。所有组均于术前2d及术后第4d、7d、11d、14d、17d、21d测量大鼠MWT（n=8）。术后14d每组各取6只大鼠DRG进行WB、PCR验证Nav1.6的表达情况。2.为了探究MAPK信号通路是否通过调控Nav1.6表达从而促进骨癌痛发生,我们检测Sham组与BCP组大鼠DRG中p38、JNK和ERK的磷酸化水平。随后将84只SD大鼠随机分为6个组（n=14）:Sham组、BCP组、BCP+SB203580（p38抑制剂）组、BCP+SP600125（JNK抑制剂）组、BCP+U0126（ERK上游MEK抑制剂）组、BCP+Vehicle组。建模后12-14d分别进行鞘内注射SB203580（2μg/10μl）、SP600125（20μg/10μl）、U0126（10μg/10μl）及溶剂（10μl）。术后14d给药前及给药后2、4、6、8h进行MWT测量。各组于第14d给药后4小时取6只大鼠DRG进行Western Blot检测p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38/p38、Nav1.6的表达情况,q-PCR检测Nav1.6m RNA表达量,并通过免疫荧光检测Nav1.6与p-p38的共定位情况。结果:1.骨癌痛大鼠DRG中Nav1.6 m RNA和蛋白表达均升高（*P<0.05 vs Sham组）。2.与BCP组相比,sh Nav1.6#2组、sh Nav1.6#3组Nav1.6 m RNA和蛋白表达显着下调（#P<0.01 vs BCP组）,且机械缩足阈值下降较骨癌痛组明显缓慢。3.BCP组DRG中p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK均升高;BCP+SB203580组、BCP+SP600125组、BCP+U0126组中相应的p38、JNK、ERK蛋白磷酸化被抑制;但只有BCP+SB203580组出现骨癌痛大鼠机械痛阈的升高及Nav1.6表达显着降低。结论:大鼠背根神经节中p38 MAPK通路而非JNK、ERK通路激活,能够上调Nav1.6的表达,促进骨癌痛的发生。
贾晓颖[2]（2021）在《糖络宁对高糖培养下大鼠背根神经元中miR-211及IRE1α-CHOP通路的影响》文中研究说明研究目的本研究从体外角度,针对miR-211及IRE1α-CHOP通路来探讨糖络宁防治糖尿病周围神经病变（DPN）的作用机理。通过基因沉默和过表达,验证miR-211及IRE1α-CHOP通路在DPN发病中的作用。研究方法60只SD大鼠,随机分为2组,正常组35只,糖络宁组25只,分别予以2.5 g/kg-d的糖络宁生药和等量蒸馏水灌胃。连续灌胃10天,制备正常血清和糖络宁血清。新生大鼠提取背根神经元细胞（DRGn）。采用Lipo2000法进行转染,将细胞分为正常组、模型组、抑制剂对照组、抑制剂组、中药组、激动剂中药对照组和激动剂中药组。使用q-PCR 检测 DRGn 细胞中 miR-211、IRE1α、CHOP 和 XBP1 的基因表达水平;Western Blot法检测DRGn细胞中IRE1α、p-IRE1α、XBP1、CHOP蛋白表达;荧光探针法测定DRGn细胞ROS水平,黄嘌呤氧化酶技术检测SOD活性,硫代巴比妥法测定MDA含量。研究结果1.qRT-PCR检测结果:与正常组相比,模型组的miR-211、IRE1α、XBP1、CHOP mRNA值均显着升高（P<0.01）;与模型组相比,中药组、抑制剂组的miR-211、IRE1α、XBP1、CHOP mRNA值均明显降低（P<0.01）,抑制剂对照组无差异（P>0.05）;与中药组相比,激动剂中药组的miR-211、IRE1α、XBP1、CHOP mRNA值升高（P<0.01）,激动剂中药对照组无差异（P>0.05）。2.Western Blot检测结果:与正常组相比,模型组、抑制剂对照组IRE1α、p-IRE1α、XBP1、CHOP蛋白表达明显增高（P<0.01）;与模型组相比,中药组、抑制剂组IRE1α、p-IRE1α、XBP1、CHOP蛋白表达明显降低（P<0.01）,抑制剂对照组无差异（P>0.05）;与中药组相比,激动剂中药组IRE1α、p-IRE1α、XBP1、CHOP蛋白表达明显升高（P<0.01）,激动剂中药对照组无差异（P>0.05）。3.氧化指标检测结果:与正常组相比,模型组的ROS、MDA显着提高（P<0.01）,SOD活力明显减低（P<0.01）;与模型组相比,中药组、抑制剂组ROS、MDA明显减低（P<0.01）,SOD活力增加（P<0.01）,而抑制剂对照组无差异（P>0.05）;与中药组相比,激动剂中药组ROS、MDA升高（P<0.01）,SOD活力减低（P<0.01）,激动剂中药对照组无差异（P>0.05）。结论1.DRGn细胞通过转染miR-211抑制剂和激动剂可构建有效的miR-211低表达和过表达的模型。miR-211抑制剂可使IRE1α-CHOP通路活性减低,进而缓解高糖对DRGn细胞的氧化损伤。miR-211激动剂能增加IRE1α-CHOP通路的活性,进而使糖络宁对高糖诱导的DRGn细胞的抗氧化作用降低。2.高糖可使DRGn细胞中miR-211表达增加,进而激活IRE1α-CHOP通路,引发内质网应激和氧化应激,使细胞受损;糖络宁含药血清可使miR-211水平减低,降低IRE1α-CHOP通路活性,进而改善内质网应激和氧化应激,缓解细胞损伤。本研究表明,糖络宁可改善高糖诱导的DRGn细胞的氧化损伤,这一保护作用可能依赖于糖络宁能下调miR-211的表达,进而抑制高糖下IRE1α-CHOP通路的活性,缓解氧化损伤,改善DPN。
陈枫[3]（2021）在《基于miRNA-211及PERK/CHOP通路研究糖络宁对高糖环境大鼠背根神经元细胞的影响》文中研究指明研究目的本研究通过体外实验从细胞凋亡角度探讨糖络宁对高糖培养环境下的大鼠背根神经元（DRGn）细胞中miR-211及其相关PERK/CHOP通路的作用,为阐明中药糖络宁治疗糖尿病周围神经病变（DPN）的部分机制提供依据。研究方法准备清洁级6～8周SD雄性大鼠60只,随机选择其中25只为中药组（CM组,n=25）,其余为正常组（NG组,n=35）,分别按糖络宁组方生药2.5（kg·d）及等体积蒸馏水灌胃,用于制备TLN组及NC组血清。取孕15d的SD胎鼠用于背根神经节细胞取材。将DRGn细胞接种于6孔板。细胞转染实验则分为7组:正常组（NC组）、模型组（DM组）、糖络宁组（TLN组）、DM+miR-211抑制剂对照组（miR-211iNC组）、DM+miR-211抑制剂组（miR-211i组）、DM+TLN+miR-211 激动剂对照组（miR-211mNC组）、DM+TLN+miR-211激动剂组（miR-211m组）,采用实时荧光定量PCR技术检测DRGn细胞中的miR-211、PERK、elF2α、ATF4、CHOP基因表达水平、采用Western Blot技术检测DRGn细胞中PERK、p-PERK、elF2α、p-elf2α、ATF4、CHOP的蛋白表达水平;流式法检测细胞凋亡。研究结果1.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中miR-211、PERK、elF2α、ATF4、CHOP的RNA表达水平的影响与NC相比,DM组DRGn细胞中miR-211、PERK、elF2α、ATF4、CHOP mRNA水平显着增高（P<0.01）;与DM组相比,TLN组DRGn细胞中miR-211、PERK、elF2α、ATF4、CHOPmRNA水平明显降低（P<0.01）;与DM组相比,miR-211iNC组miR-211、PERK、e1F2α、ATF4、CHOP mRNA水平无明显差异（P>0.05）,而miR-211i组值明显降低;miR-211、PERK、elF2α、ATF4、CHOP mRNA水平显着增高（P<0.01）。与TLN组相比,miR-211mNC的miR-21 1、PERK、elF2α、ATF4、CHOP mRNA水平没有显着改变（P>0.05）,miR-211m组的miR-211、PERK、elF2α、ATF4、CHOP mRNA水平明显增高（P<0.01）。2.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中PERK、p-PERK、elF2α、p-elf2α、ATF4、CHOP蛋白水平的影响Western Blot检测结果:与NC组相比,DM组PERK、p-PERK、e1F2α、p-elF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平明显增高（P<0.01）,elF2α磷酸化水平明显升高（P<0.05）;与DM组相比,TLN组PERK、p-PERK、p-elF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,e1F2α磷酸化水平明显降低（P<0.05）;与DM组相比,miR-211iNC组PERK、p-PERK、elF2α、p-elF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）,而miR-211i组PERK、p-PERK、elF2α、p-elF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与TLN组相比,miR-211mNC组PERK、p-PERK、p-elF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平没有显着改变（P>0.05）,miR-211m组PERK、p-PERK、p-elF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平是明显增高（P<0.05）。3.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞凋亡水平的影响与NC相比,DM组DRGn细胞凋亡水平显着增高（P<0.01）;与DM组相比,TLN组的DRGn细胞凋亡程度明显降低（P<0.01）;与DM组相比,miR-211iNC组细胞凋亡水平无明显差异（P>0.05）,而miR-211i组细胞凋亡水平明显降低（P<0.01）。与TLN组相比,miR-211mNC组的细胞凋亡水平没有显着改变（P>0.05）,糖络宁miR-211m组的细胞凋亡水平明显增高（P<0.01）。结论1.糖络宁可以改善高糖环境下DRGn细胞的细胞凋亡水平;2.糖络宁可能是通过下调miR-211影响其相关PERK/CHOP通路从而而影响细胞凋亡而发挥作用的。
张肖怡[4]（2020）在《脂肪酸对糖尿病大鼠神经损伤和心肌易损性增加的影响和机制》文中研究表明背景:糖尿病神经病变和心血管病变是糖尿病常见又严重的并发症,一旦发生很难逆转,但至今其发病机制仍不明确。以往的研究主要集中在糖尿病高血糖对神经元和心肌细胞的损伤作用,而糖尿病病变中脂肪酸的影响往往容易被忽视。我们的研究发现辣椒素受体（transient receptor potential vanilloid type1,TRPV1）在糖尿病大鼠背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）和心肌的表达量显着降低,饮食中给予辣椒或者辣椒素缓慢激活TRPV1,可以明显改善糖尿病大鼠神经病变和心肌缺血-再灌注损伤的易损性;降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）和P物质（substance P,SP）体外作用也可以保护心肌的缺氧复氧损伤,因此,TRPV1-CGRP/SP的激活在糖尿病神经病变和心血管病变中发挥了重要的保护作用。同时根据文献报道,糖尿病患者体内升高的脂肪酸中有些具有抑制TRPV1的作用,那么这部分脂肪酸对糖尿病神经病变和心肌缺血-再灌注损伤是否具有损伤作用,其作用是否通过抑制TRPV1-CGRP轴,从而抑制了机体的保护作用,具体的作用机制是什么?这是我们实验的主要目的。本实验主要通过对文献中发现报道的糖尿病人体内增多的脂肪酸做筛选,并验证其对TRPV1的作用。用相应的脂肪酸作用于糖尿病大鼠的DRG神经元和对心脏进行体外缺血-再灌注,观察DRG神经元的生长情况和心肌功能的变化,最后进一步探讨其可能的作用机制。目的:（1）检测不同浓度的油酸（oleic acid,OA）对DRG神经元TRPV1通道的作用。（2）用OA作用于糖尿病神经病变大鼠DRG神经元,检测其对TRPV1及其下游降钙素基因相关肽（CGRP）和P物质（SP）以及神经生长因子（NGF）的表达的影响。同时检测DRG神经元氧化应激损伤、线粒体功能、凋亡和轴突的生长情况。用辣椒素（capsaicin）激活TRPV1,检测是否能逆转OA的作用。（3）因为capsaicin激活TRPV1后会刺激释放CGRP,那么CGRP对糖尿病神经病变大鼠DRG神经元是否有保护作用?通过外源性给予CGRP或者慢病毒介导的过表达CGRP后,检测SP和NGF的表达;同时检测糖尿病DRG神经元氧化应激、凋亡、线粒体膜电位和轴突生长情况。（4）用OA体外灌流正常大鼠的心脏,并进行缺血-再灌注（I/R）,检测心功能的变化。进一步给予PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002,简单说明TRPV1在大鼠心脏I/R的作用机制。方法:（1）分离正常和糖尿病成年SD大鼠DRG,原代培养DRG神经元细胞。用钙成像（Fluo4-AM离子探针）的方法检测不同浓度的capsaicin和OA对DRG神经元内Ca2+浓度变化的影响。（2）用STZ诱导产生糖尿病大鼠模型,分离培养其DRG神经元,用capsaicin和OA作用于糖尿病大鼠DRG神经元,检测DRG细胞损伤（LDH检测）、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（JC-1）和凋亡（TUNEL）以及轴突的生长情况（anti-βⅢtubulin antibody）;最后检测TRPV1、CGRP、SP和NGF的m RNA和蛋白的表达情况（PCR、western blot和ELISA）。（3）用过表达CGRP的慢病毒（LV-CGRP）或者体外给予CGRP作用于糖尿病大鼠DRG神经元,检测DRG细胞损伤（LDH检测）、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（JC-1）和凋亡（TUNEL）以及轴突的生长情况（anti-βⅢtubulin antibody）,最后检测CGRP、SP和NGF的m RNA和蛋白的表达情况（PCR、ELISA）。（4）采用Langendorff灌流装置进行离体心脏缺血-再灌注（停灌30min,复灌60min）。给予OA、capsaicin和PI3K的抑制剂LY294002,记录缺血-再灌注后心脏功能:左心室主动收缩压（left ventricular development pressure,LVDP）,左室舒张末期压力（left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP）,心率（heart rate,HR）,左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）以及室性心律失常的发生情况（室性早搏、室速和室颤）。同时检测心肌缺血区PI3K/Akt通路中p-Akt的表达情况（western blot）。结果:（1）体外原代培养大鼠DRG神经元,用PGP9.5对DRG神经元进行鉴定,可以发现DRG神经元生长良好,细胞贴壁后慢慢长出轴突。并且TRPV1和CGRP、SP、NGF在DRG神经元上都有共表达。（2）体外分离、培养正常和糖尿病大鼠DRG神经元,培养24h后进行Ca2+成像。在正常大鼠DRG神经元中,10-7,10-6,10-5 mol/L的辣椒素（capsaicin,Cap）可以浓度依赖性地升高细胞内Ca2+浓度（P<0.001）。用最适浓度10-6 mol/L的Cap分别作用于正常和糖尿病大鼠DRG神经元,糖尿病大鼠DRG神经元内Ca2+浓度增加小于正常大鼠DRG神经元,也验证了糖尿病大鼠DRG中TRPV1的表达减少。先用5×10-8,5×10-7,5×10-6mol/L的油酸（oleic acid,OA）和10-6mol/L辣椒平（capsazepine,Cpz）分别作用于正常大鼠DRG神经元,5×10-6mol/L的OA和10-6mol/L Cpz的作用类似,细胞内Ca2+浓度变化没有明显差别（P>0.05）。相对于Cpz和5×10-6mol/L的OA,5×10-8,5×10-7mol/L的OA均可以升高细胞内Ca2+浓度（P<0.001）。接着给予10-6mol/L Cap,TRPV1受体近一步被激活。Cpz和5×10-6mol/L的OA在Cap作用后,细胞内Ca2+浓度均没有明显的变化（P>0.05）;相对于Cpz和5×10-6mol/L的OA,5×10-8,5×10-7mol/L的OA在Cap作用下,细胞内Ca2+浓度均明显升高（P<0.001）。说明低浓度的OA对TRPV1有一定的激活作用,高浓度的OA作用类似TRPV1的拮抗剂Cpz,对TRPV1受体有抑制作用。（3）OA对糖尿病大鼠DRG神经元的作用:糖尿病大鼠DRG神经元培养液中的乳酸脱氢酶（LDH）浓度升高（P<0.01）,活性氧（ROS）生成增多（P<0.01）,线粒体膜电位（MMP）降低（P<0.01）,细胞凋亡率增加（P<0.01）,DRG神经元轴突增生受损（P<0.01）,再生能力减弱。同时TRPV1、CGRP、SP和NGF的表达不论在蛋白还是m RNA水平均减少（P<0.05）。10-6 mol/L的Cap可以缓解糖尿病大鼠DRG神经元的损伤（P<0.05）,拮抗剂辣椒平（capsazepine,Cpz）可以取消capsaicin的保护作用（P>0.05）。用5×10-6mol/L的OA作用于糖尿病DRG神经元,神经元的损伤没有进一步的增加（P>0.05）,但是用Cap作用后,Cap的保护作用消失（P>0.05）;TRPV1、CGRP、SP和NGF的表达在蛋白和m RNA水平也没有增加（P>0.05）。说明5×10-6mol/L的OA发挥了类似TRPV1拮抗剂的作用,取消了Cap激活TRPV1后对糖尿病大鼠DRG神经元的保护作用。（4）CGRP对糖尿病大鼠DRG神经元的作用:用外源性10-8mol/L的CGRP作用于糖尿病DRG神经元,可以改善糖尿病DRG神经元的损伤,使得细胞的损伤减少（P<0.05）,ROS的生成减少（P<0.01）,升高MMP（P<0.05）,神经元凋亡率减少（P<0.01）,轴突增生增加（P<0.01）;同时10-7mol/L拮抗剂CGRP8-37可以取消CGRP的保护作用（P>0.05）。那么CGRP的作用是否依赖于SP和NGF呢,用LV-CGRP感染糖尿病DRG神经元,DRG神经元的损伤减小（P<0.01）,轴突的增生增加（P<0.01）,同时检测SP和NGF的表达,SP和NGF的m RNA和蛋白的表达都没有明显的增加（P>0.05）。说明CGRP对糖尿病大鼠DRG神经元的损伤具有保护作用,并且其保护作用不依赖SP和NGF。（5）OA缺血预处理对离体大鼠心脏I/R的影响:在缺血前,10-6 mol/L Cap作用后心脏LVDP、HR和±dp/dtmax明显增加（P<0.01）,LVEDP降低（P<0.01）;5×10-6mol/L OA作用后LVDP、HR和±dp/dtmax明显降低（P<0.05）,LVEDP增加（P<0.05）,再给予10-6 mol/L Cap,可以抑制OA对心功能的影响（P>0.05）。再灌注后Cap明显改善I/R对心功能的损伤,LVDP、HR和±dp/dtmax明显升高（P<0.01）,LVEDP降低（P<0.01）。同时Cap可以改善OA对心功能的损伤,LVDP、HR和±dp/dtmax降低（P<0.05）,LVEDP升高（P<0.05）。先给予PI3K的拮抗剂LY294002,再给予Cap,发现Cap的保护作用被取消（P>0.05）。在整个I/R期间,10-6 mol/L Cap作用后,室性早搏的发生次数增加（P<0.05）,室速和室颤的发生次数没有明显的变化（P>0.05）;5×10-6mol/L OA单独作用后,室性早搏的发生次数明显增加（P<0.01）,室速和室颤的发生次数增加（P<0.05）;在OA的基础上再给予Cap,心脏室性早搏（P<0.01）、室速（P<0.01）和室颤（P<0.05）的发生次数均减少。和单独给予Cap相比,给予LY294002后再给予Cap,室性早搏的发生次数减少（P<0.05）。检测心肌缺血区p-Akt的表达,Cap作用后p-Akt的表达增加（P<0.01）,OA和LY294002均可以抑制capsaicin诱导的p-Akt的增加（P<0.01）。说明OA可以通过抑制TRPV1-CGRP轴,抑制PI3K/Akt信号通路,从而加重心肌I/R损伤。结论:（1）OA对TRPV1的作用与浓度有关,低浓度可以轻度激活TRPV1,高浓度抑制TRPV1。（2）糖尿病神经病变大鼠DRG神经元中,TRPV1以及其下游的感觉神经肽CGRP、SP和NGF的表达减少,外源性的给予capsaicin可以改善糖尿病DRG神经元的氧化应激损伤,促进轴突再生。外源性给予大剂量的OA,并不加重糖尿病DRG神经元的损伤,但是减弱了TRPV1激活后的保护作用。（3）CGRP可以保护糖尿病神经病变DRG神经元,并且保护作用并不通过SP和NGF发挥作用。（4）正常大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤中,OA可以加重损伤,并且抑制capsaicin激活TRPV1对I/R损伤的保护,其作用可能是通过PI3K/AKT信号通路来实现的。综上所述:大剂量的OA可以抑制TRPV1受体,从而抑制了TRPV1-CGRP轴激活后对糖尿病大鼠神经病变和心脏缺血-再灌注损伤的保护作用,可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路来实现的。
李逸潇[5]（2020）在《基于miR-200a及MAPKs信号通路研究糖络宁对高糖下大鼠背根神经元的影响》文中研究说明研究目的及意义:本次课题从体外实验角度对糖络宁治疗DPN的可能机制miR-200a及MAPKs信号通路进行验证与探索,以部分阐明中药糖络宁用于临床治疗糖尿病周围神经病变的可能作用机制。研究方法:1.清洁级雄性6-8周SD大鼠60只,按随机数字表分类法随机分为4组:高浓度糖络宁组（15只）,中浓度糖络宁组（15只）,低浓度糖络宁组（15只）,正常组（15只）,分别按糖络宁组方生药5 g/kg·d、2.5 g/kg·d、1.25 g/kg·d和等量蒸馏水灌胃;连续给药10天后制备含药血清和正常对照血清。从新生SD胎鼠取材制备背根神经元细胞（DRGn）。2.将DRGn细胞接种于96孔板,随机分为4组:正常组、50、75、100 mmol/L葡萄糖组,分别培养24、48 h后采用CCK-8法检测各个葡萄糖浓度对DRG细胞活性的影响,确定高糖培养最佳浓度及指标检测适宜时间点。3.将DRGn细胞接种于96孔板,随机分为6组:正常组、2.5%、5%、10%、20%、30%糖络宁含药血清组,分别培养24、48 h后采用CCK-8法检测各个糖络宁含药血清浓度对DRGn细胞活性的影响,确定糖络宁含药血清培养最佳浓度及指标检测适宜时间点。4.将DRGn细胞接种于6孔板,随机分为5组:正常组、高糖组、高浓度糖络宁组、中浓度糖络宁组、低浓度糖络宁组,培养24h后,采用qRT-PCR法检测miR-200a、Jun、Mapk8、Map3k8mRNA 表达量,采用 Western Blot 法检测 Jun、JNK、Map3k8 蛋白表达量,流式法检测细胞凋亡。研究结果:1.CCK-8检测结果:时间比较:24h相比,不同浓度葡萄糖各组,48h后大鼠DRGn细胞活性下降较24 h更低,各浓度葡萄糖组不同时间同浓度比较具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与24h相比,10%糖络宁含药血清中大鼠DRGn细胞活性较48h相比明显下降,有统计学意义（P<0.01）。其他糖络宁含药血清组24 h与48 h相比均有下降,没有统计学意义（P>0.05）。组间比较:在同一时间点,随着高糖浓度的增加,DRGn细胞活性逐渐下降,各浓度葡萄糖组同时间不同浓度比较具有统计学意义（P<0.01）。作用24h后,随着糖络宁含药血清浓度的增加,大鼠DRGn细胞活性呈先高后低的趋势,在10%糖络宁含药血清浓度达到峰值,除5%与2.5%、20%糖络宁含药血清浓度组间比较没有意义（P>0.05）,其余各组间比较均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。作用48 h后,整体趋势与24 h一致,在10%糖络宁含药血清浓度达峰,除5%与2.5%糖络宁含药血清浓度组间比较没有意义（P>0.05）,其余各组间比较均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。分析不同浓度下的葡萄糖及糖络宁含药血清干预后的生长曲线,选定75 mmol/L葡萄糖浓度、10%糖络宁含药血清作为干预浓度,药物作用后的24 h为观察点。2.qPCR检测结果:与正常组相比,高糖组miR-200a、Jun、Map3k8、Mapk8mRNA值明显增高,有统计学意义（P<0.01）。与高糖组相比,糖络宁组各组miR-200a、Jun、Map3k8、Mapk8mRNA值明显降低,有统计学意义（P<0.01）。与中浓度糖络宁组相比,高浓度糖络宁组miR-200a、Jun、Map3k8、Mapk8 mRNA值明显升高,有统计学意义（P<0.01）。低浓度糖络宁组miR-200a、Jun、Mapk8mRNA值明显升高,有统计学意义（P<0.01）。3.Western Blot检测结果:与正常组相比,高糖组JNK1、c-JUN、Map3k8磷酸化蛋白表达及磷酸化水平明显增高,有统计学意义（P<0.01）,Map3k8总蛋白水平明显增高,有统计学意义（P<0.01）,JNK1、c-JUN总蛋白表达无明显变化(P>0.（05）。与高糖组相比,糖络宁组各组JNK1、c-JUN、Map3k8磷酸化蛋白表达及磷酸化水平明显降低,有统计学意义（P<0.01）,总蛋白表达均无明显变化（P>0.05）。分别与高、低浓度糖络宁组相比,中浓度糖络宁组JNK1、c-JUN、Map3k8磷酸化蛋白表达及其磷酸化水平降低幅度更大,有统计学意义（P<0.01）。4.流式检测结果:与正常组相比,高糖组细胞凋亡率明显增高（P<0.01）,有统计学意义;与高糖组相比,糖络宁组各组细胞凋亡率明显降低（P<0.01）,有统计学意义;与低、高浓度糖络宁组相比,中浓度糖络宁组细胞凋亡率明显降低（P<0.01）,有统计学意义。研究结论及意义:1.高糖刺激能抑制大鼠DRGn细胞的活性,糖络宁含药血清能明显改善高糖刺激对大鼠DRGn细胞活性抑制。2.高糖刺激能上调大鼠DRGn细胞中的miR-200a水平,激活MAPKs信号通路进而促进细胞凋亡,糖络宁含药血清,尤其是中浓度糖络宁含药血清能通过抑制miR-200a上调,抑制MAPKs信号通路,明显减少细胞凋亡水平。总的来说,糖络宁可能通过抑制miR-200a表达,影响其介导的MAPK信号通路,降低细胞凋亡水平,减少神经损伤,防治DPN的发生及进展。
刘琴[6]（2020）在《基于miRNA-200a探讨糖络宁改善高糖下大鼠背根神经元氧化应激机制》文中研究表明研究目的本研究从体外实验探讨糖络宁对高糖培养的大鼠背根神经元细胞miR-200a及氧化应激的影响,以部分阐明中药糖络宁用于临床治疗糖尿病周围神经病变的可能作用机制。研究方法SPF级SD大鼠灌胃10天制备糖络宁含药血清及大鼠正常血清。提取并鉴定大鼠背根神经元神经节（DRGn）细胞。采用不同葡萄糖浓度（50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L）、不同浓度糖络宁含药血清（2.5%、5%、10%、20%、30%）培养DRGn细胞,通过CCK-8法检测细胞活性,确定最佳高糖浓度及最佳糖络宁含药血清浓度;运用荧光探针技术检测DRGn细胞中的ROS水平,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力,硫代巴比妥法检测MDA含量;采用实时荧光定量PCR技术检测DRGn细胞中miR-200a、PI3K的基因表达水平;通过Western Blot技术检测DRGn细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达水平。研究结果1.不同浓度葡萄糖及糖络宁含药血清对DRGn细胞活性的影响随着葡萄糖浓度的增加,DRGn细胞活性显着下降,有统计学差异（P<0.01）;50 mmol/L葡萄糖浓度组与75 mmol/L葡萄糖浓度组、75 mmol/L葡萄糖浓度组与100 mmol/L葡萄糖浓度组相比细胞活性均显着下降,有统计学差异（P<0.01）。与24 h相比,各葡萄糖浓度组DRGn在48 h细胞活性均明显下降,有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。随着糖络宁含药血清浓度的增加,DRGn细胞活性呈现先升高后下降的趋势,在糖络宁含药血清浓度为10%时细胞活力最大。其中2.5%浓度组与5%浓度组相比细胞活力无统计学差异（P>0.05）,5%浓度组与10%浓度组相比、10%浓度组与20%浓度组相比、20%浓度组与30%浓度组相比细胞活力均有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。与24 h相比,同一浓度糖络宁含药血清干预下的DRGn在48h的细胞活性均有所下降,10%糖络宁含药血清干预下细胞活性下降有统计学差异（P<0.05）,其余糖络宁含药血清干预下细胞活性下降无统计学差异（P>0.05）。2.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞氧化应激水平的影响与正常组相比,高糖组DRGn细胞中ROS、MDA含量显着增高（P<0.01）,SOD活力显着下降（P<0.01）;与高糖组相比,糖络宁组各组DRGn细胞中ROS、MDA含量显着下降（P<0.01）,SOD活力显着增高（P<0.01）。3.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中miR-200a mRNA、PI3K mRNA表达水平的影响与正常组相比,高糖组DRGn细胞中miR-200amRNA值显着增高（P<0.01）、PI3K mRNA值显着降低（P<0.01）;与高糖组相比,糖络宁组各组DRGn细胞中miR-200a mRNA值显着降低（P<0.01）、PI3K mRNA值显着增高（P<0.01）。4.糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平的影响与正常组相比,高糖组 PI3K、p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-AKT、p-AKT/AKT 蛋白表达水平均显着降低（P<0.01）;与高糖组相比,糖络宁组各组PI3K、p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-AKT、p-AKT/AKT蛋白表达水平均显着增高（P<0.01）。结论1.糖络宁可以改善高糖环境下DRGn细胞的氧化应激水平;2.糖络宁改善高糖培养下的DRGn细胞中氧化应激水平可能是通过调控miR-200a及PI3K/AKT信号通路实现的。
郭凯凯[7]（2019）在《骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠复杂区域疼痛综合征Ⅰ型疗效及作用机制的研究》文中研究表明目的复杂性区域疼痛综合征（Complex regional pain syndrome.CRPS）是一种严重的慢性疼痛疾病,目前尚无针对CRPS的特效治疗。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有多向分化潜能。BMSCs移植在治疗神经系统疾病的研究中取得了积极的效果。本研究拟采用BMSCs移植,观察其对复杂区域疼痛综合征Ⅰ（CRPS-Ⅰ）模型大鼠的治疗效果,并研究其相关的作用机制。方法（1）通过全骨髓粘附法体外分离,培养和纯化正常SD大鼠的骨髓组织中的BMSCs。（2）建立CRPS-Ⅰ型大鼠动物模型,并将实验大鼠随机分为空白组（未接受任何干预的大鼠）,模型组（未接受任何干预的CRPS-Ⅰ型大鼠模型）,治疗组（接受鞘内BMSCs移植治疗的CRPS-Ⅰ型大鼠模型）,对照组（接受鞘内细胞培养基注射的大鼠）;每组15只。机械性缩足反射阈值（Mechanical withdrawal threshold,MWT）和热缩足反射潜伏期（Thermal withdrawal latency,TWL）检测大鼠痛阈来评估治疗效果。（3）免疫荧光染色检测干预前后大鼠背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）免疫荧光表达强度。（4）实时荧光定量PCR检测干预前后大鼠DRG脑源性神经营养因子BDNF、降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide,CGRP）、P物质（Substance-P,SP）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）和白介素-6（Interleukin6,IL-6）和电压门控钠通道亚型Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9在mRNA水平的表达。（5）Western-blot检测干预前后大鼠DRG脑源性神经营养因子BDNF、CGRP、SP、TNF-α和IL-6和电压门控钠通道亚型Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9在蛋白水平的表达结果（1）显微镜观察,干细胞表型分析和脂肪形成/成骨诱导的分化证实获得的细胞是 BMSC。（2）模型组和对照组大鼠DRG的BDNF免疫荧光强度显着高于空白组（P<0.05）。BMSCs移植后治疗组大鼠DRG中BDNF的免疫荧光强度则明显减弱,低于模型组和对照组的表达强度（P<0.05）。（3）CRPS-I型大鼠TWL值和MWL值均显着降低（P<0.05）。经鞘内移植BMSCs后,治疗组大鼠TWL值在术后7、10及14天TWL值分别为（1.27±0.36s、1.49±0.31s和1.52±0.35s）;MWL值在术后7、10及14天TWL值分别为（3.54±0.32s、5.26±0.29s和6.44±0.30s）;明显高于模型组和对照组大鼠,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）CRPS-Ⅰ型大鼠背根神经节中BDNF、CGRP、SP、TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白的表达明显升高,高于空白组大鼠（P<0.05）。而经鞘内移植BMSCs后,背根神经节中BDNF、CGRP、SP、TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白的表达均有明显降低（P<0.05）。（5）CRPS-Ⅰ型模型组大鼠背根神经节组织中Nav1.7、Nav1.8、和Nav1.9mRNA和蛋白的表达显着增强,高于空白组组大鼠背根神经节组织中的表达（P<0.05）。经鞘内移植BMSCs后,治疗组大鼠背根神经节组织中Nav1.7、Nav1.8、和Nav1.9的表达出现降低,低于同模型组大鼠背根神经节组织中的表达（P<0.05）。结论BMSCs移植能够改善CRPS-Ⅰ型模型大鼠的疼痛和痛觉过敏。其机制可能与减少受损神经组织中神经肽和炎症细胞因子的释放,以及抑制VGSCs中相关亚型活性有关。
詹鹏[8]（2019）在《NRG-1通过ITGB1/FAK/AKT通路促进Ⅰ型糖尿病大鼠背根神经节神经元轴突生长的研究》文中认为研究目的:探究ITGB1/FAK/AKT通路在神经调节蛋白-1（NRG-1）促进Ⅰ型糖尿病大鼠背根神经节神经元轴突生长中的作用,明确轴突再生的机制,为改善糖尿病患者晚期神经病变感觉减退提供理论支持。实验方法:取180-210 g左右的成年雄性SD大鼠,使用链脲佐菌素（STZ）诱导出Ⅰ糖尿病;诱导成功八周后,按照Goldenberg SS等人方法提取大鼠脊髓背根神经节神经元细胞,采用Tubulin-βⅢ特异性荧光染色对所得神经元细胞进行鉴定。通过蛋白定量及轴突长度分析明确NRG-1对糖尿病大鼠神经元生长的促进作用,并采用RT-qPCR及western blot手段分析ITGB1/FAK/AKT信号通路在NRG-1处理前后的表达变化情况,最后设计ITGB1特异性siRNA阻断上述通路,从而明确该通路在NRG-1促进Ⅰ型糖尿病大鼠背根神经节神经元轴突生长中的作用。实验结果:通过血糖、体重测定等方法,证实本研究中Ⅰ型糖尿病大鼠诱导成功。Tubulin-βⅢ荧光染色表明所得细胞是神经元细胞,且纯度在90%以上。RT-qPCR及western blot结果表明,与正常大鼠相比,糖尿病大鼠中ITGB1/FAK/AKT通路表达显着降低,而NRG-1的加入能够显着促进轴突生长,并上调该通路,且使用siRNA阻断该通路后,NRG-1的促轴突生长作用被部分逆转。结论:NRG-1能够促进Ⅰ型糖尿病大鼠背根神经节神经元轴突的生长,且ITGB1/FAK/AKT通路在此过程中发挥了关键作用。
董甜甜[9]（2019）在《资木瓜总苷通过MC-Histamine-HR1-TRPA1-DRG途径产生RA关节镇痛作用》文中认为目的:研究资木瓜总苷通过抑制肥大细胞活化,减少炎性因子产生,从而减轻对背根神经节神经细胞的活化作用,达到对类风湿关节炎（RA）关节镇痛的作用。方法:（1）小鼠骨髓来源肥大细胞（m BMMC）的培养及鉴定:分离提取C57BL/6小鼠骨髓来源的细胞,诱导分化培养4周后,进行TB染色和电镜观察,鉴定为m BMMC。（2）小鼠背根神经节神经细胞（DRGn）的培养及鉴定:分离提取C57BL/6小鼠的脊髓背根神经节,酶解消化成单细胞后培养1周,进行免疫细胞化学和免疫荧光鉴定为DRGn。（3）CCK-8和MTT法检测不同浓度资木瓜总苷对m BMMC、RBL-2H3细胞和DRGn的毒性作用。（4）β-氨基己糖苷酶（β-Hexosaminidase）法检测m BMMC和RBL-2H3细胞活化脱颗粒情况。（5）建立共培养体系:组胺标准品与DRGn共培养,m BMMC与DRGn共培养,分别加入H1受体拮抗剂和TRPA1拮抗剂。（6）ELISA检测肥大细胞培养液中组胺（Histamine）含量、共培养体系中P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）含量。（7）Western blot检测DRGn的PLC-γ1蛋白和TRPA1蛋白的表达。结果:（1）经过鉴定,所提取培养的原代m BMMC和DRGn纯度均达到90%以上。（2）细胞毒性检测,资木瓜总苷浓度在0.01-0.32mg/ml之间时对m BMMC、RBL-2H3细胞和DRGn几乎无毒性。（3）资木瓜总苷可显着降低经化合物C48/80刺激m BMMC和RBL-2H3细胞释放的β-Hexosaminidase的释放率（P<0.01）。（4）资木瓜总苷可显着抑制m BMMC和RBL-2H3细胞释放Histamine的含量（P<0.01）。（5）在组胺标准品与DRGn共培养中,随着Histamine浓度的增高,DRGn释放的神经肽SP也随之增高,而加入H1受体拮抗剂后,SP相应地减少（P<0.05）。（6）在m BMMC与DRGn共培养体系中,分别加入资木瓜总苷、H1受体拮抗剂和TRPA1拮抗剂处理12h后,SP和CGRP的含量相应地减少,PLC-γ1和TRPA1蛋白表达量也减少（P<0.05）。结论:（1）资木瓜总苷浓度在0.01-0.32mg/ml之间对m BMMC的存活无影响,且随着药物浓度增高抑制肥大细胞活化脱颗粒。（2）Histamine能通过HR1呈浓度依赖性地引起DRGn释放SP。（3）资木瓜总苷可能是通过抑制MC-Histamine-HR1-TRPA1-DRG途径发挥类风湿关节炎镇痛作用。
戴晨[10]（2019）在《810nm弱激光对M1型骨髓源性巨噬细胞的调控作用及其机制研究》文中指出脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的修复是尚未解决的世界性难题。研究表明,减轻继发性损伤是促进SCI修复和改善患者临床预后的关键环节。巨噬细胞（M?）是参与SCI继发性损伤最重要的炎症细胞。应答于损伤区内环境中不同的细胞因子,巨噬细胞表现出M1和M2两种细胞表型。其中,对SCI修复起负面作用的M1型巨噬细胞不仅数量众多,且分布广泛,在病程中占据主导地位;而起正面作用的M2型巨噬细胞仅一过性增高,且分布相对集中。巨噬细胞这种不平衡的极化特性,是SCI修复不可逆的重要因素之一。调节SCI后M1/M2型巨噬细胞的比例,特别是抑制M1的表达数量,减轻炎症反应可显着促进损伤脊髓的功能恢复。药物干预、细胞移植等现有研究手段,虽能在一定程度调整巨噬细胞极化,但存在药物安全窗窄、免疫排斥反应、临床难以有效实施开展等多种不足,亟需寻找一种更安全、有效、简便可行的治疗方法。弱激光治疗（Low-level LaserTherapy,LLLT）,作为一种经典的物理治疗手段,具有安全、无创、实施简便等优点以及显着的抑炎、促修复作用,目前已广泛应用于皮肤病损、外周神经损伤等临床多个领域。课题组前期研究发现,LLLT可以减轻SCI大鼠损伤部位的炎症反应,抑制胶质瘢痕的形成,促进运动功能的恢复;初步的临床试验结果也证实了LLLT具有促损伤修复的效应。深入研究发现,LLLT可以调节SCI后大鼠损伤区巨噬细胞的极化状态,下调M1的数量,抑制促炎因子TNF-α、IL-13、IL-1β的分泌;上调M2的比例,促进抑炎因子IL-4和神经营养因子BDNF的分泌,增加神经元存活与轴突再生,促进脊髓损伤修复。但是,LLLT是否可以在体外直接作用于M1型骨髓源性巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophage,BMDM）,发挥调控M1表型极化和分泌的作用?这种调控作用是以何种途径实现的?在促脊髓损伤修复中的作用是什么?这几点尚不明确。已往研究表明,NF-κB信号通路在调控M1型巨噬细胞极化过程中扮演着重要角色。激活NF-κB可促进巨噬细胞向M1方向极化。那么,NF-κB信号通路是否参与LLLT调控M1表型极化?LLLT条件下NF-κB是如何调控巨噬细胞极化的?带着上述问题,我们开展了以下三方面的研究。实验一:810nm弱激光对M1-BMDM表型极化的影响目的:研究弱激光照射对原代M1型巨噬细胞活性及极化水平的作用方法:Balb/c小鼠骨髓中分离培养原代巨噬细胞,LPS+IFN-γ刺激诱导巨噬细胞M1表型极化,采用流式细胞术检测培养和极化情况。将成熟的M1型巨噬细胞随机分为弱激光照射组与对照组。照射组采用输出功率2mW/cm2、光斑面积4.5cm2,通过照射时长44s、440s、1111s,分别获得0.4J、4J和10J能量参数照射组;对照组置于暗箱,不给于照射。照射后2和24小时,使用CCK-8法对各组细胞进行活性检测,RT-qPCR检测各组细胞iNOS的mRNA表达水平。照射后24小时,Western-blot检测各组细胞iNOS蛋白的表达水平,免疫荧光染色检测各组细胞iNOS蛋白的表达及定位。结果:各能量参数弱激光照射后2小时,对应各组细胞的活性均未发生明显改变;4J组弱激光照射后24小时,细胞活性显着提高。各量参数弱激光照射后2小时,对应各组细胞iNOS的mRNA水平均未发生明显改变;照射后24小时,对应各组细胞iNOS的mRNA水平较对照组均显着下调,以4J组下调效果最为明显。照射后24小时,较对照组,0.4J和4J组显着下调iNOS蛋白水平,4J组效果较0.4J组更为明显。iNOS+细胞比例在0.4J和4J组也显着降低,4J组较0.4J组下降趋势更为显着。结论:810nm弱激光抑制M1-BMDM表型极化的作用在剂量和反应时长上具有一定的依赖性,且所选参数是安全可靠的。实验二:810nm弱激光调控M1-BMDM分泌对神经元轴突的影响目的:研究弱激光影响M1-BMDM分泌对被根神经节细胞轴突的作用方法:弱激光照射条件和细胞分组同实验一。各组弱激光照射后24小时,RT-qPCR检测M1-BMDM促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA水平,ELISA法检测M1-BMDM上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、BDNF及NGF的浓度,免疫荧光染色法检测经弱激光照射后M1-BMDM上清过继培养背根神经节细胞24小时后,其轴突生长长度,Western-blot检测转录因子NF-κBp65及其磷酸化蛋白表达水平。照射后2小时和24小时,探针检测M1-BMDM中ROS的含量。结果:照射后24小时,较对照组,各照射组TNF-α和IL-1β的m-RNA表达显着下调,IL-1β的分泌也被显着抑制;4J和10J照射组TNF-α的分泌水平及典极化转录因子NF-κB p65及其磷酸化蛋白表达显着下调;4J照射组IL-6的m-RNA表达和分泌被显着抑制,神经营养因子BDNF和NGF分泌水平显着上调。照射后2小时,较对照组,10J组M1-BMDM中ROS含量显着上升,24小时后,较对照组,4J组ROS含量显着降低。上清移液培养背根神经节细胞24小时后,较对照组,4J及10J组的上清液显着促进背根神经节细胞轴突的生长。结论:弱激光照射可以显着抑制M1-BMDM分泌促炎因子,减弱氧化应激水平,且这种作用可能是通过抑制NF-κB p65及其磷酸化蛋白表达的途径实现的,此外,弱激光具有促进M1-BMDM神经营养因子分泌帮助神经元轴突生长的作用。实验三:810nm弱激光通过Nrf2/NF-κB信号通路调控M1-BMDM表型极化目的:研究弱激光调控M1-BMDM表型极化的机制方法:将细胞分为对照组、M1组、M1+LLLT组、M1+LLLT+Nrf2-si-RNA组,选4J能量参数810nm弱激光对M1+LLLT组和M1+LLLT+Nrf2-si-RNA组进行照射,其余两组置于暗箱,不给于照射。照射后24小时,运用Western-blot检测各组细胞iNOS、Nrf2、NF-κbp65、p-NF-κbp65、p-Ikk-β、IκB-α及p-IκB-α的蛋白表达水平。运用RT-qPCR检测各组细胞中iNOS、Nrf2、NF-κbp65、TNF-α、IL-1β及IL-6的m-RNA表达水平。运用ELISA检测各组细胞TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌水平。运用免疫荧光染色和Western-blot检测Nrf2和NF-κbp65的入核水平。结果:我们建立了一个体外M1型骨髓源性巨噬细胞（M1-BMDMs）弱激光疗法模型,结果表明,弱激光照射可以激活M1型骨髓源性巨噬细胞的抗氧化应激经典转录因子Nrf2,同时抑制经典IKK-β/IκBα/NF-κB p65信号通路。通过RNA干扰技术使Nrf2沉默,我们构建了M1-BMDM弱激光疗法的体外模型,进一步研究弱激光调节NF-κB p65的特异性机制。研究结果显示通过沉默Nrf2,可以逆转弱激光疗法对IKK-β/IκB-α/NF-κB p65信号通路的调节作用,而且M1-BMDM分泌的促炎因子也表现出了一致的变化。结论:弱激光调控Nrf2/ikk-β/ikb-α/NF-κBp65信号通路抑制M1型巨噬细胞的表型极化和促炎因子分泌。
二、分离培养大鼠背根神经节神经元的一种优化培养基（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、分离培养大鼠背根神经节神经元的一种优化培养基（论文提纲范文）
（1）p38 MAPK通路上调电压门控钠通道Nav1.6在骨癌痛发生中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分:基于转录组测序结果分析骨癌痛大鼠背根神经节mRNA表达差异 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 实验药品、试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 骨癌痛模型建立 |
| 2.2 实验动物及分组 |
| 2.3 影像学检查 |
| 2.4 机械痛阈的测定 |
| 2.5 骨癌痛大鼠背根神经节提取 |
| 2.6 骨组织病理检查(HE染色) |
| 2.7 骨癌痛大鼠背根神经节m RNA表达谱的检测 |
| 2.8 实时荧光定量PCR(q-PCR) |
| 2.9 统计分析处理 |
| 结果 |
| 1.胫骨内注射乳腺癌细胞MRMT-1 引起雌性SD大鼠骨痛 |
| 2.骨癌痛引起大鼠DRG中 mRNA的差异表达 |
| 3.qPCR法验证mRNAs表达差异 |
| 4.骨癌痛大鼠与假手术大鼠差异表达mRNA的 GO分析 |
| 5.骨癌痛大鼠与假手术大鼠差异表达mRNA的 KEGG分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分:p38 MAPK通路上调Nav1.6 通道在骨癌痛发生中的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 实验药品、试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 针对Nav1.6 基因的慢病毒载体构建和包装 |
| 2.2 鞘内置管 |
| 2.3 药物准备 |
| 2.4 实验分组 |
| 2.5 Western Blot |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 统计分析处理 |
| 结果 |
| 1.Nav1.6 在骨癌痛大鼠背根神经节中的表达升高 |
| 2.抑制DRG中 Nav1.6 表达可改善骨癌痛大鼠机械痛敏 |
| 3.骨癌痛大鼠背根神经节中MAPK信号通路磷酸化激活 |
| 4.鞘内注射p38 MAPK抑制剂明显升高骨癌痛大鼠机械痛阈 |
| 5.鞘内注射P38 MAPK抑制剂降低DRG中 Nav1.6 的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 电压门控钠通道在慢性疼痛中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的科研学习成果 |
| 致谢 |
（2）糖络宁对高糖培养下大鼠背根神经元中miR-211及IRE1α-CHOP通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 综述 |
| 综述1 糖尿病周围神经病变的中西医认识 |
| 一. 中医认识 |
| 二. 西医认识 |
| 三. 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述2 microRNA对糖尿病慢性并发症影响 |
| 一. miRNA |
| 二. miRNA与糖尿病慢性并发症 |
| 三. 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 实验用药 |
| 3. 仪器 |
| 4. 试剂 |
| 方法 |
| 1. 糖络宁含药血清及正常大鼠血清的制备 |
| 2. 大鼠DRGn细胞的分离培养 |
| 3. 干预分组 |
| 4. 细胞转染 |
| 5. q-PCR法检测miR-211及IRE1α-CHOP通路相关基因表达水平 |
| 6. Western Blot法检测IRE1α-CHOP通路相关蛋白的表达水平 |
| 7. 氧化指标的检测 |
| 8.数据分析 |
| 结果 |
| 1. DRGn细胞生长情况 |
| 2. 糖络宁对DRGn细胞miR-211及IRE1α-CHOP通路相关基因表达的影响 |
| 3. 糖络宁对DRGn细胞IRE1α-CHOP通路相关蛋白表达的影响 |
| 4. 糖络宁对DRGn细胞氧化应激水平的影响 |
| 讨论 |
| 1. miR-211在疾病中的作用 |
| 2. 氧化应激与DPN |
| 3. 内质网应激与DPN |
| 4. miR-211与内质网应激、氧化应激 |
| 5. 糖络宁对内质网应激和氧化应激的作用 |
| 6. 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）基于miRNA-211及PERK/CHOP通路研究糖络宁对高糖环境大鼠背根神经元细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一：糖尿病周围神经病变的中医研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：糖尿病周围神经病变的西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 1 实验动物 |
| 2 实验用药 |
| 3 主要仪器设备 |
| 4 主要试剂 |
| 方法 |
| 1 糖络宁含药血清及正常大鼠血清的制备 |
| 2 大鼠DRGn细胞的分离培养 |
| 3 分组及培养基的配置 |
| 4 细胞转染 |
| 5 实时荧光定量PCR技术检测miR-211、PERK、elF2α、ATF4和CHOP mRNA的表达水平 |
| 6 运用Western Blot技术检测DRGn中PERK/CHOP信号通路相关蛋白表达水平 |
| 7 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 DRGn细胞生长情况 |
| 2 糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中miR-211 mRNA水平的影响 |
| 3 糖络宁对大鼠DRGn细胞PERK/CHOP信号通路相关蛋白的影响 |
| 4 糖络宁对大鼠DRG细胞凋亡水平的影响 |
| 讨论 |
| 1 miR-211在DPN中的作用 |
| 2 糖络宁与PERK/CHOP通路 |
| 3 miR-211抑制表达和激动表达与PERK/CHOP通路 |
| 4 内质网应激、细胞凋亡与DPN |
| 5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）脂肪酸对糖尿病大鼠神经损伤和心肌易损性增加的影响和机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠背根神经节(DRG)神经元分离培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞生长状态和鉴定 |
| 2.2 TRPV1和CGRP、SP、NGF在 DRG神经元上共表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 油酸在糖尿病大鼠DRG神经元损伤中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验溶液配方 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 DRG内 Ca2+浓度的变化 |
| 2.2 各组TRPV1 的表达 |
| 2.3 各组CGRP的表达 |
| 2.4 各组SP的表达 |
| 2.5 各组NGF的表达 |
| 2.6 各组LDH的表达 |
| 2.7 各组凋亡情况 |
| 2.8 各组活性氧(ROS)生成情况 |
| 2.9 各组线粒体膜电位(MMP)变化 |
| 2.10 各组DRG神经元轴突增生情况(neurite outgrowth) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 CGRP在糖尿病大鼠DRG神经元损伤中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CGRP对糖尿病DRG神经元活性的影响 |
| 2.2 CGRP对糖尿病DRG神经元凋亡的作用 |
| 2.3 CGRP对糖尿病DRG神经元活性氧生成的作用 |
| 2.4 CGRP对糖尿病DRG神经元线粒体膜电位的作用 |
| 2.5 CGRP对糖尿病DRG神经元轴突生长的作用 |
| 2.6 LV-CGRP转染糖尿病DRG神经元 |
| 2.7 LV-CGRP对糖尿病DRG神经元活性的影响 |
| 2.8 LV-CGRP对糖尿病DRG神经元轴突生长的作用 |
| 2.9 LV-CGRP对 DRG神经元SP和 NGF蛋白表达的影响 |
| 2.10 LV-CGRP对 DRG神经元SPmRNA和 NGFmRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 OA在大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各项心脏功能指标及意义 |
| 2.2 OA对正常大鼠离体心脏心功能的影响 |
| 2.3 I/R室性心律失常 |
| 2.4 心肌缺血区p-Akt的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）基于miR-200a及MAPKs信号通路研究糖络宁对高糖下大鼠背根神经元的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 综述 糖尿病周围神经病变的中西医文献综述 |
| (一) DPN的西医研究进展 |
| (二) DPN的中医研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 一、实验动物及实验环境 |
| 二、实验主要药品 |
| 三、实验试剂 |
| 四、实验仪器 |
| 实验方法 |
| 一、糖络宁含药血清及正常大鼠含药血清的制备 |
| 二、SD胎鼠DRG的分离培养及纯化 |
| 三、DRGn细胞的NSE免疫荧光鉴定 |
| 四、CCK-8法检测糖络宁含药血清对高糖培养细胞活性的影响 |
| 五、运用实时荧光定量PCR技术检测DRGn中miR-200a、Jun、Mapk8、Map3k8mRNA表达水平 |
| 六、运用Western Blot技术检测DRG中MAPKS信号通路相关蛋白表达水平 |
| 七、运用流式法检测DRG的细胞凋亡水平 |
| 实验结果 |
| 一、DRGn细胞生长情况 |
| 二、DRGn细胞的NSE免疫荧光鉴定 |
| 三、不同浓度葡萄糖及糖络宁对大鼠DRGn细胞活性的影响 |
| 四、糖络宁对大鼠背根神经元细胞miR-200a、MAPKs信号通路相关基因表达的影响 |
| 五、糖络宁对大鼠背根神经元细胞MAPKs信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 六、糖络宁对大鼠DRG细胞凋亡水平的影响 |
| 讨论 |
| 一、DRGn的分离培养及干预条件的确定 |
| 二、糖络宁含药血清对高糖培养的DRGn细胞活性的影响 |
| 三、糖络宁含药血清对高糖培养下的DRGn细胞凋亡影响的机制 |
| 四、问题与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）基于miRNA-200a探讨糖络宁改善高糖下大鼠背根神经元氧化应激机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述1 糖尿病周围神经病变的中医认识 |
| 1. 病名认识 |
| 2. 病因病机 |
| 3. 临床治疗 |
| 4. 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述2 microRNA在糖尿病慢性并发症中的研究进展 |
| 1. miRNA |
| 2. miRNA与糖尿病慢性并发症 |
| 3. 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 实验用药 |
| 3. 主要仪器设备 |
| 4. 主要试剂 |
| 方法 |
| 1. 糖络宁含药血清及正常大鼠血清的制备 |
| 2. 大鼠DRGn细胞的分离培养 |
| 3. DRGn细胞的NSE免疫荧光鉴定 |
| 4. CCK-8法测定DRGn细胞活性 |
| 5. 分组及培养基的配置 |
| 6. 氧化应激水平的测定 |
| 7. 实时荧光定量PCR技术检测miR-200a mRNA、PI3K mRNA的表达水平 |
| 8. Western blot技术检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表达水平 |
| 9. 统计学方法 |
| 结果 |
| 1. DRGn细胞生长情况 |
| 2. DRGn细胞NSE免疫荧光鉴定 |
| 3. 不同浓度葡萄糖及糖络宁含药血清对DRGn细胞活性的影响 |
| 4. 糖络宁对高糖培养下DRGn细胞氧化应激水平的影响 |
| 5. 糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中miR-200a mRNA、PI3K mRNA表达水平的影响 |
| 6. 糖络宁对高糖培养下DRGn细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的影响 |
| 讨论 |
| 1. 氧化应激机制在DPN中的作用 |
| 2. 糖络宁对氧化应激的影响 |
| 3. miR-200家族在DPN中的作用 |
| 4. 糖络宁对PI3K/AKT信号通路的调控 |
| 5. 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠复杂区域疼痛综合征Ⅰ型疗效及作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠复杂区域疼痛综合征Ⅰ型的疗效研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞移植对复杂区域疼痛综合征Ⅰ型大鼠脑源性神经营养因子和炎症因子蛋白及基因表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 骨髓间充质干细胞移植对复杂区域疼痛综合征Ⅰ型大鼠钠离子通道蛋白及基因表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章和翻译书籍 |
| 致谢 |
（8）NRG-1通过ITGB1/FAK/AKT通路促进Ⅰ型糖尿病大鼠背根神经节神经元轴突生长的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）资木瓜总苷通过MC-Histamine-HR1-TRPA1-DRG途径产生RA关节镇痛作用（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第一部分 原代mBMMC的分离、培养与鉴定 |
| 第二部分 原代DRGn的分离、培养与鉴定 |
| 第三部分 资木瓜总苷对肥大细胞活化脱颗粒及对DRGn的影响 |
| 第四部分 组胺标准品对DRGn的影响 |
| 第五部分 资木瓜总苷对肥大细胞-DRGn共培养体系的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 天然单体化合物抑制肥大细胞脱颗粒的研究进展 |
| 参考文献 |
| 后记 |
| 附录:攻读硕士学位期间发表的部分学术论着 |
（10）810nm弱激光对M1型骨髓源性巨噬细胞的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 810nm弱激光对M1-BMDM表型极化的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 810nm弱激光调控M1-BMDM分泌对神经元轴突的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 810nm弱激光通过Nrf2/NF-κB信号通路调控M1-BMDM表型极化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、分离培养大鼠背根神经节神经元的一种优化培养基（论文参考文献）
- [1]p38 MAPK通路上调电压门控钠通道Nav1.6在骨癌痛发生中的作用及机制研究[D]. 林铭雪. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]糖络宁对高糖培养下大鼠背根神经元中miR-211及IRE1α-CHOP通路的影响[D]. 贾晓颖. 北京中医药大学, 2021(08)
- [3]基于miRNA-211及PERK/CHOP通路研究糖络宁对高糖环境大鼠背根神经元细胞的影响[D]. 陈枫. 北京中医药大学, 2021(08)
- [4]脂肪酸对糖尿病大鼠神经损伤和心肌易损性增加的影响和机制[D]. 张肖怡. 山西医科大学, 2020(12)
- [5]基于miR-200a及MAPKs信号通路研究糖络宁对高糖下大鼠背根神经元的影响[D]. 李逸潇. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]基于miRNA-200a探讨糖络宁改善高糖下大鼠背根神经元氧化应激机制[D]. 刘琴. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠复杂区域疼痛综合征Ⅰ型疗效及作用机制的研究[D]. 郭凯凯. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [8]NRG-1通过ITGB1/FAK/AKT通路促进Ⅰ型糖尿病大鼠背根神经节神经元轴突生长的研究[D]. 詹鹏. 华中科技大学, 2019(03)
- [9]资木瓜总苷通过MC-Histamine-HR1-TRPA1-DRG途径产生RA关节镇痛作用[D]. 董甜甜. 三峡大学, 2019(06)
- [10]810nm弱激光对M1型骨髓源性巨噬细胞的调控作用及其机制研究[D]. 戴晨. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)