一、周围神经43kD蛋白在损伤坐骨神经中的表达（论文文献综述）
高文双[1]（2021）在《DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛》文中研究表明研究背景神经病理性疼痛（Neuropathic Pain,NP）为一难治的临床问题,也是世界性的公共健康问题。它是由于躯体感觉系统的疾病或异常导致的疼痛,它反映了神经系统的异常兴奋性,并存在多种解剖和功能的改变。不同于只伴随伤害性刺激存在而存在的生理性疼痛,神经病理性疼痛可对正常无害刺激表现为自发性疼痛和痛觉过敏。既往研究表明神经病理性疼痛的机制非常复杂,涉及到整个躯体疼痛感受通路:从周围神经损伤到背根神经节神经元兴奋性增加,再到脊髓和大脑神经通路的改变,可贯穿整个神经系统。神经病理性疼痛的发病机制不仅是神经元结构和功能的改变,还是卫星细胞、雪旺细胞、外周的免疫系统、星形胶质细胞、脊髓小胶质细胞和多种细胞组成部分共同参与形成的结果。在中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）中,小胶质细胞作为脊髓的常驻巨噬细胞,起源于卵黄囊原始巨噬细胞。这些细胞广泛分布于整个中枢神经系统中,时刻监测局部环境的变化,以便对各种有害刺激做出快速的免疫应答,介导炎症反应。既往研究表明在神经病理性疼痛的发展过程中,小胶质细胞中的各种炎症因子受IFN-y/IFN-γ受体系统、Toll 2/ToIl 3/Toll 4样受体、嘌呤P2X4受体以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的调节。此外,在机械痛觉过敏的发展过程中,小胶质细胞在与邻近神经元的信息传递中发挥了关键作用。因此,脊髓小胶质细胞是逆转神经系统功能紊乱的一个潜在的治疗靶点,因此,探究小胶质细胞中分子的功能对揭示神经病理性疼痛及痛觉过敏的潜在机制和寻找治疗神经病理性疼痛的新方法、新思路是至关重要的。适配器分子作为分子支架精确地组织效应器蛋白相互结合形成信号复合体。已知的DOK3（Downstream of Kinase-3）是一个典型的适配器分子,为DOK家族的成员之一,主要表达于免疫细胞中,如巨噬细胞、B细胞以及浆细胞。越来越多的研究表明DOK3主要涉及免疫信号通路的负反馈调控,并参与促进或维持免疫细胞中抑制性因子的激活。既往研究表明,抑制DOK3的表达可增加巨噬细胞中维生素B6的抗炎作用,并且在TLR9信号通路中,DOK3的降解增加了巨噬细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的产生。然而,有趣的是,对于适配器蛋白在细胞内信号通路中扮演的促进或抑制角色仍然存在争议。一个典型的例子为突触相关蛋白（Synapse-Associated Proteins,SAP）,其在不同的信号通路中主要发挥促进或抑制作用主要取决于激活的不同的信号通路及细胞类型。据文献报道,适配器蛋白DOK3在B细胞的演变进化过程中起着重要作用,在DOK3-/-小鼠中,浆细胞的产生明显减弱;流感病毒感染DOK3缺陷的巨噬细胞,IFN-β的合成明显受限;此外,DOK3在巨噬细胞TLR3信号的转导中也起着关键作用。总的来说,尽管这些结果是非常可信的,但其在理论上存在一定的矛盾,因此,需要进一步的研究来阐释适配器蛋白分子DOK3的双向作用机制。既往研究表明G蛋白偶联受体（G-Protein Coupled Receptors,GPCRs）为一种七次跨膜、与G蛋白偶联参与细胞内信号转导的膜受体,研究表明人体中存在近一千余种不同的G蛋白偶联受体,可被炎症介质、神经递质、肽类、细胞因子等配体激活,参与各种信息传递过程,如细胞代谢、神经传递、免疫炎症反应的调控等,其异常激活或抑制与多种疾病的发生密切相关,并且还参与神经病理性疼痛及痛敏的形成。研究表明GPR84作为G蛋白偶联受体,病理条件下,在巨噬细胞和小胶质细胞中的表达显着上调,介导神经病理性疼痛和炎症介质的产生和维持,并且,在内毒素血症或多发性硬化症小鼠模型中,小胶质细胞以强烈、持续的方式表达GPR84。因此,GPR84是介导炎症相关疾病的有效靶点。了解抑制炎症反应及信号传递的机制对治疗神经病理性疼痛及炎症反应非常重要,因为神经损伤与炎症反应可导致严重的神经病理性疼痛及痛觉过敏等问题。尽管DOK3在巨噬细胞、B细胞等的作用已有广泛研究,但DOK3在小胶质细胞中扮演的角色及DOK3与GPR84蛋白之间的相互作用关系目前尚不清楚。基于以上研究背景,本研究对DOK3和GPR84在小胶质细胞介导的神经病理性疼痛和炎症反应及其相互作用机制进行探讨,可为神经性疼痛的临床治疗提供新的靶点及思路。第一部分DOK3通过与GPR84相互结合参与小胶质细胞介导的炎症反应研究目的1.明确DOK3在小胶质细胞介导的炎症反应中的表达变化及其作用。2.探究DOK3是否参与介导GPR84激活诱导的小胶质细胞的炎症反应。3.验证DOK3与GPR84在小胶质细胞中的相互作用关系。研究方法1.用干扰DOK3表达的慢病毒序列转染小胶质细胞,建立稳定的DOK3敲减细胞系。通过免疫印迹和实时荧光定量PCR分析确定转染成功率及敲除效率。2.实时荧光定量PCR检测DOK3下调组较正常对照组小胶质细胞DOK3,TNF-α,IL-1β,IL-6,iNOS,P38,CD68,CD11B,Argl 和 CD206 mRNA 水平的表达变化。3.不同浓度的GPR84激动剂（6-OAU）孵育小胶质细胞120分钟,实时荧光定量PCR检测不同刺激浓度下DOK3 mRNA水平的变化。应用Western Blot免疫印迹检测DOK3,p-p38和Iba-1蛋白水平的变化。4.6-OAU分别孵育DOK3下调组与正常对照组小胶质细胞,实时荧光定量PCR检测TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA水平的变化。5.脂多糖（LPS）刺激小胶质细胞4小时和8小时,荧光共聚焦分析检测GPR84和DOK3蛋白水平的变化。6-OAU刺激小胶质细胞1小时和2小时,荧光共聚焦分析检测GPR84和DOK3蛋白水平的变化。6.LPS孵育小胶质细胞4小时,通过免疫共沉淀分析DOK3与GPR84的蛋白免疫印迹,探究DOK3与GPR84蛋白相互作用关系。7.重组GST和GST-DOK3纯合蛋白分别与小胶质细胞裂解液孵育2小时。应用GST-pulldown实验检测GPR84,确定GPR84的蛋白水平,验证DOK3与GPR84是否存在物理性结合。研究结果1.干扰DOK3表达的慢病毒序列有效下调小胶质细胞内DOK3的水平设计靶向下调DOK3 mRNA的慢病毒序列#1、#2、#3,Western Blot与实时荧光定量PCR分析检测DOK3蛋白与RNA水平的变化。与对照组病毒序列相比较,转染慢病毒序列#3使DOK3蛋白与mRNA水平下调最明显,DOK3 mRNA水平下降约50%。因此,后续实验采用序列#3转染小胶质细胞下调DOK3水平的表达。2.DOK3敲减导致小胶质细胞炎症因子释放减少。干扰DOK3表达的慢病毒序列转染小胶质细胞,实时荧光定量PCR分析检测小胶质细胞内炎症及致痛因子的表达水平。研究表明,DOK3敲减组较对照组小胶质细胞内TNF-α,IL-1β,IL-6,P38,iNOS和CD68等炎症介质的水平明显下调;相反,小胶质细胞抗炎标记物Argl和CD206的水平则明显升高。3.DOK3参与GPR84激活诱导的炎症反应浓度为1μM的GPR84激动剂（6-OAU）孵育小胶质细胞,时间依赖性地增加DOK3 mRNA的表达水平,同时6-OAU以不同浓度孵育小胶质细胞60分钟,DOK3的表达水平呈浓度依赖性地增加。6-OAU孵育小胶质细胞,p-p38和Iba-1的蛋白水平随DOK3蛋白水平的增加而增加,这与炎症因子IL-1β,TNF-α及IL-6的水平增加相对应。6-OAU孵育小胶质细胞诱导GPR84的激活,DOK3敲减组较对照组合成炎症介质TNF-α IL-1β和IL-6的能力显着减弱,TNF-α（对照组,2.3倍;DOK3敲减组,1.25倍）;IL-1β（对照组,1.45倍;DOK3敲减组,1.4倍）;IL-6（对照组,1.65倍;DOK3敲减组,1.2倍）;而且,6-OAU增加了 DOK3 mRNA的水平,但两组GPR84蛋白自身表达无明显变化。4.用LPS或GPR84激动剂孵育小胶质细胞可诱导DOK3和GPR84相互结合LPS刺激小胶质细胞,使DOK3由细胞质转移到细胞膜上发挥作用。LPS刺激使小胶质细胞活力降低,并迅速升高TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA水平,降低 Arg1 的表达。用LPS刺激小胶质细胞0,4或8小时,LPS处理组较对照组GPR84和DOK3的荧光强度在小胶质细胞膜上显着增强。此外,GPR84和DOK3共定位于小胶质细胞膜,且合并荧光强度在LPS刺激下逐渐增强。此外,用6-OAU孵育小胶质细胞1或2小时,荧光共聚焦分析表明6-OAU处理组较对照组中DOK3和GPR84的合并荧光强度在细胞膜上亦明显增强。用LPS刺激小胶质细胞4小时,用抗DOK3的抗体进行免疫共沉淀,用抗GPR84的抗体进行免疫印迹分析。Western Blot分析表明,无论是生理还是LPS刺激条件下,GPR84都与DOK3存在相互结合。应用GST-DOK3融合蛋白进行GST pull-down实验分析,经LPS刺激后的小胶质细胞裂解液中,GST-DOK3组有明显的GPR84免疫印迹,而纯合GST蛋白对照组则未检测到GPR84免疫印迹的存在。研究结论GPR84激动剂和LPS可有效诱导小胶质细胞的炎症反应,导致DOK3水平的增加,并伴随炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6及小胶质细胞炎症标记物Iba-1的表达上调。在DOK3敲减的情况下,小胶质细胞对炎性刺激的反应显着受损。炎症状态下,DOK3从细胞质转移到细胞膜上,通过与GPR84相互结合形成信号复合体,参与GPR84的信号通路传导,从而介导小胶质细胞的免疫反应。第二部分D0K3通过与GPR84相互作用参与脊髓小胶质细胞介导的神经病理性疼痛研究目的1.明确DOK3在CCI诱导的小鼠神经病理性疼痛中的作用。2.探究DOK3对GPR84激活诱导的小鼠脊髓炎症反应的影响。3.探究普瑞巴林是否通过抑制DOK3表达来缓解神经病理性疼痛及炎症反应的发展。研究方法1.慢性压迫野生型和DOK3-/-小鼠坐骨神经以建立CCI模型。通过测量机械缩爪阈值及热痛阈值,检测小鼠CCI术后0,3,7,14,21天的机械痛阈和热痛阈变化。2.通过实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓中DOK3,TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的水平变化。3.应用免疫荧光染色检测小鼠脊髓组织中Iba-1,p-p38和GPR84蛋白水平的变化。通过Western Blot免疫印迹分析检测DOK3蛋白水平的变化。4.野生型和DOK3-/-小鼠鞘内注射6-OAU以诱导脊髓中GPR84的激活,分别于0,1,2,4小时测量机械缩爪阈值,并检测鞘注2小时后DOK3,TNF-α,IL-1β和IL-6的水平变化。5.野生型小鼠连续3天鞘内注射DOK3 cDNA质粒以增强脊髓中DOK3 水平的表达,与此同时,持续2周普瑞巴林胃内给药,分别于0,3,7,14天测量机械缩爪阈值及炎症因子变化。研究结果1.CCI模型诱导DOK3-/-小鼠产生的神经病理性疼痛及炎症反应较野生型小鼠明显减轻与假手术组相比,CCI术后3-21天,野生型小鼠机械痛阈值显着下降,这表明CCI模型的成功建立。虽然DOK3-/-小鼠表现出与野生型小鼠相同的正常机械疼痛阈值及热痛阈值,但CCI术后,与野生型小鼠相比,DOK3-/-小鼠的机械触摸痛及热痛觉敏感明显减轻。CCI术后野生型小鼠DOK3 mRNA的水平明显增加,DOK3-/-小鼠无DOK3 mRNA的表达。野生型和DOK3-/-小鼠较各自假手术组小鼠脊髓中TNF-α mRNA水平分别增加2.2和1.47倍,IL-1β mRNA水平分别增加1.81和1.37倍,IL-6 mRNA水平分别增加1.65和1.64倍。除IL-6,两基因型间差异均有统计学意义。此外,在DOK3-/-小鼠中,CCI诱导的GPR84和CD11B mRNA水平的上调被显着抑制,而Arg1水平则无明显变化。免疫荧光分析显示,CCI手术后,野生型和DOK3-/-小鼠脊髓中Iba-1、p-p38和GPR84的水平明显升高,但在DOK3-/-小鼠中,CCI术后,Iba-1、p-p38和GPR84水平的升高明显受到抑制。2.GPR84激活诱导的DOK3-/-小鼠的机械痛阈较野生型小鼠明显减轻,炎症反应能力明显受损鞘内注射6-OAU后,野生型与DOK3-/-小鼠机械痛阈值皆明显下降,然而,鞘注后2小时和4小时,两基因型间有明显差异。鞘内注射6-OAU 2小时后,DOK3 mRNA水平显着升高,小鼠脊髓的免疫印迹检测分析进一步证实了这一结果。此外,鞘内注射6-OAU后,野生型与DOK3-/-小鼠脊髓中IL-1β mRNA水平较各自对照组分别升高2.8倍和1.65倍;TNF-α mRNA水平分别升高4.0倍和1.79倍;IL-6 mRNA水平分别升高1.9倍和1.4倍。免疫荧光分析表明,GPR84激活后,野生型与DOK3-/-小鼠中CD11B水平升高,然而,在DOK3-/-小鼠中,GPR84激活前后,CD11B水平增加较野生型小鼠明显减弱,这与其mRNA水平变化相一致。而且,免疫荧光分析表明DOK3主要表达于小鼠脊髓小胶质细胞中,并且DOK3与GPR84在脊髓小胶质细胞中共定位存在。3.应用普瑞巴林可减轻DOK3表达增强诱导的神经病理性疼痛和炎症反应野生型小鼠鞘内注射DOK3 cDNA质粒,以上调DOK3水平的表达。在第3-7天机械痛阈明显下降,于第14天恢复至基础水平。与对照组小鼠相比,普瑞巴林能有效缓解DOK3高表达诱导的痛觉过敏,在第7天时有统计学意义。免疫组织化学和PCR分析显示DOK3在脊髓中表达明显增加,这表明了 DOK3 cDNA质粒的有效性。我们还发现,DOK3高表达可激活脊髓中小胶质细胞,小胶质细胞标记物Iba-1明显上调,但未观察到星形胶质细胞的激活,星形细胞标记物GFAP无明显变化。与升高的DOK3水平相一致,TNF-α（2.72倍）、IL-1β（3.46倍）和IL-6（7.69倍）的水平明显高于对照组小鼠,CD11B亦有同样的变化。与对照组相比,应用普瑞巴林显着降低了 DOK3 mRNA的表达,并伴随IL-1β降低了 41%,TNF-α降低了 33%,IL-6降低了 35%。进一步的实验表明,普瑞巴林能有效抑制脂多糖诱导小胶质细胞中DOK3水平的升高,进一步证实了在小胶质细胞中,普瑞巴林对DOK3表达的影响。然而,普瑞巴林对BV2小胶质细胞中DOK3的基础水平无明显作用。研究结论CCI诱导DOK3-/-小鼠产生的神经病理性疼痛及炎症反应较对照组小鼠明显减轻,GPR84激活诱导的DOK3-/-小鼠的机械触摸痛和炎症因子释放较对照组明显减弱;应用普瑞巴林通过降低DOK3的表达水平,缓解神经病理性疼痛。DOK3在参与GPR84通路介导的小胶质细胞激活诱导的神经病理性疼痛和炎症反应中发挥积极作用。普瑞巴林有效缓解神经病理性疼痛,其潜在机制可能是通过抑制DOK3的水平或GPR84信号通路实现的。
崔梦丽[2]（2021）在《NLRP3炎性小体在小鼠周围神经损伤中的作用研究》文中研究表明目的周围神经损伤是由于各种原因引起的并在该神经所支配的范围内出现了诸多方面的障碍。NLRP3可检测到各种微生物基序和内源性危险信号,从而导致炎性小体的形成。本课题研究使用NLRP3基因敲除小鼠来构建外周神经损伤模型,旨在更深一步的探索NLRP3炎性小体是否参与外周神经损伤疾病,及其在外周神经损伤后的修复中的作用,为更好的探索外周神经损伤及修复机制奠定实验基础。方法本研究选用C57BL/6野生型小鼠（WT）,NLRP3基因敲除小鼠(Nlrp3-/-)和TLR4基因敲除小鼠(Tlr4-/-)。按照以下步骤进行:1、构建外周神经钳夹伤的动物模型。采用抽签的方式将WT小鼠随机的分为对照组（42只）,钳夹伤组（60只）;Nlrp3-/-小鼠随机分为对照组（12只）,钳夹伤组（48只）及Tlr4-/-小鼠钳夹伤组（3只）。小鼠麻醉后,对照组仅暴露出坐骨神经60秒（s）;钳夹伤组暴露出坐骨神经并用止血钳夹伤60s。2、检测NLRP3炎性小体。利用HE和LFB染色检测坐骨神经的炎症与髓鞘变化情况。利用RT-qPCR方法检测NLRP3,Caspase-1,ASC,IL-18和IL-1β因子在基因水平的变化。利用Western blot方法检测NLRP3,Caspase-1,ASC,IL-18和IL-1β在蛋白水平的变化。利用免疫荧光法检测ASC寡聚成核的情况以及巨噬细胞浸润情况。3、检测WT小鼠与Nlrp3-/-小鼠坐骨神经损伤后的恢复情况。利用Western blot方法于1周（w）检测p75NTR和GAP-43的蛋白表达。利用免疫组化法于2 w和3 w检测p75NTR和GAP-43的蛋白表达情况。利用坐骨神经功能指数（SFI,Sciatic nerve function index）来评价小鼠运动功能方面的恢复情况。4、利用Western blot方法检测TLR4参与调控NLRP3产生情况。结果构建小鼠的外周坐骨神经钳夹伤损伤模型成功。（1）WT小鼠检测结果:相比对照组,LFB染色结果表明钳夹伤组髓鞘结构不完整且发生脱髓鞘。HE染色结果表明钳夹伤组炎症细胞增多。RT-qPCR结果表明,NLRP3和IL-1β的m RNA水平在钳夹伤组显着升高（P<0.0001）;Western blot结果表明,Caspase-1和ASC的蛋白水平在钳夹伤组显着升高（P<0.01）,而NLRP3和IL-1β的蛋白水平在神经损伤后24 h显着升高（P<0.01）;免疫荧光分析,钳夹伤组ASC斑点的数量显着升高（P<0.01）。（2）Nlrp3-/-小鼠检测结果:相比对照组,LFB和HE染色结果与WT钳夹伤组相同;与此同时,免疫荧光检测发现,与Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组相比,WT小鼠钳夹伤组CD68+巨噬细胞数量更多;RT-qPCR结果表明,相比WT小鼠钳夹伤组,在坐骨神经损伤后所测定时间点,NLRP3和IL-1β的m RNA水平在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组显着降低（P<0.0001）,神经损伤后24 h和48 h,ASC和Caspase-1的m RNA水平在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组显着降低（P<0.001）;Western blot结果表明,相比WT小鼠钳夹伤组,坐骨神经损伤后12h和24h,NLRP3、IL-18和IL-1β的蛋白水平,在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中显着降低（P<0.01）,神经损伤后24 h,ASC和Caspase-1的蛋白水平,在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中显着降低（P<0.01）。（3）神经损伤后的修复结果:Western blot方法和免疫组化方法结果都表明,相比WT小鼠钳夹伤组,p75NTR和GAP-43的蛋白水平在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中增高。SFI的结果显示,相比WT小鼠钳夹伤组,SFI的评分在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中增高。（4）TLR4调控NLRP3的表达结果:Western blot检测结果,与WT小鼠钳夹伤组相比,NLRP3、NF-κB和TLR4的蛋白水平在Tlr4-/-小鼠钳夹伤组中表达减少。结论成功构建三种实验小鼠的坐骨神经钳夹伤模型。坐骨神经损伤后可引起NLRP3炎性小体的形成并进一步被激活;并且TLR4在一定程度上正向调控了NLRP3的形成。此外,敲除NLRP3基因可减弱神经损伤后的炎症反应,加快坐骨神经的运动功能的恢复。本研究,为外周神经损伤的炎症发生机制提供了理论依据,为临床治疗外周神经损伤及功能恢复提供了新的线索。
刘振辉[3]（2021）在《仿生导电人工神经支架的研究》文中进行了进一步梳理目的:（1）制备具有导电功能的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架,并对其进行表征,验证其生物相容性,利用支架进行细胞三维立体培养,研究电刺激对RSC96细胞生长的影响。（2）制备具有取向性纳米纤维的PLLA纤维膜,并对其进行表征,验证其生物相容性,研究纤维取向性对RSC96细胞信号蛋白的影响。（3）制备仿生导电人工神经支架,将支架植入大鼠坐骨神经缺损,探讨仿生导电人工神经支架对大鼠坐骨神经修复效果和机制。方法:（1）利用梯度冷冻和冷冻干燥技术制备出具有多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架。通过微结构、溶胀和脱溶涨、导电率、形状记忆功能、载药及药物释放性能、力学性能和生物相容性对制备的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架进行表征,对三维立体培养的RSC96细胞进行组织学评价,观察不同培养条件下细胞生长行为。（2）利用静电纺丝技术制备出具有取向纳米纤维的PLLA纤维膜。通过扫描电镜、力学性能、降解性和生物相容性对制备的PLLA纤维膜进行表征。利用免疫荧光技术研究纤维取向性对RSC96细胞ERK、P38MAPK、MEK和LRP4蛋白的影响。（3）利用定制的模具制备多微通道导电支架,将第二部分制备的高取向PLLA纤维膜和定制的多微通道导电支架组合成仿生导电人工神经支架,并将神经支架植入到大鼠坐骨神经缺损处。将实验动物分为支架组（S）、支架联合电刺激组（S&E）和自体神经移植组（AT）,通过坐骨神经功能指数、神经电生理检测、肌肉组织学检测、再生神经的组织学检测来分析仿生导电神经支架对周围神经再生的影响。结果:（1）加入的多壁碳纳米管没有影响琼脂糖支架的孔隙组成比和形状记忆功能,但0.025%wt多壁碳纳米管提高了支架在溶胀平衡状态下的溶胀率和保水能力。多壁碳纳米管改变了琼脂糖支架的电导率、载药及药物释放能力和力学性能。高浓度多壁碳纳米管对RSC96细胞和PC12细胞的增殖有一定影响。电镜下PC12细胞在多壁碳纳米管琼脂糖支架上生长状态良好。多壁碳纳米管的加入未改变RSCs细胞的S100β表达量。当电刺激存在时,RSC96细胞层沿支架纵轴排列较好,0.025%MWCNT-琼脂糖支架和0.05%MWCNT-琼脂糖支架表现出更好的细胞黏附性。（2）制备的PLLA纤维膜为多孔结构,纤维大部分为取向排列,高取向纤维膜的纤维取向性更高,其表面光滑,粗细均匀,纤维间形成立体的三维孔隙并分布于整个纤维膜。取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（59.06±2.49）MPa,取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（56.82±2.80）MPa,两种纤维膜拉伸强度没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（1037.07±133.30）MPa,高取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（971.45±112.39）MPa,两种纤维膜杨氏模量没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为364.48±53.79,高取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为356.89±40.21,两种纤维膜断裂伸长率没有统计学差异。增加PLLA纤维膜的取向,并未明显改变纤维膜的拉伸强度、杨氏模量和断裂延伸率。改变纤维膜的纤维取向程度,对PLLA纤维膜的降解速率没有影响。取向PLLA纤维膜和高取向PLLA纤维膜对RSC96细胞的增殖均没有影响。和取向性纤维膜相比,高取向的PLLA纤维膜上的RSC96细胞呈现出现明显的丝状伪足,沿着排列整齐的纳米纤维延伸。和取向性PLLA纤维膜相比,高取向PLLA纤维增加了RSC96细胞ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白表达量（P<0.01）。（3）制备的仿生导电人工神经支架跟大鼠坐骨神经匹配良好,植入神经缺损出未见异物反应。S&E组坐骨神经功能指数、神经电生理结果、肌肉组织学结果、轴突和髓鞘再生效果接近AT组,好于S组。术后12周时免疫组化结果显示,NF-H蛋白和S00-β蛋白表达,S&E组和AT组的高于S组（P<0.01）,而S&E组接近AT组。LRP4蛋白和P38MAPK蛋白表达,AT组高于S组（P<0.01）,但AT和S&E组,S&E组和S组相比均无差异无统计学意义。ERK蛋白和MEK蛋白表达情况,AT组高于S组和S&E组（P<0.01）,S&E组和S组两者相比差异无统计学意义。结论:（1）多壁碳纳米管琼脂糖支架具有高的孔隙率、一定的形状记忆功能、载药及药物释放能力、导电能力,良好的生物相容性。在电刺激存在时,具有导电性能的多壁碳纳米管琼脂糖支架对RSC96细胞生长具有引导作用。（2）和取向性的PLLA纤维膜相比,高取向性的PLLA纤维膜未改变其力学性能、降解性和生物相容性,但增加了ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白的表达量,能引导RSC96细胞生长和迁移,这有利于其在周围神经再生中的应用。（3）仿生导电人工神经支架联合电刺激能够增强周围神经再生。电刺激可能通过ES通过与MAPK信号通路的激活促进周围神经再生,ERK、P38MAPK、MEK和LRP4可能参与周围神经再生。
王江波[4]（2020）在《SPP1在周围神经损伤后Wallerian溃变中对雪旺细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制研究》文中进行了进一步梳理目的:雪旺细胞在周围神经损伤后的Wallerian溃变中发挥着重要作用,参与了Wallerian溃变的整个过程。在Wallerian溃变过程中,雪旺细胞会在不同的时期发生增殖、凋亡,同时经历了一系列基因表达的变化,影响着周围神经再生的命运。但这些基因调节雪旺细胞增殖和凋亡的内在机制仍不清楚。本课题组前期的研究结果表明,分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1,SPP1）和蛋白激酶Cα（protein kinase c alpha,PKCα）在大鼠坐骨神经损伤后均表达上调,同时上调的SPP1能够促进雪旺细胞增殖,抑制雪旺细胞凋亡;上调的PKCα也能够促进雪旺细胞增殖。已有文献报道SPP1能够促进PKCα的表达,那么SPP1是否通过PKCα影响雪旺细胞增殖和凋亡,SPP1作为分泌型糖蛋白又是如何影响胞内激酶PKCα等问题均不明确。既往研究指出SPP1能够与多种细胞的膜表面受体CD44和αvβ3结合影响胞内信号通路,其中包括PKCα及下游信号分子。但受体CD44和αvβ3是否参与了周围神经损伤后SPP1调节雪旺细胞增殖和凋亡的功能,以及是否将信号从SPP1传递给PKCα也并不清楚。PKCα可以通过ERK促进细胞增殖,通过Bcl-2抑制细胞凋亡,但在雪旺细胞中SPP1通过PKCα促进雪旺细胞增殖、抑制雪旺细胞凋亡是否也与上述信号通路相关都需要进一步探讨。因此,本研究的主要目的是探究SPP1是否可以通过PKCα发挥作用;明确受体CD44和αvβ3是否参与SPP1对PKCα的调节;揭示SPP1/PKCα分别调节雪旺细胞增殖与凋亡的信号通路,以期为临床上周围神经损伤修复的干预提供可靠的分子靶点。方法:1.收集患者外伤后损伤的正中神经远端组织。2.利用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色技术检测SPP1、PKCα在人周围神经损伤后表达的变化及定位。3.培养原代雪旺细胞,通过siRNA干扰SPP1同时PMA激活PKCα,或者质粒过表达SPP1同时利用Go6976抑制PKCα,探究SPP1和PKCα之间的关系,及对雪旺细胞增殖和凋亡的影响,具体包括:利用EdU和流式细胞技术等检测对雪旺细胞增殖和凋亡的影响,利用Western blot检测下游p-ERK/ERK、Bcl-2/Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3 表达情况。4.建立大鼠坐骨神经损伤模型,通过RT-qPCR、Western blot检测细胞表面蛋白CD44和αvβ3在神经损伤后表达的变化趋势,利用免疫荧光染色检测其在大鼠坐骨神经和原代雪旺细胞中定位。5.在原代雪旺细胞中,通过siRNA分别沉默CD44和β3,利用EdU和流式细胞技术等检测其对雪旺细胞增殖和凋亡的影响,利用Western blot检测下游p-ERK/ERK、Bcl-2/Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3 表达情况。6.利用外源性SPP1（rOPN）模拟分泌型SPP1,与CD44、β3的siRNAs相结合,进一步探究SPP1对雪旺细胞增殖和凋亡发挥作用的信号通路。结果:1.患者正中神经损伤远端组织中,SPP1和PKCα均定位于雪旺细胞中,且在神经损伤后表达呈上调趋势。2.和SPP1一样,PKCα能够抑制雪旺细胞凋亡,促进雪旺细胞增殖;同时与SPP1均能上调ERK磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达水平,抑制Caspase-3活化,且SPP1可以通过激活PKCα调节上述细胞因子,进而促进雪旺细胞增殖和抑制其凋亡。3.CD44和αvβ3均在大鼠坐骨神经雪旺细胞中定位,且周围神经损伤后表达增加。同时CD44主要表达于原代雪旺细胞的细胞膜上,而αvβ3表达于细胞膜表面的黏着斑上。4.在原代雪旺细胞中CD44和αvβ3均能够抑制凋亡、促进增殖,分别用siRNA沉默两者后发现雪旺细胞中p-ERK/ERK、Bcl-2/Bax相对表达下调,cleaved Caspase-3/Caspase-3 相对表达上调。5.与过表达内源性SPP1类似,加入外源性SPP1（rOPN）也可以上调雪旺细胞中PKCα的表达,同时上调ERK磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达,抑制Caspase-3活化。6.siRNAs 分别沉默 CD44 或 β3 后,PKCα 表达、ERK 磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达下调,Caspase-3被活化。在CD44或β3被沉默的背景下加入rOPN,rOPN无法发挥上调雪旺细胞中PKCα、ERK磷酸化、Bcl-2/Bax相对表达、抑制Caspase-3活化的作用。SPP1促进PKCα及下游信号通路的作用被si-CD44或si-β3 所阻断,说明 CD44 和 β3 均参与 SPP1-PKCα 对雪旺细胞增殖的促进和凋亡的抑制作用。结论:我们通过对可能参与SPP1在周围神经损伤后Wallerian溃变过程中促进雪旺细胞增殖、抑制雪旺细胞凋亡的分子机制的研究,得出如下结论:1.临床患者周围神经损伤后,雪旺细胞中SPP1和PKCα表达明显增加。2.SPP1通过细胞膜上CD44和αvβ3,激活PKCα及下游信号通路促进雪旺细胞增殖,抑制细胞凋亡。3.SPP1通过PKCα-ERK通路促进雪旺细胞增殖。4.SPP1 通过调节 PKCα-Bcl2/Bax-cleaved Caspase-3/Caspase-3 介导雪旺细胞的抗凋亡作用。
罗宇婷[5]（2020）在《三法三穴对坐骨神经损伤大鼠背根神经节cAMP-PKA信号通路表达的影响》文中研究指明[目的]为了研究以三法三穴为代表的推拿手法是否通过影响cAMP-PKA信号通路进而促进SNI大鼠的损伤恢复,本研究以大鼠坐骨神经损伤模型（Sciatic Nerve Injury,SNI）为例,通过利用行为学、组织形态学、分子生物学技术对大鼠坐骨神经损伤后的情况进行综合评价,观察SNI大鼠的感觉功能和神经损伤的修复情况,探究推拿的起效机制,为推拿治疗周围神经损伤提供科学依据。[方法]以SD大鼠作为实验动物,将SD雄性大鼠分为正常组、假手术组、模型组及三法三穴组。模型组及三法三穴组通过坐骨神经夹持建立SNI模型,三法三穴组选择殷门、承山、阳陵泉三穴并使用“按摩推拿手法模拟仪”操作点法、拨法、揉法进行干预,每穴每法各1min。运用光热耐痛阈实验来评价大鼠感觉功能（痛温觉）的恢复,运用坐骨神经功能指数评价大鼠神经功能和后肢精细动作恢复情况;运用HE染色、尼氏染色和免疫荧光技术观察坐骨神经及DRG神经元形态;运用分子生物学技术检测背根神经节（DRG）中cAMP、PKA、CREB的表达情况,通过定性定量的检测方法,结合行为学、形态学结果进行综合分析,评价推拿对SNI大鼠感觉功能及神经功能恢复的影响,阐释推拿促进周围神经损伤修复的机理。[结果]1.光热耐痛阈实验—推拿能促进SNI大鼠感觉功能（痛温觉）的恢复光热耐痛阈结果显示SNI大鼠左足（正常侧）的实验结果组间（正常组、假手术组、模型组及三法三穴组）比较无统计学差异,而右足（患侧）差异较明显。造模后7d,正常组与假手术组结果相比无明显差异,而模型组明显高于正常组与假手术组（P<0.05）,提示夹持损伤导致了坐骨神经损伤,神经纤维出现了连续性中断,痛觉传导功能受损。推拿20d后,三法三穴组SNI大鼠的舔舐足部时间明显较造模后7d时缩短,低于模型组（P<0.05）。2.坐骨神经功能指数（SFI）—推拿能改善SNI大鼠的后肢精细动作和受损神经恢复造模后7d,正常组与假手术组实验结果无明显差异,模型组SFI指数与假手术组相比有所降低（P<0.05）。此时可见坐骨神经损伤后大鼠患侧后肢出现无法受力及严重跛行的情况。干预20d后,模型组指数仍低于假手术组（P<0.05）,而三法三穴组指数高于模型组（P<0.05）。3.坐骨神经HE染色—推拿能改善SNI大鼠坐骨神经的结构正常组及假手术组坐骨神经神经纤维结构正常,纤维排列规则有序;模型组神经纤维局部区域排列凌乱松散,纤维丝断裂,神经纤维丝变细或减少;三法三穴组神经组织相较于模型组神经纤维排列规则有序,结构致密,组织结构大体趋向正常。4.尼氏染色—推拿能促进SNI大鼠坐骨神经和DRG形态恢复坐骨神经:正常组可见坐骨神经纤维整体有序,纤维横切面结构完整正常;假手术组中神经纤维细胞排列规则有序,结构致密;模型组中神经纤维横切面可见纤维排列疏松,结构紊乱,神经纤维丝断裂;三法三穴组中神经纤维排列规则有序,部分神经纤维丝结构较细,染色较浅。DRG:正常组中多数神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;假手术组多数神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;少量神经元胞体中尼氏小体崩解至完全溶解消失,胞浆淡染,细胞肿胀;模型组中尼氏体颗粒在所有神经元细胞中整体减少,尼氏染色淡染;较多神经元胞体中尼氏体崩解为细尘状颗粒,进而完全溶解消失;因尼氏体消失,胞浆着色浅,胞体肿胀,细胞由多极形状变为圆形;三法三穴组较模型组神经元细胞中尼氏颗粒清晰,数量丰富,神经元细胞结构正常;少量神经元胞体局部区域尼氏小体崩解至细尘状颗粒,并渐渐向外扩展,胞浆淡染,细胞肿胀。5.荧光染色—推拿能保护并促进SNI大鼠感觉神经元恢复正常组大鼠DRG中神经元大多呈圆形或三角形,核仁居中,染色清晰,形态饱满;假手术组神经元形态与正常组相似;模型组可见神经元数目减少,形态皱褶增多或破裂,有轻微水肿现象,直径增加,核仁部分出现偏移或消失现象;三法三穴组在干预后20d,神经元染色较为清晰,神经元数量较多,核仁大多居中,形态恢复较为饱满。6.Western-blotting—推拿能通过促进通路关键蛋白表达促进坐骨神经恢复6.1 DRG中cAMP表达情况造模后7d,正常组与假手术组cAMP表达量无明显差异;与正常组比较,模型组表达水平显着降低（P<0.05）;干预20d时,与模型组相比,三法三穴组cAMP表达水平呈明显升高趋势（P<0.05）,三法三穴组与模型组相比差异较大（P<0.05）。6.2 DRG中PKA表达情况造模后7d,正常组与假手术组PKA表达量无明显差异,与正常组比较,模型组PKA表达水平显着降低（P<0.05）;干预20d后,与模型组比较,三法三穴组PKA表达量升高明显（P<0.05）;差异较大。6.3 DRG中CREB表达情况造模后7d,正常组与假手术组CREB表达量无明显差异,与正常组相比,模型组表达量虽有所下降但差异不明显;干预20d后,与模型组相比,三法三穴组CREB表达量可以观察到有上升的表现,但无统计学差异。以上结果提示:推拿可以提高DRG中cAMP、PKA、CREB蛋白的表达,进而促进周围神经损伤的恢复。[结论]以三法三穴为代表的推拿手法可以提高DRG中cAMP、PKA、CREB的表达,通过影响cAMP-PKA通路中的三个关键蛋白,从而激活通路;同时也可改善SNI大鼠DRG中神经元的形态,恢复坐骨神经超微结构,加速SNI大鼠感觉功能和后肢精细动作的恢复,进而起到促进周围神经损伤后修复的作用。说明以三法三穴为代表的推拿治疗周围神经损伤的机制之一是激活cAMP-PKA信号通路。
邵帅[6]（2020）在《三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响》文中指出[目的]为评价三法三穴对SNI大鼠坐骨神经SC增殖和神经瘢痕形成的影响而开展本实验,本实验从行为学、组织形态学与分子生物学三个层面,评价三法三穴干预能否通过调节TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,影响SNI模型大鼠坐骨神经损伤点SC增殖及神经瘢痕的形成,促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。以期进一步揭示推拿促进坐骨神经损伤后修复的机理,完善推拿治疗周围神经损伤的理论基础,为推拿治疗周围神经损伤疾病提供科学证据。[方法]1 动物分组、造模和干预方法选取健康雄性SD大鼠78只,随机分为假手术组、模型组、三法三穴组,每组各26只。采用坐骨神经夹持损伤法制备SNI模型大鼠。三法三穴组从造模后第8天（d）开始,对大鼠殷门穴、承山穴、阳陵泉穴进行点法、拨法、揉法干预,每穴每手法1min。干预10d休息1d,共干预20次。2行为学检测方法每组每个时间点随机选取6只大鼠进行行为学观察。在造模后7d、14d、21d、28d,检测各组大鼠斜板试验角度。在造模后7d、28d,检测各组大鼠SFI。3组织形态学检测方法每组随机选取4只大鼠,在造模后28d时运用HE染色法,观察SNI大鼠坐骨神经损伤点SC细胞数目和神经瘢痕厚度及染色深度的变化。4蛋白定量检测方法每组每个时间点随机选取4只大鼠,运用免疫荧光标记法,观察造模后7d、28d时坐骨神经损伤点中S100、TGF-β1、Smad2及造模后28d时坐骨神经损伤点Ⅰ/Ⅲ型胶原和FN的表达变化。每组每个时间点随机选取6只大鼠,运用Western-blotting技术,检测坐骨神经损伤点在造模后7d、14d、28d三个时间点TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达变化。5统计方法使用Image J 1.48u软件分析免疫荧光和Western-blotting图像。使用SAS 8.0软件对数据进行统计分析。[结果]1三法三穴干预对SNI大鼠运动功能恢复的影响SFI结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,大鼠SFI显着降低（P<0.01）。三法三穴组与模型组相比,大鼠SFI显着升高（P<0.01）,且接近假手术组水平。斜板实验结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d、21d、28d,大鼠斜板倾斜角度显着降低（均有P<0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后14d、21d,大鼠斜板倾斜角度有升高趋势（P>0.05）,造模后28d,斜板倾斜角度显着升高（P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢精细动作及后肢肌力的恢复,说明三法三穴干预能够促进SNI大鼠后肢运动功能的恢复。2三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经SC增殖的影响HE染色结果:假手术组神经纤维轴索及髓鞘完整、排列紧密,SC核嵌于鞘膜外。模型组神经纤维稀疏、散乱,鞘膜外SC核数量较假手术组减少。三法三穴组坐骨神经可见再生的神经纤维,并有很厚的髓鞘包绕、轴索清晰,鞘膜外SC核数量较模型组明显增多。S100免疫荧光染色结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠坐骨神经损伤点SC标记物S100的平均光密度值明显降低（均有P<0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,坐骨神经S100平均光密度值明显升高（P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够增加神经损伤后期SC的数目。3三法三穴干预对SNI大鼠坐骨神经瘢痕形成的影响HE染色结果:造模后28d,假手术组坐骨神经损伤点神经外膜结缔组织深染,模型组神经外膜结缔组织深染,三法三穴组神经外膜结缔组织染色较模型组明显变浅。Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN免疫荧光染色结果:造模后28d,与假手术组相比,模型组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原、FN表达均明显增多（均有P<0.05）。与模型组相比,三法三穴组SNI大鼠坐骨神经外膜Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN表达均明显减少（均有P<0.05）。以上结果提示:三法三穴干预能够抑制SNI大鼠坐骨神经Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN分泌,从而抑制神经外膜瘢痕形成。4三法三穴干预对TGF-β1/Smad2通路蛋白表达的影响免疫荧光染色结果:TGF-β1表达部位与S100高度重合,且在模型组、三法三穴组坐骨神经外膜也出现高表达,Smad2表达在DAPI表达位置附近。模型组与假手术组相比,造模后7d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量明显升高（P<0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异（P>0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1的表达量未见明显差异（P>0.05）。模型组与假手术组相比,造模后7d、28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量明显升高（均有P<0.05）,三法三穴组与模型组相比,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。Western-blotting结果:模型组与假手术组相比,造模后7d、14d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量明显升高（均有P<0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。三法三穴组与模型组相比,造模后14d,坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量出现下调趋势（P>0.05）,造模后28d,SNI大鼠损伤侧坐骨神经TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达量无明显差异（P>0.05）。以上结果提示:坐骨神经损伤后,TGF-β1主要在SC和损伤神经外膜中表达,Smad2在细胞核周围表达。三法三穴干预在周围神经损伤早期对TGF-β1/Smad2通路蛋白有轻微的下调作用,可能与神经瘢痕形成有关。[结论]三法三穴干预能够增加损伤后期SNI大鼠坐骨神经SC的数目。三法三穴干预能够通过轻微下调TGF-β1/Smad2通路蛋白表达,抑制SNI大鼠坐骨神经瘢痕的形成,以促进SNI大鼠运动功能恢复。
陈怡然[7]（2020）在《基于JNK信号通路探讨针刺对坐骨神经损伤大鼠神经修复的机制研究》文中指出目的:从整体、细胞和分子水平,研究针刺对坐骨神经损伤的治疗机制。分别通过观察神经运动功能和组织形态结构、血清和神经氧化损伤标志物表达、JNK信号通路介导的凋亡相关蛋白和雪旺细胞特异性标志蛋白表达,探索针刺对坐骨神经损伤大鼠神经修复的效果及其作用机制。同时通过观察RSC96细胞系细胞周期和细胞凋亡改变、JNK信号通路介导的凋亡相关蛋白表达,进一步探索针刺后血清效应物质对氧化损伤的雪旺细胞的保护效果和作用机制。材料与方法:1体内动物实验（论文一至论文三）1.1动物分组与造模SPF级SD大鼠70只,分为假手术组（SHAM）、模型组（SNCI）、浅刺组（SEA）、深刺组（DEA）和非穴深刺组（NEA）,每组14只。除SHAM组外,其余4组采用经典钳夹法制备大鼠坐骨神经挤压性损伤模型。1.2干预方法造模1天后各组按照相应干预措施开始针刺治疗。SEA和DEA两组选取造模同侧的“环跳”穴作为治疗部位,SEA组针刺入约0.5cm,深度以触及进针部位下方的肌肉组织为宜;DEA组刺入约1.5cm,深度以触及神经干为宜。NEA组选取造模同侧“环跳”穴与膝关节外侧缘连线上,约损伤处远侧端1cm处作为治疗部位,刺入深度约1.5cm以触及神经干为宜。各组均小幅度提插捻转3次后连接电针仪正极,尾部连接负极。采用疏密波,频率2.0Hz、电流2.0m A,每日1次,每次20min,连续治疗14天。1.3取材和指标检测取材前对所有实验大鼠进行坐骨神经运动功能评价,之后在麻醉状态下进行神经电生理检测,腹主动脉取血用于ELISA法检测血清中SOD、MDA、8-OHd G水平。过量麻醉处死大鼠后,分别取坐骨神经和背根神经节,其中1只大鼠所取的神经组织于2.5%戊二醛中固定,用于透射电子显微镜下观察组织超微结构;3只大鼠所取的神经组织于4%多聚甲醛中固定,用于免疫组化法观察S100蛋白表达、免疫荧光法观察p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-8蛋白表达;其余大鼠所取的组织-80℃冻存,用于ELISA法检测神经中SOD、MDA、8-OHd G水平;RT-PCR法检测JNK、c-Jun、Bcl-2、Bax、caspase-8、caspase-3 m RNA表达;Westernblot法检测p-ERK、p-p38、p-JNK、TNF-α、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、S100蛋白表达。2体外细胞实验（论文四）2.1针刺血清制备与细胞分组15只SD大鼠分为空白组和治疗组,空白组10只,治疗组5只,空白组大鼠造模方法和干预方法同体内实验SHAM组一致,治疗组大鼠造模方法和干预方法同体内实验深刺组一致,连续治疗14天,末次治疗后0.5h行腹主动脉取血,分离血清灭活滤过制备针刺血清。细胞根据诱导和干预条件不同,分为3组,分别是对照组（Control）、模型组（H2O-2）和针刺血清组（H2O-2+Acupuncture serum）。2.2细胞培养和干预条件筛选复苏RSC96细胞系,进行常规传代培养,培养至第3代,采用CCK-8法筛选H2O-2诱导细胞凋亡和针刺血清干预细胞的条件。2.3指标检测采用流式细胞仪和Annexin V/PI双染法检测细胞周期和细胞凋亡水平;ELISA法检测细胞上清液中TNF-α表达水平;免疫荧光法检测S100、Cleaved caspase-3蛋白表达;加入JNK抑制剂SP600125后,Westernblot法检测p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-3蛋白表达。结果:一、体内动物实验论文一针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠神经功能、形态修复及氧化损伤的实验研究1实验大鼠坐骨神经运动功能评价钳夹法制备挤压损伤大鼠坐骨神经功能指数（SFI）显着下降（P<0.01）。治疗后,与SNCI组比较,SEA、DEA两组SFI存在显着上升（P<0.01）,DEA组上升程度高于SEA组（P<0.01）。2实验大鼠坐骨神经电生理检测钳夹法制备挤压损伤大鼠运动神经传导速度（MNCV）显着下降（P<0.01）。治疗后,与SNCI组比较,SEA、DEA两组MNCV存在显着上升（P<0.01）,DEA组上升程度高于SEA组（P<0.05）。3实验大鼠坐骨神经组织超微结构观察SHAM组神经髓鞘和雪旺细胞结构完整。SNCI组髓鞘结构变形,完整雪旺细胞消失,出现少量无髓神经纤维。SEA组神经髓鞘结构恢复,但是排列松散,存在板层分离;DEA组神经髓鞘结构较为完整,可见髓鞘厚度不均的有髓神经纤维和大量雪旺细胞增生。NEA组神经髓鞘结构恢复较差,几乎未见雪旺细胞。4实验大鼠背根神经节组织超微结构观察各组背根神经节超微结构未见明显异常,髓鞘结构基本完整,髓鞘边缘可见结构完整的雪旺细胞。5针刺“环跳”穴对大鼠血清氧化损伤标志物的影响与SHAM组比较,SNCI组SOD水平显着降低（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组SOD水平显着升高（P<0.01）,DEA组SOD水平高于SEA组（P<0.01）。与SHAM组比较,SNCI组MDA、8-OHd G水平显着升高（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组MDA、8-OHd G水平显着降低（P<0.01）,DEA组MDA、8-OHd G水平低于SEA组,NEA组MDA、8-OHd G水平低于SNCI组但远高于SEA、DEA组（P<0.01或P<0.05）。6针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经氧化损伤标志物的影响与SHAM组比较,SNCI组SOD水平显着降低（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组SOD水平显着升高（P<0.01）,DEA组SOD水平高于SEA组（P<0.01）。与SHAM组比较,SNCI组MDA、8-OHd G水平显着升高（P<0.01）。与SNCI组比较,SEA、DEA组MDA、8-OHd G水平显着降低（P<0.01）,DEA组MDA、8-OHd G水平低于SEA组（P<0.01）,NEA组MDA水平低于SNCI组但远高于SEA、DEA组（P<0.01）,NEA组8-OHd G水平低于SNCI组（P<0.01）,但高于DEA组（P<0.01）。论文二针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠JNK信号通路的实验研究1针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经和背根神经节MAPK信号通路的影响坐骨神经组织中,p-ERK蛋白,DEA组表达低于其余4组（P<0.05）,其余4组比较无显着差异。p-p38蛋白,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达升高（P<0.05）,DEA组蛋白表达降低（P<0.05）;与SNCI、SEA组比较,DEA组表达降低（P<0.05）,NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。p-JNK蛋白,与SHAM组比较,其余4组表达均升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组蛋白表达降低（P<0.05）。背根神经节组织中,p-ERK蛋白,与SHAM组比较,DEA、NEA组表达升高（P<0.05）。与DEA组比较,NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。p-p38蛋白,与SHAM组比较,其余4组表达均升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA组蛋白表达降低（P<0.05）;与SEA、DEA组比较,NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。p-JNK蛋白,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达升高（P<0.05）;与SNCI、SEA组比较,DEA组蛋白表达降低（P<0.05）、NEA组蛋白表达升高（P<0.05）。2针刺“环跳”穴干预大鼠坐骨神经和背根神经节JNK信号通路对凋亡的影响2.1 RT-PCR法检测大鼠坐骨神经和背根神经节中JNK、c-Jun、Bcl-2、Bax、caspase-8、caspase-3m RNA表达的影响坐骨神经组织中,JNK1 m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显着降低（P<0.05）。JNK2 m RNA各组表达无统计学差异（P>0.05）。JNK3 m RNA,与SHAM组比较,其余4组表达显着升高（P<0.05）,各组之间表达无统计学差异。c-Jun m RNA,与SHAM组比较,其余4组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显着降低（P<0.05）,SNCI、SEA、NEA之间表达无统计学差异。Bcl-2/Bax m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达显着降低（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显着升高（P<0.05）;NEA组表达显着低于SNCI组（P<0.05）。Caspase-3 m RNA,各组表达无统计学差异。Caspase-8 m RNA,与SHAM组比较,其余4组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,其余3组表达显着降低（P<0.05）,其中SEA和NEA无显着差异,DEA组表达低于NEA组（P<0.05）。背根神经节组织中,JNK1 m RNA,与SHAM组比较,SNCI组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA组表达显着降低（P<0.05）。JNK2 m RNA,与SHAM组比较,SNCI组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,其余3组表达显着降低。JNK3 m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、DEA组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA、NEA组表达显着降低（P<0.05）;与SEA、DEA组比较,NEA组表达显着降低（P<0.05）。c-Jun m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA、NEA组表达显着降低（P<0.05）;SEA和NEA组表达无显着差异,DEA组表达低于上述2组（P<0.05）。Bcl-2/Bax m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA组表达显着降低（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA组表达显着升高（P<0.05）;DEA组表达高于SEA组高于NEA组（P<0.05）。Caspase-3 m RNA,与SHAM组比较,其余四组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,SEA、DEA组表达显着降低（P<0.05）,DEA组表达低于NEA组（P<0.05）。Caspase-8 m RNA,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组表达显着升高（P<0.05）;与SNCI组比较,DEA组表达显着降低（P<0.05）,SEA、NEA组与之表达无统计学差异。2.2免疫荧光法检测针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经和背根神经节中p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-8蛋白表达的影响坐骨神经组织中,p-JNK蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。p-c-Jun蛋白荧光强度各组均较低,与SHAM组比较,SNCI、NEA组强度明显增加;与SNCI组比较,SEA、DEA组强度明显减少,NEA组强度轻微减少。Bcl-2蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。Bax蛋白荧光强度各组均较高,与SHAM组比较,SNCI、SEA、NEA组强度明显增加;与SNCI组比较,DEA组强度明显减少。Cleaved-caspase-3蛋白荧光强度各组差异较大,SHAM组和DEA组强度较低,SEA和NEA组强度较高,SNCI组强度最高。Cleaved-caspase-8蛋白荧光强度各组差异较大,SNCI组强度很高,其余4组强度较低。背根神经节组织中,p-JNK蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。p-c-Jun蛋白荧光强度各组均较低,SNCI组强度相对较高,其余4组强度较低。Bcl-2蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。Bax蛋白荧光强度各组均较高,与SHAM组比较,SNCI、NEA组强度明显增加;与SNCI组比较,SEA、DEA组强度明显减少。Cleaved-caspase-3蛋白荧光强度各组差异较大,SHAM组和DEA组强度较低,SEA和NEA组强度较高,SNCI组强度最高。Cleaved-caspase-8蛋白荧光强度各组均较低,组间未见明显差异。2.3 Western Blot法检测针刺“环跳”穴对大鼠坐骨神经和背根神经节中TNF-α、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8蛋白表达的影响坐骨神经组织中,TNF-α蛋白,SHAM组表达较低,SNCI组表达增加（P<0.05）,DEA组较SNCI组表达减少（P<0.05）。Bcl-2/Bax蛋白比值,与SHAM组比较,SNCI组能显着降低（P<0.05）,SEA和DEA显着增加（P<0.05）,DEA组优于SEA组（P<0.05）。p-c-Jun蛋白,SHAM、SNCI、SEA和NEA组表达无统计学差异,DEA组表达减少（P<0.05）。Cleaved Caspase-3蛋白,与SHAM组比较,SNCI和NEA组显着增加（P<0.05）,SEA和DEA显着减少（P<0.05）,DEA组优于SEA组（P<0.05）。Cleaved Caspase-8蛋白,与SHAM组比较,SNCI组显着增加（P<0.05）,SEA和DEA组显着减少（P<0.05）。背根神经节组织中,TNF-α蛋白,SHAM组表达较低,SNCI组表达增加（P<0.05）,DEA组较SNCI组表达减少（P<0.05）。Bcl-2/Bax蛋白比值,与SHAM组比较,SNCI组显着降低（P<0.05）,SEA和DEA显着增加（P<0.05）,DEA组优于SEA组（P<0.05）。p-c-Jun蛋白,与SHAM组比较,SNCI组显着增加（P<0.05）,DEA显着减少（P<0.05）。Cleaved Caspase-3蛋白,与SHAM组比较,SNCI组显着增加（P<0.05）,SEA和DEA显着减少（P<0.05）,两组之间无统计学差异。Cleaved Caspase-8蛋白,SHAM、SNCI、SEA和NEA组表达无统计学差异,DEA组显着降低（P<0.05）。论文三针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠雪旺细胞S100蛋白的影响1针刺对大鼠坐骨神经雪旺细胞S100蛋白表达的影响与SHAM组比较,SNCI组S100表达减少（P<0.05）。与SNCI组比较,SEA、DEA组表达升高（P<0.05）,DEA组表达高于SEA组（P<0.05）。二、体外细胞实验论文四针刺血清调控JNK信号通路干预H2O-2诱导的RSC96细胞凋亡的实验研究1针刺血清对H2O-2诱导的RSC96细胞活力的影响不同浓度H2O-2干预细胞6h后,0-50μM组细胞活力随着H2O-2浓度的增加而降低;50-200μM组细胞活力未见明显变化;200-800μM组细胞活力随着H2O-2浓度的增加而增加。50μM H2O-2干预细胞6h后,细胞增殖抑制效率较大,增殖抑制率约为80%,因此选择H2O-2终浓度为50μmol/L,干预时间6h作为H2O-2诱导RSC96细胞损伤的实验条件。不同浓度针刺血清干预细胞24、48、72h后,细胞活力随着血清浓度的增加而逐渐降低。10%浓度针刺血清孵育RSC96细胞各个时间的细胞活力差异性较小,且对细胞增殖的抑制率较低,分别是16%、22%、14%,因此选择针刺血清浓度为10%作为针刺血清孵育RSC96细胞的实验条件。Control组细胞活力较高,培养24、48、72h后细胞存活率均为90%以上。H2O-2组细胞活力较低,培养24、48、72h后细胞存活率分别约为23%、20%、18%。H2O-2+Acupuncture serum组细胞活力相差较大,培养24、48、72h后细胞存活率分别约为40%、84%、66%。因此选择针刺血清干预时间为48h作为针刺血清孵育RSC96细胞的实验条件,此时细胞存活率提高最为显着。2针刺血清对H2O-2诱导的RSC96细胞周期的影响与Control组细胞（GO/G1期:37.87%;S期:41.13%;G2/M期:13.60%）比较,H2O-2组GO/G1期下降为25.50%（P<0.05）,S期上升为50.87%（P<0.05）。与H2O-2组细胞比较,H2O-2+Acupuncture serum组S期下降为32.33%（P<0.05）,G2/M期上升为18.30%（P<0.05）,说明H2O-2使细胞周期被阻滞在S期,针刺血清能有效解除H2O-2引起的S期阻滞。3针刺血清对H2O-2诱导的RSC96细胞凋亡的影响Control组正常细胞占绝大多数,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均较少。与Control组比较,H2O-2组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均显着增多（P<0.05）。与H2O-2组比较,H2O-2+Acupuncture serum组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞均显着减少（P<0.05）,但仍多于Control组（P<0.05）。4针刺血清对RSC96细胞上清液中TNF-α水平的影响Control组TNF-α水平未发生显着改变。H2O-2诱导使细胞上清液中TNF-α水平升高（P<0.05）,24h时达到峰值。Acupuncture serum干预下24h时开始下降,36h时水平更低（P<0.05）。5针刺血清干预RSC96细胞JNK信号通路对凋亡的影响5.1免疫荧光法检测针刺血清对RSC96细胞S100、Cleaved caspase-3蛋白表达定位S100蛋白荧光强度各组均较高,组间未见明显差异。Cleaved caspase-3蛋白,Control组和H2O-2+Acupuncture serum组荧光强度较低,H2O-2组强度较高。5.2 Western Blot法检测针刺血清对RSC96细胞p-JNK、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响p-JNK蛋白,与Control组比较,H2O-2组表达显着增加（P<0.05）;加入SP600125后表达减少（P<0.05）。p-c-Jun蛋白,与Control组比较,H2O-2组表达显着增加（P<0.05）;加入SP600125后表达减少（P<0.05）。Bcl-2/Bax蛋白比值,与Control组比较,H2O-2组显着减少（P<0.05）;与H2O-2组比较,H2O-2+Acupuncture serum组显着升高（P<0.05）;加入SP600125后显着升高（P<0.05）。Cleaved Caspase-3蛋白,与Control组比较,H2O-2组表达显着增加（P<0.05）;与H2O-2组比较,H2O-2+Acupuncture serum组和H2O-2+Acupuncture serum+SP600125组表达减少（P<0.05）。Cleaved Caspase-8蛋白,与Control组比较,H2O-2组表达显着增加（P<0.05）;与H2O-2组比较,H2O-2+Acupuncture serum组表达减少（P<0.05）;加入SP600125后表达减少（P<0.05）。结论:1.浅刺和深刺“环跳”穴能改善神经运动功能、传导功能,加快神经结构恢复,深刺效果优于浅刺。说明针刺具有改善神经运动功能和传导功能,修复组织形态结构的功能;针刺具有提高机体抗氧化能力,减少氧化损伤的功能,且深刺效果更为显着。2.针刺可调节JNK信号通路,抑制c-Jun磷酸化,使Bcl-2/Bax基因和蛋白的比值增高,Caspase-8和Caspase-3基因和活化蛋白表达减少,抑制神经细胞凋亡,深刺效果更佳。说明针刺具有通过调控JNK信号通路抑制神经细胞凋亡的功能。3.坐骨神经损伤局部组织的S100表达减少,针刺使损伤局部组织的S100表达增加。说明针刺具有促进雪旺细胞增殖和成熟的功能。4.针刺血清具有促进氧化损伤的RSC96细胞增殖的功能;针刺血清和JNK抑制剂均能够通过调控JNK信号通路抑制细胞凋亡;针刺血清抑制氧化损伤的RSC96细胞凋亡的机制可能通过调控JNK信号通路实现。
齐士斌[8]（2020）在《NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系》文中研究说明目的临床上,周围神经损伤后的轴突生长不仅扮演着重要的角色,也是目前面临的难题。周围神经损伤后,主要表现为轴突连续性的中断,导致了神经炎症反应和神经轴突信号传递的缺失,最终致使患者感觉和运动功能的丧失。众所周知,炎症反应是调控神经轴突再生的重要因素之一。核因子κB（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）作为经典的炎症因子参与到许多的炎症反应,并在其中起着重要的调控作用。然而,NF-κB在成年哺乳动物的感觉神经元轴突再生作用却是未知的。信号转导转录因子3（signal transductionoftranscriptionfactor,STAT3）同样具有调控炎症因子的合成及释放,在神经轴突再生具有一定的作用。在此,我们发现周围神经损伤后,NF-κB和STAT3均在成年感觉神经元中激活。此外,药物抑制NF-κB和STAT3的表达均可阻碍周围感觉神经元在体外及体内的轴突生长;相反,激活NF-κB后,体外轴突再生未表现出明显促进作用,而激活STAT3则可促进神经轴突的再生。此外我们还发现STAT3的激活显着促进视神经的体内再生,并在一定程度上提高了视网膜神经节细胞的存活率。更重要的是,激活STAT3可以逆转由于NF-κB受抑所引起的轴突生长受阻。综上所述,本研究表明NF-κB通过STAT3调节成年感觉神经元轴突生长。方法1.本课题研究采用外周神经损伤模型,于损伤1、3、7天后取背根神经节（dorsal rootganglion,DRG）,对感觉神经元中NF-κB及STAT3的蛋白表达进行蛋白质免疫印迹（Western Blot）定量检测。2.体外应用DRG感觉神经元培养模型,通过特异性的化学药物及小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制NF-κB及STAT3的蛋白表达,体外培养3天后,经特异性神经元标记抗体进行免疫荧光染色,标记神经元再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。3.体外DRG感觉神经元培养,通过特异性化学激活剂激活NF-κB及STAT3的活性表达,体外培养2天后,使用特异性神经元标记抗体通过免疫荧光染色标记再生轴突并统计测量其长度,以此检测NF-κB及STAT3对轴突再生的功能作用。4.体内DRG电穿孔转染特异性siRNA与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）混合溶液至腰椎4、5（Lumbar4～5,L4～5）抑制NF-κB及STAT3的活性,2天后行坐骨神经夹伤,5天后取出夹伤侧坐骨神经进行压片,统计测量被GFP转染标记的神经元再生轴突,以此检测两者在体内对轴突再生的功能作用。5.利用玻璃体注射及视神经损伤模型,将20%乙醇或STAT3特异性激活剂注射进入玻璃体并同时进行视神经损伤。术后12天再次注射Alexa-488标记的霍乱毒素B（Alexa-488-CTB）进入眼球玻璃体内顺行标记再生轴突。术后14天使用4%多聚甲醛固定视神经并通过10%、20%、30%蔗糖梯度脱水处理。冰冻切片后,测量统计视网膜神经节细胞的存活率及视神经轴突再生情况。6.利用视神经损伤模型,于损伤后14天,取出视网膜,冰冻切片后,通过特异性神经元免疫荧光染色统计视网膜神经节细胞的存活率,以此确定激活STAT3在一定程度上促进节神经元的存活。结果1.NF-κB调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内p-p65蛋白表达逐渐升高,且在第3、7天最为明显。2)药物PDTC抑制NF-κB活性,或转染p65小干扰RNA敲减其蛋白,阻碍了体外培养的DRG感觉神经元轴突的生长。3)p65小干扰RNA体内电转染至L4/L5 DRG内,敲减NF-κB蛋白后,坐骨神经轴突再生受到抑制。4)相反,药物VP16虽促进了磷酸化p65表达升高,但体外感觉神经轴突的生长未表现出明显的增长。2.STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)外周神经损伤后,DRG神经元内磷酸化STAT3表达在第一天达到高峰,此后呈现逐渐降低趋势。2)药物S3I-201抑制STAT3活性,或转染siRNA敲减其蛋白,体外培养的DRG感觉神经元轴突再生受到阻碍。3)特异性STAT3小干扰RNA电转染至L4/L5 DRG感觉神经元中,坐骨神经轴突的生长受抑。4)药物CLN不仅促进了磷酸化STAT3表达明显升高,还可显着促进成年感觉神经元的轴突再生。5)玻璃体内注射CLN激活STAT3活性,既促进视神经轴突的生长,也提高了视网膜神经节细胞的存活率。3.NF-κB通过STAT3调控感觉神经元轴突再生。1)通过PDTC抑制NF-κB活性后,不仅能降低p-p65,还能致使p-STAT3表达降低。2)使用CLN激活STAT3活性,可在一定程度上逆转NF-κB抑制剂所带来的阻碍感觉神经元轴突再生的作用。结论外周神经损伤后轴突再生的过程比较复杂,它受体内多种基因严格的联合调控。一般情况下,神经损伤后常伴随炎症反应及相关转录因子的激活,以此来调控损伤后轴突再生所需的必要物质。本研究结果表明,NF-κB及STAT3均具有调控感觉神经轴突再生的功能,且揭示了 NF-κB能通过调节STAT3进一步调控轴突再生。更为重要的是,激活STAT3不仅能促进视神经受损后的轴突再生,还可在一定程度上提高视网膜神经节细胞的存活率。
张翠红[9]（2020）在《DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究》文中认为目的:糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy,DPN）是糖尿病较为常见且严重的慢性并发症,典型的病理变化包括轴突变性、轴突缺失、髓鞘异常和节段性脱髓鞘。雪旺氏细胞作为外周神经主要的胶质细胞,为维持正常轴突冲动传导和促使受损轴突的再生提供营养支持。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和神经营养因子3（Neurotrophin 3）属于雪旺氏细胞分泌的蛋白多肽类神经生长因子,它们是神经细胞及神经胶质细胞生存、增殖、迁移和分化过程中所必需的营养物质。雪旺氏细胞中BDNF和Neurotrophin 3缺乏在糖尿病周围神经病变的发病机制中起重要作用,然而对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF和Neurotrophin 3表达下调的机制尚未完全阐明。DNA甲基化是一种常见的表观遗传学修饰方式,在调节基因转录、染色质重塑、基因组修饰和基因组完整性方面起着关键作用。DNA甲基化通常发生在基因启动子DNA的Cp G二核苷酸的胞嘧啶5’碳原子上,这一过程主要受DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）和去甲基化酶（ten-eleven translocation,TET）的调节。DNA甲基化是否参与糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞中BDNF表达缺陷,目前尚不清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种参与调节细胞多种功能的信号转导途径,可以调节细胞的增殖、代谢、自噬和凋亡,是由丝氨酸和苏氨酸组成的多蛋白激酶复合物。多种刺激,包括生长因子、葡萄糖和氨基酸等营养物质,都会影响mTOR信号通路。在mTOR信号通路上游,有不同途径对其调控,包括蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB或Akt）、腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）,以使细胞对不同的刺激产生反应。但是,糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞中BDNF、Neurotrophin 3的表达与DNA甲基化和mTOR信号通路及其上游调控分子之间是否存在网络交互关系,目前尚未见相关报道。因此,本研究通过建立糖尿病小鼠模型和利用体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96,首先,从组织水平观察糖尿病小鼠坐骨神经组织中BDNF和Neurotrophin 3的表达情况及髓鞘结构变化;然后,从细胞水平观察体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96中BDNF及Neurotrophin 3在m RNA及蛋白水平的表达变化,进一步检测BDNF启动子DNA的甲基化状态及DNA甲基转移酶DNMT的表达变化情况;同时应用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza）和特异性DNMT1 sh RNA质粒进行干预,观察DNMT1和BDNF的表达变化情况;最后,检测mTOR信号通路及其上游Akt、AMPK通路对高糖诱导的RSC96细胞中DNMT1和BDNF表达的影响。从而系统探究了DNA甲基化以及Akt/mTOR信号通路对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响,为糖尿病周围神经病变的预防和治疗提供新的研究思路,探索新的治疗干预靶点。方法:1. BDNF和Neurotrophin 3蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达及髓鞘结构变化将CD1雄性小鼠随机分为两组:正常组（normal mice）和糖尿病组（diabetic mice）。糖尿病小鼠模型构建采用腹腔单次注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,溶于0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,p H 4.4,150 mg/kg）,正常组小鼠只注射相等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,72 h后尾尖取血测定血糖,空腹血糖≥16.7 mmol/L者定义为糖尿病模型造模成功。糖尿病小鼠成模后,每周检测血糖,不符合标准者弃去,喂养16周,处死小鼠,分离坐骨神经,固定于4%多聚甲醛或4%戊二醛,用于免疫组织化学、神经髓鞘固蓝染色及电镜技术检测;部分坐骨神经组织用于提取蛋白。免疫组织化学和Western blot检测坐骨神经BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达。神经髓鞘固蓝染色及电镜技术观察小鼠坐骨神经髓鞘结构变化。2.体外高糖培养的RSC96细胞中BDNF、Neurotrophin 3蛋白和m RNA表达及BDNF启动子DNA甲基化状态检测大鼠雪旺氏细胞系RSC96在37℃,5%CO2培养箱内,用添加有10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养基中培养。（1）检测高糖环境下RSC96细胞中BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达变化:将RSC96细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L glucose,normal glucose,N）、高糖组（25mmol/L glucose,high glucose,H）和甘露醇高渗对照组（5.5 mmol/L glucose+19.5 mmol/L mannitol,M）。实验前细胞在无血清培养基中培养,以使其同步化。给予相应刺激1 d、2 d和3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测BDNF、Neurotrophin 3蛋白表达,Real-time PCR检测BDNF m RNA表达。（2）表观遗传学修饰对高糖诱导RSC96细胞中BDNF蛋白表达的作用:无血清培养基同步化细胞后,用DNA甲基转移酶抑制剂（10μmol/L 5-Aza）或组蛋白去乙酰酶抑制剂（400 nmol/L TSA）处理RSC96细胞,将RSC96细胞分为正常糖组（N）、高糖组（H）、高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）、高糖+400 nmol/L TSA组（H+TSA）。培养3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测BDNF蛋白表达。（3）甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）检测BDNF启动子DNA甲基化状态:无血清培养基同步化细胞后,将RSC96细胞分为正常糖组（N）、高糖组（H）和高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）组,细胞培养3 d后,基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）进行RSC96细胞基因组DNA提取,提取的DNA经亚硫酸盐修饰、纯化、回收备用。通过网站设计BDNF启动子区甲基化和非甲基化序列的引物对,甲基化及非甲基化引物进行PCR扩增、扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,计算甲基化的脱氧核糖核酸/甲基化+未甲基化脱氧核糖核酸,用于表示甲基化程度。3.DNMT对高糖诱导的RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响（1）检测高糖对RSC96细胞DNMT和TET m RNA表达的影响:将RSC96细胞分为正常糖组（N）和高糖组（H）,3 d后提取细胞总RNA,经过纯化、水解得到m RNA片段,经逆转录酶催化和随机引物合成第一条c DNA链,然后在DNA聚合酶I作用下合成第二条c DNA链,这些c DNA片段经过末端修复和连接,形成最终的c DNA文库,利用Illumina Hi Seq2500进行测序。（2）检测高糖对RSC96细胞DNMT1表达的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,实验前经无血清培养基培养细胞,使细胞同步化。高糖刺激细胞1 d、2 d和3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测DNMT1蛋白表达。（3）抑制DNMT1对RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响:实验前用无血清培养基培养细胞,使细胞同步化。将RSC96细胞分为正常糖组（N）、正常糖+10μmol/L 5-Aza组（N+5-Aza）、高糖组（H）、高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）。3 d后收集细胞,Western blot检测DNMT1及BDNF蛋白表达。（4）敲低DNMT1基因对BDNF蛋白表达的影响:构建DNMT1基因特异性sh RNA质粒并命名为p Genesil-1-DNMT1,高糖刺激的RSC96细胞随机分为未转染组（untransfection）、阴性对照组（p Genesil-1）和p Genesil-1-DNMT1转染组（p Genesil-1-DNMT1）。转染48 h后Western blot检测DNMT1及BDNF蛋白表达。4.Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的RSC96细胞DNMT1和BDNF表达的影响（1）检测高糖对RSC96细胞mTOR信号通路的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）蛋白表达。（2）检测mTOR通路抑制剂Torin1及激活剂MHY1485对高糖RSC96细胞D NMT1及BDNF蛋白表达的影响:细胞随机分为正常糖组（N）、正常糖+500 nmol/L Torin1组（N+Torin1）;正常糖组（N）、高糖组（H）、高糖+10μm ol/L MHY1485组（H+MHY1485）,培养3 d后收集细胞,细胞免疫荧光检测DNMT1蛋白表达,Western blot检测S6K、phospho-S6K（Thr 389）、D NMT1及BDNF蛋白表达。（3）检测高糖对RSC96细胞Akt及AMPK信号通路的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测Akt、phosph o-Akt（Ser 473）、phospho-Akt（Thr 308）、AMPK、phospho-AMPK（Thr 172）蛋白表达。（4）检测Akt及AMPK通路抑制剂（LY294002和Dorsomorp hin）对高糖RSC96细胞mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1和B DNF蛋白表达的影响:细胞随机分为正常糖组（N）、正常糖+DMSO组（N+DMSO）、正常糖+LY294002/Dorsomorphin组（N+LY294002/Dorsomorphi n）,高糖组（H）、高糖+DMSO组（H+DMSO）、高糖+LY294002/Dorsomorp hin组（H+LY294002/Dorsomorphin）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1和BDNF蛋白表达。结果:1.BDNF和Neurotrophin 3蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达及髓鞘结构变化。（1）Western blot检测结果显示:与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经组织中Pro-BDNF和mature-BDNF及Neurotrophin 3蛋白表达分别下降74.4%、40.1%和59.0%（P<0.05）。（2）免疫组化结果显示:小鼠坐骨神经组织中BDNF和Neurotrophin 3蛋白主要定位于细胞胞浆和胞核,呈棕黄色颗粒状分布,与正常组相比,糖尿病组二者表达减弱,分别降低72.8%、36.6%（P<0.05）。（3）神经髓鞘固蓝染色结果显示:与正常组相比,糖尿病组小鼠坐骨神经髓鞘变薄。（4）电子显微镜结果显示:与正常组相比,糖尿病组小鼠坐骨神经髓鞘结构不规则,出现内折现象。2. 体外高糖培养的RSC96细胞中BDNF、Neurotrophin 3蛋白和m RNA表达及BDNF启动子DNA甲基化状态检测。（1）高糖环境下RSC96细胞中BDNF和Neurotrophins 3蛋白表达变化:Western blot检测结果显示:与正常糖组相比,BDNF表达在高糖刺激2 d开始下降,且高糖刺激RSC96细胞2 d和3 d,Pro-BDNF蛋白表达分别下降了46.5%和48.3%（P<0.05）,同样,mature-BDNF蛋白表达分别下降了32.1%和23.7%（P<0.05）;但高糖刺激RSC96细胞1 d,与正常糖组和甘露醇高渗对照组相比,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达无明显差异（P>0.05）。而各组Neurotrophin 3蛋白在不同时间点的表达均没有明显差异。细胞免疫荧光结果显示:BDNF和Neurotrophin 3蛋白均定位于RSC96细胞胞核及胞浆,与正常糖组及甘露醇高渗对照组相比,高糖刺激导致RSC96细胞BDNF蛋白绿色荧光表达降低,但Neurotrophin 3蛋白表达无明显变化。Real-time PCR结果显示:与正常糖组相比,高糖组RSC96细胞中BDNF m RNA下降了61.4%（P<0.05）。（2）表观遗传学修饰对高糖诱导RSC96细胞中BDNF蛋白表达的作用:Western blot结果显示:与高糖组相比,H+5-Aza组RSC96细胞中BDNF蛋白表达升高,Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量分别是高糖组表达量的1.23倍和1.26倍（P<0.05）。然而,H+TSA组与高糖组比较,BDNF蛋白表达未见升高。细胞免疫荧光结果显示:与高糖组相比,H+5-Aza组细胞BDNF呈强阳性表达,而H+TSA组细胞BDNF表达未见明显改变。（3）甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）检测BDNF启动子DNA甲基化状态:与正常糖组细胞相比,高糖组RSC96细胞BDNF外显子I和外显子II启动子的甲基化程度显着增加（P<0.05）,H+5-Aza组外显子I和II的启动子甲基化程度降低（P<0.05）。相比之下,正常糖组和高糖组外显子IV（完全非甲基化）和外显子IX（几乎完全甲基化）启动子的甲基化程度没有差异（P>0.05）。3. DNMT对高糖诱导的RSC96细胞BDNF表达的影响。（1）高糖对RSC96细胞DNMT和TET m RNA表达的影响:RNA测序结果提示高糖组RSC96细胞DNMT1和DNMT3a m RNA表达水平升高,尤其是DNMT1m RNA表达水平显着升高。而正常糖组（N）和高糖组（H）细胞DNMT3b、TET1、TET2和TET3 m RNA的表达没有明显差别。（2）高糖对RSC96细胞DNMT1表达的影响:Western blot检测结果显示:高糖刺激RSC96细胞1 d、2 d、3 d,高糖组细胞中DNMT1蛋白表达量分别是正常糖组的2.13倍、2.22倍和2.44倍（P<0.05）。正常糖组和甘露醇高渗对照组DNMT1蛋白表达量无明显差异（P>0.05）。细胞免疫荧光检测发现DNMT1主要定位于RSC96细胞的细胞核,高糖刺激3 d后并没有改变DNMT1的亚细胞定位;但与正常糖组相比,高糖组DNMT1蛋白绿色荧光的表达水平显着增加。（3）5-Aza抑制对RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:5-Aza使正常糖组细胞DNMT1蛋白表达量下降了55.9%（P<0.05）,使高糖组细胞中DNMT1蛋白表达量下降了59.3%（P<0.05）。H+5-Aza组RSC96细胞中的Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量分别是单纯高糖组的1.67倍（P<0.05）和1.35倍（P>0.05）。而5-Aza对正常糖组细胞中的Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量无明显影响。（4）敲低DNMT1基因对BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:与阴性对照组（p Genesil-1）相比,p Genesil-1-DNMT1组RSC96细胞中DNMT1蛋白表达量下降了70.5%（P<0.05）;Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量比阴性对照组（p Genesil-1）分别明显增加了29.3%和82.9%（P<0.05）。4. Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的RSC96细胞DNMT1和BDNF表达的影响。（1）高糖对RSC96细胞mTOR信号通路的影响:Western blot检测结果显示:与正常糖组相比,高糖组RSC96细胞phospho-mTOR（Ser2448）降低了45.3%（P<0.05）。正常糖组及甘露醇髙渗对照组细胞phospho-mTOR（Ser 2448）表达无差异（P>0.05）。（2）mTOR通路抑制剂Torin1和激活剂MHY1485对高糖RSC96细胞DNMT1及BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:Torin 1显着抑制正常糖RSC96细胞mTOR通路活化,phospho-S6K（Thr 389）表达量明显降低（P<0.05）,同时使DNMT1表达量增加了1.04倍（P<0.05）,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达量分别降低了37.8%（P<0.05）和29.3%（P>0.05）。细胞免疫荧光结果显示:与正常糖组相比,Torin 1组增加了RSC96细胞核内DNMT1的表达,表现为强烈的绿色荧光;MHY1485能促进高糖RSC96细胞mTOR通路活化,phospho-S6K（Thr 389）表达水平明显增加（P<0.05）,同时使DNMT1蛋白表达量降低49.9%（P<0.05）,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达量明显增加（P<0.05）。（3）高糖对RSC96细胞Akt及AMPK信号通路的影响:Western blot检测结果显示:与正常糖组及甘露醇髙渗对照组相比,高糖组phospho-Akt（Ser 473）和phospho-Akt（Thr 308）蛋白表达量分别降低了74.1%和80.6%（P<0.05）,phospho-AMPK（Thr 172）蛋白表达量升高了46.5%（P<0.05）,三组之间总Akt和AMPK蛋白表达量无明显差异。（4）Akt及AMPK通路抑制剂（LY294002和Dorsomorphin）对高糖RSC96细胞mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1及BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:LY294002使正常糖及高糖培养的RSC96细胞phospho-mTOR（Ser 2448）表达量明显降低（P<0.05）,总mTOR表达量无明显差异。进一步发现,LY294002使高糖组DNMT1表达增加,BDNF表达减少（P<0.05）,然而在正常糖组,LY294002不影响DNMT1及BDNF的表达。这些数据表明Akt通路影响高糖RSC96细胞的mTOR通路及DNMT1和BDNF的表达;Dorsomorphin显着增加正常糖和高糖mTOR磷酸化,Western blot检测结果显示:phospho-mTOR（Ser 2448）表达量明显升高（P<0.05）,总mTOR表达量无明显变化。进一步发现,Dorsomorphin使高糖组DNMT1表达下降（P<0.05）,而正常糖组DNMT1表达量无明显变化。与对照组相比,高糖组或正常糖组RSC96细胞中Pro-BDNF和mature-BDNF表达量无明显变化。结论:1.高糖通过增加BDNF外显子I和II的启动子甲基化导致雪旺氏细胞中BDNF的表达降低。2.DNMT1介导了高糖诱导的雪旺氏细胞中BDNF表达降低。3.Akt/mTOR途径参与高糖诱导的雪旺氏细胞中DNMT1表达的升高和BDNF表达的降低。
黎显杰[10]（2020）在《吡咯加合物与正己烷生物暴露限值和中毒机制研究》文中认为正己烷（n-hexane）是一种工业上常用的有机溶剂,长期接触会诱发暴露人群职业中毒,患者表现出肢体远端的感觉异常、麻木无力,甚至出现下肢瘫痪。自上世纪90年代以来,我国正己烷的生产量和使用量逐年升高,正己烷中毒曾一度成为我国发病率最高的职业病之一。近年来虽然使用了新型溶剂替代正己烷,但长三角、珠三角地区依旧有正己烷中毒的病例报道。目前临床上对正己烷中毒病人无特异性疗法,以营养支持治疗为主,患者痊愈所需时间较长。由于其致病机制尚未明确并且无特效药物治疗,设立生物暴露限值、探究正己烷诱发周围神经病变的机制对职业中毒预防和临床治疗有重要意义。正己烷进入机体后,随着血液循环进入肝脏,主要在肝脏内细胞色素氧化酶CYP2E1的催化下代谢形成γ-二酮类化合物:2,5-己二酮（2,5-hexanedione,2,5-HD）。随后2,5-HD能与体内的含有氨基（-NH2）的基团发生反应形成2,5-二甲基吡咯加合物（简称吡咯加合物）,并在体内多种脏器内蓄积。有研究证明吡咯加合物的蓄积、氧化交联反应与周围神经损伤密切相关。提示吡咯加合物可能不仅是机体正己烷中毒的暴露标志物,还有作为效应标志物的潜力,但目前国内外关于吡咯加合物与神经损伤分子机制的有关报道较少,致病机制尚未明确。我国职业卫生标准中设立了车间空气中正己烷最高容许浓度和尿液中正己烷的代谢物——2,5-HD的生物暴露限值。但2,5-HD清除速率较快,脱离暴露1-2天就恢复到正常水平,亦不能反映机体神经损伤情况。临床诊断中使用的血清中神经损伤指标、电生理检查等非特异性指标在中毒的早期无明显变化,因此需要寻找能反映机体神经损伤情况且能进行长期监测的特异生物标志物。前期我们研究发现正己烷染毒的大鼠血清、尿液中吡咯加合物与神经损伤有较好相关性。本次研究使用大鼠为实验模型,建立毛发吡咯加合物测定方法,监测长期正己烷暴露大鼠毛发中吡咯加合物与行为学改变,比较血清、尿液和毛发吡咯加合物与神经损伤的相关性,计算毛发吡咯加合物的未观察到有害作用水平（No-observe-adverse-effect-level,NOAEL）,探究其作为生物暴露限值预防正己烷中毒的可行性。为了确定吡咯加合物蓄积与正己烷中毒的因果关系,我们使用CYP2E1抑制剂二烯丙基一硫减少大鼠体内正己烷的代谢活化,探究神经组织吡咯加合物蓄积与神经损伤的关系,验证NOAEL值的可行性。同时探讨正己烷诱发周围神经病变的早期事件、关键调控分子和损伤机制,发现有效的干预和治疗靶点,为正己烷暴露人群的职业中毒预防和临床治疗提供实验依据。第一章毛发吡咯加合物作为正己烷诱发周围神经病变的生物标志物研究目的正己烷诱发周围神经病变的发病过程是一个慢性过程。前期研究血清、尿液样本中吡咯加合物浓度与染毒动物神经损伤呈较好的相关性,尽管血清、尿液中吡咯加合物半衰期比2,5-HD长,但并不适用于正己烷中毒的职业中毒预防和临床诊断。毛发样本具有较好的稳定性,能反映吡咯加合物在机体内长时间的蓄积,可能成为比血清、尿液更好的生物标志物。因此,本研究拟建立毛发中吡咯加合物的测定方法,监测长期正己烷暴露大鼠毛发吡咯加合物的变化和大鼠行为学改变,比较血清、尿液、毛发吡咯加合物与神经损伤的相关性,计算毛发吡咯加合物的未见有害作业水平,并探究其作为正己烷中毒生物暴露限值的可行性。方法第一节毛发吡咯加合物浓度测定的方法建立使用2,5-HD浸泡大鼠毛发和人头发,建立含有吡咯加合物的毛发模型;使用不同方法消化毛发并测定吡咯加合物浓度,选择最适合稳定的方法,并进行精密度检测、加标回收率实验验证方法的可行性;测定2,5-HD浸泡毛发模型中吡咯加合物浓度;使用正己烷对大鼠染毒建立动物模型,在染毒期、染毒中期、染毒终点收集大鼠毛发,测定吡咯加合物浓度,并与大鼠的步态评分做Spearman’s相关分析。第二节确定毛发吡咯加合物的未观察到有害作用水平使用不同剂量正己烷对大鼠进行长期染毒,建立正己烷诱发周围神经病变模型;在染毒期和恢复期监测大鼠步态评分、转棒潜伏期和神经传导速度的变化;监测大鼠血清、尿液、毛发中吡咯加合物浓度变化;设立卫星组进行毒代动力学研究,计算血清、尿液、毛发中吡咯加合物的半衰期;进行多重回归分析选取最适合的行为学指标进行相关性分析,计算血清、尿液、毛发中吡咯加合物与神经损伤指标的偏相关系数,使用相关性最高的毛发吡咯加合物数据计算NOAEL值。结果第一节毛发吡咯加合物浓度测定的方法建立毛发吡咯加合物的测定方法可行,具有较高的精密度、加标回收率;体外条件下,毛发中吡咯加合物浓度与使用的2,5-HD浓度呈剂量依赖性（P<0.05）;使用相同浓度2,5-HD处理的大鼠毛发和人头发相比,反应形成吡咯加合物的浓度无差异;正己烷处理的毛发与对照组无差异;长期正己烷染毒大鼠毛发内有吡咯加合物蓄积,呈剂量依赖性,并与神经损伤呈正相关:r=0.8507（P<0.05）。第二节确定毛发吡咯加合物的未观察到有害作用水平长期正己烷染毒大鼠毛发中吡咯加合物浓度变化缓慢,半衰期比血清、尿液中吡咯加合物更长,约为24.9±7.5周;毛发吡咯加合物浓度与大鼠神经损伤程度呈正相关（染毒期r=0.683,恢复期r=0.702）（P<0.05）,且毛发吡咯加合物对步态评分的偏相关系数（染毒期0.324,恢复期0.322）高于血清（染毒期0.193,恢复期0.050）、尿液吡咯加合物（染毒期0.120,恢复期0.115）;根据0.5 g/kg染毒组大鼠未出现任何神经损伤表现,计算出毛发吡咯加合物NOAEL值:275.2 ±61.5 nmol/g.protein。结论1.毛发吡咯加合物的测定方法稳定可行,可用于检测正己烷中毒;2.毛发中吡咯加合物浓度变化缓慢、半衰期长,与神经损伤相关性最高,可以作为一个特异、敏感、稳定的效应标志物;3.毛发吡咯加合物的NOAEL值:275.2±61.5nmol/g.protein,为人群生物暴露限值提供参考。第二章吡咯加合物蓄积在正己烷诱发周围神经病变中的作用目的1.验证吡咯加合物蓄积与正己烷诱发周围神经病变的因果关系;2.验证前一章大鼠毛发吡咯加合物NOAEL的可行性;3.探究钙离子相关通路在正己烷诱发周围神经病变中的作用方法第一节二烯丙基一硫拮抗正己烷诱发神经损伤的机制研究使用正己烷对大鼠染毒建立动物模型,干预组提前2小时使用50、100mg/kg剂量的CYP2E1抑制剂二烯丙基一硫（Diallyl sulfide,DAS）进行干预;监测染毒期各组大鼠的行为学改变,评估DAS对正己烷染毒大鼠的保护作用;检测大鼠血清、尿液、毛发、坐骨神经中吡咯加合物的蓄积,验证毛发吡咯加合物NOAEL的可行性;在实验中期进行毒代动力学研究探究DAS对正己烷体内代谢的影响;染毒结束后,收集大鼠坐骨神经制作病理切片观察坐骨神经损伤,收集大鼠肝脏检测相关代谢酶的表达和活性。第二节二烯丙基一硫增强2,5-己二酮神经毒性的机制研究使用正己烷、2,5-HD对大鼠进行染毒建立模型,使用100 mg/kg剂量DAS分别对2,5-HD、正己烷染毒大鼠进行干预;监测各组大鼠步态评分、转棒潜伏期的变化;设立卫星组进行毒代动力学研究,探究DAS对正己烷和2,5-HD代谢的影响;在染毒终点,收集大鼠肝、肾、脊髓、坐骨神经测定吡咯加合物浓度;制作坐骨神经病理切片检查神经损伤,并检测髓鞘相关蛋白的表达;提取脊髓、坐骨神经蛋白,检测钙蛋白酶系统和钙依赖性自噬相关蛋白的表达;建立2,5-HD染毒的小鼠神经瘤母细胞的细胞模型,分别使用DAS和自噬抑制剂氯喹进行干预处理,观察细胞损伤,测定细胞存活率、轴突长度和钙离子浓度。结果第一节二烯丙基一硫拮抗正己烷诱发神经损伤的机制研究行为学及电生理改变:正己烷模型组大鼠在染毒期间出现了步态评分升高、转棒潜伏期下降、神经传导速度下降,而DAS低、高剂量干预组大鼠的行为学表现与模型组相比明显改善,步态评分下降、转棒潜伏期升高、神经传导速度升高（P<0.05）;坐骨神经病理检查:DAS的干预使大鼠坐骨神经损伤减轻,表现为坐骨神经切片中空泡样病变明显减少,组织结构更加致密完整;吡咯加合物浓度变化:与正己烷模型组相比,DAS低、高剂量干预组血清、尿液、毛发、坐骨神经吡咯加合物浓度均下降,呈剂量依赖性（P<0.05）;毒代动力学改变:DAS干预使得正己烷在大鼠体内代谢活化减少,表现为血清内2,5-HD、吡咯加合物水平下降,并且DAS干预组血清中2,5-HD、吡咯加合物半衰期变短,呈剂量依赖性（P<0.05）;肝脏内代谢酶的表达和活性改变:与正己烷模型组相比,DAS干预降使肝脏内CYP2E1的表达下降、活性下降,呈剂量依赖性（P<0.05）;与正己烷模型组相比,DAS干预使肝脏内NQO1的表达升高、活性升高,呈剂量依赖性（P<0.05）;与正己烷模型组相比,DAS干预使肝脏内GSTT1的表达升高、活性升高,呈剂量依赖性（P<0.05）。第二节二烯丙基一硫增强2,5-己二酮神经毒性的机制研究行为学改变:与2,5-HD模型组相比,DAS干预2,5-HD组周围神经损伤发展更快,在第三周组内所有大鼠出现瘫痪,而DAS干预正己烷组大鼠行为学表现未出现异常变化;吡咯加合物浓度变化:DAS干预2,5-HD组大鼠坐骨神经内吡咯加合物浓度是2,5-HD模型组的2倍,而DAS干预正己烷组大鼠坐骨神经内吡咯加合物浓度相比正己烷模型组下降;毒代动力学改变:DAS能减少正己烷的代谢活化,减少2,5-HD、吡咯加合物的形成,但对于2,5-HD没有直接作用;坐骨神经损伤:2,5-HD、正己烷模型组大鼠坐骨神经出现了结构紊乱和空泡样改变,DAS干预2,5-HD组结构更加紊乱,而DAS干预正己烷组未见明显损伤;与2,5-HD模型组相比,DAS干预2,5-HD组髓鞘相关蛋白MBP升高95.8%;钙离子相关通路蛋白表达:在2,5-HD模型组、正己烷模型组坐骨神经中,钙蛋白酶系统激活,DAS干预能进一步增加m-calpain、μ-calpain蛋白的表达;在2,5-HD模型组、正己烷模型组坐骨神经中,钙依赖性自噬激活,DAS的干预使自噬相关蛋白表达进一步增加;细胞实验结果显示,与2,5-HD模型组相比,DAS预处理使得2,5-HD染毒N2a细胞轴突变短、钙离子浓度升高（P<0.05）,呈剂量依赖性,而氯喹干预使2,5-HD染毒细胞轴突长度增加（P<0.05）。结论1.吡咯加合物在坐骨神经中蓄积导致神经损伤,呈剂量依赖性;2.DAS通过抑制大鼠肝脏内CYP2E1的表达和活性,减少体内2,5-HD的形成,从而减少吡咯加合物的蓄积保护坐骨神经,具有长期使用预防正己烷诱发神经病变的潜力,但DAS的使用必须在正己烷暴露之前才能达到预防目的;3.蓄积在坐骨神经中的吡咯加合物可能通过升高细胞内钙离子浓度,激活钙蛋白酶系统,对神经细胞造成损伤,而钙依赖性自噬的过度激活会加重神经损伤。第三章磷酸化TDP43积聚在正己烷诱发周围神经损伤中的作用目的拟检测2,5-HD染毒大鼠坐骨神经内吡咯加合物的蓄积和TDP43等相关蛋白的表达,探究坐骨神经内吡咯加合物引起神经损伤的信号通路和致病机制,为职业中毒预防和临床治疗正己烷诱发周围神经病变提供研究依据。方法使用不同剂量的2,5-HD对大鼠染毒建立模型;监测染毒期间各组大鼠步态评分、转棒潜伏期的变化;在染毒结束后对大鼠血清、毛发、坐骨神经内吡咯加合物进行定量分析;制作大鼠坐骨神经病理切片检测神经损伤,并使用免疫组化染色检测坐骨神经内p-TDP43蓄积;提取坐骨神经胞浆蛋白,测定TDP43、p-TDP43、内质网应激相关蛋白、钙蛋白酶、轴突损伤蛋白的表达;分别对对大鼠步态评分、坐骨神经内吡咯加合物、p-TDP43蛋白表达相关性分析,探究吡咯加合物和p-TDP43蓄积的关系。结果:行为学改变:与对照组相比,2,5-HD染毒组出现步态评分升高、转棒潜伏期下降,呈剂量依赖性（P<0.05）;吡咯加合物浓度变化:与对照组相比,2,5-HD染毒大鼠血清、毛发、坐骨神经内吡咯加合物浓度升高,呈剂量依赖性（P<0.05）;病理检查:染毒组大鼠坐骨神经病理切片显示出现空泡样改变和结构紊乱,免疫组化染色结果显示坐骨神经内有p-TDP43蓄积,呈剂量依赖性（P<0.05）;TDP43蛋白表达:与对照组相比,2,5-HD染毒组大鼠坐骨神经TDP43表达增加、p-TDP43表达增加、多聚体p-TDP43/单体TDP43比例升高,呈剂量依赖性（P<0.05）;内质网应激蛋白:与对照组相比,中、高剂量2,5-HD染毒组的PERK表达升高,低、中、高剂量组ATF4、CHOP表达升高（P<0.05）;钙蛋白酶系统:与对照组相比,2,5-HD高剂量染毒组μ-calpain表达升高,2,5-HD中、高剂量染毒组的m-calpain表达升高,而2,5-HD低、中、高染毒组calpastain 表达降低（P<0.05）;轴突损伤蛋白:与对照组相比:中、高剂量2,5-HD染毒组大鼠坐骨神经内轴突损伤蛋白SARM1表达升高,低、中、高剂量组轴突保护蛋白STMN2、NMNAT2 表达下降（P<0.05）;相关性分析:坐骨神经内p-TDP43表达与坐骨神经吡咯加合物浓度、步态评分均呈正相关（P<0.05）结论1.在2,5-HD染毒大鼠坐骨神经内发现了 p-TDP43异常积聚,且与神经损伤呈正相关;2.坐骨神经内p-TDP43多聚体积聚呈剂量依赖性,并与吡咯加合物浓度呈正相关;3.吡咯加合物可能诱发p-TDP43形成异常积聚,激活内质网应激,升高细胞内钙离子浓度,激活钙蛋白酶系统对神经细胞造成损伤。
二、周围神经43kD蛋白在损伤坐骨神经中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、周围神经43kD蛋白在损伤坐骨神经中的表达（论文提纲范文）
（1）DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 DOK3通过与GPR84相互结合参与小胶质细胞介导的炎症反应 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 溶液配制 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图 |
| 第二部分 DOK3通过与GPR84相互作用参与脊髓小胶质细胞介导的神经病理性疼痛 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 溶液配制 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脊髓小胶质细胞参与神经病理性疼痛的机制研究 |
| 神经病理性疼痛的研究现状 |
| 小胶质细胞的特征与活化的机制 |
| 与小胶质细胞激活相关的信号分子及受体 |
| 神经元与小胶质细胞相互作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
（2）NLRP3炎性小体在小鼠周围神经损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂与材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠坐骨神经损伤模型的构建 |
| 2.2 RT-qPCR检测小鼠坐骨神经损伤后相关指标的m RNA水平 |
| 2.2.1 RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA浓度的测定 |
| 2.2.3 RNA的逆转录 |
| 2.2.4 Real-time PCR反应 |
| 2.3 Western-blot检测坐骨神经损伤后相关蛋白水平 |
| 2.3.1 蛋白的提取 |
| 2.3.2 PAGE凝胶的制备(10%) |
| 2.3.3 PAGE凝胶制备(12.5%) |
| 2.3.4 电泳与转膜 |
| 2.3.5 封闭、孵抗体及显影 |
| 2.4 坐骨神经的HE、LFB染色以及免疫组化 |
| 2.4.1 标本的制备 |
| 2.4.2 坐骨神经的HE染色 |
| 2.4.3 坐骨神经的LFB染色 |
| 2.4.4 坐骨神经的免疫组化 |
| 2.5 免疫荧光检测巨噬细胞及ASC成核情况 |
| 2.6 小鼠运动功能的恢复 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 坐骨神经损伤后NLRP3炎性小体被激活 |
| 1.1 小鼠坐骨神经损伤模型的成功构建 |
| 1.2 小鼠坐骨神经的HE染色情况 |
| 1.3 小鼠坐骨神经的髓鞘特异性LFB染色 |
| 1.4 坐骨神经损伤后NLRP3炎性小体相关基因的mRNA变化 |
| 1.5 坐骨神经损伤后NLRP3炎性小体相关基因的蛋白变化 |
| 1.6 坐骨神经损伤后ASC的寡聚化 |
| 2 坐骨神经损伤后NLRP3基因敲除加速神经恢复 |
| 2.1 Nlrp3~(-/-)小鼠坐骨神经LFB染色 |
| 2.2 Nlrp3~(-/-)小鼠坐骨神经HE染色 |
| 2.3 小鼠巨噬细胞标志物CD68的免疫荧光染色 |
| 2.4 Nlrp3~(-/-)小鼠炎性组分的mRNA表达情况 |
| 2.5 Nlrp3~(-/-)小鼠炎性组分的蛋白表达情况 |
| 2.6 GAP-43和p75NTR的蛋白表达情况 |
| 2.7 小鼠运动功能恢复情况 |
| 3 TLR4/NF-κB信号通路调控NLRP3的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Toll样受体与炎性小体在神经损伤中的作用研究 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）仿生导电人工神经支架的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 多微通道导电神经支架的设计和制备及物理性能和生物相容性能检测评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 聚左旋乳酸取向性纤维膜及其生物相容性的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 仿生导电人工神经支架修复大鼠坐骨神经缺损的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象和主要试剂 |
| 1.3 实验分组和方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤修复的细胞和分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）SPP1在周围神经损伤后Wallerian溃变中对雪旺细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 雪旺细胞在Wallerian溃变中的作用及分子机制的文献综述 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 周围神经损伤修复的现状 |
| 2.3 Wallerian溃变和雪旺细胞 |
| 2.3.1 Wallerian溃变 |
| 2.3.2 雪旺细胞的发育和亚型 |
| 2.3.3 雪旺细胞在Wallerian溃变中的变化过程 |
| 2.3.4 雪旺细胞的可塑性和修复型雪旺细胞 |
| 2.3.5 周围神经损伤后髓鞘的清除 |
| 2.3.6 参与雪旺细胞在Wallerian溃变中修复程序的分子机制 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 患者正中神经损伤后远端神经组织中SPP1和PKCα表达增加且定位于雪旺细胞 |
| 4.2 患者正中神经损伤后远端神经组织中SPP1和PKCα的mRNA及蛋白表达上调 |
| 4.3 PKCα抑制雪旺细胞凋亡,促进雪旺细胞增殖 |
| 4.4 PKCα促进雪旺细胞中ERK磷酸化水平和Bcl-2的表达,抑制cleaved Caspase-3和Bax表达 |
| 4.5 siRNA抑制雪旺细胞中SPP1的表达,GV146-SPP1增加雪旺细胞中SPP1的表达 |
| 4.6 在沉默SPP1背景下激活PKCα,雪旺细胞增殖相对增加,凋亡相对减少 |
| 4.7 在过表达SPP1背景下抑制PKCα,雪旺细胞增殖相对减少,凋亡相对增加 |
| 4.8 SPP1通过PKCα促进雪旺细胞中p-ERK/ERK、Bcl-2/Bax相对表达、抑制Caspase-3活化 |
| 4.9 CD44和αvβ3在原代雪旺细胞中表达 |
| 4.10 大鼠坐骨神经损伤后远端神经中CD44定位于雪旺细胞且表达增加 |
| 4.11 大鼠坐骨神经损伤后远端神经中αv定位于雪旺细胞且表达增加 |
| 4.12 大鼠坐骨神经损伤后远端神经中CD44、αv、β3的mRNA及蛋白表达上调 |
| 4.13 si-CD44、si-β3分别抑制原代雪旺细胞中CD44、β3的表达 |
| 4.14 CD44和β3均可以促进雪旺细胞增殖,抑制雪旺细胞凋亡 |
| 4.15 CD44和β3均能促进雪旺细胞中PKCα、Bcl-2表达和ERK的磷酸化、抑制Bax表达和Caspase-3的活化 |
| 4.16 CD44和αvβ3在SPP1介导的PKCα活化及其下游信号通路中不可或缺 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 临床标本与实验动物中SPP1和PKCa在周围神经损伤后表达情况的一致性 |
| 5.2 影响SPP1对雪旺细胞增殖和凋亡调控的信号通路 |
| 5.3 分泌型SPP1的细胞表面受体在雪旺细胞上表达情况 |
| 5.4 本研究存在的局限性 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）三法三穴对坐骨神经损伤大鼠背根神经节cAMP-PKA信号通路表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 影响周围神经损伤修复的因素 |
| 1. 年龄对修复的影响 |
| 2. 神经修复和重建的时机对修复的影响 |
| 3. 伤害类型和程度对修复的影响 |
| 4. 重建技术对修复的影响 |
| 5. 供体部位发病率对修复的影响 |
| 6. 神经类型对修复的影响 |
| 7. 轴突与靶神经正确联系对修复的影响 |
| 8. 患者自身的认知能力对修复的影响 |
| 综述二 周围神经损伤的治疗 |
| 1. 手术疗法 |
| 2. 低剂量激光疗法可以增强周围神经损伤后的再生过程 |
| 3. 针刺推拿治疗对周围神经损伤有较好效果 |
| 综述三 cAMP-PKA信号通路 |
| 1. 环腺苷酸(cyclicadenylic acid,cAMP) |
| 2. 蛋白激酶A (protein kinase A,PKA) |
| 3. cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB) |
| 4. cAMP-PKA信号通路与周围神经损伤的联系 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 以三法三穴为代表的推拿手法对SNI大鼠行为学的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验二以三法三穴为代表的推拿手法对SNI大鼠形态学的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验三 三法三穴对SNI大鼠cAMP、PKA、CREB蛋白表达的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（6）三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 推拿治疗周围神经损伤的机理研究进展 |
| 1 推拿能够促进SNI大鼠损伤神经超微结构修复 |
| 2 推拿能够促进SNI大鼠运动功能的恢复 |
| 3 推拿能够促进SNI大鼠感觉功能的恢复 |
| 4 推拿对SNI大鼠干预的最佳刺激参数 |
| 参考文献 |
| 综述二 转化生长因子-β1对周围神经损伤后修复的研究进展 |
| 1 转化生长因子-β1蛋白概述 |
| 2 TGF-β1参与周围损伤后修复 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 三法三穴对SNI大鼠行为学及坐骨神经瘢痕和SC的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 三法三穴对SNI大鼠TGF-β1/Smad2通路蛋白的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 附件1 三法三穴干预后坐骨神经HE染色结果 |
| 附件2 坐骨神经S100在不同时间点的表达情况 |
| 附件3 三法三穴干预后坐骨神经Ⅰ/Ⅲ型胶原及FN的表达情况 |
| 附件4 三法三穴干预后坐骨神经TGF-β1的表达情况 |
| 附件5 三法三穴干预后坐骨神经Smad2的表达情况 |
| 附件6 三法三穴干预前后坐骨神经TGF-β1的表达变化 |
| 附件7 三法三穴干预前后坐骨神经Smad2的表达变化 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）基于JNK信号通路探讨针刺对坐骨神经损伤大鼠神经修复的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠神经功能、形态修复及氧化损伤的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠JNK信号通路的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三针刺“环跳”穴对坐骨神经损伤模型大鼠雪旺细胞S100蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四针刺血清调控JNK信号通路干预H2O2 诱导的RSC96 细胞凋亡的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 坐骨神经损伤的中西医研究进展 |
| 个人简介 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（8）NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 常规试剂 |
| 1.2 常规溶液 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DRG取材 |
| 2.2 DRG组织的消化与培养 |
| 2.3 细胞培养中抑制剂激活剂的加入 |
| 2.4 体外siRNA或DNA质粒电穿孔转染DRG神经元 |
| 2.5 细胞的免疫荧光染色 |
| 2.6 蛋白质免疫印迹 |
| 2.7 DRG组织的灌注取材 |
| 2.8 DRG冰冻切片的制备及免疫荧光染色 |
| 2.9 坐骨神经轴突损伤(Axotomy)模型的建立 |
| 2.10 DRG神经元体内电穿孔转染[52, 53] |
| 2.11 坐骨神经夹伤模型的建立、取材及压片 |
| 2.12 玻璃体内显微注射及视神经损伤模型建立 |
| 2.13 体外及体内实验神经轴突长度的测量 |
| 2.14 视网膜神经节细胞轴突的标记及再生数量统计 |
| 2.15 视网膜免疫荧光染色统计神经元存活率 |
| 2.16 统计学 |
| 实验结果 |
| 第一章 NF-κB对成年感觉神经元轴突再生的调控作用 |
| 1.1 坐骨神经损伤后,DRG神经元中p-p65表达量上调 |
| 1.2 抑制NF-κB活性阻碍成年感觉神经元的轴突再生 |
| 1.3 体内抑制NF-κB活性阻碍成年感觉神经轴突再生 |
| 1.4 激活NF-κB活性可影响感觉神经轴突再生 |
| 小结 |
| 第二章 STAT3对成年感觉神经元轴突再生的调控作用 |
| 2.1 坐骨神经损伤后,DRG神经元中p-STAT3表达量上调 |
| 2.2 抑制STAT3活性阻碍成年感觉神经元的轴突再生 |
| 2.3 体内抑制STAT3活性阻碍成年感觉神经元轴突的生长 |
| 2.4 激活STAT3活性可促进感觉神经轴突再生 |
| 2.5 激活STAT3活性可促进视神经轴突再生 |
| 2.6 激活STAT3活性能提高视神经元的存活率 |
| 小结 |
| 第三章 NF-κB通过STAT3调控感觉神经元轴突的生长 |
| 3.1 抑制N-κB活性,p-STAT3蛋白表达水平降低 |
| 3.2 NF-κB通过STAT3调控感觉神经元的轴突再生 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤后神经轴突再生的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略表 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论文、论着 |
| 致谢 |
（9）DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 BDNF和Neurotrophin3在糖尿病雪旺氏细胞中的表达及启动子甲基化状态改变 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DNMT对高糖诱导的RSC96 细胞BDNF表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Akt/m TOR信号通路对高糖诱导的RSC96 细胞DNMT1 和BDNF表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 DNA甲基化在糖尿病周围神经病变发病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）吡咯加合物与正己烷生物暴露限值和中毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 毛发吡咯加合物作为正己烷诱发周围神经病变的生物标志物研究 |
| 第一节 毛发吡咯加合物浓度测定的方法建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 确定毛发吡咯加合物的未观察到有害作用水平 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 吡咯加合物蓄积在正己烷诱发周围神经病变中的作用 |
| 第一节 二烯丙基一硫拮抗正己烷诱发神经损伤的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 二烯丙基一硫增强2,5-己二酮神经毒性的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 磷酸化TDP43积聚在正己烷诱发周围神经损伤中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 文献综述 浅谈正己烷诱发周围神经病变的预防措施和致病机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、周围神经43kD蛋白在损伤坐骨神经中的表达（论文参考文献）
- [1]DOK3通过与GPR84相互作用参与小胶质细胞介导的神经病理性疼痛[D]. 高文双. 山东大学, 2021(10)
- [2]NLRP3炎性小体在小鼠周围神经损伤中的作用研究[D]. 崔梦丽. 青岛大学, 2021(02)
- [3]仿生导电人工神经支架的研究[D]. 刘振辉. 新疆医科大学, 2021(08)
- [4]SPP1在周围神经损伤后Wallerian溃变中对雪旺细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制研究[D]. 王江波. 吉林大学, 2020(02)
- [5]三法三穴对坐骨神经损伤大鼠背根神经节cAMP-PKA信号通路表达的影响[D]. 罗宇婷. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]三法三穴对SNI大鼠施万细胞增殖和神经瘢痕形成的影响[D]. 邵帅. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]基于JNK信号通路探讨针刺对坐骨神经损伤大鼠神经修复的机制研究[D]. 陈怡然. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [8]NF-κB/STAT3信号通路调控成年神经元的轴突再生及相互关系[D]. 齐士斌. 苏州大学, 2020(02)
- [9]DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究[D]. 张翠红. 河北医科大学, 2020(01)
- [10]吡咯加合物与正己烷生物暴露限值和中毒机制研究[D]. 黎显杰. 山东大学, 2020(08)