一、反刍动物的胚胎着床与妊娠建立过程的研究进展（论文文献综述）
孔丽莉[1]（2021）在《血管内皮生长因子-A在山羊胚胎附植过程中的表达与激素调控》文中研究指明
马星[2]（2021）在《牛DBNL基因对胎盘形成作用机理研究》文中进行了进一步梳理反刍动物妊娠成功率低在世界畜牧业中普遍存在,也是畜牧业发展中亟待解决的问题。妊娠成功的关键在于早期胎儿与母体关系的建立,即胚胎附植与胎盘形成。附植过程中,胎儿绒毛膜分泌干扰素τ（Interferon tau,IFNτ）;附植结束后,绒毛膜细胞入侵子宫内膜、形成胎儿胎盘与母体胎盘紧密联系形成胎盘与母体完成连接。DBNL（Drebrin-like adaptor,DBNL）一种F-肌动蛋白结合蛋白,通过胞内信号转导参与到细胞增殖分化、迁移侵袭及凋亡等生命活动中。为研究妊娠早期牛附植与早期胎盘形成过程中DBNL的作用,本研究收集不同日龄的牛胎儿,RT-PCR测定早期妊娠中DBNL的m RNA表达量的变化。分离牛子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞,并进行转录组测序,分析细胞表达之间的差异;采用RNAi干扰技术敲降DBNL的表达量并检测处理后的子宫间质细胞、绒毛膜成纤维细胞与处理前增殖能力、迁移性与侵袭性的变化。结果如下:1、研究表明,在牛早期妊娠过程中,DBNL的表达量在附植窗口期最高,之后随着胎儿胎盘形成的进程逐步下降,20日龄的胚胎外组织中DBNL的表达量显着高于胎盘形成中胎儿内DBNL的表达量（P<0.05）;同时,形成胎盘的绒毛膜子叶、子宫肉阜内的DBNL表达量均显着高于非胎盘区域（P<0.05）。2、分离纯化后的子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞可传7-8代;经RNAi干扰DBNL表达后,子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞的迁移性与侵袭性显着低于对照组（P<0.001）,绒毛膜成纤维细胞的增殖能力显着（低于对照组P<0.001）;加入IFNτ后,子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞DBNL干扰组的迁移性与侵袭性都显着高于未加IFNτ组（P<0.001）,绒毛膜成纤维细胞的增殖能力显着高于未加IFNτ组（P<0.001）。在牛妊娠早期,IFNτ高表达期内DBNL表达量显着高于其他时期,提高了绒毛膜成纤维细胞的增殖能力、迁移性和侵袭性。
韩旭[3]（2021）在《奶牛血液中早期妊娠相关因子研究》文中指出奶牛早期妊娠诊断与奶牛场的效益密切相关,尽早发现妊娠奶牛可以缩短牛场的转群周期,提高饲养效益。本研究推测奶牛血液中存在与干扰素通路、Toll样受体通路和补体通路有关的妊娠相关因子。研究内容包括:试验一:采集未妊娠18天,妊娠18天,妊娠25天和妊娠35天奶牛血液,分离出血清,通过蛋白免疫印迹方法,以干扰素通路中的STAT1、OAS1、MX1/2/3、UBE1L抗体;Toll样受体通路中的IRAK1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9、IP10、My D88抗体;补体通路中的C1q、C1r、C1s、C2、C3、C5、C9抗体进行特异性识别,检测这些抗体在奶牛血液中的表达情况。试验结果表明:补体通路中的C1q在妊娠18天奶牛血液中特异性表达。试验二:参考前人的研究结果,使用ISG15、EPF、PAPP抗体验证试验一的妊娠诊断结果是否准确。试验结果表明:C1q与ISG15诊断结果一致,与EPF、PAPP诊断结果不同,说明C1q可用于妊娠18天奶牛的诊断。试验三:使用能与奶牛血液中妊娠相关因子特异性结合的单抗,制作奶牛早期妊娠检测胶体金试纸,最终验证其准确性、灵敏度和稳定性。本试验以补体通路中C1q抗体,制作奶牛早期妊娠检测胶体金试纸,检测妊娠18天奶牛血液。检测结果呈阳性,检测准确性高达91.7%,灵敏度高,稳定性较好。综上所述,补体通路中C1q抗体可以用于妊娠18天奶牛的诊断,并以此制作奶牛早期妊娠检测胶体金试纸,应用于实际生产。
李壮[4]（2021）在《奶山羊产后胎盘组织转录组测序及差异表达基因筛选分析》文中提出提高奶山羊良种繁殖性能对提升奶山羊总泌乳量和羊场经济效益等具有重要价值。胎盘作为促成母体与胎儿交流的重要枢纽,其分化程度、植入深度、充血量和充氧量都会影响胎儿的生存能力和健康状况,胎盘是保证母羊繁殖性能的关键。本研究以奶山羊产后胎盘为试验材料,分析不同产羔数及不同胎次的奶山羊胎盘性状与奶山羊产羔性能的关系;利用RNA-seq技术对9只同一胎次不同产羔数胎盘组织进行测序,以筛选出可能影响繁殖性能的关键基因;利用PCR技术克隆出2个关键候选基因,并进行生物信息学分析;以奶山羊胎盘滋养层细胞为试验材料,通过过表达和干扰研究关键候选基因影响滋养层细胞（GTCs）侵袭和迁移能力,初步探讨关键基因在胎盘滋养层细胞中对不同产羔数胎盘性状及胎儿生长发育的影响,揭示胎盘组织基因调控母羊产羔性能的机理,为利用胎盘性状选择高繁殖力母羊提供分子实验依据。本研究主要结果如下:1、奶山羊产后胎盘的胎盘效率、胎盘质量、子叶总数、子叶承载效率和子叶总面积随产羔数增加呈极显着增加;胎盘效率、胎盘质量、子叶总数和子叶总面积等山羊胎盘性状与产羔性能呈显着相关。2、不同产羔数胎盘组织中共检测到148个共有差异基因,差异基因主要富集在细胞生长调节、细胞粘附和生物粘附等生物学过程及细胞粘附分子通路和神经活性配体-受体相互作用信号通路;筛选出7个关键候选基因（CDH1、PRP6、SDC2、CALCRL、F2R、P2RY14和EDNRB）,CDH1基因在多羔组胎盘组织中表达下调,其在滋养层分化和囊胚形态发生及建立有效的营养和氧气运输平台至关重要,PRP6基因在多羔组胎盘组织中表达上调,其在协调其他激素刺激滋养细胞及胎儿发育具有关键作用。3、克隆出奶山羊CDH1和PRP6基因的CDS区分别为2 652 bp和720 bp,分别编码883和239个氨基酸,与山羊（Capra hircus,XM＿005692180.3）、牛（Bos taurus,AY508164.1）和绵羊（Ovis aries,XM＿027978118.1）的同源性较高。4、成功构建过表达载体pcDNA3.1-CDH1和pcDNA3.1-PRP6,其mRNA表达水平分别上调35倍和70倍;过表达CDH1基因后,GTCs平均迁移能力显着下降36.21%,CCND2、MYC和IGF2基因表达下降,其显着抑制MMP-2蛋白表达,并促进E-cadherin蛋白表达;干扰CDH1基因后,GTCs平均迁移能力显着升高55.83%,CCND2、MYC和IGF2基因表达上调,其显着促进MMP-2蛋白表达,并抑制E-cadherin蛋白表达;过表达PRP6基因后,GTCs平均迁移能力极显着升高40.83%,CCND2、MYC和IGF2基因表达上升,其显着促进MMP-2表达,并抑制E-cadherin表达;干扰PRP6基因后,GTCs平均迁移能力显着下降32.48%,CCND2、MYC和IGF2基因表达下调,其显着抑制MMP-2表达,并促进E-cadherin表达。表明CDH1和PRP6基因参与胎盘滋养层细胞在妊娠中的迁移和侵袭过程,影响胎盘建立母胎联系及胎儿成活发育进程,其是调控母羊产羔性能的关键因素之一。综上,奶山羊产后胎盘组织转录组测序筛选出的CDH1和PRP6基因是在妊娠过程中调节正常妊娠保证胎儿生长发育潜在的关键基因,影响不同产羔水平中胎盘滋养层细胞迁移和侵袭能力,保证胎盘分化、胎盘植入深度、胎盘充血量和充氧量进而影响母体产羔性能。本研究为深入研究奶山羊繁殖性能,提高产羔率奠定理论基础。
梁晶婕[5]（2021）在《小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制》文中提出早期胚胎流失是导致哺乳动物妊娠失败的主要原因之一。研究表明,绝大多数胚胎流失发生在胚胎着床阶段,这一现象普遍存在于高产奶牛、母猪等家畜,严重影响了动物的繁殖效率。辅助生殖技术的诞生使得体外授精和胚胎移植成为可能,但移植后着床率低下的问题依然没有得到显着改善。因此明确胚胎着床的调控机制对于提升哺乳动物的妊娠效率至关重要。影响胚胎着床的因素主要包括胚胎的活性、子宫内膜容受性的建立及二者之间有效的交流对话。其中,子宫内膜容受性的建立是胚胎着床启动的必要前提,也是调控着床进程的主导因素。子宫内膜容受性是指母体子宫在其生殖周期有限时间段内所达到的一种能够接纳胚胎附着的特殊生理状态。研究表明,尽管物种之间采用的着床方式不同,着床早期阶段子宫内膜容受性的建立机制却具有相似之处。然而,由于子宫内膜中各个组分在容受阶段的作用不同,其背后的分子调控网络也十分复杂,目前对于子宫内膜容受性建立的具体机制尚未明确。MicroRNA（miRNA）是一类短链非编码小RNA分子,因其能在转录后水平同时靶向调控多个基因的表达而广泛参与多种生物学进程。目前已有许多研究表明miRNA参与胚胎着床的调控,但其在子宫内膜容受性建立过程中的作用还不清晰。考虑到物种间胚胎着床早期阶段的相似性,本研究利用模式动物小鼠作为实验对象,采用小RNA测序技术对容受前期、容受期和着床期小鼠子宫内膜中的miRNA表达谱进行分析,随后结合荧光定量PCR检测技术和子宫角注射miRNA agomir或antagomir的方法筛选出差异表达且能够影响着床进程的miRNA确立为目标miRNA。随后对目标miRNA在小鼠妊娠早期的时空表达情况进行检测,并且通过建立不同小鼠模型探究影响其呈现特异表达趋势的因素。最终通过体内体外实验调控miRNA的表达,探究其对子宫内膜容受性的影响及其分子调控机制。本研究所得到的主要实验结果如下:（1）对小鼠不同妊娠时期子宫内膜组织中的miRNA表达谱进行分析,结果显示共有42个miRNA在容受前期（妊娠第1天）、容受期（妊娠第4天）和着床期（妊娠第5天）的表达呈现显着差异（|log2（Foldchange）|≥1.5且FDR<0.05）,对部分差异表达的miRNA进行荧光定量PCR验证和体内miRNA表达量干扰后发现,miR-192-5p在容受期和着床期的小鼠子宫内膜中表达量极显着降低（P<0.001）,瞬时上调着床期间子宫内膜中miR-192-5p的表达水平将导致着床失败,提示其可能参与小鼠胚胎着床的调控。（2）miR-192-5p在小鼠妊娠早期（妊娠第1-7天）呈现出持续下滑的表达趋势,在着床期及之后一直维持低水平表达。原位杂交结果显示miR-192-5p主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮层,且随着子宫进入容受期,腔上皮中miR-192-5p的表达量显着降低。检测正常妊娠小鼠模型、假孕小鼠模型、延时着床模型、人工诱导蜕膜模型中miR-192-5p的表达发现胚胎因素不是导致其在着床期间子宫内膜中表达下调的主要原因;在未孕小鼠的自然发情周期内,miR-192-5p在发情期表达量升高,在间情期表达量降低,提示其表达水平更倾向于受到子宫内膜自身周期性生理变化的影响。（3）通过构建卵巢摘除小鼠模型,并给予不同规模的激素处理发现,雌激素（β-Estradiol,E2）能够显着诱导子宫内膜上皮层中miR-192-5p的表达上调;而孕酮（Progesterone,P4）在单独作用时具有下调miR-192-5p的趋势但尚未达到显着水平,当与E2共同作用时能够极显着抑制miR-192-5p的表达。采用E2和P4共同处理小鼠以模拟容受期间子宫中的激素环境,结果显示miR-192-5p的表达受到显着抑制,提示着床期间子宫内膜中miR-192-5p表达下调是由E2和P4共同影响所致。（4）体内研究表明,上调容受期间子宫中miR-192-5p的表达致使子宫内膜容受性受损,具体表现为细胞表面微绒毛的数量得以维持、胞饮突的形成减少等;此外,部分表达于上皮层中的容受性标记分子的表达出现异常,提示miR-192-5p主要干扰了容受期间上皮细胞的转化行为。体外实验表明,miR-192-5p在非容受性子宫内膜上皮细胞系（HEC-1-A细胞）中的表达极显着高于容受性子宫内膜上皮细胞系（Ishikawa、RL95-2细胞等）。抑制HEC-1-A细胞中miR-192-5p的功能致使细胞形态变圆、细胞间连接蛋白（E-cadherin、ZO-1等）的表达水平降低、细胞骨架相关结构（如应力纤维、表面微绒毛等）发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱。此外,抑制miR-192-5p的表达导致细胞表面抗黏附蛋白Mucin1的表达下调,进而提升了细胞表面接纳胚胎附着的能力。探索miR-192-5p的潜在靶基因结果显示,转录因子抑制因子E盒结合锌指蛋白2（Zinc finger E-box-binding homeobox 2,ZEB2）和细胞骨架相关调控因子Rho GTP酶激活蛋白19（Rho GTPase-activating protein 19,ARHGAP19）是 miR-192-5p 的靶基因。二者的蛋白均在容受状态下的子宫组织和细胞中高表达,且改变子宫组织、子宫内膜上皮细胞系中miR-192-5p的表达水平能够导致二者内源性蛋白出现相应的表达变化。此外,在非容受性细胞中过表达ARHGAP19能够部分重现抑制miR-192-5p后产生的表型现象,包括细胞骨架结构的重排、细胞间E-cadherin表达量降低等。不仅如此,过表达ARHGAP19能够促使细胞间E-cadherin表达分布发生变化,细胞呈现出堆积生长的趋势。这些表型与容受期间子宫内膜上皮细胞中发生的变化相类似,提示该分子的表达上调可能促使非容受性细胞向容受性表型过渡。综上所述,本研究探索了小鼠妊娠早期在胚胎着床阶段子宫内膜中差异表达的miRNA谱,并且针对其中一个miRNA,即miR-192-5p在小鼠胚胎着床时期子宫内膜容受性建立过程中的调控作用展开了深入研究。本研究证实了 miR-192-5p高表达于非容受状态的子宫内膜上皮细胞中,参与维持上皮细胞极性和细胞表面的抗黏附特性。妊娠期间,在雌激素和孕激素的共同作用下,miR-192-5p的表达水平被显着抑制,导致细胞表面抗黏附因子表达下调;此外一些调控细胞形态和细胞骨架相关的靶基因如ZEB2、ARHGAP19等的表达水平得以释放,促使细胞连接蛋白和细胞骨架发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱,细胞状态向容受态过渡,使得胚胎着床得以启动。这些研究成果进一步揭示了 miRNA介导下子宫内膜容受性建立的分子机制,为提升哺乳动物的胚胎着床率和妊娠率提供了新的理论参考。此外,miR-192-5p还有望作为一个新的分子标记用于辅助生殖中子宫内膜容受性的评估和诊断。
程蕾[6]（2020）在《牛早期妊娠的生物标志物鉴定及分子调控机制研究》文中研究表明牛人工授精后早期阶段的妊娠识别和妊娠建立对于成功妊娠并产犊具有决定作用,早期妊娠诊断可以及时鉴别妊娠牛和空怀牛,有助于妊娠牛的精细化管理和空怀牛的复配,对于提高牛群的繁殖力具有重要意义。但截至目前,牛繁殖力性状相关的候选基因鉴定比较有限,妊娠早期的分子调控机制尚不甚清楚,精准、简便、快捷的早期妊娠诊断技术开发在牛业生产中显得十分迫切。基于此,本研究在对妊娠牛与妊娠失败牛生理生化和免疫相关指标充分比较分析的基础上,利用转录组测序和定量蛋白质组学技术对参与早期妊娠的关键候选基因和蛋白进行了筛选鉴定,探讨了它们介导妊娠识别和妊娠建立的分子调控机制,初步对基于干扰素刺激基因的牛早期妊娠诊断技术体系进行了研究。研究为深入解析牛早期妊娠的分子调控机制提供了理论依据,为新的牛妊娠诊断生物标志物开发应用提供了技术支撑,为高繁殖力牛群的分子遗传繁育奠定了基础。内容如下:1、早期妊娠阶段水牛血液参数表型分析与候选基因筛选（1）妊娠水牛与空怀水牛血液激素水平、血细胞五分类与细胞因子水平分析比较分析了29头实验牛（6头妊娠水牛,23头空怀水牛）于早期妊娠阶段的血液参数（血细胞五分类、孕酮、细胞因子）,发现:人工授精后18d至30d,妊娠水牛外周血单核细胞（MONO）绝对值和百分比均显着高于0d,人工授精后23d妊娠水牛MONO百分比显着高于空怀水牛;人工授精后14d妊娠水牛嗜酸性粒细胞（EOS）绝对值和百分比显着高于0d,但与空怀牛无显着差异。人工授精后14d至30d,妊娠水牛孕酮均显着高于空怀水牛。妊娠水牛孕酮与淋巴细胞（LYMPH）百分比呈中等负相关,与EOS绝对值以及百分比呈较强正相关。人工授精后0d至20d,妊娠水牛IFN-γ、TNF-α以及IL-1α的表达水平总体上呈下降趋势,IL-13以及IL-10总体上呈上升趋势,但与0d相比差异不显着;人工授精后18d妊娠水牛血液中ANG-1的表达水平极显着高于0d。结果提示,妊娠早期血液中MONO百分比、孕酮以及ANG-1含量的增加有助于妊娠建立。（2）水牛早期妊娠阶段的候选基因筛选对4头妊娠水牛人工授精后0d、14d、18d、20d这4个时间点的外周血液白细胞进行了转录组测序分析,共鉴定到相对于0d的差异表达基因（DEGs）74个,其中人工授精后18d的DEGs最多（52个）,为血液细胞转录组变化最为显着的时间点,而且18d转录组的差异情况与IFNT的水平变化同步。经典信号通路分析表明,人工授精后18d血液中差异基因主要参与介导干扰素信号通路（IFI6、IFIT1、IFITM3、ISG15、MX1以及OAS1）和被胞质模式识别受体激活IRF信号通路等;功能富集分析结果显示,HBA1/HBA2、HBB、NUPR1、IFIT1、IFIT3、ITGA4以及ISG15是早期妊娠阶段参与调节胚胎发育以及繁殖系统发育与功能的关键候选基因。2、妊娠识别标志基因在奶牛早期妊娠诊断中的应用研究结合前期研究,进一步利用荧光定量PCR技术对人工授精后0d至28d妊娠奶牛（n=11）和空怀奶牛（n=8）外周血中ISG15、OAS1和RSAD2基因的表达进行了检测。通过扩大分析群体（妊娠牛19头,空怀牛17头）,用受试者工作曲线（ROC）系统评估了单独或联合利用这3个基因的表达进行妊娠诊断的效果。最后,对准确性最高的组合通过设计荧光探针引物和双重荧光定量PCR技术进行了妊娠诊断的检测效果评估。结果表明,人工授精后18d妊娠奶牛外周血中ISG15、OAS1和RSAD2基因的表达量均显着高于空怀奶牛;3个基因单独或联合应用于早期妊娠诊断时,RSAD2单基因的敏感性（即灵敏性）为100%,特异性为88.2%;ISG15与RSAD2基因联合应用的敏感性为94.7%,特异性为100%。双重定量PCR扩增的结果显示:尽管ISG15基因单独应用于妊娠诊断的敏感性为100%,但特异性仅为88.2%（截断值为1.402）;RSAD2基因单独应用的敏感性为89.5%,特异性为88.2%;二者联合应用于妊娠诊断的敏感性、特异性以及诊断的临界值与单重定量PCR一致。本研究初步建立了基于双重荧光定量PCR的早期妊娠诊断技术体系。3、早期妊娠阶段牛血清差异蛋白表达谱与关键候选蛋白筛选研究利用标记与定量蛋白质组学技术（i TRAQ）,结合IPA?生信分析以及RT-q PCR、Western blot等技术,共获得早期妊娠阶段（人工授精后28d之内）奶牛血清中的差异表达蛋白114个,其中妊娠牛血清中特有的差异蛋白64个,空怀牛血清中特有的差异蛋白33个,妊娠牛和空怀牛血清中共有的差异蛋白17个。对妊娠牛和空怀牛在人工授精后不同时间点的蛋白质表达谱进行了比较分析,构建了妊娠牛与空怀牛血清中的蛋白质表达谱。其中,参与胚胎发育、繁殖系统发育与功能改变的差异蛋白28个。研究基于hub protein筛选结果进一步采用Western blot技术对其中的部分关键蛋白（EFEMP1、CD44、KRT18、NRF2和BRCA2）进行了验证,结果与i TRAQ检测一致,可以作为奶牛妊娠诊断的候选生物标志物。4、关键候选基因介导牛早期妊娠的分子机制以牛子宫内膜上皮细胞为研究模型,采用si RNA技术抑制NRF2表达24h至96h后检测细胞增殖以及HO-1、HOXA10基因的表达情况。结果显示,NRF2抑制表达后导致细胞增殖能力明显减弱,HO-1以及HOXA10在m RNA和蛋白水平均显着下调。研究进一步结合IFNT刺激和si RNA抑制实验对未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）通路相关基因表达进行了分析,结果表明:牛子宫内膜上皮细胞经IFNT刺激后,NRF2以及内质网应激反应相关基因（GRP78、CHOP、PERK和ATF6）的表达量显着上调,提示IFNT可诱导牛子宫内膜上皮细胞发生ERS,并通过激活ATF6和PERK来引发UPR;而si RNA抑制NRF2表达后,牛子宫内膜上皮细胞中IFNT诱导的UPR被抑制,并导致CHOP基因的转录水平显着上调,BCL2与BAX m RNA的表达量以及表达量的比值显着下降,并导致细胞凋亡发生。因此推测,NRF2可能通过UPR通路参与IFNT调节的牛母体妊娠识别过程。
江康峰[7]（2020）在《IFN-τ对奶牛子宫内膜损伤的保护作用及其机制研究》文中研究指明由病原微生物感染引起的子宫内膜损伤是导致奶牛不孕的主要原因之一。IFN-τ作为牛、羊等反刍类动物滋养外胚层释放的一种特殊的I型干扰素,在子宫内膜微环境的免疫调控过程中发挥着十分重要的作用。本课题组早期的研究证实,IFN-τ通过经典的I型干扰素信号通路JAK/STAT调控Bo LA-I介导的免疫排斥反应,我们也发现IFN-τ在小鼠炎症模型中可以抑制机体的炎症免疫应答。然而,IFN-τ对炎性损伤的奶牛子宫内膜的调控作用以及抑制炎症免疫应答的分子机制尚未被完全揭露。本研究首先通过使用致病性大肠杆菌来源的脂多糖（LPS）刺激奶牛子宫内膜上皮细胞构建细胞损伤的体外模型,并发现一定浓度的IFN-τ可保护上皮细胞免受炎性损伤;接下来重点探讨了IFN-τ对其非经典通路PI3K/AKT的调节作用,并证实IFN-τ可通过激活PI3K/AKT抑制上皮细胞的炎性应答与凋亡;随后研究了受IFN-τ调节的miR-92b对PI3K/AKT等相关通路的靶向作用以深入探究IFN-τ抗损伤的分子机制,为进一步拓展IFN-τ在奶牛临床的应用价值以及后期筛选治疗子宫炎性损伤的miRNA分子靶点奠定了科学理论基础。本研究的主要内容与结果如下:（1）首先利用酶消化与机械法相结合的方式成功分离培养出原代子宫内膜上皮细胞,并使用不同浓度（0-20μg/m L）的LPS对细胞进行不同时间（0-24 h）的刺激,随后通过CCK-8和流式细胞术对细胞活力和凋亡情况进行检测。结果显示,10μg/m L的LPS刺激24 h后能够显着诱导子宫内膜上皮细胞发生凋亡,并以此条件构建本研究后续的细胞损伤模型。由于IFN-τ具有低细胞毒性的优良特性,本研究随后对IFN-τ的作用浓度进行了筛选,结果发现IFN-τ在20 ng/m L和40 ng/m L的浓度下能够显着缓解LPS过度刺激诱导的细胞损伤。Western blot结果进一步证实IFN-τ以浓度依赖性方式抑制细胞凋亡因子Bax/Bcl-2比值以及炎症信号蛋白TLR4和p-p65表达水平。以上结果表明,IFN-τ可保护子宫内膜上皮细胞免受炎性损伤。（2）PI3K/AKT通路不仅对细胞增殖起到调节作用,也可以抑制炎症反应的过度激活。结果表明,PI3K/AKT在子宫内膜上皮细胞的炎性损伤过程中呈现低表达模式,但IFN-τ可以上调并激活PI3K/AKT,而PI3K/AKT的特异性抑制剂LY294002则显着阻断IFN-τ对PI3K/AKT的激活作用,同时也抑制IFN-τ对TLR4、p-p65以及Bax/Bcl-2的下调作用。为了深入探究IFN-τ对PI3K/AKT通路的调控作用,本研究检测了IFN-τ对PI3K/AKT下游信号分子GSK3β、β-catenin和Foxo1表达的影响。Western blot和免疫荧光试验结果显示,IFN-τ通过激活PI3K/AKT上调p-GSK3β和p-Foxo1的表达水平并阻止β-catenin的降解。进一步分析发现,β-catenin激动剂SB216763在激活β-catenin后可上调p-Foxo1并下调p-p65,而敲减β-catenin则起到相反的作用。这些结果表明,IFN-τ通过PI3K/AKT介导的β-catenin抑制Foxo1和NF-κB p65的激活。此外,为了探索Foxo1在PI3K/AKT抑制TLR4中的关键作用,本试验在敲减Foxo1的同时使用LY294002抑制PI3K/AKT。结果发现,Foxo1的敲减能够阻断LY294002对TLR4的上调作用,同时也进一步加强IFN-τ对TLR4的抑制作用。最后,本研究在体内检验了IFN-τ对小鼠子宫内膜炎性损伤模型的保护作用。免疫荧光试验结果显示,IFN-τ能够抑制小鼠子宫内膜的细胞凋亡以及上调上皮细胞间紧密连接蛋白（TJPs）的表达,而使用LY294002抑制PI3K/AKT后可以阻断IFN-τ对小鼠子宫内膜损伤的保护作用。以上结果表明,IFN-τ通过激活PI3K/AKT/β-catenin通路抑制Foxo1继而阻止TLR4和NF-κB p65的活化。（3）miRNA广泛地参与人和动物体各种疾病的发生过程,例如奶牛子宫内膜炎。同样地,miRNA也参与了IFN-τ的炎症免疫调控过程。因此,本研究从miRNA的角度进一步探索IFN-τ保护细胞免受炎性损伤的分子机制。基于先前的高通量测序结果,本研究首先筛选出5个与奶牛子宫内膜炎密切关联的miRNA,并于牛子宫内膜上皮细胞系（BEND细胞）上验证了IFN-τ对它们的调控作用。RT-q PCR结果显示,IFN-τ显着上调miR-92b的表达。为了探究miR-92b是否参与IFN-τ的抗损伤过程,本试验将miR-92b inhibitor转染进BEND细胞抑制miR-92b后发现,IFN-τ对p-AKT的上调以及对p-p65和TLR4的下调均被显着性阻断。相反地,转染miR-92b mimic过表达miR-92b后可明显抑制LPS刺激诱导的TLR4、p-p65和Bax/Bcl-2的上调。为了揭示miR-92b抑制炎症与凋亡反应的分子机制,本研究对miR-92b的靶基因进行了KEGG通路富集。分析发现,miR-92b主要靶向PI3K/AKT等细胞增殖与炎症反应相关的通路,并进一步确证过表达miR-92b可以激活PI3K/AKT/β-catenin通路。双荧光素酶报告试验证实,miR-92b直接靶向PTEN m RNA 3’-UTR从而抑制胞内PTEN的蛋白水平。PTEN是PI3K/AKT的负调控因子,可通过抑制PI3K/AKT介导细胞的增殖与炎症反应。Western blot和免疫荧光试验结果显示,过表达PTEN可有效地逆转miR-92b对p-AKT的上调和对p-p65的下调,而敲减PTEN后却可上调p-AKT并抑制p-p65表达。β-catenin作为一种重要的共转录因子,据报道可在肿瘤细胞中介导PTEN的转录。为了证实β-catenin在炎症反应过程中对PTEN的调控作用,本试验使用β-catenin激动剂SB216763处理细胞后发现,上调β-catenin可显着抑制LPS诱导的PTEN表达,并激活p-AKT。以上结果表明miR-92b介导IFN-τ的抗损伤作用;miR-92b通过PTEN/PI3K/AKT/β-catenin信号轴抑制TLR4介导的细胞炎性应答与凋亡,而β-catenin也可负反馈调节PTEN的表达,并进一步加剧上游PI3K/AKT的激活。结论:IFN-τ对LPS介导的奶牛子宫内膜上皮细胞的炎性损伤具有保护作用,其作用机制是通过上调miR-92b靶向PTEN从而激活PI3K/AKT/β-catenin通路,进而抑制TLR4/NF-κB驱动的炎症与凋亡反应,保护细胞免受炎性损伤。
杨龙[8]（2020）在《体外培养胚胎分泌物对小鼠非手术胚胎移植效率影响的初步研究》文中研究表明胚胎移植是胚胎工程中非常重要的程序,在家畜育种方面具有重要作用。影响胚胎移植效率的因素较多,本研究以小鼠为模型,进行胚胎分泌物对胚胎移植效率影响的研究,简要如下。对小鼠受精胚胎进行体外培养,收集胚胎培养液,采用超速离心法提取胚胎分泌的外泌体,透射电子显微镜观察呈现圆形或椭圆形杯状囊泡结构,为典型的外泌体形态。对培养液进行mi RNA提取、RT-q PCR,在培养液中检测到mi R-25、mi R-302c、mi R-191;生物信息学结果提示胚胎分泌到培养液中的mi RNA在胚胎发育过程中或发挥重要的功能。进一步验证胚胎分泌物的生物学功能,将含有胚胎分泌物的移植液和不含胚胎分泌物的移植液用于胚胎移植,结果表明两组的胚胎移植效率差异不显着。推测与两方面原因有关:一方面胚胎移植液量仅为培养液量很少一部分,并没有完全包含胚胎所有分泌物;另一方面胚胎分泌物中成分不完全明确,存在一些对胚胎发育有利的成分,但也无法排除对胚胎发育有害的成分。因此,在后续的研究中,通过控制单一因素变量对胚胎分泌物进行深入研究,将对非手术胚胎移植效率的提高具有重要意义。综上,本研究发现胚胎在体外培养过程中分泌外泌体和mi RNA,这些分泌物在胚胎发育过程中可能具有重要的作用,本研究对胚胎移植效率的提高具有重要意义。
马丽[9]（2020）在《Circ-9110吸附miR-100-5p调控奶山羊子宫内膜基质细胞增殖的分子机理研究》文中认为胚胎附植对雌性家畜受孕起决定性的作用。胚胎附植成功的两个不可或缺的因素是胚胎的质量和容受性的子宫内膜,相关研究表明,超过60%的体外授精胚胎植入失败是由子宫内膜容受性异常引起的,胚胎植入失败会给动物生产造成重大的损失。本课题组前期研究表明,mi RNAs和circ RNAs可能调控奶山羊容受性子宫内膜的建立。然而,mi RNAs和circ RNAs在奶山羊容受性子宫内膜中的作用和分子调控机理还需深入研究。根据实验室前期建立的数据库,得到奶山羊容受前期（PE,D5）和容受期（RE,D15）子宫内膜组织中差异性表达的mi RNAs。由于ESCs在子宫内膜容受期主要发挥增殖的作用,本试验通过采用双荧光素酶基因报告系统、RNA干扰、过表达、免疫荧光等技术,研究circ RNA、mi RNA和m RNA在奶山羊胚胎植入期对子宫内膜基质细胞增殖的调控作用及分子调控机理,获得以下研究结果:1.miR-100-5p对ESCs增殖的调控作用mi R-100-5p在RE中的表达量与PE相比显着下调（p<0.05）。在体外,mi R-100-5p mimic处理48 h后,降低ESCs的活力,抑制ESCs的增殖,凋亡相关蛋白caspase3的表达量与NC处理组相比显着上调,而Bcl2/Bax的比值显着下调（p<0.01）。相反的,mi R-100-5p inhibitor处理48 h后,促进ESCs的活力,促进ESCs的增殖,caspase3的蛋白表达量与NC处理组相比显着下调,而Bcl2/Bax的比值显着上调（p<0.01）。2.miR-100-5p的靶基因HOXA1对ESCs增殖的调控作用本研究通过构建双荧光素酶报告发现,HOXA1是mi R-100-5p的靶基因,并且mi R-100-5p下调HOXA1在ESCs中m RNA（p<0.05）和蛋白的表达量（p<0.01）。此外,HOXA1在RE中的表达量显着高于PE中的表达量（p<0.05）。另外,在构建HOXA1过表达载体时发现,HOXA1 X1有缺失,HOXA1 X2与预测片段完全匹配。在体外,HOXA1可促进ESCs的活力,促进ESCs的增殖,过表达的HOXA1使caspase3的蛋白表达量显着下调,而Bcl2/Bax的比值显着上调（p<0.01）。相反的,HOXA1 si RNA降低ESCs的活力,抑制ESCs的增殖,敲低HOXA1使caspase3的蛋白表达量显着上调,而Bcl2/Bax的比值显着下调（p<0.01）。3.circ-9110作为ce RNA通过吸附mi R-100-5p对ESCs增殖的调控作用本研究通过构建双荧光素酶报告发现,circ-9110吸附mi R-100-5p,且circ-9110下调mi R-100-5p在ESCs中的表达（p<0.05）。此外,circ-9110在RE中的表达量显着高于PE中的表达量（p<0.05）。在体外,circ-9110促进ESCs的活力,促进ESCs的增殖,过表达的circ-9110使caspase3的蛋白表达量显着下调,而Bcl2/Bax的比值显着上调（p<0.01）。相反的,circ-9110 si RNA降低ESCs的活力,抑制ESCs的增殖,敲低circ-9110使caspase3的蛋白表达量显着上调,而Bcl2/Bax的比值显着下调（p<0.01）。4.circ-9110/mi R-100-5p/HOXA1对ESCs增殖的调控机理在ESCs中,mi R-100-5p降低了p-PI3K,p-AKT,p-m TOR,p-ERK1/2的蛋白的相对表达水平（p<0.01）,从而抑制了PI3K/AKT/m TOR和ERK1/2通路,而HOXA1和circ-9110激活了PI3K/AKT/m TOR和ERK1/2通路。circ-9110能够作为ce RNA吸附mi R-100-5p进而调控ESCs。综上所述,circ-9110、mi R-100-5p和HOXA1在奶山羊容受性子宫内膜中具有差异性表达,初步揭示了circ-9110吸附mi R-100-5p通过HOXA1参与奶山羊容受性子宫内膜的调控。本研究对探索奶山羊子宫内膜容受性建立的机制和提高奶山羊繁殖性能提供了试验依据。
赵干[10]（2020）在《奶牛妊娠外泌体miRNA表达谱分析及其对早期子宫免疫微环境的调控机制研究》文中研究表明繁殖障碍性疾病对奶牛生产造成巨大损失,尽早诊断妊娠状况能够有效避免奶牛生产过程中的无效饲养、繁殖周期延长等问题。因此,探索奶牛正常妊娠相关的分子标记物对进一步理解母胎免疫耐受机制,指导奶牛实际生产具有非常重要的意义。由于绝大多数细胞均能够分泌外泌体,并且其分泌量和内容物（核酸、蛋白质和脂质等）在正常及病理状态下会存在显着差异,因此外泌体备受科研工作者关注。基于外泌体的分子诊断技术被认为是一项非常有前景的新型疾病诊疗手段。哺乳动物（包括人）妊娠期间大量胎盘源外泌体差异性携带miRNA进入母体血液循环,构成母体血液循环中外泌体主要成分,研究这些差异分拣的miRNA或可反映妊娠进展和胎儿的生长发育情况。此外,外泌体miRNA也可能参与调节哺乳动物妊娠期间胎儿免疫耐受的机制,但是其在奶牛妊娠过程中的功能研究鲜有报道。本文以不同妊娠时期荷斯坦奶牛为研究对象,运用高通量测序技术比较未孕（gestational day,GD 0）以及正常妊娠早期（GD 60）、中期（GD150）和晚期（GD 240）奶牛外周血浆中外泌体的miRNAs富集差异,揭示了妊娠各个时期特异性miRNAs;重点探讨了妊娠早期外泌体中差异富集最显着的bta-miR-499对母体子宫免疫微环境的分子调控机制,为进一步探索妊娠外泌体miRNAs的生物作用和可能的临床应用价值奠定科学基础,相关研究结果与结论如下:1.本文采用超高速离心法从奶牛的外周血浆中分离外泌体,利用透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体形态及粒子直径分布进行分析。结果显示电镜下分离物呈现典型的杯盘状双层膜立体结构,粒子直径大小主要分布在30-140nm之间,符合典型的外泌体特征。免疫印迹分析外泌体标记蛋白CD63和CD9以及胎盘特异外泌体标记蛋白胎盘碱性磷酸酶（Plancental Alkaline Phosphatase,PLAP）,结果显示各组外泌体均表达CD63和CD9,且除未孕奶牛外,妊娠各组外泌体均表达PLAP蛋白,表明妊娠期间大量胎盘源外泌体存在。随后采用ELISA法检测妊娠各时期外泌体中PLAP含量,结果发现随着妊娠进展,外泌体PLAP表达量呈上升趋势,这与外周血中外泌体浓度趋势一致。因此推测在奶牛妊娠期间,胎盘来源的外泌体大量释放到母体血液循环中导致外周血中外泌体含量显着上升。2.外泌体在不同生理条件下所富集的miRNA存在显着差异。本文通过高通量测序技术筛选出了妊娠各个阶段血浆妊娠外泌体差异性miRNAs,如妊娠早期的bta-miR-499、bta-miR-16a、bta-miR-20a、bta-miR-223和bta-miR-128等,妊娠中期的bta-miR-493、bta-miR-127和bta-miR-143等以及妊娠晚期的bta-miR-122、bta-miR-182、bta-miR-183、bta-miR-200b和bta-miR-200c等,推测各妊娠阶段妊娠外泌体差异性miRNAs可能参与母体与胎儿交流。3.妊娠早期子宫免疫微环境的变化对妊娠建立至关重要。通过比较未孕和妊娠早期奶牛外周血浆外泌体中miRNA富集差异,并对其差异miRNAs的候选靶基因进行信号通路注释。结果显示,以bta-miR-499高表达为代表的miRNAs在妊娠早期外泌体中显着富集,这些靶基因主要注释在免疫炎症反应相关的信号通路上,如肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路、NF-κB信号通路和Ras信号通路等。以上结果表明,妊娠早期外泌体可能通过其富集的miRNAs（如bta-miR-499）发挥免疫炎症调节作用。4.基于以上miRNAs可能参与一系列炎症应答过程,本文进一步分析了妊娠早期奶牛子宫角远端组织促炎因子TNF-α和IL-6的表达水平。qPCR结果显示,与未孕组相比,妊娠早期TNF-α和IL-6呈现显着高表达（p<0.05）,同时免疫组织化学结果也证实妊娠早期TNF-α和IL-6阳性表达。以上结果表明,奶牛妊娠早期子宫局部表现为偏向Th1促炎免疫微环境。5.NF-κB是炎症免疫应答主要调节因子之一,可调节下游促炎因子TNF-α和IL-6表达。KEGG分析显示NF-κB信号可能是早期妊娠子宫免疫微环境调节的“开关”。免疫荧光结果显示NF-κB在妊娠早期子宫呈现高表达,提示NF-κB在早期妊娠子宫处于激活状态,可能作为子宫局部促炎/抗炎（Th1/Th2）微环境的转换“开关”。6.体外LPS（1μg/m L）诱导奶牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEND）构建NF-κB激活状态下的促炎子宫微环境模型,探讨妊娠早期外泌体（p-EXO）bta-miR-499对促炎子宫内膜细胞的调节潜能。结果显示,TNF-α和IL-6在LPS刺激BEND细胞后表达显着上调（p<0.05）,然而共孵育p-EXO（10μg/m L）后该趋势出现逆转,但是共孵育同浓度的未孕组外泌体（n-EXO）未出现逆转现象。qPCR结果显示共培养p-EXO的BEND细胞bta-miR-499的表达水平显着升高（p<0.05）,并且转染bta-miR-499模拟物后显着减弱了LPS诱导的TNF-α和IL-6表达。以上结果表明,早期妊娠外泌体bta-miR-499（p-EXObta-miR-499）具有抑制炎症免疫反应的潜能。7.本文进一步探讨了p-EXO-bta-miR-499是否通过抑制NF-κB通路的激活来调节促炎细胞因子的表达。免疫荧光结果显示,p-EXO减弱了LPS诱导BEND细胞NF-κB入核现象,但n-EXO组无明显变化,同时过表达bta-miR-499得到相似的结果。以上结果表明,p-EXO-bta-miR-499可能通过抑制NF-κB信号激活调节促炎因子表达。8.miRNA可通过抑制靶基因表达来参与下游生物学活动。双荧光素酶报告实验证实bta-miR-499直接靶向Lin28B mRNA的3’UTR从而抑制胞内Lin28B的表达水平。Let-7家族在炎症应答中能够调控NF-κB信号激活,而Lin28B被认为是let-7家族表达的抑制因子。为了探讨bta-miR-499是否通过靶向Lin28B上调let-7家族表达来抑制NF-κB的激活,将agomiR-499转染BEND细胞后发现let-7家族的表达显着增加,这与si RNA干扰Lin28B表达后的结果相似,而过表达Lin28B显着抑制了let-7家族成员的表达,以上结果表明miR-499抑制Lin28B表达,提高胞内let-7水平。随后p-NF-κB报告载体和免疫印迹实验直接证实let-7抑制NF-κB信号激活。此外,qPCR结果发现p-EXO中也存在大量let-7富集,但富集的种类与p-EXO处理BEND细胞后上调的let-7家族成员有差异,表明pEXO可以直接递送let-7到靶细胞,也可以通过bta-miR-499/Lin28B上调胞内let-7家族表达水平,从而抑制NF-κB激活进而减弱Th1促炎细胞因子表达,调节局部炎症微环境。9.采用体外小鼠妊娠模型进一步论证研究结果。在ICR小鼠妊娠的第5.5天（E5.5,以发现小鼠阴道栓为基准,记为妊娠第0.5天,即E0.5）和E7.5注射miR-499抑制剂（0.5μmol/kg,i.p.）,对照组妊娠小鼠注射等量的miR-NC,于E8.5和E14.5收集样品。结果显示miR-499抑制剂干预下小鼠胚胎数量显着减少（p<0.05）,小鼠妊娠中期（E14.5）胎儿平均体重较miR-NC组显着降低（p<0.05）,表明miR-499抑制剂干预可能改变了子宫局部微环境导致胎鼠生长抑制。随后为进一步探究以上结果是否由于子宫局部炎症微环境的变化引起,分别采用免疫荧光技术和qPCR分析各组NF-κB p65,IL-6和TNF-α的表达,结果显示抑制miR-499导致NF-κB异常激活以及促炎因子显着上调表达（p<0.05）。由此推测,小鼠早期妊娠的建立与维持依赖于适度的子宫促炎微环境,随着miR-499抑制剂的干预,破坏了局部促炎/抗炎细胞因子平衡,导致胚胎流失和胎儿生长抑制等妊娠异常风险增加。结论:（1）奶牛妊娠各时期以胎盘外泌体为主的妊娠相关外泌体差异富集miRNAs,并被大量释放到母体血液循环中,这些miRNAs的发现为探索正常妊娠相关分子标记物提供了参考,也为研究妊娠期间母胎交流机制打开了新的思路;（2）妊娠早期外泌体通过递送let-7和miR-499等直接或间接靶向NF-κB信号通路,调节子宫局部免疫微环境促炎/抗炎平衡,为奶牛母胎免疫耐受机制提供了新的科学依据。
二、反刍动物的胚胎着床与妊娠建立过程的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反刍动物的胚胎着床与妊娠建立过程的研究进展（论文提纲范文）
（2）牛DBNL基因对胎盘形成作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 反刍动物妊娠早期胎盘形成过程及DBNL的功能 |
| 1.1 妊娠早期的胎盘形成 |
| 1.1.1 胎盘形成的过程 |
| 1.1.2 IFNτ对妊娠识别及胎儿附植的影响 |
| 1.2 妊娠早期的牛胎儿基因表达量变化及DBNL基因的功能 |
| 1.2.1 妊娠早期胎盘形成过程中胎儿与母体的基因的表达变化 |
| 1.2.2 DBNL基因的功能 |
| 试验部分 |
| 第二章 牛妊娠早期子宫与胎儿绒毛膜中DBNL mRNA水平表达量的检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试验器材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 采集不同部位样品 |
| 2.2.2 提取牛子宫及胎儿不同部位的RNA |
| 2.2.3 制备牛不同采样部位的cDNA |
| 2.2.4 RT-PCR检测DBNL的表达量 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 不同时期的胎儿日龄的测定 |
| 2.3.2 扩增产物质量 |
| 2.3.3 扩增特异性 |
| 2.3.4 数据处理与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 分离纯化子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验器材 |
| 3.1.3 试剂的配置 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 子宫样品采样 |
| 3.2.2 组织块分离法分离子宫内膜上皮细胞与间质细胞 |
| 3.2.3 子宫内膜上皮细胞与间质细胞的分离 |
| 3.2.4 子宫内膜上皮细胞与间质细胞的鉴定 |
| 3.2.5 绒毛膜组织采样 |
| 3.2.6 分离绒毛膜成纤维细胞 |
| 3.2.7 绒毛膜上皮细胞与成纤维细胞的分离 |
| 3.2.8 绒毛膜细胞的鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 子宫间质细胞与子宫内膜上皮细胞的分离 |
| 3.3.2 鉴定子宫内膜上皮细胞与纯化后的子宫间质细胞 |
| 3.3.3 绒毛膜成纤维细胞的分离 |
| 3.3.4 绒毛膜成纤维细胞的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 转录组差异表达分析 |
| 4.1 试验仪器与材料 |
| 4.1.1 试验仪器 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 RNA-Seq数据的评估和质控 |
| 4.2.2 差异表达分析与结果可视化 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 DBNL在子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞中的差异性表达 |
| 4.3.2 子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞中的差异表达基因的功能富集 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 DBNL对绒毛膜成纤维细胞与子宫间质细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验器材 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 干扰共培养体系中子宫间质细胞和绒毛膜成纤维细胞内DBNL的表达 |
| 5.2.2 IFNτ模拟牛早期胎儿附殖环境 |
| 5.2.3 子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞的趋化运动试验 |
| 5.2.4 子宫间质细胞与绒毛膜成纤维细胞的侵袭试验 |
| 5.2.5 绒毛膜成纤维细胞的增殖能力试验 |
| 5.2.6 划痕恢复试验 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 sh RNA的电转效率 |
| 5.3.2 RT-PCR检测shRNA干扰效率及筛选IFNτ最适浓度 |
| 5.3.3 DBNL对绒毛膜成纤维细胞与运动性、侵袭性的影响 |
| 5.3.4 DBNL对子宫间质间质细胞的趋化运动性、侵袭性的影响 |
| 5.3.5 DBNL对绒毛膜成纤维细胞增殖能力的影响 |
| 5.3.6 DBNL对绒毛膜成纤维细胞迁移性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）奶牛血液中早期妊娠相关因子研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 早期妊娠诊断原理和依据 |
| 1.2 传统妊娠诊断法 |
| 1.2.1 观察法 |
| 1.2.2 触诊法 |
| 1.2.3 超声波诊断法 |
| 1.3 生化检测法 |
| 1.3.1 血小板计数测定法 |
| 1.3.2 血清碱性磷酸酶活力测定法 |
| 1.3.3 血清电泳分析法 |
| 1.3.4 血清酸滴定法 |
| 1.3.5 硫酸铜滴定法 |
| 1.3.6 胶体金试纸条妊娠检测法 |
| 1.4 孕酮(Progesterone) |
| 1.5 干扰素tau(IFN-τ) |
| 1.5.1 研究背景 |
| 1.5.2 IFN-τ与妊娠 |
| 1.6 早期妊娠相关因子(EPF) |
| 1.6.1 研究背景 |
| 1.6.2 EPF与妊娠 |
| 1.6.3 EPF的其它功能 |
| 1.7 妊娠相关糖蛋白(PAG) |
| 1.7.1 研究背景 |
| 1.7.2 PAG与妊娠 |
| 1.8 干扰素(IFN)信号通路 |
| 1.8.1 研究背景 |
| 1.8.2 IFN信号通路与妊娠 |
| 1.9 Toll样受体(TLRs)信号通路 |
| 1.9.1 研究背景 |
| 1.9.2 TLRs信号通路与妊娠 |
| 1.10 补体信号通路 |
| 1.10.1 研究背景 |
| 1.10.2 补体信号通路与妊娠 |
| 1.11 试验目的及意义 |
| 1.12 技术路线 |
| 第2章 IFN通路、TLRs通路和补体通路与早期妊娠 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验设备 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 血清的分离和电泳前处理 |
| 2.2.2 蛋白免疫印迹试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 STAT1、OAS1、MX1/2/3、UBE1L抗体在血液中的表达 |
| 2.3.2 IRAK1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9、IP10、My D88 抗体在血液中的表达 |
| 2.3.3 C1q、C1r、C1s、C2、C3、C5、C9 抗体在血液中的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 ISG15、EPF、PAPP与妊娠诊断 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 ISG15 可通过奶牛血液进行妊娠18 天诊断 |
| 3.3.2 EPF可通过奶牛血液进行妊娠25 天诊断 |
| 3.3.3 PAPP可通过奶牛血液进行妊娠35 天诊断 |
| 第4章 奶牛早孕检测试纸 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 胶体金制备 |
| 4.2.2 胶体金标记抗体蛋白 |
| 4.2.3 胶体金垫处理和组装 |
| 4.2.4 胶体金试纸条测试准确率计算 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 胶体金溶液表征 |
| 4.3.2 金标抗体最适pH |
| 4.3.3 金标抗体最适蛋白浓度 |
| 4.3.4 缓冲液选择 |
| 4.3.5 封闭液选择 |
| 4.3.6 胶体金试纸条检测结果 |
| 4.3.7 胶体金试纸条检测稳定性 |
| 4.3.8 胶体金试纸条检测准确性 |
| 4.4 讨论 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 抗体信息 |
（4）奶山羊产后胎盘组织转录组测序及差异表达基因筛选分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胎盘与胎儿生长发育研究进展 |
| 1.1.1 胎盘发育及血管网络建立 |
| 1.1.2 胎盘发育的分子生物学机制及其营养环境 |
| 1.1.3 胎盘内分泌功能 |
| 1.2 家畜胎盘与繁殖性能研究进展 |
| 1.3 转录组测序(RNA-Seq)的研究进展 |
| 1.3.1 转录组测序概况 |
| 1.3.2 转录组测序数据分析概述 |
| 1.3.3 基于转录组测序的胎盘研究 |
| 1.4 本研究试验目的和意义 |
| 第二章 奶山羊胎盘性状与繁殖性能的相关性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 性状测定方法 |
| 2.1.3 胎盘子叶组织学观察 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同产羔数奶山羊胎盘性状 |
| 2.2.2 不同产羔数奶山羊胎盘子叶组织结构 |
| 2.2.3 不同胎次西农萨能奶山羊胎盘形状 |
| 2.2.4 奶山羊胎盘性状与产羔数相关分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 转录组测序技术筛选奶山羊胎盘繁殖性能的关键基因 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验样品的采集 |
| 3.1.2 RNA提取与检测 |
| 3.1.3 cDNA文库构建、质检与测序 |
| 3.1.4 测序数据处理及过滤 |
| 3.1.5 参考基因组比对 |
| 3.1.6 基因表达分析 |
| 3.1.7 GO和 KEGG富集分析 |
| 3.1.8 差异基因c DNA合成 |
| 3.1.9 qRT-PCR检测差异表达mRNA |
| 3.1.10 数据统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA质量检测结果与测序质量分析 |
| 3.2.2 基因差异表达分析 |
| 3.2.3 差异基因GO和 KEGG富集分析 |
| 3.2.4 TLG 组与DLG 组和SLG组基因的聚类热图及韦恩分析 |
| 3.2.5 候选基因筛选与q RT-PCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 山羊CDH1和PRP6 基因克隆及序列分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验试剂与设备 |
| 4.1.2 总RNA提取 |
| 4.1.3 CDH1和PRP6 基因克隆 |
| 4.1.4 CDH1和PRP6 基因生物信息学分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CDH1和PRP6 基因克隆 |
| 4.2.2 CDH1和PRP6 基因序列分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 过表达和干扰CDH1和PRP6 基因对胎盘滋养层细胞迁移侵袭的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pcDNA3.1-CDH1和pcDNA3.1-PRP6 过表达载体的构建 |
| 5.2.2 过表达CDH1和PRP6对GTCs迁移能力的影响 |
| 5.2.3 过表达CDH1和PRP6 基因对GTCs侵袭迁移相关基因表达的影响 |
| 5.2.4 过表达CDH1和PRP6 基因对GTCs侵袭迁移相关蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CDH1和PRP6 基因干扰效率检测 |
| 5.2.6 干扰CDH1和PRP6对GTC迁移能力的影响 |
| 5.2.7 干扰CDH1和PRP6 基因对GTCs增殖侵袭迁移相关基因的影响 |
| 5.2.8 干扰CDH1和PRP6 基因对GTCs侵袭迁移相关蛋白表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 存在问题及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胚胎着床概述 |
| 1.1.1 不同物种的着床方式 |
| 1.1.2 影响着床的主要因素 |
| 1.1.3 雌激素和孕激素在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.2 MicroRNA概述 |
| 1.2.1 microRNA的合成与分泌 |
| 1.2.2 miRNA的作用方式 |
| 1.3 miRNA在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.3.1 miRNA参与调控胚胎活性 |
| 1.3.2 miRNA参与调控着床期间子宫内膜生理状态的变化 |
| 1.3.3 miRNA参与着床期间母-胎对话 |
| 1.3.4 循环miRNA和妊娠 |
| 1.4 本研究的目的与内容 |
| 1.4.1 研究的目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 不同胚胎着床时期小鼠子宫内膜差异表达miRNA的筛选及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 测序结果分析 |
| 2.3.2 荧光定量PCR检验miRNA的表达水平 |
| 2.3.3 miR-192-5p抑制小鼠胚胎着床 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR-192-5p在小鼠妊娠早期子宫中的表达及其影响因素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠模型有效性鉴定 |
| 3.3.2 miR-192-5p在不同小鼠模型中的表达规律 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 雌激素和孕激素对子宫中miR-192-5p表达的调控 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠激素模型鉴定 |
| 4.3.2 miR-192-5p在不同激素处理下小鼠子宫中的表达规律 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 miR-192-5p调控容受期间子宫上皮细胞转化的机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 瞬时上调miR-192-5p的表达量致使小鼠子宫内膜容受性受损 |
| 5.3.2 miR-192-5p在子宫内膜上皮细胞生理调控中的作用 |
| 5.3.3 miR-192-5p靶基因的筛选及鉴定 |
| 5.3.4 靶基因ARHGAP19调控细胞极性促使子宫内膜上皮细胞向容受态过渡 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论、创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间的研究成果 |
（6）牛早期妊娠的生物标志物鉴定及分子调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 牛早期胚胎发育与胚胎损失 |
| 1.2.2 妊娠诊断直接检测方法 |
| 1.2.3 妊娠诊断间接检测方法 |
| 1.2.4 妊娠识别的分子机制 |
| 1.2.5 妊娠识别阶段的新型生物标志物研究 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 实验一 牛早期妊娠血液生理生化指标分析以及相关候选基因的鉴定研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 技术路线 |
| 2.3.2 实验牛同期发情、人工授精及妊娠诊断 |
| 2.3.3 血常规检测 |
| 2.3.4 P_4含量检测 |
| 2.3.5 血清PAG检测 |
| 2.3.6 血清细胞因子检测 |
| 2.3.7 水牛妊娠识别标志基因鉴定 |
| 2.3.8 奶牛外周血中妊娠识别标志基因的表达分析 |
| 2.3.9 妊娠识别标志基因的诊断价值分析 |
| 2.3.10 妊娠识别标志基因双重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 水牛妊娠诊断 |
| 3.2 水牛妊娠早期白细胞参数变化 |
| 3.3 水牛妊娠早期P_4水平 |
| 3.4 水牛妊娠早期白细胞参数与P_4的相关性 |
| 3.5 水牛妊娠早期血液细胞因子水平分析 |
| 3.6 水牛妊娠识别标志基因的发掘 |
| 3.6.1 水牛妊娠早期血液中差异基因分析 |
| 3.6.2 差异基因的生物学功能分析 |
| 3.6.3 差异基因定量PCR验证 |
| 3.7 妊娠识别标志基因在奶牛早期妊娠诊断中的应用研究 |
| 3.7.1 妊娠识别标志基因在奶牛外周血中的表达规律 |
| 3.7.2 干扰素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2 单独或联合应用于奶牛早期妊娠的诊断效能分析 |
| 3.7.3 基于双重荧光定量PCR的妊娠诊断技术体系 |
| 3.7.4 利用双重荧光定量PCR进行妊娠诊断的准确性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 妊娠牛与空怀牛的血液生理生化指标差异 |
| 4.2 妊娠水牛血液细胞转录组测序鉴定差异表达基因 |
| 4.3 基于妊娠识别标志基因的早期妊娠诊断 |
| 5 小结 |
| 实验二 牛血清妊娠相关差异蛋白筛选及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 技术路线 |
| 2.3.2 iTRAQ实验 |
| 2.3.3 iTRAQ测序数据分析 |
| 2.3.4 iTRAQ测序数据的实验验证 |
| 2.3.5 siRNA抑制牛子宫内膜上皮细胞NRF2 基因表达实验 |
| 2.3.6 NRF2 介导UPR信号通路的功能研究 |
| 2.3.7 荧光定量PCR实验数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 奶牛妊娠早期血清差异蛋白鉴定 |
| 3.1.1 实验牛样本中血清孕酮水平分析 |
| 3.1.2 高丰度蛋白的去除 |
| 3.1.3 iTRAQ实验质控分析 |
| 3.1.4 总差异蛋白 |
| 3.1.5 差异表蛋白参与的生物学功能分析 |
| 3.2 妊娠早期血清差异蛋白的验证 |
| 3.2.1 差异蛋白的定量PCR检测 |
| 3.2.2 Western blot检测妊娠或空怀差异蛋白在血清中的表达 |
| 3.3 NRF2功能验证 |
| 3.3.1 siRNA抑制NRF2 对子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 siRNA抑制NRF2 表达对HO-1和HOXA10 表达的影响 |
| 3.3.3 IFNT对 NRF2 基因及UPR通路相关基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.4 siRNA抑制NRF2 表达对IFNT调节UPR通路及凋亡相关基因m RNA表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于iTRAQ技术的早期妊娠奶牛血清差异蛋白 |
| 4.2 差异蛋白NRF2功能验证 |
| 4.2.1 牛子宫内膜上皮细胞中抑制NRF2对HO-1和HOXA10 表达的影响 |
| 4.2.2 子宫内膜上皮细胞中NRF2 抑制表达对IFNT调节UPR通路的影响 |
| 5 小结 |
| 创新点 |
| 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附表论文补充数据 |
| 已发表文章 |
| 致谢 |
（7）IFN-τ对奶牛子宫内膜损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IFN-τ及其生物学作用 |
| 1.1 IFN-τ的发现 |
| 1.2 IFN-τ与妊娠识别 |
| 1.3 IFN-τ的其他作用 |
| 1.4 I型干扰素信号转导通路 |
| 2 奶牛子宫内膜炎 |
| 2.1 子宫内膜炎及其危害 |
| 2.2 子宫内膜炎发病机制 |
| 2.3 子宫内膜的天然免疫反应 |
| 2.3.1 依赖MyD88的信号通路 |
| 2.3.2 不依赖MyD88的信号通路 |
| 3 MicroRNA(miRNA)及其生物学作用 |
| 3.1 miRNA的发现 |
| 3.2 miRNA的生物合成及其作用机制 |
| 3.3 miRNA与炎性免疫应答 |
| 4 PI3K/AKT与 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 4.1 PI3K/AKT通路及其生物学作用 |
| 4.2 Wnt/β-catenin通路及其生物学作用 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 IFN-τ对奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的保护作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 原代奶牛子宫内膜上皮细胞培养 |
| 2.2.2 免疫荧光染色技术 |
| 2.2.3 细胞增殖检测 |
| 2.2.4 细胞凋亡检测 |
| 2.2.5 细胞周期检测 |
| 2.2.6 RT-qPCR技术 |
| 2.2.7 Western blot技术 |
| 2.3 试验数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 原代子宫内膜上皮细胞的培养和鉴定 |
| 3.2 子宫内膜上皮细胞炎性损伤模型的构建 |
| 3.3 IFN-τ作用浓度的筛选及对细胞损伤的保护作用 |
| 3.4 IFN-τ抑制细胞炎症和凋亡反应相关蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 第三章 IFN-τ对 PI3K/AKT信号通路的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 原代奶牛子宫内膜上皮细胞培养 |
| 2.2.2 奶牛子宫内膜上皮细胞的分组处理 |
| 2.2.3 细胞转染试验 |
| 2.2.4 小鼠子宫内膜损伤模型的构建 |
| 2.2.5 流式细胞术试验 |
| 2.2.6 RT-qPCR技术 |
| 2.2.7 Western blot技术 |
| 2.2.8 免疫荧光染色技术 |
| 2.3 试验数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 IFN-τ激活PI3K/AKT信号通路 |
| 3.2 IFN-τ通过PI3K/AKT抑制子宫内膜上皮细胞的炎性应答与凋亡 |
| 3.3 IFN-τ对 PI3K/AKT下游信号分子表达的作用 |
| 3.4 IFN-τ通过PI3K/AKT/β-catenin抑制TLR4/NF-κB信号通路 |
| 3.4.1 β-catenin抑制下游Foxo1和NF-κB的激活 |
| 3.4.2 Foxo1 促进TLR4/NF-κB的激活 |
| 3.5 IFN-τ对小鼠子宫内膜炎性损伤的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 第四章 IFN-τ通过miR-92b调控PI3K/AKT通路 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 奶牛子宫样本的采集 |
| 2.2.2 子宫组织病理学检测 |
| 2.2.3 奶牛子宫内膜上皮细胞系的培养及处理 |
| 2.2.4 RT-qPCR技术 |
| 2.2.5 细胞转染试验 |
| 2.2.6 miR-92b靶基因的预测和验证 |
| 2.2.7 Western blot技术 |
| 2.2.8 流式细胞术试验 |
| 2.2.9 免疫荧光染色技术 |
| 2.2.10 免疫组织化学技术 |
| 2.3 试验数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 IFN-τ调控的miRNA的筛选及验证 |
| 3.2 miR-92b介导IFN-τ的抑炎作用 |
| 3.3 miR-92b抑制细胞炎性应答 |
| 3.4 miR-92b抑制细胞凋亡反应 |
| 3.5 miR-92b激活PI3K/AKT/β-catenin通路 |
| 3.6 PTEN作为miR-92b作用靶点的验证 |
| 3.7 miR-92b通过PTEN抑制细胞炎性应答 |
| 3.8 β-catenin抑制PTEN表达 |
| 4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 1 本研究主要结论 |
| 2 本研究的不足之处与改进 |
| 参考文献 |
| 附录:作者简历 |
| 致谢 |
（8）体外培养胚胎分泌物对小鼠非手术胚胎移植效率影响的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 非手术胚胎移植进展 |
| 1.1.1 非手术胚胎移植 |
| 1.1.2 影响非手术胚胎移植的因素 |
| 1.1.3 小鼠模型在生殖发育研究中的重要性 |
| 1.1.4 小鼠非手术法胚胎移植 |
| 1.1.5 体外胚胎培养对胚胎移植效率的影响 |
| 1.1.6 输卵管液对胚胎移植的影响 |
| 1.1.7 激素对胚胎移植的影响 |
| 1.1.8 辅助生殖技术对胚胎移植效率的影响 |
| 1.2 胚胎附植 |
| 1.2.1 胚胎附植的分子机制 |
| 1.2.2 激素与胚胎附植 |
| 1.2.3 粘附分子与胚胎附植 |
| 1.2.4 细胞外基质蛋白与胚胎附植 |
| 1.2.5 血管生成与胚胎附植 |
| 1.3 外泌体在生殖生理过程中的作用 |
| 1.3.1 外泌体 |
| 1.3.2 外泌体对卵母细胞发育的影响 |
| 1.3.3 外泌体对早期胚胎发育的影响 |
| 1.3.4 外泌体对胚胎附植的影响 |
| 第二章 胚胎培养液中胚胎分泌物的分析 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 胚胎培养后的胚胎培养液中外泌体的形态 |
| 2.2.2 胚胎培养液miRNA的分析 |
| 2.2.3 胚胎培养液中miR-25的靶基因预测 |
| 2.2.4 胚胎培养液中miR-302c的靶基因预测 |
| 2.2.5 胚胎培养液中miR-191的靶基因预测 |
| 2.2.6 miR-25、mi R-302c和 mi R-191 功能分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 胚胎培养液作为移植液对小鼠非手术胚胎移植效率的影响 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 胚胎移植液的量对胎儿出生率的影响 |
| 3.2.2 胚胎培养液成分对胎儿出生率的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）Circ-9110吸附miR-100-5p调控奶山羊子宫内膜基质细胞增殖的分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 子宫内膜容受性的研究进展 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 子宫内膜研究 |
| 1.3 胚胎植入研究 |
| 1.4 子宫内膜蜕膜化研究 |
| 1.5 子宫内膜基质细胞研究 |
| 1.5.1 子宫内膜基质细胞的功能 |
| 1.5.2 ESCs干细胞研究 |
| 1.6 ESCs的增殖和分化研究 |
| 1.6.1 ESCs周期的激素调节 |
| 1.6.2 ESC增殖和分化的重要控制因素 |
| 1.6.3 参与ESC增殖和分化的转录因子 |
| 1.7 miRNAs调控子宫内膜的研究进展 |
| 1.7.1 成熟miRNAs的起源 |
| 1.7.2 miRNAs的作用机制 |
| 1.7.4 miRNAs在奶山羊子宫内膜中的研究进展 |
| 1.7.5 miR-100的研究进展 |
| 1.8 circ RNAs调控子宫内膜的研究进展 |
| 1.8.1 真核生物中circ RNA的起源 |
| 1.8.2 真核生物中circ RNAs的数量 |
| 1.8.3 真核生物中circ RNAs的功能 |
| 1.8.4 circ RNAs在动物生产中的研究进展 |
| 1.8.5 circ RNAs在胚胎植入中的研究进展 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 1.10 试验思路与方法 |
| 试验研究 |
| 第二章 miR-100-5p调控奶山羊ESCs增殖作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验仪器 |
| 2.2.2 材料试剂 |
| 2.2.3 试验动物 |
| 2.2.4 培养及鉴定奶山羊子宫内膜基质细胞(ESCs) |
| 2.2.5 qPCR过程 |
| 2.2.6 细胞增殖分析 |
| 2.2.7 细胞周期和细胞凋亡检测 |
| 2.2.8 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 奶山羊子宫内膜基质细胞(ESCs)的鉴定 |
| 2.3.2 miR-100-5p在奶山羊子宫内膜容受期(RE)和容受前期(PE)中的表达 |
| 2.3.3 miR-100-5p在 ESCs中的表达效率 |
| 2.3.4 miR-100-5p对 ESCs活力的影响 |
| 2.3.5 miR-100-5p对 ESCs增殖的影响 |
| 2.3.6 miR-100-5p对 ESCs周期的影响 |
| 2.3.7 miR-100-5p对 ESCs凋亡的影响 |
| 2.3.8 miR-100-5p对 ESCs凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 miR-100-5p通过靶基因HOXA1 调控ESCs增殖的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验仪器 |
| 3.2.2 材料试剂 |
| 3.2.3 试验动物 |
| 3.2.4 细胞培养 |
| 3.2.5 RT-q PCR |
| 3.2.6 构建双荧光素酶报告载体 |
| 3.2.7 HOXA1过表达载体构建 |
| 3.2.8 细胞增殖检测 |
| 3.2.9 细胞周期和细胞凋亡检测 |
| 3.2.10 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 3.2.11 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 miR-100-5p靶基因的鉴定 |
| 3.3.2 奶山羊HOXA1基因的鉴定 |
| 3.3.3 HOXA1在奶山羊容受期和容受前期子宫内膜中的差异表达 |
| 3.3.4 HOXA1过表达和干扰效率检测 |
| 3.3.5 HOXA1对ESCs活力的影响 |
| 3.3.6 HOXA1对ESCs增殖的影响 |
| 3.3.7 HOXA1对ESCs周期的影响 |
| 3.3.8 HOXA1对ESCs凋亡的影响 |
| 3.3.9 HOXA1对ESCs凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 circ-9110 在奶山羊子宫内膜中的筛选及其对ESCs增殖的调控作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验仪器 |
| 4.2.2 材料试剂 |
| 4.2.3 试验动物 |
| 4.2.4 细胞培养 |
| 4.2.5 RT-q PCR |
| 4.2.6 双荧光素酶报告载体构建 |
| 4.2.7 circ-9110过表达载体构建 |
| 4.2.8 细胞增殖检测 |
| 4.2.9 细胞周期和细胞凋亡检测 |
| 4.2.10 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 4.2.11 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 circ-9110的筛选 |
| 4.3.2 circ-9110 作为竞争性内源RNA(ce RNA)结合miR-100-5p |
| 4.3.3 circ-9110 在奶山羊子宫内膜容受期(RE)和容受前期(PE)中的表达水平 |
| 4.3.4 circ-9110过表达和干扰效率检测 |
| 4.3.5 circ-9110对ESCs活力的影响 |
| 4.3.6 circ-9110对ESCs增殖的影响 |
| 4.3.7 circ-9110对ESCs周期的影响 |
| 4.3.8 circ-9110对ESCs凋亡的影响 |
| 4.3.9 circ-9110对ESCs凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 circ-9110/miR-100-5p/HOXA1 调控奶山羊子宫内膜基质细胞增殖的分子机理研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验仪器 |
| 5.2.2 材料试剂 |
| 5.2.3 试验动物 |
| 5.2.4 细胞培养 |
| 5.2.5 蛋白提取和Western blot分析 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 miR-100-5p对 PI3K/AKT/m TOR和 ERK1/2 信号通路的影响 |
| 5.3.2 HOXA1对PI3K/AKT/m TOR和 ERK1/2 信号通路的影响 |
| 5.3.3 circ-9110对PI3K/AKT/m TOR和 ERK1/2 信号通路的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）奶牛妊娠外泌体miRNA表达谱分析及其对早期子宫免疫微环境的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(ABBREVIATIONS) |
| 第一章 外泌体和妊娠免疫及其关联研究进展 |
| 1.前言 |
| 2.外泌体及其生成 |
| 2.1 外泌体的发现 |
| 2.2 外泌体分泌机制 |
| 2.3 外泌体介导细胞间通讯 |
| 2.4 外泌体miRNA分拣机制 |
| 3.外泌体与妊娠调节 |
| 3.1 胎盘外泌体 |
| 3.2 胎盘外泌体与妊娠免疫 |
| 3.3 胎盘外泌体与妊娠疾病 |
| 4.子宫免疫微环境平衡及其相关分子机制 |
| 4.1 Th1/Th2细胞因子 |
| 4.2 经典NF-κB炎症信号通路与妊娠子宫免疫微环境调节 |
| 4.3 miRNA、NF-κB以及妊娠免疫 |
| 5.研究目的和意义 |
| 第二章 奶牛各时期妊娠外泌体MIRNA谱分析 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 血浆样本采集 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要数据分析软件 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 血浆中外泌体的分离 |
| 3.2 外泌体鉴定 |
| 3.3 外泌体浓度测定 |
| 3.4 胎盘外泌体浓度测定(ELISA法) |
| 3.5 外泌体总RNA提取(试剂盒法) |
| 3.6 外泌体小RNA文库构建及测序 |
| 3.7 测序质量评估 |
| 3.8 序列比对以及miRNA注释 |
| 3.9 差异miRNA分析 |
| 3.10 差异miRNA靶基因预测以及GO/KEGG通路富集分析 |
| 3.11 cDNA制备与荧光定量PCR |
| 4.数据统计与分析 |
| 5.结果与分析 |
| 5.1 外泌体鉴定 |
| 5.2 差异miRNA分析 |
| 5.3 各组差异miRNA预测靶基因GO功能注释 |
| 5.4 各组差异miRNA预测靶基因KEGG通路注释 |
| 5.5 荧光定量PCR |
| 6.讨论 |
| 6.1 血液循环中的胎盘外泌体 |
| 6.2 外泌体miRNA——疾病指示分子 |
| 6.3 妊娠期特异性外泌体miRNAs |
| 7.小结 |
| 第三章 早期妊娠外泌体对子宫免疫微环境调控的机制研究 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要数据分析软件 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 外泌体提取与鉴定 |
| 3.2 外泌体miRNA提取 |
| 3.3 外泌体摄取实验 |
| 3.4 cDNA制备与荧光定量PCR |
| 3.5 双荧光素酶报告实验 |
| 3.6 重组DNA转化 |
| 3.7 重组质粒鉴定 |
| 3.8 重组质粒大量抽提(试剂盒法) |
| 3.9 重组质粒和miRNA转染 |
| 3.10 双荧光素酶报告系统检测 |
| 3.11 siRNA以及常规质粒细胞转染 |
| 3.12 免疫印迹分析(Western blot) |
| 3.13 妊娠小鼠血清外泌体提取 |
| 3.14 H&E染色 |
| 3.15 免疫组化染色 |
| 3.16 细胞/组织免疫荧光 |
| 4.数据统计与分析 |
| 5.结果与分析 |
| 5.1 妊娠早期外泌体miRNAs及其靶基因通路注释 |
| 5.2 奶牛妊娠早期子宫局部呈现促炎微环境 |
| 5.3 妊娠早期外泌体抑制促炎因子表达 |
| 5.4 妊娠早期外泌体通过bta-miR-499 抑制促炎因子表达 |
| 5.5 外泌体bta-miR-499 抑制NF-κB信号激活 |
| 5.6 外泌体bta-miR-499 靶向Lin28B调节NF-κB信号激活 |
| 5.7 Lin28B抑制let-7 表达 |
| 5.8 Let-7 抑制NF-κB信号激活减弱促炎因子表达 |
| 5.9 妊娠早期小鼠模型中抑制小鼠子宫miR-499的表达 |
| 5.10 早期妊娠小鼠抑制miR-499对胚胎生长发育的影响 |
| 6.讨论 |
| 6.1 早期妊娠子宫促炎局部微环境 |
| 6.2 外泌体miR-499与子宫促炎体外模型 |
| 6.3 Lin28B/let-7/NF-κB信号轴 |
| 6.4 miRNA核酸治疗 |
| 7.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录A:论文补充材料 |
| 附录B:作者简历 |
| 附录C:代表性文章 |
| 致谢 |
四、反刍动物的胚胎着床与妊娠建立过程的研究进展（论文参考文献）
- [1]血管内皮生长因子-A在山羊胚胎附植过程中的表达与激素调控[D]. 孔丽莉. 东北农业大学, 2021
- [2]牛DBNL基因对胎盘形成作用机理研究[D]. 马星. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]奶牛血液中早期妊娠相关因子研究[D]. 韩旭. 河北工程大学, 2021(08)
- [4]奶山羊产后胎盘组织转录组测序及差异表达基因筛选分析[D]. 李壮. 西北农林科技大学, 2021
- [5]小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制[D]. 梁晶婕. 浙江大学, 2021
- [6]牛早期妊娠的生物标志物鉴定及分子调控机制研究[D]. 程蕾. 华中农业大学, 2020(04)
- [7]IFN-τ对奶牛子宫内膜损伤的保护作用及其机制研究[D]. 江康峰. 华中农业大学, 2020(02)
- [8]体外培养胚胎分泌物对小鼠非手术胚胎移植效率影响的初步研究[D]. 杨龙. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [9]Circ-9110吸附miR-100-5p调控奶山羊子宫内膜基质细胞增殖的分子机理研究[D]. 马丽. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [10]奶牛妊娠外泌体miRNA表达谱分析及其对早期子宫免疫微环境的调控机制研究[D]. 赵干. 华中农业大学, 2020(01)