一、抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响（论文文献综述）
李睿[1]（2018）在《基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究》文中认为鼻咽癌是我国的高发恶性肿瘤之一,发病率居耳鼻咽喉部位恶性肿瘤之首。因发病部位解剖结构复杂,鼻咽癌一般不适合手术,而是首选放射治疗。目前放射治疗对早期鼻咽癌患者的治愈率己高达90%以上,但由于早期筛查方法的局限性,大部分鼻咽癌确诊患者已发展到临床中晚期,常伴发远端转移;另外,部分鼻咽癌患者在放射治疗后容易复发。总之,此类临床晚期、转移性或复发性的鼻咽癌严重拉低患者的五年生存率。因此,探索更高效特异的鼻咽癌诊治用的生物靶标日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。鼻咽癌与EBV关系密切,在鼻咽癌患者中EBV以II型潜伏态存在,表达一种核心蛋白EBNA1和两种重要的膜蛋白LMP1和LMP2。其中,LMP1和LMP2作为主要的癌蛋白,被认为与鼻咽癌的发生发展密切相关。自90年代起,许多研究人员己提出LMP1和LMP2可作为重要的鼻咽癌诊治用靶标蛋白,但至今未能在临床中获得有效应用。本研究拟以LMP1和LMP2作为研究对象,通过免疫原制备探索和特异性单克隆抗体的筛选鉴定,以期获得适合鼻咽癌诊治用的特异性抗体,为LMPs作为鼻咽癌诊治靶标的探索提供科学依据。本论文的第一部分旨在利用小鼠单克隆抗体筛选平台,从免疫原制备方式比较、免疫佐剂和免疫方案组合比较、抗体筛选方法比较以及抗体性能评价等方面探索LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的筛选策略。首先,通过LMPs的氨基酸序列分析确定出LMP1和LMP2各胞外区的氨基酸序列组成,采用多肽化学合成、多肽串联原核表达、全序列昆虫细胞真核表达、全序列哺乳动物细胞表达等不同方式制备出一系列LMPs免疫原,发现LMPs胞外区序列的疏水性严重影响合成肽的合成质量和重组抗原的活性。其次,利用上述制备的LMPs抗原,结合弗氏佐剂、铝佐剂、CpG佐剂以及多糖类、小分子激动剂等免疫佐剂,设计了多种免疫方案进行小鼠免疫,通过常规ELISA和条带Western Blot评价不同免疫方案下的LMPs特异性抗体应答效果,发现合成肽SPL1-3偶联组和有目的抗原表达的全细胞免疫组能诱导出LMPs特异性抗体应答,但不同免疫佐剂的免疫应答比较未见显着差异。再次,比较了全细胞裂解液和膜蛋白包被ELISA与细胞ELISA、ELISPOT以及基于多肽的流式分选等不同筛选方法,发现基于多肽的B细胞分选特异性较差,而细胞ELISA检测灵敏度高且操作方便,是适合细胞膜抗原高通量抗体筛选的最佳筛选策略。最后,对筛选到的98株LMPs抗体进行性质鉴定和应用探索,发现4株LMP1胞内区特异性单抗具有良好的天然抗原结合能力,其识别表位为首次报道;组织学分析显示anti-LMP1单抗9F2和anti-LMP2单抗3A7在免疫组化检测中有良好的灵敏度和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断新工具;另外,发现单抗9F2转染入胞后能显着降低LMP1阳性细胞内NF-κB水平,对细胞的生长具有一定的抑制作用,显示出潜在的治疗价值。据报道,兔单抗与小鼠单抗相比,其识别的表位更加丰富,对于多肽或小分子等低免疫原性的抗原具有更好的识别能力。鉴于LMPs抗原在小鼠中的免疫原性较弱,本研究的第二部分工作旨在建立一个高效的兔单抗筛选平台,探索LMPs在实验兔中的抗体应答情况,为筛选更好的LMPs特异性单抗奠定基础。首先,确定了兔B细胞群的流式细胞分选方案。第二,构建了兔B细胞的单细胞PCR方法,抗体的轻重链基因扩增成功率为60-100%。第三,建立了兔B细胞体外刺激培养方法和最佳的兔B细胞体外培养条件,在该条件下兔B细胞体外培养阳性率（OD值>0.5）平均为38.75%。第四,构建了兔单抗体外重组表达载体pRVRCH/pRVRCL,可满足兔抗体基因在HEK293表达系统中的高效表达。第五,基于此技术平台,分别制备了特异识别戊肝病毒和轮状病毒的两种兔单克隆抗体,验证了兔单抗筛选平台的可行性,并发现实验兔较实验鼠表现出免疫应答速度更快、滴度更高,倾向于产生更高的亲和力的抗体的优越性。最后,本研究利用兔单抗筛选平台对LMPs特异性抗体应答进行了初步探索,结果显示细胞抗原和LMP2A的N端重组抗原能够在实验兔中产生明显的抗体应答,尤其是重组抗原在实验兔中的抗体应答滴度较其在实验鼠中的应答滴度提升10-100倍,为进一步筛选LMPs兔单抗奠定坚实基础。综上所述,本论文针对EB病毒潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2的胞内和胞外区特异性抗体的筛选策略进行了全面的探索,成功获得了具有应用潜力的胞内区抗体,证实LMPs特定的合成肽和有目的抗原表达的全细胞抗原可以在小鼠体内诱导出针对LMPs膜外区的抗体应答,建立了高效的兔单克隆抗体筛选和表达平台,为LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的开发奠定了基础。
黄暨生[2]（2016）在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中研究表明恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段（如手术治疗、放疗、化疗等）后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能（GJIC）的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯（GJIC）功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP（tk+）细胞混合A375（tk-）细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高（P<0.05）,说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能（即缝隙连接机制）发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
蔡艳玲[3]（2011）在《RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究》文中认为目的构建含有小发夹RNA （shRNA）的针对hTERT基因的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,并探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）的表达对大肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法设计合成3条针对hTERT基因的siRNA,将筛选出最有效的siRNA合成shRNA寡核苷酸片段插入到真核质粒pGPU6/GFP/Neo中,进行酶切和测序鉴定。将构建好的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,采用脂质体法转染人大肠癌SW480细胞。在荧光显微镜下观察细胞转染效率及细胞形态学变化。RT-PCR法检测不同转染时间SW480细胞中hTERTmRNA的表达水平。TRAP-PCR-ELISA法检测转染48小时后SW480细胞的端粒酶活性。免疫组化法检测SW480细胞中hTERT蛋白的表达。流式细胞仪检测转染后细胞周期分布。TUNEL法检测转染后细胞凋亡状况。激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体跨膜电位（MMP）的变化。透射电镜观察转染后细胞超微结构。结果将筛选出干扰效率较好的的siRNA序列合成shRNA片段后,将其成功插入质粒pGPU6/GFP/Neo中,构成重组真核质粒pGPU6/GFP/ Neo-hTERT-shRNA。SW480细胞以质粒与脂质体比例为1：2.5、转染48h时的转染效率较高,其转染率达59%。RT-PCR结果显示,hTERT-shRNA组的hTERTmRNA表达水平在转染48h时降低较明显,与空白组、脂质体组、NC-shRNA组比较,抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。TRAP-PCR-ELISA结果示,hTERT-shRNA组SW480细胞端粒酶活性显着降低18.7%,与其它三组比较,差别均有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果示,hTERT-shRNA组被染色的阳性细胞明显少于其他组,经病理图像分析软件分析灰度值后得出,转染48h后hTERT-shRNA组与空白组比较,差异有明显统计学意义（P<0.05）,同时与脂质体组和NC-shRNA组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。流式细胞仪结果示,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加,S期细胞减少,提示hTERT-shRNA质粒转染SW480细胞后,使进入静止状态的细胞增多,细胞增殖指数下降约14.2%,与NC-shRNA组比较,差别有显着统计学意义（P<0.05）。TUNEL结果示,与其他组比较,hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着增多,凋亡指数为21.5%,明显比其他组增高,差异有统计学意义（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察结果,hTERT-shRNA组可见多个含有核分裂相的细胞,细胞Rh123荧光强度明显增强,MMP显着下降,与其他组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。透射电镜观察结果示,SW480细胞体积明显缩小,表面突起及微绒毛减少,甚至消失,细胞核固缩,染色质不均匀地沿核膜下聚集,空泡增多。结论成功构建了针对hTERT基因的重组真核表达质粒pGPU6/GF P/Neo-hTERT-shRNA。它能有效沉默hTERT基因,因而能有效抑制人大肠癌SW480细胞增殖生长,降低端粒酶活性,最终促使肿瘤细胞凋亡。目的研究靶向hTERT基因的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对人大肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的治疗作用。方法于裸鼠右侧腋下皮下注射人大肠癌SW480细胞建立大肠癌移植瘤动物模型,待肿瘤长到一定大小时,随机分为生理盐水组（NS组）、NC-shRNA组和hTERT-shRNA组。各组连续进行相应治疗6次后,观察肿瘤的生长状况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,HE染色观察肿瘤组织细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中hTERT蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况,RT-PCR法检测瘤组织中hTERTmRNA的表达,PCR-TRAP-ELISA法检测肿瘤组织的端粒酶活性。结果所有裸鼠在接种SW480细胞第14天后,皮下肿瘤结节直径达5-7mm,成功构建了裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%。荷瘤裸鼠开始治疗后,hTERT-shRNA组瘤体积增长速度慢于NS组和NC-ShRNA组,并于第18天开始明显减慢。HE染结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织出现局部坏死区,瘤组织细胞形态发生明显改变。免疫组化法检测结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT蛋白表达水平下降,可见少量hTERT蛋白阳性细胞,细胞呈浅棕色。TUNEL法检测结果示,hTERT-shRNA组凋亡细胞数明显增多,细胞分布密集,与NS组和NC-shRNA组比较,凋亡指数分别增加29.4%和31.1%,差异有显着统计学意义（P<0.01）；RT-PCR法检测结果示,hTERT-shRNA组hTERT mRNA表达水平较NS组和NC-shRNA组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。PCR-TRAP-ELISA法检测结果示,hTERT-shRNA组与NS组和NC-shRNA组比较,端粒酶活性降低较明显,抑制率分别为48.5%和53.0%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA通过下调hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达,促进肿瘤细胞的凋亡,从而抑制大肠癌移植瘤的生长。
宋英[4]（2010）在《RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的体内外实验研究》文中进行了进一步梳理鼻咽癌是我国华南地区一种常见的恶性肿瘤,且发病率高。目前鼻咽癌的治疗多采用放疗为主结合化疗免疫治疗及手术治疗、中医治疗等的综合疗法,但由于放疗后易发生局部复发和远处转移,以及鼻咽癌细胞对化疗药物不敏感和化疗药物的严重毒副作用,从而影响了预后,并限制了进一步提高患者生存率。因此,从基因治疗的角度,寻找毒性低、疗效好、特异性强的新的治疗技术具有重要的临床意义。RNA干扰技术是当今研究鼻咽癌基因治疗领域的一个热点。它是一种转录后基因沉默现象,在以往的实验中,通过单基因RNA干扰能够抑制肿瘤细胞的生长增殖。然而无论在基础研究或临床实验中,单独干扰某个基因对研究肿瘤的防治方面存在有很大局限性。利用分子生物学技术,针对不同基因发展的基因治疗技术,通过改变或修饰相关基因及其表达产物的方式治疗恶性肿瘤己成为肿瘤生物治疗中最引人注目的研究领域,也可能是恶性肿瘤治疗的希望所在。目前国内外研究同时干扰多个基因的报道较少。尤其三个以上的基因同时干扰更为少见。联合沉默肿瘤细胞中多个癌基因,会成为研究肿瘤基因治疗的一个前沿问题。也是肿瘤基因治疗中一个新的研究方向。由于肿瘤的发生发展是多基因突变多步骤多因素共同作用的结果,我们分析,如果同时阻断其中的几条通路,对肿瘤的治疗效果可能比只阻断一条要好,为进一步研究多基因共沉默在肿瘤治疗中的作用,我们带着这样一个全新观念需要验证的思路,通过不同检验手段付诸于实验来验证多个基因串联在一起的真核质粒能否同时沉默目的基因的表达并且能否能够最大限度地发挥基因沉默的效果。研究多基因共干扰的前提是设计出一种方法,能够同时转染干预多个基因的表达。本实验通过利用分子生物学基因克隆技术,VEGF，C-myc,Survivin,hTERT的cDNA序列构建并鉴定一个载体同时编码VEGF,C-myc,Survivin,hTERT四个不同基因的shRNA质粒,与干扰单基因进行比较,将其导入CNE-2Z细胞,研究其能否对鼻咽癌细胞生长和增殖的抑制作用诱导细胞凋亡,能否最大限度地提高单个基因的沉默效率,为研究鼻咽癌基因治疗奠定实验基础并提供治疗策略,有望为鼻咽癌基因治疗提供一个行之有效的新思路。方法（1）构建同时表达VEGF,C-myc,Survivin,hTERT并含荧光素标记的shRNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF,C-myc,Survivin,hTERT的质粒，分别命名为P-2,P-3,P-4,P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株。（2）以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞转染及表达情况。（3）以噻哗蓝法检测细胞增殖活性。（4） real-time-PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用。（5）免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果。（6） Transwell侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变。（7）流式细胞仪观察各组凋亡率。（8）体内裸鼠成瘤：以激光共聚焦显微镜观察质粒在移植瘤癌组织中转染及表达情况并通过体积变化,RT-PCR和免疫印迹及TUNNEL凋亡检测等指标观察质粒对肿瘤的抑制效果。结果（1）载体构建与鉴定质粒载体pGenesil 1.1,pGenesil 1.2,pGenesil 1.3, pGenesil1.4里面来只有一个Sad的酶切位点,而质粒VEGF,C-cmy, Survivin, hTERT均能够被SacI所酶切出一条约900bp,600bp,900bp,600bp不等的DNA条带,说明目的基因片段VEGF, C-myc, Survivin, hTERT已经分别插入到质粒载体pGenesil 1.1,pGenesil 1.2, pGenesil 1.3, pGenesil 1.4里。挑取克隆正确的质粒转化菌液VEGF, C-myc, Survivin, hTERT去测序。经测序结果分析：均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准。通过本实验,应用有效的克隆技术,构建出一个载体同时编码4个不同基因的表达质粒,这将为以后多基因共沉默奠定坚实的研究基础。（2）质粒转染检测质粒转染细胞24h,空白对照组未见表达的绿色荧光细胞。其他各组均可见大量表达绿色荧光的细胞,其中阴性对照组细胞生长良好,有许多贴壁细胞表达绿色荧光。多基因组和各单基因组出现大量悬浮的表达绿色荧光的圆形死亡细胞。其中多基因组凋亡细胞数较多。我们将质粒转染CNE-2Z细胞后共聚焦显微镜下观察到大量表达绿色荧光的细胞,说明质粒能有效转染该细胞。（3）MTT法检测细胞活力与空白对照组比较,P-1、P-2、P-3、P-4、P-5各组各时间点的细胞吸光度A值均显着下降,P<0.05；p-1组分别和P-2、P-3、P-4、P-5各组之间比较,p-1组各时间点的吸光度A值差异有统计学意义P<0.05。BC和NC组各时间点的吸光度A值差异没有统计学意义P>0.05。p-1和P-2、P-3、P-4、P-5转染癌细胞96小时细胞生长抑制率分别达到72%、42%、41%、40%、45%。MTT结果显示转染细胞后,多基因组细胞增殖明显受抑制,说明同时沉默VEGF, C-myc, Survivin,hTERT四个基因比单独沉默其中的一个基因能更有效的抑制CNE-2Z细胞的生长。（4）转染后48小时不同基因在不同组别中的mRNA定量表达.在p-1和p-2中VEGF的抑制率分别是：76.47%±2.08和69.75%±3.05在p-1和p-3中C-myc的抑制率分别是：79.73%±3.01和77.43%±1.98在p-1和p-4中Survivin的抑制率分别是：80.89%±2.35和73.92%±2.56在p-1和p-5中hTERT的抑制率分别是：74.60%±2.68和70.47%±2.87。实时定量PCR结果显示各个单基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起单个基因的mRNA表达下降,多基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起四个基因的mRNA同时表达下降,说明多基因组的mRNA沉默作用强于单基因。（5）转染48小时后western blotting蛋白检测。VEGF基因在P-1、P-2中的蛋白抑制率分别是66.95%±2.42和64.30%±3.13,C-myc基因在P-1、P-3中的蛋白抑制率分别是62.89%±2.97和59.18%±3.09Survivin基因在P-1、P-4中的蛋白抑制率分别是79.48%±1.92和70.51%±2.56hTERT基因在P-1、P-5中的蛋白抑制率分别是79.60%±1.87和76.33%±4.11。蛋白印记结果显示各个单基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起单个基因的蛋白表达下降,多基因质粒转染CNE-2Z细胞后引起四个基因的蛋白同时表达下降,说明多基因组的蛋白沉默作用强于单基因。（6） Trans well侵袭小室模型测定细胞体外侵袭能力。7组细胞在48h后Trans well侵袭小室中多基因组穿膜细胞数比空白对照组和单基因组明显减少（P<0.05）单基因组和空白对照组穿袭细胞数也存在统计学差异（P<0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较无统计学差异（P>0.05）,表明单基因质粒和多基因组质粒均可转染可降低CNE-2Z细胞的体外侵袭能力,其中多基因组比单基因组更能明显地降低鼻咽癌细胞穿袭能力。侵袭实验结果显示转染细胞后,体外侵袭能力明显降低,说明同时沉默VEGF,C-myc,Survivin,hTERT四个基因比单独沉默其中的一个基因能更有效地降低恶性侵袭力。（7）流式细胞仪检测细胞凋亡。处理48小时后,空白对照组凋亡率是5.3%±1.26,阴性对照组凋亡率是7.4%±1.02,p-1组凋亡率是37.6%±0.94,p-2组凋亡率是20.6%±1.27,p-3组凋亡率是22.6%±±0.98,p-4组凋亡率是23.7%±1.09,p-5组凋亡率是22.9%±1.31,空白对照组和阴性对照组凋亡率比较二者之间没有统计学差异（p>0.05）。单基因组与空白对照组凋亡率比较二者之间有明显统计学差异（p<0.05）。多基因组与空白对照组凋亡率比较二者之间有明显统计学差异（p<0.01）。单基因和多基因组凋亡率比较二者之间具有明显统计学差异（p<0.05）。流式细胞仪检测细胞凋亡实验表明同时沉默肿瘤细胞中多个基因比单独沉默一个基因能够更好的诱导肿瘤细胞凋亡。（8）癌裸鼠动物模型的治疗效果。空白对照组和阴性对照组裸鼠肿瘤持续增长,体积明显增大；多基因治疗组和单基因治疗组肿瘤生长缓慢,其中多基因治疗肿瘤生长速度最慢.荧光显微镜下观察质粒治疗组和阴性对照组可见大片癌组织表达绿色荧光,而空白对照组的移植瘤未见绿色荧光。在治疗结束时,P-1,P-2、P-3、P-4、P-5组肿瘤比空白对照组肿瘤生长明显受到抑制。各组抑瘤率分别是,P-1：82.40%、P-2：46.24%、P-3：48.47%、P-4：51.93%、P-5：46.78%TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡率：空白对照组和阴性对照组偶可见凋亡细胞,凋亡指数为分别为2.8±01.12、3.7±0.95; VEGF、C-myc、Survivin和hTERT单基因质粒组凋亡细胞凋亡指数分别为21.5%±2.31、23.8%±1.98、19.9%±2.75和24.60%±±3.09。多基因质粒组凋亡细胞明显增多凋亡指数为49.8%±1.98。表明单基因组和多基因组对鼻咽癌移植瘤均有诱导凋亡作用,其中多基因组诱导凋亡作用最明显。结论本实验首次通过多基因干扰证实了不同基因的沉默导致相应mRNA及目的蛋白的表达下调,从而有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,移植瘤生长明显受到抑制,初步证实RNA同时干扰四个不同基因比单独抑制其中的一个基因能够更好的抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖,促进细胞的凋亡。本研究为鼻咽癌的基因治疗提供了一个新的研究方向。
柯霞[5]（2010）在《靶向脱氧核酶抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表达的实验研究》文中研究说明鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma,NPC）是耳鼻喉喉头颈外科常见恶性肿瘤,好发于我国南方及东南亚地区。病因学研究表明,鼻咽癌的发病与EB病毒感染、遗传易感性、饮食习惯及某些环境理化因素有关,其发生也是一个多基因参与、多步骤的复杂过程,其中,EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV）扮演重要角色。在EB病毒编码的众多蛋白当中,潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1, LMP1）是目前唯一证实的恶性转化基因。脱氧核酶（deoxyribozyme, DNAzyme,DZ）技术作为一种新型的基因治疗工具,能有效抑制目的基因表达,已广泛应用于肿瘤、病毒的基因治疗研究当中。本课题针对EBV-LMP1mRNA,设计并合成具有高效抑制性及特异性的脱氧核酶,观察其对鼻咽癌细胞及裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型中EBV- LMP1基因表达的抑制作用以及对鼻咽癌细胞产生的生物学影响,为鼻咽癌的预防和临床治疗提供新的基因治疗策略。第一部分脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1基因表达的研究目的:根据前期研究结果,合成高效特异抑制EBV-LMP1基因表达的靶向脱氧核酶,并观察其对鼻咽癌细胞内靶基因的抑制效应。方法:以EBV-LMP1基因为抑制靶点,合成脱氧核酶DZ509（经前期细胞外分子水平切割筛选,证明具有高效性和特异性）、以及相对应的突变体mutDZ509（15nt碱基活性中心第4位点突变）和反义寡核苷酸ASODN509（有相同底物识别序列但无酶活性）,5’端用FITC标记,并进行硫代化修饰,经脂质体分别转染C666-1细胞,命名为DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组。同时设立未转染空白对照组及仅转染脂质体对照组。转染后24h,荧光显微镜观察转染效率。采用RT-PCR、Western Blot方法检测其抑制LMP1mRNA和蛋白表达的效率。结果:转染后24h, DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组转染效率分别为64%、60%及65%。RT-PCR结果显示:与空白对照组相比,脂质体对照组对EBV-LMP1mRNA表达抑制率为5.94%,差异无显着性（P>0.05）;而ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1基因表达,其抑制率分别为23.33%、53.18%、68.76%,其抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,各组间比较,差异有显着性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组相比, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组相比,P<0.05。Western Blot检测结果与RT-PCR基本一致。与空白对照组相比,脂质体组对EBV-LMP1蛋白表达抑制率为1.68%,差异无显着性（P>0.05）;ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1蛋白表达,抑制率各为22.14%、50.39%、68.21%,其抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,各组间比较,差异有显着性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05; DZ509组与ASODN509组相比, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组相比, P<0.05。结论:与mutDZ509、ASODN509相比,DZ509能高效抑制鼻咽癌细胞中EBV-LMP1基因表达,为进一步体内实验提供基础。第二部分EBV-LMP1靶向脱氧核酶对鼻咽癌细胞生物学特性的影响目的:探讨靶向脱氧核酶对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法:将脱氧核酶DZ509、相对应的突变体mutDZ509、无酶活性的反义寡核苷酸ASODN509经脂质体转染至C666-1细胞,分别命名为DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组。同时设立未转染空白对照组及仅转染脂质体对照组。转染后24h、48h及72h,采用MTT法检测各实验组细胞的增殖情况。转染后24h,采用流式细胞仪检测各实验组细胞的细胞周期;采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI检测各实验组细胞的凋亡情况。结果:MTT结果显示,转染后24h,与空白对照组相比,脂质体组细胞增殖抑制率为5%,差异无显着性（P>0.05）; DZ509组、mutDZ509组和ASODN509组细胞增殖抑制率分别为31%、16%、14%,组间比较差异有显着性（P<0.05）,抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509。转染后48h, DZ509、mutDZ509、ASODN509对细胞增殖抑制明显减弱,抑制率分别为19%、7%和6%,其中,DZ509组与mutDZ509组、ASODN509组比较,差异有显着性（P<0.05）;mutDZ509组与ASODN509组相比,差异无显着性（P>0.05）。转染后72h结果与48h基本一致。转染后24h,流式细胞仪检测C666-1细胞周期,结果显示:对于G0/G1期比率,与空白对照组50.28%相比,脂质体组为55.23%,差异无显着性（P>0.05）;DZ509组为68.46%,差异有显着性（P<0.05）、mutDZ509组、ASODN509组分别为63.72%和62.23%,差异无显着性（P>0.05）,其中DZ509组和mutDZ509组、ASODN509组比较,差异无显着性（P>0.05）。mutDZ509组与ASODN509组比较,差异无显着性（P>0.05）;对于S期所占比率,与空白对照组39.30%相比,脂质体组为33.72%,差异无显着性（P>0.05）;DZ509组为12.37%,差异有显着性（P<0.05）;mutDZ509组、ASODN509组分别为27.05%和28.77%,差异无显着性（P>0.05）,其中DZ509组和mutDZ509组、ASODN509组比较,差异有显着性（P<0.05）。mutDZ509组与ASODN509组比较,差异无显着性（P>0.05）。流式细胞仪检测并计算凋亡率,转染后24h,与空白对照组相比,脂质体组细胞凋亡率为0.48%,差异无显着性（P>0.05）;DZ509、mutDZ509、ASODN509组细胞凋亡率约为16.64%、10.47%、8.81%,其凋亡诱导效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,差异有显着性（P<0.05）。结论:较mutDZ509、ASODN509相比,DZ509能明显抑制鼻咽癌细胞增殖,使细胞生长停滞于G0-G1期,DNA合成减少,并诱导细胞凋亡。第三部分EBV-LMP1靶向脱氧核酶对裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤生长的影响目的:建立裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型;观察靶向脱氧核酶、突变脱氧核酶及反义寡核苷酸对移植瘤生长及LMP1表达的影响。方法:将鼻咽癌细胞C666-1种植于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况。成瘤后,将裸鼠随机分为DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组、PBS组,每组各7只,每天于瘤体内分别多点注射脱氧核酶DZ509、突变体mutDZ509、反义寡核苷酸ASODN509及对照PBS,观察并记录肿瘤生长情况。7天后处死裸鼠。剥离肿瘤组织,RT-PCR检测LMP1mRNA表达、Western Blot、免疫组织化学检测LMP1蛋白表达。结果:成功建立裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型。经DZ509、mutDZ509、ASODN509和PBS干预后, DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组、PBS组瘤体重量分别为（0.225±0.05）g、（0.4±0.08）g、（0.475±0.15）g、（1.125±0.25）g。与PBS组相比,DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组肿瘤重量均减轻、差异有显着性（P<0.05）;DZ509组与mutDZ509组、ASODN509组比较,肿瘤重量减轻,差异有显着性（P<0.05）;而mutDZ509组与ASODN509组比较,差异无显着性（P>0.05）。对肿瘤组织RNA行RT-PCR检测结果显示,以PBS组为对照,各组对LMP1mRNA表达的抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,抑制率分别为19.34%、45.36%、62.89%,组间比较差异有显着性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组比较, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组比较, P<0.05。Western Blot检测结果显示,以PBS组为对照,各组对LMP1蛋白的抑制效应ASODN509<mutDZ509< DZ509,抑制率分别为18.45%、42.34%、63.13%,差异有显着性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组比较, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组比较, P<0.05。免疫组织化学结果显示:经DZ509、mutDZ509、ASODN509及PBS处理后,各组肿瘤组织切片LMP1阳性表达细胞占总细胞数比率分别为:21.8%、38.5%、52.5%、69.3%,其比例: DZ509<mutDZ509<ASODN509< PBS。与PBS组相比,DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组LMP1蛋白表达减少,各组比较,差异有显着性。其中,其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组比较,P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组比较, P<0.05。结论:靶向LMP1脱氧核酶DZ509在裸鼠体内能明显抑制移植瘤的生长,抑制LMP1mRNA及蛋白表达,有望成为治疗鼻咽癌有效的基因药物。
李烨[6]（2010）在《采用RNAi抑制CUL5基因表达对连续照射期间CNE2细胞增殖状况影响的研究》文中研究说明【研究背景与目的】鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在我国南方地区尤为高发,由于鼻咽部解剖位置的特殊性及鼻咽癌细胞对射线较为敏感的特点,目前放射治疗被认为是首选的治疗手段,一直以来,常规分割放射治疗作为鼻咽癌及其它恶性肿瘤的放射治疗方法在临床上己得到公认,而且也得到了比较好的临床治疗结果,但部分患者放疗后未控或局部复发导致鼻咽癌常规放疗失败。、已有较多的临床研究认为鼻咽癌常规分割放射治疗失败的原因为放疗中存在肿瘤细胞加速再增殖,故研究其机制,寻找克服放疗中肿瘤细胞加速再增殖途径是提高肿瘤局部控制率的一大关键。已有研究证实,细胞受照射后其增殖活性的改变与细胞周期基因有关。为了探索鼻咽癌常规放疗中肿瘤细胞加速增殖的机制,本课题组前期已应用不同的实验方法对鼻咽低分化鳞癌细胞株（CNE2）在连续分割照射中的细胞增殖状态进行研究,明确了CNE2细胞株在连续分割照射中确实存在中后期加速再增殖现象,同时应用基因芯片技术、实时荧光定量PCR筛选出与照射后CNE2细胞株增殖状态相关的差异基因：CDC25A、CUL5、p21、DDA3、CCNG1、ABL1、CDKN1A、CKS2、CCNE1、CDC2、CDKN2C、CCND3等,CUL5为细胞增殖活性增高时显着上调的基因之一,其在照射增殖活性最高时相与最低时相表达差异在2倍以上,因此笔者选择CUL5作为开展功能研究的目的基因。本研究通过离体细胞实验的方法,采用RNA干扰（RNAi）技术抑制CUL5基因的表达,探索CUL5基因表达情况对鼻咽癌放射治疗中细胞增殖活性的影响。RNAi是近年来迅速发展的基因阻断技术,其可通过双链RNA的介导特异性降解靶mRNA,从而抑制或阻断目的基因表达。该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。目前RNAi方法的应用在肿瘤放射治疗领域主要集中在放疗增敏方面,本研究利用RNAi技术的特异性、高效性、自身无细胞毒性等基本特点,直接对CNE2细胞株进行CUL5基因功能研究,探讨出CUL5在连续分割照射下鼻咽癌细胞加速再增殖现象中所起的作用,为初步探明鼻咽癌常规放疗中肿瘤细胞加速增殖的分子生物学机制奠定基础。【研究方法】1.构建、培养稳定抑制CUL5基因表达的细胞株：构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5,以阳离子脂质体法转染入CNE2中,经过G418毒性实验及阳性克隆有限稀释法筛选、培养出抑制CUL5表达的鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5。2.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在mRNA水平上验证照射前、后所构建细胞株CUL5基因的干扰效果。3.四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）及流式细胞术（FCM）检测在60Co-γ线,2Gy/d,连续5d的照射下细胞株的生长增殖变化情况。【研究结果】1.构建了重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5,经酶切及测序鉴定符合要求；经转染、筛选、培养,培育出CUL5表达抑制的鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5及阴性对照细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC。2. RT-PCR检测鼻咽癌细胞CUL5基因的表达情况,通过凝胶成像系统分析电泳条带,以β-actin为内参校正,测定空白对照组（CNE2组）、阴性对照组（CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC组）、实验组（CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组）CUL5的灰度比,照射前各组分别为0.122、0.175、0.004,实验组CUL5基因表达受到明显抑制；照射第1、3、5天实验组CUL5基因表达较对照组仍受到明显抑制。3.MTT法检测表明：连续分割照射5d期间,CNE2组及CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC组细胞以第3天增殖率最高（分别为122.4%,120.7%）,CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组第1天增殖率最高（103%）,3组均以第5天最低。流式细胞术检测表明：CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组在连续分割照射第1天增殖速度最快（SPF值=29.35,PI值=43.32）,后逐渐下降,第5天增殖最慢（SPF值=15.47,PI值=25.32）；CNE2组第3天增殖速度最快（SPF值=35.34,PI值=50.69）,第5天增殖最慢（SPF值=19.35,PI值=30.67）。两组比较,CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组增殖速度减慢且未出现加速增殖现象。【研究结论】1.成功培育出CUL5表达抑制的鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5及阴性对照细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC。2. CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5细胞无论是在照射前（即未照射）还是在照射后,CUL5的表达均下调,说明对CUL5的干扰作用有效且稳定。3. CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5细胞在连续分割照射5d期间的生长增殖速度减慢,且呈逐天下降趋势,说明抑制CUL5表达后,鼻咽癌照射加速再增殖现象有所改变,这将为寻找鼻咽癌基因治疗的靶点、研究靶向治疗药物提供实验基础和理论依据。
曹莹[7]（2009）在《含人端粒酶RNA突变体的端粒酶抑制剂筛选模型的构建》文中进行了进一步梳理研究背景和目的端粒酶是由催化蛋白亚基和RNA亚基组成的逆转录酶,它能够以其自身的RNA作为模板,补充端粒末端在DNA复制过程中丢失的序列。在正常体细胞中端粒随着细胞的分裂而不断缩短其长度直至一临界值可致该细胞衰老甚至死亡。相反,在85%以上的肿瘤细胞中端粒酶都有表达,其对于肿瘤细胞的增殖有着重要的作用。因此,以端粒酶为靶点筛选端粒酶特异抑制剂是近年来寻找新抗肿瘤药物的热点。目前,还没有端粒酶抑制剂特异的筛选模型。本课题组设计了端粒酶主要成分即端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）和起模板作用的端粒酶RNA（human telomerase RNA,hTR）相互作用的酵母三杂交模型。酵母的转录因子2个功能部分LexA（DNA结合结构域）和Gal4-AD（转录激活结构域）被人为分开,其中LexA通过MS2衣壳蛋白与hTR连接（诱饵,bait）,Gal4-AD与hTERT连接（猎物,prey）。由于hTR与hTERT可特异性结合,使酵母的转录因子的2个功能部分相互靠拢而启动报告基因的表达。但当hTR与hTERT之间存在抑制hTR与hTERT结合的因素时（Inhibitors,Is）,报告基因不表达。通过选择性培养酵母,就可以筛选抑制hTR与hTERT特异结合的抑制剂。由于hTR中若干序列会影响RNA的正常转录故本课题组对其进行基因突变并构建含人端粒酶RNA突变体的酵母三杂交诱饵质粒,而后与含hTERT的猎物质粒共转染入宿主酵母菌,得针对端粒酶主要成分即端粒酶逆转录酶和起模板作用的端粒酶RNA相互作用的基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型。方法1、端粒酶RNA（hTR）基因的定点突变根据hTR的DNA序列中三处连续四个或四个以上碱基T串联排列部分并结合突变前后杂交RNA分子二级结构的分析进行突变位点的设计,确保可作为转录终止信号的串联碱基T的连续性中断并且保证突变前后的杂交RNA二级结构没有很大的变化,其中的MS2 RNA的茎环结构亦仍独立存在,也就是使突变不影响MS2 RNA与酵母三杂交系统中杂交蛋白的结构并共同行使激活RNA聚合酶引起报告基因转录的能力。根据以上要求拟定在hTR基因第41、80及102位碱基运用重叠延伸PCR法（overlapping extension PCR,OE-PCR）进行T→A的点突变。根据hTR的DNA序列及突变位点,按照引物设计原则,采用引物设计软件（Primer Premier 5.0）设计引物。重叠延伸PCR单个位点定点诱变需要三个PCR反应来完成,本研究中需突变三个位点,故进行三次循环,得突变产物hTRm。产物进行TA克隆连接转化,菌落PCR筛选阳性克隆,小量抽提质粒PMD18T-hTRm,送重组质粒测序验证突变是否成功。2、基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的构建（1）酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2表型及自激活性的检测将酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2（已经引入了pHyblex/ZeoMS2质粒的酵母菌株L40ura3）分别涂布于营养缺陷培养基YC—U,YC—W,YC—H,YC—UWH上并观察其生长情况来验证该酵母表型,并检测其β-半乳糖苷酶活性即自激活性。（2）人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建将PMD18T-hTRm和PRH3′质粒进行AvrⅡ、AatⅡ双酶切后重组诱饵质粒PRH3’-hTRm,对重组质粒进行PCR及酶切鉴定,鉴定为成功构建后,将该重组诱饵质粒电转染入酵母菌L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2感受态细胞中,而后涂布于营养缺陷培养基YC—U,YC—W,YC—H,YC—UWH上观察其生长情况,并检测其自身毒性。（3）3-氨基-1,2,4-三氮唑（3-Amino-1,2,4-triazole）即3—AT抗性分析将质粒PRH3′同pYESTrp3,阳性对照质粒pRH3′/IRE同pYESTrp3/IRP分别共转染入酵母L40 ura3/pHyblex/ZeoMS2中,分别涂布于含不同浓度3—AT的营养缺陷培养基YC—H上,并观察其生长情况从而确定最大限度消除假阳性需加入的3—AT的浓度值。（4）基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的初步构建将猎物质粒pYESTrp3-hTERT（1-608）,pYESTrp3-hTERT（17-593）,pYESTrp3-hTERT（292-608）,pYESTrp3-hTERT（292-952）中的任意一个与诱饵质粒PRH3′-hTRm一一配对,采用电击转染的方法共转入酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2中,将共转染后的酵母菌株分别涂布于营养缺陷培养基YC—UZ,YC—WZ,YC—HZ,YC—UWHZ上并观察其生长情况。（5）β-半乳糖苷酶活性分析将营养缺陷培养基YC—UWHZ上生长的菌落进行β-半乳糖苷酶活性分析来确定hTR与hTERT片段是否结合,并可以初步筛选阳性克隆。（6）反复传代排除假阳性克隆反复传代三次,且每次传代后均进行β-半乳糖苷酶活性检测。（7）菌落PCR筛选阳性克隆选择上一步骤中β-半乳糖苷酶活性分析为阳性的菌落进行菌落PCR进一步筛选阳性克隆。100℃水浴10分钟裂解酵母,离心取上清作为模板,进行PCR验证酵母菌中是否成功转入含hTRm的诱饵质粒,在确证含hTRm的诱饵质粒成功转入的基础上,进行二次PCR,验证含hTERT片段的猎物质粒是否成功转入,取两次PCR均为阳性的酵母菌进行保菌备用。结果1、端粒酶RNA（hTR）基因的定点突变突变产物结果测序结果显示,端粒酶RNA（hTR）基因成功地进行了预期突变,第41、80及102位碱基T突变A,并无预期外的随机突变发生。2、基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的构建（1）酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2表型验证及自激活性的检测酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2在营养缺陷培养基YC-U,YC-W,YC-H,YC-UWH上均不能生长,在不含腺嘌呤的YPD培养基上有红色菌落生长,而在YPDA平板上为白色菌落生长,且经β-半乳糖苷酶活性检测,菌落仍为白色并无蓝色菌落产生。验证了酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2表型为MATa,ura3-52 leu2-3,112,his3-200,trp1-1,ade2,LYS2∷（lexA op）-HIS3,LexA-MS2 coat（TRP1）,且无自激活性。（2）人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建重组诱饵质粒PRH3′-hTRm经PCR及酶切验证构建成功,并转入酵母菌L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2中,经在YPDA酵母液体培养基中过夜培养后,观察其生长情况并与同样生长条件下的空酵母菌L40 ura3/pHyblex/ZeoMS2比较其吸光度发现,这两种酵母菌的生长并无明显差异。同时,转染了重组诱饵质粒PRH3′-hTRm的酵母菌L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2在YC及YC-U平板上肉眼可见菌落,而在YC-W,YC-H,YC-UWH培养基上均无菌落生长,验证了重组诱饵质粒PRH3′-hTRm含URA3选择标记,转入该质粒后的宿主酵母营养型变为His-,Trp-,Ade-,Leu—。（3）3-氨基-1,2,4-三氮唑（3-Amino-1,2,4-triazole）即3—AT抗性分析转染了质粒PRH3′+pYESTrp3的酵母L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2涂布在含不同浓度3-AT的营养缺陷培养基YC-H上生长情况为,当3-AT浓度在0-10mM范围,平板上均有菌落生长,当3-AT浓度大于10mM时,酵母菌落数几乎为零;而转化了质粒pRH3′/IRE+pYESTrp3/IRP的酵母L40 ura3/pHyblex/ZeoMS2,在3-AT浓度在0-20mM范围时,平板上均有菌落生长,且在3-AT浓度在0-10mM时,随着浓度增加菌落数逐渐减少,当3-AT浓度大于10mM且增大时,酵母菌落数几乎无变化。因此,我们认为3-AT浓度为10mM时能较大限度的消除酵母三杂交中的假阳性,选择10mM作为后续实验中3-AT添加的最适浓度。（4）基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的初步构建共转入猎物质粒和诱饵质粒后的酵母菌株在营养缺陷培养基YC-UZ,YC-WZ,YC-HZ,YC-UWHZ上均能生长。（5）β-半乳糖苷酶活性分析在含有1mg/ml X-GAL和100mM的KPO4（PH7.0）的低熔点琼脂糖覆盖的YC-UWH培养板上,除阴性对照即共转染了质粒PRH3′和pYESTrp3的酵母L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2涂布的平板外,均可见蓝色菌落。（6）反复传代排除假阳性克隆反复传代三次,且每次传代后均进行β-半乳糖苷酶活性检测,最终得到共21个阳性克隆,其中pYESTrp3-hTERT（1-608）+PRH3′-hTRm 8个,pYESTrp3-hTERT（17-593）+PRH3′-hTRm 5个,pYESTrp3-hTERT（292-608）+PRH3′-hTRm5个,pYESTrp3-hTERT（292-952）+PRH3′-hTRm 3个。（7）菌落PCR筛选阳性克隆经两次菌落PCR鉴定,最终筛选到阳性克隆6个,其中pYESTrp3-hTERT（1-608）+PRH3′-hTRm 1个,pYESTrp3-hTERT（17-593）+PRH3′-hTRm 2个,pYESTrp3-hTERT（292-608）+PRH3′-hTRm 2个,pYESTrp3-hTERT（292-952）+PRH3′-hTRm 1个。结论1、成功构建了hTR突变体的重组质粒PRH3′-hTRm,可作为酵母三杂交系统中的“诱饵”。2、成功构建了针对端粒酶主要成分即端粒酶逆转录酶和起模板作用的端粒酶RNA相互作用的,基于酵母三杂交系统的端粒酶特异抑制剂高通量筛选模型。本研究的创新之处利用酵母三杂交系统理论,首次将人端粒酶的两个核心成分hTERT与hTR是否结合作为唯一的变量并通过对hTR进行碱基突变来克服构酵母三杂交系统的缺陷,构建了基于酵母三杂交的含人端粒酶RNA突变体的端粒酶抑制剂高通量筛选模型,为寻找端粒酶抑制剂开辟了新的途径。
刘成武[8]（2008）在《病毒载体介导的微型核酶对犬贾第虫端粒酶活性的影响》文中研究指明本研究在对犬贾第虫（G. canis）病毒研究的基础上,构建了犬贾第虫病毒（GCV）通用型转染载体,在载体中引入了抗性盒、多克隆酶切位点和内源性启动子,并在G. canis体内持续稳定表达了绿色荧光蛋白基因;根据国外报到的蓝氏贾第虫的端粒重复序列设计了寡聚核苷酸探针[5′-TAGGG-3′]5与Bal31-EcoRI不同消化时间的G. canis基因组DNA进行杂交鉴定,确定了我国G. canis端粒重复序列为（TAGGG）n;在此基础上,采用改进的端粒重复序列扩增法（TRAP）首次对G. canis滋养体时期和包囊时期的端粒酶活性进行了检测,并在滋养体时期检测到很强的端粒酶活性,而包囊时期未检测到端粒酶活性;将两端携带反义GcTERT基因的微型核酶插入到犬贾第虫病毒载体pNEO/GDH/MCS中,构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体TRzS和TRzL,其体外转录体对GcTERT基因体外转录RNA切割效率分别为76.14%和83.42%,同时构建一个反义RNA载体,切割效率为31.56%;体内试验表明TRzS和TRzL对GcTERT基因表达抑制效果显着,最高可分别达84%和72%,端粒酶活性明显降低的同时,转染组虫体细胞数量显着低于正常对照组（P<0.01）。本试验成功的构建和应用了犬贾第虫病毒通用型载体,为进行贾第虫细胞生物学和分子生物学等方面的研究奠定了基础,同时对G. canis端粒酶活性的研究,也为将来以端粒酶作为化疗的靶位点,进行贾第虫病的预防和治疗提供新思路。
明宇[9]（2008）在《RNAi对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性影响的研究》文中指出本研究将采用小分子干扰RNA技术进行研究,探讨chTR、chTERT的shRNA对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性的影响。首先,针对chTR的二级结构中模板区、假结区和CR4-CR5区设计shRNA序列,并与pSilencer 1.0-U6构建成重组质粒载体:pSi-chTR-sh1、pSi-chTR-sh2、pSi-chTR-sh3。然后,将重组质粒载体转染MDCC-MSB1细胞,实验分为九组:未转染组、转染空质粒组、转染pSi-chTR-sh1组、转染pSi-chTR-sh2组、转染pSi-chTR-sh3组、转染pSi-chTERT-sh组（质粒载体为本室保存）、共转染pSi-chTERT-sh和pSi-chTR-sh1组、共转染pSi-chTERT-sh和pSi-chTR-sh2组、共转染pSi-chTERT-sh和pSi-chTR-sh3组。最后,应用MTT法、端粒酶活性检测法和细胞周期检测法对转染重组质粒后的细胞进行检测。结果显示,重组质粒转染细胞后出现了明显的细胞生长抑制、端粒酶活性下降和细胞周期阻滞现象,与未转染组和转染空质粒组比较有统计学意义。在单独转染组中,转染chTR组和转染chTERT组的抑制效果没有显着差异,而转染pSi-chTR-sh1组比转染pSi-chTR-sh2组和转染pSi-chTR-sh3组的抑制效果明显,表明直接干扰模板区的shRNA抑制效果较为明显。在联合转染组中,三个组抑制效果没有明显差异,但是都比单独转染组抑制效果明显,表明chTR能与chTERT相互作用,共同维持端粒酶活性。研究表明分别应用chTR、chTERT和联合应用chTR和chTERT的shRNA都能抑制端粒酶活性,且联合转染组效果更加明显。也表明chTR的二级结构中假结区和CR4-CR5区与chTERT相互作用,共同维持端粒酶活性。为研究chTR对端粒酶的活性调控方面的作用和chTR和chTERT的相互作用进行了实验性研究,为寻求最有效地抑制端粒酶活性的shRNA并为肿瘤治疗新策略提供了可能性。
谭晶[10]（2008）在《靶向hTERT基因的siRNA治疗胰腺癌的实验研究》文中研究指明[背景与目的]胰腺癌的发病率占恶性肿瘤的1%—5%,近年来在世界范围内有明显增多的趋势,其传统的治疗方法主要是手术切除为主,放疗和化学药物联合治疗。虽然经改良手术方法,改变放疗化疗策略,进行综合治疗,但结果并不令人满意,胰腺癌患者死亡率仍然居高不下,其五年生存率低于5%。近年来随着分子生物学,基因免疫学的进步,人们从基因、免疫学的角度对胰腺癌的发病机制有了新的认识,为胰腺癌的治疗提供了新途径、新方法。胰腺癌基因治疗被认为是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后肿瘤治疗的新模式,各国专家学者正在探究胰腺癌的生物学行为,发现胰腺癌基因改变在胰腺癌浸润转移中发挥主要作用,胰腺癌的浸润及转移也是一个基因变化逐步积累的过程。端粒（telomere）是真核线性染色体末端结构,由端粒DNA和端粒结合蛋白组成。端粒酶（telomerase）是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白酶,是一种RNA依赖的DNA聚合酶。具有活性的端粒酶由一个RNA亚基和几个蛋白组份构成。RNA亚基（humantelomerase RNA,hTR）含有端粒DNA复制的模板。蛋白组分包括具有催化活性的端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）和端粒酶相关蛋白1（human telomerase-associated protein 1,hTEP1）。hTR和hTEP1在很多正常人组织中都有表达,而hTERT则表达于细胞永生化过程中具有端粒酶活性的细胞中,在细胞的癌变过程中起关键作用。大多数肿瘤中可以检测到端粒酶的活性,而在正常人体组织中却无表达,提示端粒酶是一种广泛的肿瘤标志物。近年来通过检测胰液中端粒酶活性诊断胰腺癌的研究有了很大进展,发现胰腺癌患者胰液中端粒酶活性远高于慢性胰腺炎和良性肿瘤。端粒酶基因可被认为是癌基因的一个重要成员。人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reversetranscriptase,hTERT）是由1132个氨基酸残基组成,分子量为127kDa。端粒酶的活性与hTERT基因表达水平高度相关,它能被多种转录因子,癌基因及抑癌基因调控。新近的研究表明hTERT的高表达能通过多分化刺激来抑制细胞凋亡,导致细胞永生化。封闭或下调hTERT表达能引起端粒缩短,破坏染色体稳定性而抑制细胞生长并促进细胞凋亡,逆转肿瘤细胞恶性表型。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是存在于真核细胞内的一种自我保护现象,RNA干扰主要发生在基因转录后,即mRNA的修饰或翻译水平上,具有特异、高效和持久的特点。早期的RNA干扰试验大多使用的是化学合成的siRNA（small interference RNA）,通过RISC对相应的RNA进行特异性降解,可以连续地对新产生的RNA发挥作用,因而具有所需药物少、效率高、持续时间长、特异性强的优点。本研究利用基因工程技术,将人hTERT-siRNA序列插入pSilencer4.1CMV neo,构建重组质粒pSilencer4.1CMVneo-hTERT-siRNA,从体内和体外两个方面研究该重组质粒对人胰腺癌细胞生长的抑制作用,为靶向hTERT的siRNA的临床应用研究奠定基础。迄今,以pSilencer4.1CMVneo为载体的重组质粒pSilencer4.1CMVneo-hTERT-siRNA抗人胰腺癌的研究尚未见报道。[方法]1.设计hTERT-siRNA,设计出的靶向siRNA在GenBank中进行BLASTTM分析,选取序列;siRNA表达模板的合成;空载体pSilencer4.1-CMV neo依次用HindⅢ及BamHI酶切;DNA片段快速纯化回收试剂盒回收酶切后的大片段;酶切后的载体去磷酸化;hTERT-siRNA表达载体构建;重组质粒的酶切及测序鉴定2.pSilencer4.1-CMV neo hTERT-siRNA转染BxPC-3细胞及阳性细胞筛选;分组后48h hTERT基因表达的RT-PCR检测;MTT法检测重组质粒转染BxPC-3细胞48h后对细胞活力的影响;流式细胞术检测各组48h（T1组、T2组、Lipofectamine组、错配组、细胞对照组）细胞周期及凋亡发生情况。各组细胞48h端粒酶蛋白表达的Western-blot检测3.裸鼠成瘤及实验分组:接种BxPC-3细胞0.2ml于裸鼠背部皮下,建立人原发性胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,待肿瘤生长至直径约5mm时,将荷瘤裸鼠随机分为四组,①肿瘤对照组②空载组（即pSilencer4.1-CMVneo空质粒组）:分组当天瘤体内直接注射pSilencer4.1-CMVneo空质粒(20μg·0.1ml-1·只-1),每10天注射1次,连续注射3次。③T1组（即重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT1-siRNA组）:分组当天瘤体内直接注射重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT1-siRNA,20μg·0.1ml-1·只-1每10天注射1次,连续注射3次。④T2组（即重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT2-siRNA组）:分组当天瘤体内直接注射重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT2-siRNA,20μg·0.1ml-1·只-1每10天注射1次,连续注射3次。荷瘤裸鼠分组处理30天后,测量瘤体大小,计算肿瘤体积,然后脱颈处死裸鼠,用电子天平称取瘤重。HE染色光镜组织形态学观察各组裸鼠皮下肿瘤组织学特点及裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织的病理形态学变化以及是否出现转移病灶。电镜观测各组肿瘤组织超微结构变化。RT-PCR检测各组瘤体中hTERT、Bcl-2、BaxmRNA的表达。免疫组织化学检测各组瘤体中Bcl-2、Bax、p53、VEGF、端粒酶蛋白表达。Western blot检测各组瘤体中端粒酶蛋白表达情况。[结果]1.合成的T1、T2两对寡核苷酸单链退火形成双链。2%琼脂糖凝胶进行电泳。结果显示两片段均为55bp,琼脂糖凝胶电泳图显示清晰条带。琼脂糖凝胶电泳初步鉴定重组质粒:重组质粒在0.8%琼脂糖凝胶电泳图上于预期位置出现阳性条带与实验预想一致,初步鉴定正确。测序结果表明siRNA表达模板成功构建于pSilence4.1 CMV载体上,序列完全正确。2.琼脂糖凝胶电泳结果显示:重组体pSilencer4.1-CMV neo-hTERT-siRNA T1、T2组BxPC-3中hTERT-mRNA的表达较Lipofectamine组、阴性对照组和细胞组BxPC-3细胞中hTERT-mRNA表达量显着下降。GAPDH组未见明显条带显示。MTT结果显示:T1、T2对BxPC-3细胞有明显生长抑制作用,而Lipofectamine组、阴性对照组及细胞对照组对细胞生长基本无抑制作用。T1组和T2组与Lipofectamine组、阴性对照组及细胞对照组相比,存在明显差异,具有统计学意义（P＜0.05）。而T1组和T2组间比较,差异不明显（P＞0.05）,Lipofectamine组、阴性对照组及细胞对照组三组间比较,差异不明显（P＞0.05）。流式细胞术检测结果显示:T1组和T2组BxPC-3细胞株,G0/G1期细胞比例增高,S期和G2/M期细胞比例降低,细胞的增殖活力明显降低。Lipofectamine组、细胞对照组和错配组的BxPC-3细胞的增殖活力无明显改变。Lipofectamine组、细胞对照组和错配租的BxPC-3细胞细胞发生凋亡比率较低,而T1组和T2组细胞凋亡比例显着增加。各组细胞经Western blot检测分析表明,内参照GAPDH为均一显影的条带,但Telomerase蛋白显影条带密度不同。其中,Lipofectamine组、细胞对照组和错配组BxPC-3细胞端粒酶蛋白表达量较高,而T1、T2组细胞端粒酶蛋白表达量显着下降。3.各组荷瘤裸鼠分组处理30天后,裸鼠存活率为100%。处死全部裸鼠,肉眼观察:全部裸鼠体表淋巴结及腹腔淋巴结未见转移,亦未见腹膜转移及腹水,心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织亦均未见转移灶。HE染色光镜下可见肿瘤对照组和空载组肿瘤细胞特点与原细胞株基本一致,肿瘤成分叶结节状生长,质地较韧,包膜完整。T1组、T2组移植瘤HE染色见瘤组织癌细胞密度减少,细胞皱缩,间质结缔组织增多,伴轻度纤维化改变,部分癌巢发生程度不等片状坏死。有的散在坏死癌巢中无细胞结构。四组裸鼠以上各脏器HE染色病理形态学变化基本为正常形态变化。分组处理30天后各组裸鼠皮下移植瘤体积及瘤重差异较显着,T1组及T2组肿瘤体积及瘤重较肿瘤对照组和空载组均差异显着（P＜0.01）。T1组及T2组间比较无明显差异（P＞0.05）,肿瘤对照组及空载组组间比较亦无明显差异（P＞0.05）。各组裸鼠肿瘤超微结构:在肿瘤对照组和空载组,肿瘤细胞BxPC-3细胞表面微绒毛样突起较多,细胞核大而不规则,核内有假包含体。核仁明显而大,形状不规则,核仁可紧贴核膜,常染色质丰富。细胞器较少,线粒体数量不多,线粒体嵴较少,排列也不规则。能见到粗面内质网,但数量较少,部分细胞内能见到微丝样物质,核分裂像常见,细胞核质比较大,为典型恶性肿瘤细胞的形态特征。T1组和T2组BxPC-3细胞超微结构发生了明显变化,细胞表面微绒毛减少或消失,部分线粒体肿胀,同时见胞质密度增加,核染色质浓缩成二个或几个大的团块边聚于核被膜下,进而核裂解为碎块,可见凋亡小体。分组处理30天后,T1组和T2组hTERT,Bcl-2,Bax mRNA表达较肿瘤对照组和空载组均有显着性差异（P＜0.01）。T1组及T2组间比较无明显差异（P＞0.05）,肿瘤对照组及空载组组间比较亦无明显差异（P＞0.05）。分组处理30天后,T1组和T2组Bcl-2,Bax,Telomerase,p53,VEGF蛋白表达较肿瘤对照组和空载组均有显着性差异（P＜0.01）。T1组及T2组间比较无明显差异（P＞0.05）,肿瘤对照组及空载组组间比较亦无明显差异（P＞0.05）。Western blot结果显示:重组质粒pSilencer4.1-CMVneo-hTERT-siRNA作用后,T1组和T2组Telomerase蛋白表达条带强度较肿瘤对照组和空载组明显减弱,蛋白表达差异较显着。而T1组和T2组间比较以及肿瘤对照组和空载组间比较差异均不明显。[结论]1.以hTERT基因为靶点的siRNA序列设计合理,成功获得两条片段均为55bp的hTERT1-siRNA和hTERT2-siRNA。2.经酶切及测序鉴定证实hTERT1-siRNA和hTERT2-siRNA表达模板分别成功构建于pSilence4.1CMV neo载体上,获得两条重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT1-siRNA和pSilencer4.1-CMV-neo-hTERT2-siRNA,序列完全正确。3.重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA能特异性的诱导同源互补的mRNA降解,下调hTERTmRNA和端粒酶蛋白的表达水平,具有良好的RNAi沉默效应。4.重组质粒pSilencer4.1 CMV neo-hTERT-siRNA明显抑制BxPC-3胰腺癌细胞的生长,细胞周期发生阻滞,促进细胞凋亡,具有一定的体外抗胰腺癌作用。5.重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA能在裸鼠体内有效抑制BxPC-3胰腺癌细胞皮下移植瘤的生长,促进胰腺癌细胞凋亡,具有体内抗胰腺癌的作用。6.重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA能够显着下调裸鼠移植瘤体内抗凋亡基因hTERT mRNA、Bcl-2 mRNA和蛋白、mtp53和端粒酶蛋白表达水平,上调促凋亡基因Bax mRNA和蛋白表达水平,其抗胰腺癌作用可能与促进胰腺癌细胞凋亡有关。7.重组质粒pSilencer4.1 CMV neo-hTERT-siRNA能够显着下调裸鼠移植瘤体内VEGF蛋白表达水平,可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。8.hTERT基因的表达水平与某些癌基因、抑癌基因的表达水平可能存在一定程度的相关性,有待进一步深入证实。
二、抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响（论文提纲范文）
（1）基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学概况 |
| 1.1.2 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.3 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒简介 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的形态和结构特征 |
| 1.2.3 EB病毒的生命周期 |
| 1.2.4 EB病毒与肿瘤 |
| 1.3 EB病毒潜伏膜蛋白研究进展 |
| 1.3.1 潜伏期膜蛋白1(LMP1) |
| 1.3.2 潜伏期膜蛋白2(LMP2) |
| 1.4 肿瘤治疗性抗体药物研究进展 |
| 1.4.1 单克隆抗体制备技术 |
| 1.4.2 抗体药物治疗肿瘤的作用机制 |
| 1.4.3 肿瘤抗体药物的靶点(胞内、胞外) |
| 1.5 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 引物与多肽 |
| 2.3.7 免疫佐剂 |
| 2.3.8 其他常规试剂 |
| 2.3.9 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 分子生物学实验常规溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 ELISA检测用溶液 |
| 2.4.4 免疫组化相关液体的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 小鼠单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.5.4 小鼠淋巴细胞的流式分选与检测 |
| 2.5.5 小鼠杂交瘤细胞的抗体可变区基因钓取 |
| 2.5.6 兔单抗平台相关实验 |
| 2.5.7 免疫学相关试验方法 |
| 2.5.8 其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 基于小鼠单抗筛选平台对LMPs相关抗体筛选的探索 |
| 3.1 LMPs相关的抗原研究 |
| 3.1.1 合成肽及其偶联抗原 |
| 3.1.2 原核重组表达抗原 |
| 3.1.3 真核表达系统的重组抗原 |
| 3.1.4 抗原表达细胞株 |
| 3.1.5 核酸免疫抗原的制备 |
| 3.2 LMPs胞外、胞内区抗体筛选免疫方案的制定 |
| 3.3 LMPs相关免疫效果评价 |
| 3.3.1 合成肽免疫组 |
| 3.3.2 原核表达重组抗原免疫组 |
| 3.3.3 细胞与核酸免疫组 |
| 3.4 Anti-LMPs抗体筛选方案探索 |
| 3.4.1 基于抗原表达细胞的筛选 |
| 3.4.2 基于抗原特异性记忆B细胞的流式分选 |
| 3.5 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定与应用 |
| 3.5.1 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定 |
| 3.5.2 Anti-LMPs抗体在免疫组化方面的应用 |
| 3.5.3 Anti-LMP1抗体在鼻咽癌治疗方面的初步探索 |
| 3.6 第一部分小结 |
| 第二部分 兔单抗筛选平台的建立及LMPs特异性兔单抗筛选的探索 |
| 3.7 基于兔B细胞特异性分选的兔单抗筛选平台的建立 |
| 3.7.1 兔抗原特异性B细胞染色方案制定 |
| 3.7.2 兔B细胞单细胞PCR平台的建立 |
| 3.7.3 兔B细胞体外刺激培养平台 |
| 3.7.4 抗体重组表达载体构建 |
| 3.8 兔单抗筛选平台的应用 |
| 3.9 LMPs特异性兔单克隆抗体筛选探索 |
| 3.10 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌特异性诊断治疗性抗体开发的必要性和重要性 |
| 4.2 多次跨膜膜蛋白特异性抗体筛选的挑战 |
| 4.3 LMPs膜内区抗体在鼻咽癌个性化诊断及治疗中的潜力 |
| 4.4 基于流式分选的兔单克隆抗体筛选平台的重要性 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 第一章 肿瘤基因治疗概述 |
| 一、 基因沉默疗法 |
| 二、 抑癌基因疗法 |
| 三、 免疫基因疗法 |
| 四、 自杀基因治疗 |
| 五、 抗肿瘤血管生成基因疗法 |
| 六、 肿瘤多药耐药基因疗法 |
| 第二章 肿瘤自杀基因治疗研究进展 |
| 一、 自杀基因及自杀基因治疗系统 |
| 二、 自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
| 三、 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
| 第三章 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
| 第四章 木犀草素、芹菜素及槲皮素药理作用及抗肿瘤作用 |
| 一、 木犀草素与肿瘤的相关研究 |
| 二、 芹菜素与肿瘤的相关研究 |
| 三、 槲皮素与肿瘤的相关研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 人黑色素瘤细胞HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 RT-PCR扩增人tk读码框 |
| 二、 慢病毒载体质粒pLV-tk/GFP的构建和鉴定 |
| 三、 细胞培养、传代、冻存、复苏 |
| 四、 重组慢病毒的包装与感染 |
| 五、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 六、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 七、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 三、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 第四节 讨论 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第二章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞间缝隙连接通讯的作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 A375生长曲线绘制 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法和流式细胞技术观察GJIC功能 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 五、 统计方法 |
| 第三节 结果 |
| 一、 A375细胞的增殖测定 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法及流式细胞术检测药物对A375细胞GJIC功能的影响 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 四、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 第四节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件Ⅰ：本论文中使用的缩略语 |
| 附件Ⅱ：pLXSN-tk质粒中tk基因测序图 |
| 附件Ⅲ：已在国内外学术期刊上发表的相关论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（3）RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写索引 |
| 前言 |
| 第一部分 shRNA真核表达载体构建及其对大肠癌SW480细胞凋亡的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNAi沉默hTERT基因对人大肠癌SW480细胞荷瘤裸鼠的治疗作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的体内外实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 一条载体编码四个不同基因SHRNA质粒的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的体内实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题不足之处及未来临床展望 |
| 参考文献 |
| 综述 RNA干扰研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）靶向脱氧核酶抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表达的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：脱氧核酶抑制鼻咽癌EBV-LMP1 基因表达的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1 基因的表达 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV-LMP1 靶向脱氧核酶对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 EBV-LMP1 靶向脱氧核酶对裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤生长的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 课题创新性 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章 |
（6）采用RNAi抑制CUL5基因表达对连续照射期间CNE2细胞增殖状况影响的研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 CUL5的RNA干扰真核表达载体的构建 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二章 CUL5表达抑制的CNE2细胞株的建立及检测 |
| 引言 |
| 1. 材料及方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 照射后CUL5表达抑制的CNE2细胞株增殖情况的研究 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（7）含人端粒酶RNA突变体的端粒酶抑制剂筛选模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 实验材料与仪器 |
| 实验方法 |
| 第一部分 端粒酶RNA(hTR)基因的定点突变 |
| 第二部分 基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的构建 |
| 一、酵母菌L40 ura3/pHyblex/ZeoMS2表型及自激活性的检测 |
| 二、人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建 |
| 三、基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的初步构建 |
| 四、基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的后期筛选 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中英缩写对照表 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（8）病毒载体介导的微型核酶对犬贾第虫端粒酶活性的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 贾第虫病毒及载体研究进展 |
| 1 贾第虫病毒的研究进展 |
| 2 贾第虫病毒载体的研究进展 |
| 第二章 端粒、端粒酶的研究进展及与寄生虫的关系 |
| 1 端粒的结构与功能 |
| 2 端粒酶的研究进展 |
| 3 寄生虫端粒酶的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犬贾第虫病毒通用型转染载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 犬贾第虫端粒重复序列的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 犬贾第虫端粒酶活性的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 犬贾第虫病毒转染载体介导的微型核酶对 GcTERT 基因体外转录体切割效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 犬贾第虫病毒转染载体介导的微型核酶对端粒酶活性抑制效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 附录 蓝氏贾第虫和犬贾第虫端粒酶逆转录酶基因(TERT)序列比较 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
（9）RNAi对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性影响的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 端粒酶及其抑制剂的研究进展 |
| 第二章 RNAi 的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 chTR 的shRNA 表达载体的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 shRNA 对 MDCC-M581 细胞端粒酶活性影响的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（10）靶向hTERT基因的siRNA治疗胰腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA转染胰腺癌细胞BxPC-3及其沉默效应的研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA对胰腺癌细胞BxPC-3裸鼠皮下移植瘤生长抑制作用的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 胰腺癌基因治疗的研究进展 |
| RNA干扰与肿瘤治疗 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响（论文参考文献）
- [1]基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究[D]. 李睿. 厦门大学, 2018(06)
- [2]木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学, 2016(11)
- [3]RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究[D]. 蔡艳玲. 广西医科大学, 2011(09)
- [4]RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的体内外实验研究[D]. 宋英. 郑州大学, 2010(01)
- [5]靶向脱氧核酶抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表达的实验研究[D]. 柯霞. 重庆医科大学, 2010(02)
- [6]采用RNAi抑制CUL5基因表达对连续照射期间CNE2细胞增殖状况影响的研究[D]. 李烨. 广西医科大学, 2010(10)
- [7]含人端粒酶RNA突变体的端粒酶抑制剂筛选模型的构建[D]. 曹莹. 南方医科大学, 2009(01)
- [8]病毒载体介导的微型核酶对犬贾第虫端粒酶活性的影响[D]. 刘成武. 吉林大学, 2008(11)
- [9]RNAi对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性影响的研究[D]. 明宇. 吉林大学, 2008(10)
- [10]靶向hTERT基因的siRNA治疗胰腺癌的实验研究[D]. 谭晶. 昆明医学院, 2008(10)