一、腺病毒载体介导外源性端粒酶在组织工程种子细胞中的表达（论文文献综述）
田恬[1]（2020）在《Sema3A转染牙龈间充质干细胞对大鼠骨缺损修复的促进作用及相关机制研究》文中研究指明背景和目的临床上常见到骨缺损难以愈合的情况,如牙根周围大面积骨缺失导致牙齿的松动脱落,肿瘤或者外伤引起的颌骨缺损及病理性骨吸收导致牙槽嵴骨量的不足等情况,如何修复大面积的骨缺损仍是目前临床工作中亟待解决的难题之一[1]。目前骨缺损修复技术主要是利用组织或生物材料对缺损区进行重建,包括自体骨移植、异体骨移植和骨替代材料移植等方法。利用肋骨、髂骨等自体骨进行骨移植很难达到理想的骨形态修复,并且会带来自身组织损伤,可能出现供区感染等并发症。异体骨移植和骨替代材料移植的主要问题在于免疫排斥反应,其成血管化和成骨速度较慢。骨组织工程主要优势在于应用自身来源的自体细胞所带来的低感染性和低致癌性,免疫排斥反应小。然而,由于口腔内特殊的微环境和复杂多变的病因,目前还没有令人十分满意的骨再生方法。近年来,基因治疗技术与组织工程的迅猛发展为口腔颌面骨再生治疗提供了新思路[2,3]。种子细胞、生长因子、支架载体是传统组织工程学研究领域的主要内容,随着基因治疗技术的发展,克服了局部应用外源性生长因子的众多缺点,如实施过程复杂、成本高、半衰期短且易在体内被酶解、毒副作用、扩散较快难以维持有效治疗浓度等,通过外源性基因编辑的干细胞长期稳定的表达目的蛋白成为当前研究热点[4,5]。本课题组以原代培养的大鼠牙龈间充质干细胞（gingival-derived mesenchymal stem cells,GMSCs）作为体外实验的种子细胞模型,研究信号素3A（Semaphorin 3A,Sema3A）转染对GMSCs成骨向分化的促进作用及对破骨前体细胞活化的抑制作用,初步探讨其作用机制;并以Wistar大鼠颅骨骨缺损模型作为体内实验的动物模型,检测Sema3A修饰的GMSCs对大鼠骨缺损修复效能的影响,以期为临床治疗中口腔颌面骨组织再生提供科学依据。目前在口腔骨再生医学中应用广泛的干细胞主要有牙源性干细胞和非牙源性干细胞两大类。牙源性干细胞主要有牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）[6,7]、牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）[8]、GMSCs[9];非牙源性干细胞主要有骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells,BMSCs）[10]和脂肪干细胞（adipose stem cells,ADSCs）[11]。牙龈是口腔中的一种特殊组织,覆盖在牙槽嵴和磨牙后区,是口腔黏膜免疫和生物化学屏障的特殊组成部分。在生理状态下健康的牙龈组织表现出伤口愈合速度快和无瘢痕愈合的特点[12]。近年来研究发现来源于牙龈组织的间充质细胞具有临床应用潜能,与其他间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）相比,GMSCs具有取材方便且对机体的损伤小、易大量扩增、核型稳定等优点,使得GMSCs成为具有潜在实用价值的种子细胞[9],但亦有相反的研究报道指出,与PDLSCs相比,GMSCs体外矿化能力较弱,不利于骨组织再生,对于这一研究结果目前尚存争议[13,14]。信号素3A（Sema3A）是第一个在脊椎动物中被发现的信号素,其调控作用最为典型,在神经系统[15]、心血管系统[16]、肿瘤的发生及免疫调节[17]等生理或病理过程中发挥重要的作用。研究发现临床中患者颅脑外伤合并骨折的情况比单纯骨折时骨痂形成速度快,甚至对于不规则的颌骨骨折合并颅脑外伤时,骨愈合速度增快[18,19]。后期实验证明颅脑外伤时机体通过分泌多种细胞因子调节骨修复,其中Sema3A是目前研究较多的调节因子[20]。通过对Sema3A更深入的研究发现其在骨代谢方面也发挥重要调节作用[21-23]。我们通过文献研究发现,Sema3A基因敲除的实验小鼠出现骨发育不良的表现。局部注射Sema3A重组蛋白促进成骨的同时未见治疗区异常骨吸收,这些都表明Sema3A可能具有双向调节骨代谢的作用,促进成骨的同时抑制破骨[21,24]。目前广泛应用在组织工程中促成骨的生长因子包括骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）等,体外实验证实有效增强成骨相关基因的表达,诱导间充质细胞成骨向分化。然而,破骨细胞和成骨细胞之间相互偶联作用,BMP在促进骨形成的同时活化了破骨细胞进一步参与骨改建[25-27]。BMP多以蛋白形式结合支架材料或者结合缓释载体的方式作用于缺损区促进骨再生。应用蛋白作为促成骨因子就会面临蛋白降解、作用有效期、成本较高及产品稳定性等问题,而成骨的过程是一个长时间的作用过程,我们更需要促成骨因子的持续性供给。因此,我们假设:采用基因治疗的方法,通过病毒转染的方式把Sema3A基因整合到靶细胞中持续发挥促成骨分化作用的同时抑制破骨细胞活化,并通过体外和体内实验证实这一假设。基于以上认识,本课题首先体外分离纯化培养大鼠GMSCs（rGMSCs）,构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并成功转染rGMSCs,建立Sema3A修饰的rGMSCs体系,然后在体外矿化诱导条件下,研究Sema3A转染对rGMSCs成骨分化的影响并探讨其相关机制;其次,体外建立细胞间接共培养体系,检测Sema3A转染rGMSCs对破骨前体细胞分化的影响及探讨相关机制;同时构建Wistar大鼠颅骨骨缺损动物模型,进一步通过体内动物实验研究Sema3A修饰rGMSCs对骨缺损修复效能的影响,为其在口腔骨组织工程中的应用提供理论基础。实验方法1.Sema3A转染对rGMSCs成骨分化作用的影响1.1 rGMSCs分离培养及鉴定从山东大学动物中心购进的4周龄SPF级Wistar雄性大鼠数只,采用酶消化法从下颌磨牙颊舌侧牙龈组织中获得原代牙龈细胞,消化传代后利用有限稀释克隆法获得具有干细胞特性的牙龈间充质细胞进行传代培养。对纯化的rGMSCs分别进行克隆形成率（colony forming unit,CFU）分析、流式细胞术检测细胞表面分子表达,成脂诱导培养和成骨诱导培养并通过油红O染色和茜素红染色鉴定rGMSCs的多向分化潜能。1.2构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并转染rGMSCs设计Sema3A基因特异性引物并扩增,酶切目的基因和载体（pLenO-GTP）进行连接反应,转化连接产物到大肠杆菌DH5A中,质粒小提后重组酶切鉴定,质粒大提。病毒包装系统合并转染试剂加入293T细胞中,收集转染后的病毒上清液,超浓缩后-80℃保存备用。将rGMSCs以细胞密度为1×104个/cm2接种于96孔板中,细胞共分为3组:空白对照组、空载体组（Lv-NC组）、Sema3A转染 rGMSCs 组（Lv-Sema3A 组）,每组均设定 5 个感染复数（multiplicity of infection,MOI）值（MOI=30,50,80,100,120）,筛选慢病毒载体转染rGMSCs最佳的MOI值;用最佳MOI值计算病毒量并转染rGMSCs,通过荧光显微镜观察、流式细胞仪检测转染效率,Real-time PCR和Western blot方法分析Sema3A转染rGMSCs的可行性。1.3 Sema3A转染促进rGMSCs成骨分化的作用研究矿化诱导条件下,检测Sema3A转染对rGMSCs成骨分化相关因子ALP、Runx2、OCN的mRNA及蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,在倒置相差显微镜下观察细胞矿化结节形成情况,茜素红染色并应用十六烷基氯化吡啶将钙离子析出后用酶标仪检测吸光度值对细胞外基质中矿化结节的钙含量进行半定量分析。上述实验均重复至少三次,分析体外矿化诱导培养条件下Sema3A转染对rGMSCs体外成骨分化的影响。2.体外共培养体系下,Sema3A转染rGMSCs对破骨前体细胞分化的影响选择鼠源性的单核-巨噬细胞系（RAW264.7细胞）作为破骨前体细胞,体外构建间接共培养系统,将rGMSCs、Sema3A转染rGMSCs、空载体转染rGMSCs分别与RAW264.7共培养,siRNA降低Sema3A转染rGMSCs的Nrp1受体表达后与 RAW264.7 共培养,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色检测破骨细胞特异性分化情况;酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测不同时间点各组共培养液中Sema3A的含量;Real-time PCR 和 Western blot 检测共培养 RAW264.7 细胞中 RANKL、OPG 的mRNA和蛋白的表达水平。上述实验均重复至少三次。3.Sema3A修饰rGMSCs促进大鼠骨缺损修复的实验研究选择雄性8周龄SPF级Wistar大鼠55只,随机分组将大鼠分为5组,每组10只,余5只备用,实验分组:Sema3A转染rGMSCs和胶原载体复合物组;空载体转染rGMSCs和胶原载体复合物组;rGMSCs和胶原载体复合物组;胶原载体组;单纯骨缺损空白组。制备大鼠颅骨骨缺损动物模型,分别将各组细胞种植于胶原膜中,培养细胞-胶原膜复合物并移植入骨缺损处,胶原载体组放置等体积的胶原膜,严密缝合,空白组直接缝合。于常规喂养8周后采用心脏内灌注法获得颅骨标本,通过标本大体观察、X线检查、HE染色、Masson染色等方法观察各组骨缺损修复的效果。实验结果1.Sema3A转染对rGMSCs成骨分化作用的影响1.1 rGMSCs分离培养和鉴定rGMSCs原代培养3天后,倒置显微镜下观察细胞贴壁生长,分散且形态不规则,约4-5天左右长满皿底80%-90%,可传代培养。传代后细胞呈集落样增殖,形态单一为长梭形、多角形和不规则形态,CFU结果显示rGMSCs克隆形成率约为58%。用有限稀释法获得单克隆形成单位,扩大培养后得到具有自我更新能力的rGMSCs。流式细胞仪检测显示,CD44、CD90、CD29阳性表达,CD45、CD11b阴性表达。rGMSCs矿化诱导培养4周后茜素红染色可见实验组细胞外基质有红染矿化结节,常规培养的对照组未见明显改变。成脂诱导培养3周后油红O染色可见实验组细胞胞质内出现红染脂滴,常规培养的对照组未见明显改变。1.2构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并转染rGMSCsPCR扩增目的基因Sema3A CDS区域,PCR产物纯化后用BamHI/XbaI双酶切与相同酶切位点的载体（pLenO-GTP）连接反应,连接产物转化DH5A感受态,阳性克隆鉴定后质粒纯化抽提。将构建的携带Sema3A基因的载体、病毒包装系统共转染293T细胞,培养48小时后收集细胞上清液纯化、浓缩,获得病毒原液滴度为实验组:2.7× 109 TU/ml;空载体组:1.8×109 TU/ml。筛选病毒转染GMSCs最佳MOI值,用MOI=80转染rGMSCs经嘌呤霉素筛选后,流式细胞术检测转染效率达99%以上。Real-time PCR和Western blot结果显示,与空白对照组相比,LCv-Sema3A组Sema3A mRNA和蛋白的表达量显着升高。1.3 Sema3A转染对rGMSCs成骨分化的作用成骨诱导培养第3天、7天、14天,与空白对照组相比,Lv-Sema3A组成骨相关基因ALP、Runx2、OCN mRNA和蛋白的表达增高。成骨诱导培养28天,与对照组相比,茜素红染色显示Lv-Sema3A组矿化结节形成显着增多。十六烷基氯化吡啶将钙离子析出后用酶标仪检测吸光度值,半定量结果显示,与对照组相比,Lv-Sema3A组细胞外基质钙离子沉积量显着增多。2.体外共培养体系下,Sema3A转染rGMSCs对破骨前体细胞分化的影响建立细胞共培养体系后,加入含有30ng/ml可溶性RANKL的诱导培养液诱导培养5天后,应用TRAP染色检测空白对照组（RAW264.7组）、共培养组:RAW264.7-Control 组、RAW264.7-Lv-NC 组、RAW264.7-Lv-Sema3A 组 RAW264.7细胞分化情况。与空白对照组相比,共培养各组TRAP+的破骨细胞样细胞数均有减少;与RAW264.7-Control组相比,Sema3A转染rGMSCs显着抑制了 RANKL诱导下RAW264.7细胞TRAP+的破骨细胞样细胞形成;采用siRNA降低Nrp1受体的表达后,Sema3A转染rGMSCs对RANKL诱导下RAW264.7细胞破骨向分化的抑制作用显着减弱。ELISA检测诱导培养3天、5天、7天后共培养液中Sema3A 的浓度,与 RAW264.7-Control 组相比,RAW264.7-Lv-Sema3A 组培养液中Sema3A浓度显着增加且随着培养时间的延长而逐渐增加。Real-time PCR和Western blot结果显示,共培养组和单独培养RAW264.7组相比,RANKL mRNA和蛋白表达水平均降低,而OPG mRNA和蛋白表达水平均升高,OPG/RANKL的比值升高。与 RAW264.7-Control 组相比,RAW264.7-Lv-Sema3A 组 RANKL mRNA和蛋白表达水平显着降低,而OPG mRNA和蛋白表达水平显着升高,OPG/RANKL的比值显着升高。3.Sema3A修饰rGMSCs对大鼠骨缺损修复效能的影响。经标本大体观察、X线检查、石蜡切片HE染色、Masson染色分析,Sema3A修饰rGMSCs作为种子细胞的实验组大鼠骨缺损区有大量新骨生成,新生骨骨质致密、成熟,骨小梁排列整齐,修复效果明显优于对照组。结论1.构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并转染rGMSCs,使得rGMSCs稳定高表达Sema3A,Sema3A转染对rGMSCs增殖活性和成骨能力起正向调节作用。2.Sema3A转染rGMSCs抑制破骨前体细胞的活化,具体表现在共培养条件下,升高OPG/RANKL 比值,抑制RAW264.7细胞的破骨向分化;siRNA降低Nrpl受体表达后,Sema3A转染rGMSCs对RAW264.7细胞的破骨向分化的抑制作用显着减弱。3.Sema3A修饰rGMSCs可显着提高大鼠骨缺损的修复效果。
李钟奇[2]（2020）在《椎间盘退变关键标志物筛选及携载TGF-β3支架对椎间盘修复的实验研究》文中提出研究背景腰痛（Low back pain,LBP）是工业化国家的主要健康问题之一,是人致残的主要原因。LBP 与椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IDD）有关。椎间盘（intervertebraldisk,IVD）高度因退变而降低,改变了受影响脊髓节段的力学特性。这个过程加速了邻近节段和其他脊柱结构的退变,如小关节、韧带和肌肉等。IDD不仅影响IVD,还影响其周围组织,如肌肉和韧带,并影响脊柱应对日常生活中正常生理负荷的能力。从长远来看,IDD会导致腰椎管狭窄和随之而来的神经组织压迫。腰椎管狭窄是引起下腰部疼痛和神经性跛行的主要原因,尤其是老年人。考虑到现今社会生活水平提高和医疗卫生事业的发展,老年人口在逐年增加。老年患者往往还合并有骨质疏松,心脑血管等慢性疾病,因此这类患者LBP和IDD相关疾病的治疗问题变得更加困难。目前对IDD的治疗包括药物治疗、物理治疗等保守治疗和椎间盘摘除术、脊柱融合术、椎间盘置换术等侵入性治疗,但这些方法都不能恢复IVD的原有结构和功能。近些年,生物信息学的快速发展为研究IDD带来了机遇,它将统计学、数学、信息学和计算机科学的方法恰当的整合在一起来解决问题。生物信息学应用的主要领域包括:发现基因、预测基因表达、序列比对、蛋白结构比对、预测蛋白结构、预测蛋白间相互作用等。通过公共数据库检索方式,可以挖掘并验证与IDD相关的潜在基因与信号通路,以此从基因层面了解IDD的发病机制,并为IDD的预防和治疗研究提供新的思路和研究方向。近年来,以细胞为基础的组织工程对IDD的治疗已被证明是一种很有前景的治疗方法,应用组织工程学方法构建与IVD结构和功能相符的组织工程植入体,可以替代退变IVD并保留其力学运动范围,从而对退变的IVD结构进行重建和修复,使IVD功能得到恢复,达到治疗IDD的目的。纤维环组织工程就是以纤维环的再生和修复为目的的一种修复方法。通过筛选,应用新型的复合支架,即脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶作为纤维环损伤修复的支架材料,因其具有较好的生物相容性、可降解性及力学性能,并能携载和连续释放合适的生长因子,满足新生纤维环组织在不同阶段对生长因子的需求,最终达到修复受损的IVD的目的。第一部分:椎间盘退变关键标志物的筛选研究目的:本研究同时应用GSE56081和GSE124272这两个数据集去挖掘和验证与IDD相关的潜在基因与信号通路,为IDD的发病机制的研究提供新思路。研究方法:首先,对GEO数据库下载的GSE56081和GSE124272这两个数据集中的数据进行预处理,然后利用limma包提供的经典贝叶斯方法对IDD和Healthy两组的差异表达基因进行分析。随后,在毒性与基因比较数据库（CTD）中搜索疾病相关基因,并将搜索到的疾病相关基因与差异表达基因取交集,得到的交集基因被判断为疾病相关的差异表达基因。接着根据得到的疾病相关的差异表达基因,利用 DAVID 软件进行 Gene Ontology（GO）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。并且,利用STRING数据库对疾病相关的差异表达基因进行蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,筛选PPI网络中的hub蛋白,通过Cytoscape软件的MCODE插件筛查重要模块,并利用DAVID对重要模块进行KEGG通路富集分析。接着将PPI网络中筛选得到的hub基因与模块基因取交集作为关键基因,并将在GSE124272数据集中验证成功的基因作为marker基因。随后使用ROC曲线来证明得到的marker基因的诊断效能,最后使用基因集合富集分析（GSEA）对marker基因进行分析。研究结果:本研究共筛选出1184个差异表达基因,随后与CTD数据库中得到的2295个疾病相关基因取交集,共得到142个疾病相关的差异表达基因。富集分析结果显示,这142个疾病相关的差异表达基因共富集了 130个GO-biological process（BP）,18 个 GO-cellular component（CC）,28 个 GO-molecular function（MF）以及27条KEGG信号通路（最显着富集的为肿瘤坏死因子信号通路和HTLV-I感染）。随后,还对这142个疾病相关的差异表达基因进行PPI网络分析,结果共得到了 223个PPI关系对,包括83个编码蛋白,其中金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP1）连接度最高,并挖掘出1个关键的子模块,模块中包含的基因有基质金属蛋白酶2（MMP2）、I型胶原α2链（COL1A2）、SMAD家庭成员3（SMAD3）、SMAD家庭成员2（SMAD2）、转化生长因子β1（TGFB1）、Ⅳ型胶原α1链（COL4A1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、转录因子snail 1（SNAI1）、TIMP1、聚集蛋白聚糖（ACAN）。KEGG信号通路富集分析结果显示,模块共富集到16条信号通路,其中最显着富集到结肠直肠癌信号通路。接着,将模块基因与top20 hub基因取交集,共得到9个交集基因,其中ACAN基因在GSE56081和GSE124272这两个数据集中的相对表达水平上下调一致。因此,将ACAN作为marker基因。ACAN的ROC面积在两个数据集中均达到了 0.8以上,具有良好的诊断效能。最后,GSEA富集分析显示,ACAN富集到10条正相关的信号通路和9条负相关的信号通路,其中最显着的正相关信号通路是帕金森病通路,最显着的负相关信号通路是嗅觉传导信号通路。研究结论:HTLV-I感染和肿瘤坏死因子信号通路可能在IDD过程中发挥着重要作用;TIMP1基因可能通过HIF-1α信号通路调节髓核细胞凋亡在IDD过程中扮演重要角色;COL1A2可能通过血小板激活、黏着斑、PI3K-Akt信号通路在IDD过程中起作用;ACAN基因可能是诊断IDD的一个潜在治疗靶点,并通过帕金森病通路和嗅觉传导信号通路发挥重要作用。本研究为IDD的潜在标志物进行分析,并对疾病相关的差异表达基因进行富集分析,为探索IDD侵袭、增殖、凋亡等生物学行为的调控机制提供了新的观点,并可能为探索IDD的研究提供了新的线索。第二部分:携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶修复退变椎间盘的实验研究研究目的:运用脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶作为纤维环损伤修复的支架材料,通过包裹转化生长因子β3（Transforming Growth Factor-β3,TGF-β3）达到缓释效果,观察纤维环源干细胞在携载TGF-β3脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶的生长情况以细胞-基材复合体在体内外对退变纤维环修复情况,为构建IVD纤维环组织工程支架材料和细胞因子的选择提供一定的理论基础和实践依据。研究方法:首先从纤维环组织中分离并纯化纤维环源干细胞,检测其自我更新多向分化能力。接着制备携载TGF-β3脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶,并检测T GF-β3、细胞增殖、I型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan,ACAN）的基因表达情况。最后,采用磁共振成像（MRI）方法和做苏木精-伊红染色（HE染色）观察纤维环修复情况,以检测携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶在体内对IDD的修复作用。研究结果:从电镜图可以明显看到支架上孔结构比较大,孔与孔相连构成通孔,形成三维立体网状结构,并且。TGF-β3含量随时间的延长而增加,到第7天时达到峰值。在第1、3、5天,3组之间细胞增殖情况没有明显差异,但在第7天,携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶组的细胞增殖情况明显高于其他两组。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ和Aggrecan基因mRNA及蛋白表达水平在携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶组明显高于不携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶组。通过大鼠的体内实验,将所构建的携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶植入受损的IVD内,通过4周、8周MRI结果和4周HE染色结果分析实验组和对照组,表明携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶在体内对IDD有明显的修复作用。研究结论:所构建的携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶具有相互沟通的空隙,初步显示出携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶具有良好的结构性能;所构建的携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶对体外分离培养的纤维环源干细胞的生长、增殖无明显的抑制作用,并且纤维环源干细胞能在其表面及内部黏附、生长和增殖,初步显示出携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶具有良好的细胞相容性;所构建的携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶植入动物体内,4周及8周以后能够缓解椎间隙的狭窄和生物力学性能的降低,4周HE染色提示结构接近正常,初步显示出携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶对IDD具有良好的修复作用。
杨家祥[3]（2019）在《3D打印技术构建的新型复合组织工程骨修复骨缺损的研究》文中提出目的:通过3D打印技术打印的高孔隙率、可控孔隙大小的新型聚己内酯（PCL）支架结合具有高效成骨分化能力的载转BMP-7基因的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的富血小板血浆凝胶构建出的新型复合组织工程骨。探究新型复合组织工程骨在兔胫骨骨缺损的成骨效果,希望为大面积骨缺损的修复重建提供理论依据。方法:从新西兰大白兔的骨髓中体外分离兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并对其进行传代培养后分为A、B、C三组。A组为转染对照腺病毒的BMSCs（Ad-null）,B组为转染BMP-7基因过表达腺病毒的BMSCs（Ad-BMP-7）,C组为转染BMP-7基因沉默腺病毒的BMSCs（Ad-shBMP-7）。通过实时荧光定量PCR（RealtimePCR）、蛋白印迹法（Western blot）、茜素红钙染色（Alzarin-Red S）分别对正常BMSCs及A、B、C三组的OPN-mRNA和BMP-7-mRNA、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）、骨桥蛋白（OPN）和钙化结节数量及染色深度进行检测。采用Landersberg法制备富血小板血浆（PRP）,并与转染BMSCs混合后在激活剂的作用下通过双腔导管进行喷射混匀得到含有转染BMSCs的PRP凝胶组织。通过3D打印技术打印的高孔隙率、可控孔隙大小的新型PCL支架结合转染的骨髓间充质干细胞的富血小板血浆凝胶构建出的新型复合组织工程骨。将24只重量约3kg的兔子随机分为4组,每组6只,通过手术方式建立长约1cm的胫骨骨缺损模型。通过CT三维重建扫描获取个体化兔胫骨骨缺损的结构数据。根据得到数据,将熔融的PCL通过3D打印机打印出PCL支架。将载有转染BMSCs的PRP凝胶组织通过3D打印机灌注入PCL支架内构建新型复合组织工程骨。每组分别用不同的材料植入骨缺损处,A组:空白对照组;B组:自体骨重建;C组:支架+正常BMSCs建;D组:支架+转BMP-7基因的BMSCs重建,4组均进行胫骨小钢板固定。术后3个月4组兔子均处死并取出整段的胫骨,行缺损处Micro-CT扫描观察其成骨融合情况。结果:（1）经过Percoll密度梯度离心法获取兔BMSCs,经实验证明是兔子BMSCs。（2）实时荧光定量PCR检测:A、B两组BMP-7-mRNA值均高于C组,差异有统计学意义（P<0.05）,B组BMP-7-mRNA值高于A组,差异有统计学意义（P<0.05）;B组OPN-mRNA值均高于A、C组,差异有统计学意义（P<0.05）,A、C两组之间无明显差异（P>0.05）。（3）Western blot检测:A、B两组BMP-7及OPN值均高于C组,差异有统计学意义（P<0.05）,B组BMP-7及OPN值高于A组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）茜素红钙染色:镜下观察见B组的镜下茜素红染色深度及钙结节数量均比A、C两组高,A组的镜下茜素红染色深度及钙结节数量比C组高。在钙含量半定量测定结果中发现A、B两组钙含量均比C组高,差异有统计学意义（P<0.05）,B组钙含量稍高于A组,差异无统计学意义（P>0.0.5）。（5）三月后行兔胫骨Micro-CT结果:D、B两组的骨痂生成量明显优于其它两组,其中D、B两组骨痂生成量无明显差异。结论:（1）携带BMP-7基因的腺病毒载体可有效转染BMSCs,转染后的BMSCs可以大量表达OPN和BMP-7。（2）3D打印构建的PCL支架具有高孔隙率及可控孔隙大小,可以确保支架植入体内后能够获得良好的氧气、营养物质以及有利于新陈代谢物质排出。（3）3D打印构建的新型复合组织工程骨具有良好的骨诱导能力,可以代替自体骨移植。
王清富[4]（2013）在《聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染脂肪干细胞的实验研究》文中研究说明创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等原因所致的骨缺损临床常见。作为治疗骨缺损金标准的自体骨移植,由于存在取骨量有限和取骨区并发症,已不能满足骨缺损治疗的需要。组织工程学的兴起为治疗骨缺损带来了新的希望。骨组织工程利用具有成骨能力或潜能的种子细胞与生物材料在体外复合后植入体内,通过新生的骨组织修复骨缺损,是理想的治疗模式。组织工程有三大要素,即种子细胞、诱导因子和支架。其中种子细胞是其中最基本也是首要的环节。干细胞有自我复制及多向分化潜能,是组织工程最理想的种子细胞。目前干细胞的来源主要有骨骼肌卫星细胞、胚胎干细胞、骨髓来源的间充质干细胞等。骨骼肌卫星细胞含量较低,所需肌肉取材较难；胚胎来源的干细胞存在免疫排斥及伦理问题；骨髓间充质干细胞作为组织工程骨的种子细胞已被多数学者认可,以往骨组织工程种子细胞的研究多集中于骨髓间充质干细胞,但其存在数量少、取材困难、体外培养相对困难且易老化、病人不易接受等缺点。自从2001年Zuk等从人体抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第一次分离获得具有多向分化潜能的干细胞,即脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）以来,脂肪干细胞的研究成为继骨髓干细胞之后又一热点。研究表明ADSCs体外特定诱导条件下实现了向骨、软骨、脂肪、肌肉、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞以及肝细胞方向分化。ADSCs以其自体来源、容易获取、细胞充足、多向分化、基因稳定表达、自体移植无免疫排斥反应、不涉及医学伦理学问题等特点可能成是构建组织工程化骨组织较理想的种子细胞。诱导因子在是组织工程的三要素之一,目前骨组织工程诱导因子来源主要是三种途径：直接加入诱导因子、通过载体缓释诱导因子和基因治疗技术使靶细胞自身表达释放诱导因子等方面。前两者是单纯给予的外源性诱导因子,但组织工程研究中,细胞因子无论是从天然生物中提纯,还是用基因工程表达,均存在程序复杂,产量低,活性不稳定等缺点,因此如何有效发挥细胞生长因子适时、适量效用,利用细胞与基质材料特异性勃附,细胞增殖,定向分化,发挥正常的生理功能,以实现最终理想的功能替代,一直是组织工程研究的难点与热点,基因工程技术与组织工程的结合为以上问题的解决提供了可供选择的良好办法。基因技术在组织工程中的应用主要是将目标诱导因子的基因转染到种子细胞里使诱导因子持续释放,以满足种子细胞定向诱导分化的需要。诱导因子是干细胞定向分化的决定性影响因子,骨形态发生蛋白（bone morp-hogenetic protein, BMP）是转化生长β超家族成员,目前已发现共有20多种亚型,BMP-2是特异性的骨生长因子,是目前已知能单独诱导干细胞成骨分化的诱导因子,也是公认活性最强的成骨诱导诱导因子之一。其基因重组产品rBMP-2是唯一获美国食品药物管理局批准可用于临床的成骨诱导因子。但这种外源性诱导因子rBMP-2具有诸多弊端,如易扩散、降解快、半衰期较短、用量大、价格昂贵等,极大地影响其成骨效应的发挥,限制了其在临床上的广泛应用。利用基因转染技术通过BMP-2基因修饰种子细胞,使其内源性地表达,从而克服上述缺点,可望解决骨组织工程的难题之一—诱导因子问题基因转染技术的应用涉及到一个关键的问题是如何选择合适的基因转染载体。目前常用的转基因载体包括病毒载体和非病毒转基因载体两大类。其中病毒载体在目前的科研工作和临床试验中是主要使用的载体。但是病毒载体具有一些难以克服的缺陷,如制备复杂、靶向特异性差、高免疫原性、体内不能重复使用、可能导致感染的潜在危险和引起细胞恶性转化等,上述这些缺陷,限制了以病毒载体在临床上的实际应用。所以近年来有越来越多的研究者将视线放在了非病毒载体上面。非病毒载体具有成本低、制备相对简单、容易批量生产、携带遗传物质容量大、安全性好等优点,但也有转基因效率相对低下、本身并无特异细胞或组织靶向性等缺点。聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）是一种新的多聚阳离子型的基因载体,作为一种转基因效率相对较高的非病毒载体,已经成为非病毒载体领域衡量其他类型载体效率的一个“金标准”。本课题以PEI为基因转染载体,ADSCs作为种子细胞,将诱导因子BMP-2基因转染到靶细胞ADSCs中,使其持续分泌诱导因子BMP-2,进而诱导种子向成骨细胞分化,为进一步构建组织工程骨,治疗骨缺损、骨不连等疾病奠定理论基础和实验依据。本课题分三部分进行。第一部分为兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）的基本生物学特性及其多向诱导分化的实验研究。对ADSCs进行体外分离培养及传代扩增,探讨兔ADSCs理想的体外培养方法；观察其原代及传代细胞的形态及生长特点,探讨ADSCs生物学特性；对其表型特征进行鉴定,以及体外传代培养和成骨分化诱导对其表型的影响。探讨体外传代培养对ADSCs增殖分化及凋亡的影响。对第3、6代ADSCs行成脂、成骨诱导分化,评价ADSCs多向分化潜能,进一步确认其干细胞的属性,并探讨ADSCs体外定向诱导成骨分化潜能,为ADSCs作为骨组织工程种子细胞提供理论依据。第二部分为PEI介导基因转染兔ADSCs的实验研究。观察PEI （13KDa,高分枝）对兔ADSCs的毒性大小,观察PEI不同浓度、不同时间点下ADSCs存活率,对PEI作为ADSCs基因载体的安全性进行评价；观察PEI微粒、PEI和DNA混合物微粒的微观形态,评估PEI与DNA质粒的相容性,并探讨PEI与DNA质粒结合的最佳N/P比值（即PEI所含氨基氮与DNA所含磷酸基团的摩尔数比）；检测PEI介导增强绿色荧光蛋白（pEGFP）基因转染ADSCs的转染效率,观察不同N/P比值对转染率的影响,探讨获得最高转染的最佳N/P比值；从而评估PEI作为基因载体转染ADSCs的可行性及效率,为ADSCs基因转染寻找较为理想的基因转染载体,为下一步ADSCs成骨研究提供理论依据。第三部分为PEI介导BMP-2基因转染兔脂肪干细胞的实验研究。BMP-2是公认的最强的也是唯一单独诱导干细胞成骨分化的细胞因子。构建真核表达质粒pEGFP-N1-BMP-2,以PEI为基因载体介导BMP-2基因转染ADSCs,检测转染后基因表达,分析PEI介导BMP-2基因转染ADSCs的可行性、转染的稳定表达、转染效率以及转染对ADSCs生物学特性的影响,评估PEI为基因载体介导BMP-2基因转染ADSCs的成骨分化效果,为了进一步研究非病毒载体PEI介导的BMP-2转染ADSCs在动物体内成骨修复的作用,从而探讨利用基因技术在骨组织工程种子细胞自身表达细胞因子BMP-2诱导下兔脂肪干细胞成骨分化的效果,为进一步构建组织工程骨,治疗骨缺损、骨不连等疾病奠定理论基础和实验依据。第一部分兔脂肪干细胞的基本生物学特性及其多向诱导分化的实验研究目的：探讨脂肪干细胞的分离培养方法及其基本生物学特性,并对细胞表型进行鉴定,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法：从成年日本大耳白兔的颈背部分离脂肪组织,通过I型胶原酶消化法获取原代ADSCs并培养,待细胞生长至约80%融合时传代,用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况和形态特征,研究其增殖过程,描绘其生长曲线；流式细胞技术检测细胞表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45的表达及其变化,分析其表型特征；将ADSCs行成骨和成脂诱导,分别通过ALP、茜素红、VonKossa（钙结节）染色和油红。染色检测ADSCs成骨分化潜能和成脂分化潜能,未诱导组作为对照组。结果：体外培养的脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈“S”型。流式细胞仪检测第3、6代ADSCs均高表达CD29、CD44,阳性率超过90%；低表达CD34、CD45阳性率不超过5%,且CD29、CD44随着传代表达逐渐增高,CD34、CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、vonKossa染色阳性,成脂诱导实验组油红。染色阳性,对照组均为阴性。结论：兔脂肪干细胞在体外易于分离培养,保持稳定增殖,并表达间充质干细胞相关的表型,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。有望成为骨组织工程理想的种子细胞。第二部分聚乙烯亚胺介导基因转染兔脂肪干细胞的实验研究目的：探讨非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI,13KDa,分支型）作为载体介导基因转染脂肪干细胞的可行性。方法：检测不同浓度下PEI对脂肪干细胞的毒性。以PEI为载体,不同N/P值下将增强绿色荧光蛋白基因转染脂肪干细胞,荧光显微镜下观察转染后48h小时转染效果,计算各N/P值下的转染效率,并以Iipofectamine2000转染作为对照组。结果：当PEI浓度在50μ g/ml以内,其对脂肪干细胞的毒性极小,细胞存活率90%以上,浓度100μ g/ml以上时,PEI细胞毒性明显增加；不同的N/P值转染效率不同,当N/P<6,比值增大转染效率随之增高；当N/P值为6时转染效率最高,此后转染效率随比值的升高而下降。结论：PEI是一种低价、安全、实用、高效率的基因转染载体,可用于脂肪干细胞基因转染。第三部分聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染兔脂肪干细胞的实验研究目的：分析聚乙烯亚胺作为载体介导骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因转染脂肪干细胞（ADSCs）的基因表达,评估转染后细胞的成骨分化效果。方法：取成年日本大耳白兔的颈部脂肪,经体外分离培养的方法获得ADSCs,并对其进行表型鉴定,明确其脂肪干细胞的属性,用聚乙烯亚胺介导BMP-2基因转染至脂肪干细胞,G-418筛选获得阳性细胞克隆。RT-PCR检测mRNA表达,ELISA法BMP-2蛋白表达分泌,western-bloting法检测骨钙素和Ⅰ胶原蛋白的含量,碱性磷酸酶定量检测,并行茜素红染色,未转染组作对照。结果：从兔脂肪组织中分离出来的第3、6代ADSCs均高表达CD29、CD44,阳性率超过90%；低表达CD34、CD45阳性率不超过5%,且CD29、CD44随着传代表达逐渐增高,CD34.CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低；转染细胞有BMP-2mRNA的转录及其蛋白的表达分泌,碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ胶原蛋白的含量增加,茜素红染色呈阳性反应,对照组阴性。结论聚乙烯亚胺可介导BMP-2基因转染兔脂肪干细,BMP-2基因在ADSCs中有效表达并诱导其定向成骨分化。
周诺[5]（2012）在《PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究》文中研究指明目的牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）技术是利用骨痂的愈合机理产生新骨,是一种内源性的骨组织工程学技术。自其开始应用于颅颌面领域以来,大量基础和临床研究逐渐开展,随着基础研究的深入以及该技术的改进和成熟,牵张成骨在颌面部整形、肿瘤的术后重建以及牙槽种植修复等方面展现出了广阔的应用前景,成为口腔颌面外科领域的研究热点。虽然DO有许多传统手术不可比拟的优势,已被广泛地应用于各种颅颌面的畸形以及四肢短小畸形的矫治,但其较长的牵张和固定时间,限制了其在临床上的广泛应用。因此如何提高DO的新骨形成的速度,缩短其固定时间,减少其并发症的发生和保证新骨形成质量,正成为目前该领域的研究热点。本课题利用hBMP-2作为促进因子,将基因工程和组织工程的技术结合起来,先把hBMP-2转染入兔BMSCs,构建稳定表达hBMP-2的BMSCs,再与组织工程支架材料Pluronic F-127复合,注射入牵张区内,使hBMP-2能在牵张区内稳定持续地起作用,拟让其能促进兔下颌骨的牵张成骨新骨生成。从组织学水平、蛋白水平、基因水平观察和检测牵张间隙内新骨的形成以及改建的情况,为牵张成骨技术在治疗各种颌面部畸形或骨缺损等疾患上的广泛应用奠定基础。方法1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化:取成年健康新西兰大白兔,穿刺双侧胫骨抽取骨髓,通过密度梯度离心法收集细胞后培养,原代培养8-10d后传代培养,按照1:3传代,每3-4天可传代1次,传到第3代时用地塞米松,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸配制而成的成骨诱导分化液进行成骨诱导14至21天,并分别用茜素红染色,ELISA以及免疫组化的方法检测其矿化结节的形成和ALP、BGP的表达。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs:取第3代BMSCs,用脂质体介导携带hBMP-2基因的pcDNA3.1质粒转染入BMSCs中,观察GFP表达的情况,MTT法检测转染后细胞的增殖和生长的能力,通过RT-PCR检测瞬时转染后hBMP-2 mRNA的表达。转染后再用G418筛选2周,筛选出稳定转染的阳性细胞,收集备用。将经过筛选后的BMSCs培养4周后,对其进行BMP-2的免疫组织化学以及Western Blot检测。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养:利用Pluronic F-127低温下为水溶液,室温可凝固的特点,冰浴中制备凝胶并消毒后与转染hBMP-2的BMSCs复合,调整细胞浓度,使细胞浓度达到2.5×107个/ml,MTT法检测Pluronic F-127的细胞毒性。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型的建立:取成年健康新西兰大白兔6只,依据其下颌骨的解剖结构设计牵张器。利用传统单线骨皮质切开的术式,在右侧下颌骨第二和三磨牙间行骨切开术,固定牵张器。术后潜伏期为5天,第6天开始牵张,每天牵张2次,每次0.5mm,共牵张7mm,随后固定。于牵张固定2周、6周后分别摄X线片以观察新生骨愈合以及改建情况。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究:取健康新西兰白兔48只随机分为4组,每组12只,于固定期第2天进行干预。实验分组:A组:牵张间隙内注射200 u 1 hBMP-2基因修饰的BMSCs/Pluronic F-127凝胶复合物;B组:注射200μ1 hBMP-2基因修饰的BMSCs液;C组:注射200μ1 BMSCs液;D组:注射200μ1生理盐水。分别于牵张结束固定2w、6w各组处死动物6只,通过大体病理、摄X线片、扫面电镜、HE染色组织切片、免疫组化等手段检测新骨形成和改建情况。结果1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化结果:BMSCs培养8-10d后即可长满瓶底,并可传代,传代后细胞生长状态良好,可一直维持BMSCs的典型形态以及生长状态,细胞呈现长梭形形状,旋涡式的排列并可成功向成骨方向诱导。其中钙结节茜素红染色见阳性结节染色。ALP含量逐渐升高,并在2周后达到最高,与未诱导组有显着差异（p<0.05）。BGP免疫组化也呈阳性染色。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的结果:利用脂质体介导携带hBMP-2的pcDNA3.1质粒成功转染BMSCs,转染效率约30%;转染24h能观察到弱荧光表达,48h后荧光强度增强;MTT法显示转染后的BMSCs生长增殖能力无明显变化;RT-PCR也检测到了hBMP-2 mRNA的表达。用G418成功筛选出稳定转染的细胞,该细胞培养4周可用免疫组织化学以及Western Blot方法检测到BMP-2蛋白地稳定表达。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的结果:Pluronic F-127在4℃时为水溶液,37℃下为凝胶状,其与转染hBMP-2基因的BMSCs复合后,MTT检测结果见复合物中的BMSCs生长增殖能力无明显变化（p>0.05）。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的结果:所有的实验动物都成功地完成了手术,术区与口内无穿通,无感染,并能顺利牵张。实验动物全部存活至预定时间,体重皆有不同程度地增加。从手术至取材,应用于体内的牵张器均固位良好,无断裂以及脱钉现象。X线片见新骨形成在时间段有明显变化,符合临床上牵张成骨的成骨规律。动物模型构建成功。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究结果:通过大体病理、X线、扫描电镜和HE染色组织切片观察,新骨形成质量由高到低排列为:A组>B组>C组=D组;通过免疫组化观察并经过灰度值统计软件分析,在固定期第2周和6周A组牵张区骨质量明显高于B组（p<0.05）,B组牵张区骨质量明显高于C组与D组（p<0.05）,在各期C、D两组间无明显差异（p>0.05）。结论1.密度梯度离心法简便、易行,可大量扩增、纯化兔骨髓间充质干细胞,所获细胞经过诱导后可向成骨细胞分化。2.通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因导入BMSCs,并使其获得基因及蛋白的表达。3.组织工程支架材料Pluronic F-127具有低温下为水溶液,室温可凝固的特点,细胞相容性良好。4.兔子不仅性情温顺,饲养方便,对手术耐受性好,易于操作,而且术后愈合效果好,是一个稳定可靠的实验模型动物,可适合较大样本的实验研究。5.hBMP-2基因修饰BMSCs复合可注射骨组织工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成,为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供了一定的理论依据以及技术参考。
黄俊俊[6]（2012）在《pAd-bFGF-GFP转染兔骨髓间充质干细胞与脱细胞支架体外构建组织工程韧带的实验研究》文中研究指明目的非常严重的韧带损伤无法自行修复，往往需要韧带的重建。但无论自体或异体的韧带移植物及合成材料均不能取得满意结果。组织工程学的兴起为韧带重建提供了一条新的途径。组织工程学韧带构建包括建立韧带形态的支架结构，培养种子细胞并在支架上生长和产生细胞外基质，对原来的支架进行改建，最终形成具有自我更新和修复能力的韧带组织。脱细胞韧带支架通过脱去细胞成分，基本消除了免疫源性，同时保留天然韧带的形态和结构，生物力学性能未受影响。作为一种天然支架材料受到广泛关注。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal cells，BMSCs）是目前比较热门的种子细胞，体外能快速扩增。有实验表明碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可促进骨髓间充质干细胞生长和分泌韧带特异性细胞外基质。通过转基因治疗基因转导入生长因子基因并在体内改良种子细胞及改变体内微环境来促进器官组织的形成，是目前组织工程中研究的热点。本研究利用腺病毒载体将碱性成纤维细胞生长基因转入骨髓间充质干细与脱细胞韧带支架复合培养共同构建组织工程韧带。方法1．分离、培养兔BMSCs和韧带成纤维细胞（ligament fibroblast，LF）。并对BMSCs细胞进行鉴定分别通过骨髓穿刺Ficoll密度梯度离心法和组织块培养法分离兔骨髓间充质干细胞和髌韧带成纤维细胞。MTT法检测两种细胞的增殖活性。通过成骨，成软骨，成脂肪细胞多向分化能力的测定来鉴定BMSCs。2．Gateway技术构建携带人bFGF基因的重组腺病毒载体（pAd-bFGF-GFP）构建只需两步：BP反应构建入门克隆，LR反应创建表达克隆。表达克隆在293细胞包装成目标腺病毒。测定病毒滴度。扩增腺病毒载体转染293细胞后realtimeRT-PCR及westernblot检测bFGF的表达。3.pAd-bFGF-GFP转染兔骨髓间充质干细胞后测定培养液中bFGF的表达和对细胞增值及分泌细胞外基质的影响及与韧带成纤维细胞的比较携带bFGF基因的腺病毒用不同MOI值来转染兔骨髓间充质干细胞，通过流式细胞仪检测转染效率。 MTT法检测转染后骨髓间充质干细胞增殖来确定最佳MOI值。以最佳MOI值转染骨髓间充质干细胞，ELISA检测bFGF蛋白表达、分泌趋势。将携带bFGF目的基因腺病毒转染的BMSCs（pAd-bFGF-GFP.BMSCs）、LF，BMSCs，转染空病毒的BMSCs（pAd-GFP-BMSCs）进行MTT细胞增殖比较。Realtime RT-PCR检测bFGF对BMSCs表达Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ、波形蛋白（Vimentin）在mRNA水平的影响。4．韧带脱细胞处理，并进行组织学及生物力学检测；1%DCA法进行韧带脱细胞处理。将pAd-bFGF-GFP.BMSCs,LF， BMSCs，pAd-GFP-BMSCs种植脱细胞韧带支架，MTT法检测种子细胞在脱细胞支架上的黏附、生长、增殖情况。Realtime RT-PCR检测种子细胞Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ和Vimentin蛋白mRNA水平的表达。组织学切片，冰冻切片和共聚焦显微镜观察pAd-bFGF-GFP.BMSCs在支架的生长分布情况。生物力学检测体外复合培养对韧带机械性能的影响。结果1．分离培养的BMSCs与LF在大体形态学上相似，均表现为长梭形、漩涡样生长。MTT检测结果显示BMSCs的增殖活性明显优于LF。BMSCs具有向成骨，成脂肪，成软骨多向分化能力。2．成功构建了携带人bFGF基因的质粒，对重组质粒进行PCR鉴定和基因测序表明成功合成和整合了人bFGF基因。用重组质粒腺病毒载体系统成功构建了重组腺病毒pAd.bFGF-GFP。通过在293细胞内的扩增，我们得到了高滴度的病毒,滴度测定为（4.85×109ifu/ml）。realtime RT-PCR及Western-blot证实目的基因bFGF在基因水平和蛋白水平高效表达。3．腺病毒对BMSCs细胞有很高的转染效率，MTT结果显示MOI值为200时，BMSCs细胞具有最强的增值能力。ELISA检测显示：转染后48h bFGF就已经显着表达，分泌高峰出现在第7天，此后逐渐下降,2周时仍检测到。pAd-bFGF-GFP转染BMSCs与其他细胞相比具有更强的细胞增值能力。培养2周后Realtime RT-PCR检测显示Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA表达均显着高于其他组。VimentinmRNA表达与LF相当。4． MTT法检测显示种子细胞与脱细胞支架复合培养后bFGF基因转染骨髓间充质干细胞后能明显促进细胞生长。Realtime PCR显示pAd-bFGF-GFP转染BMSCs的Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ表达均显着高于其他组。Vimentin mRNA表达与成纤维细胞相当。HE染色和冰冻切片共聚焦显微镜观察pAd-bFGF-GFP-BMSCs在脱细胞韧带纤维间生长良好，呈梭形生长。生物力学检测显示复合培养脱细胞韧带与未培养韧带相比最大应力没有差别，弹性模量降低。结论1．成功分离培养获得兔骨髓间充质干细胞和韧带成纤维细胞，并通过分化培养鉴定确认获得具有多向分化能力的BMSCs。成纤维细胞的获取创伤较大。2．成功构建了携带人bFGF基因的高滴度缺陷型重组腺病毒。3．转染bFGF基因的BMSCs细胞能持续分泌bFGF至少两周，具有很强的增值能力和表达韧带特异性细胞外基质蛋白mRNA能力，优于韧带成纤维细胞和BMSCs细胞和转染空病毒的BMSCs细胞，4．体外转基因BMSCs能在脱细胞韧带上良好生长，并能大量表达韧带特异性的基质蛋白mRNA，优于韧带成纤维细胞和BMSCs细胞和转染空病毒的BMSCs细胞，生物力学性能基本保留。
仲伟俍[7]（2010）在《转基因同种异体组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究》文中提出目的：应用逆转录病毒载体将外源性人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因整合到兔关节软骨细胞的基因组中,使其获得永生化,并对其生物学特性进行研究。以基因转染得到的永生化软骨细胞为种子细胞,复合骨基质明胶（Bone Matrix Gelatin, BMG）构建组织工程软骨,对其修复兔关节软骨缺损的能力进行评价,从而探讨转入hTERT基因的永生化软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性及BMG作为软骨组织工程支架材料的优越性。方法：1.分离、培养兔关节软骨细胞并对其特有表型进行鉴定。通过阳离子脂质体将pLEGFP-C1-hTERT质粒与pVSV-G质粒共转染GP2-293包装细胞,并对转染后72小时内收集到的病毒上清进行浓缩,再感染分离得到的第2代兔关节软骨细胞,并观察转染后GP2-293细胞和软骨细胞绿色荧光蛋白GFP的表达。使用NIH3T3细胞对病毒原液和浓缩液进行病毒滴度测定,并比较前后的变化。使用含有G418的培养液筛选被病毒浓缩液感染后的关节软骨细胞,将得到的克隆扩大培养,并采用RT-PCR法检测扩增细胞内hTERT基因的表达。扩增后的软骨细胞在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况,绘制细胞生长曲线和计算群体倍增时间来探讨转入hTERT基因对细胞增殖的影响。通过RT-PCR法和免疫组化染色来评价转入hTERT基因后软骨细胞表型的变化情况和细胞因子BMP-4对转染后软骨细胞表型的影响。最后通过平板克隆形成实验观察转入hTERT基因后对软骨细胞转化倾向的影响。2.制备兔骨基质明胶BMG,将得到的BMG修剪后冻干,环氧乙烷灭菌后置于-80‘C保存备用。将永生化软骨细胞复合BMG生长,制备成细胞-载体复合物,并分别采用RT-PCR法和免疫组化法检测细胞复合BMG生长3天后Ⅱ型胶原的表达情况。8只雄性新西兰兔随机分成A、B两组,建立双侧股骨滑车关节面软骨缺损的模型,每个膝关节均有两处软骨缺损,包含实验组和对照组。A组：实验组为永生化软骨细胞复合BMG（A1）,对照组为空白BMG（A2）;B组：实验组为永生化软骨细胞复合BMG（B1）,对照组为第2代软骨细胞复合BMG（B2）.分别于术后6周和12周取材,行大体观察和Moran大体评分。结果：1.得到的兔关节软骨细胞以多角形和三角形为主,胞浆丰富,具有良好的折光性,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色结果均呈阳性。通过pLEGFP-C1-hTERT质粒与pVSV-G质粒共转染GP2-293包装细胞,细胞内可见绿色荧光蛋白GFP表达,收集到的病毒上清液经浓缩后病毒滴度明显提高。浓缩病毒液感染兔关节软骨细胞72小时后见软骨细胞胞浆中有成片黄绿色荧光蛋白表达。经G418筛选4周后最终得到克隆并将其扩增,已经连续传至25代,初步建立了永生化软骨细胞系。而未经转染的第2代软骨细胞经G418筛选1周后全部死亡。通过RT-PCR法能够检测到永生化软骨细胞的hTERT基因在mRNA水平的表达。体外连续培养中,永生化软骨细胞增殖活力提高,生长速度加快,群体倍增时间缩短,而细胞体积缩小并逐渐拉长,呈长梭形或放射状排列,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色呈阴性,RT-PCR法几乎检测不到Ⅱ型胶原的mRNA表达,标化后的灰度值明显低于正常第2代软骨细胞组和加入BMP-4的永生化软骨细胞组（P<0.05）。转入hTERT基因的软骨细胞在体外贴壁生长的过程中具有接触抑制性,克隆形成率仅为5.8%,远低于Hela细胞的克隆形成率,不具备恶性转化倾向。2.制得的BMG呈疏松多孔隙的海绵状结构,具有一定的韧性和强度,易被修剪成各种需要的形状。去分化的永生化软骨细胞复合BMG体外培养3天后,Ⅱ型胶原能够重新被翻译、表达。手术后6周和12周A1、B1、B2均由软骨样组织修复,关节面完整,修复组织与周围正常软骨整合满意,而A2软骨缺损处凹陷,其内有少量灰白色透明样物质填充,周围界限清楚。Moran大体评分结果显示在两个时间点实验组（A1、B1）、正常阳性对照组（B2）评分结果均明显优于空白BMG对照组（A2）,差异具有统计学意义（P<0.05）。术后6周,实验组（A1、B1）及正常阳性对照组（B2）评分差异不具有统计学意义（P>0.05）；术后12周,实验组（A1、B1）优于正常阳性对照组（B2）,有统计学意义（P<0.05）。术后12周各组的得分均高于各自术后6周的得分（P<0.05）。结论：1.通过转入外源性hTERT基因建立了永生化软骨细胞系,关节软骨细胞在体外培养的寿命显着延长。2.永生化软骨细胞在体外单层培养的过程中表型逐渐丢失,细胞因子BMP-4可以使永生化软骨细胞的表型得到维持。3.BMG可作为种子细胞的良好载体,并可以诱导去分化的永生化软骨细胞重新分化。4.hTERT构建的永生化关节软骨细胞作为软骨组织工程的种子细胞具有可行性。
王超锋[8]（2010）在《异体椎间盘复合表达外源性hBMP7因子的髓核细胞构建组织工程椎间盘的实验研究》文中研究表明椎间盘退变是引起成人腰腿痛、颈肩痛的主要原因。随着人均寿命的延长和社会工作压力增大,椎间盘退变性疾病的发病率明显升高,而目前的保守治疗和外科手术治疗均不能从根本上,解决患者的病情。通过动物实验及临床初步应用证明,椎间盘移植后可以异体存活,并能完全缓解患者的临床症状,就其生物力学方面亦可满足生理活动需要,但植入的异体椎间盘在生化代谢及组织学上有明显的退行性改变,这将导致临床症状的再次出现,并可能出现椎间盘活动度消失等并发症。最近的研究结果显示椎间盘内细胞活性的提高能延缓甚至阻止椎间盘退变性改变。因此本实验拟通过以异体椎间盘为支架材料,以表达外源性人BMP7的髓核细胞为种子细胞,体外构建组织工程椎间盘,并观察组织工程椎间盘的生物活性及功能情况。1.深低温储存温度及时间对异体椎间盘生物活性的影响目的:探讨不同的深低温储存温度及储存时间对异体椎间盘生物活性影响,获得最适合临床应用的保存条件。方法:取犬椎间盘52只,分为对照组、液氮保存组和-80℃保存组。在冷冻保存液中分别储存于液氮及-80℃低温冰箱中,在储存的2w、1m、2m、4m、6m及12m时,通过EB/FAD法检测椎间盘组织中不同部位的细胞存活率,以DMMB法检测髓核组织蛋白多糖（PG）含量,以羟脯氨酸法检测髓核组织中的总胶原含量。结果:各检测时间点两组间外层纤维环细胞活性明显高于内层纤维环及髓核组织（p<0.05）,内层纤维环及髓核组织间细胞活性未见明显不同;在内层纤维环及髓核组织中,细胞存活率在储存2w时,可见液氮组明显高于-80℃组（p<0.05）,自储存1月起至12个月,两组间均无明显差别（p>0.05）。在储存期间两储存组蛋白多糖含量均逐渐降低,在1m至12m储存期间,液氮保存组蛋白多糖含量均高于-80℃保存组。而两组间总胶原蛋白含量在储存期间随时间逐渐降低,但两组间未见明显差异。结论:利用液氮保存椎间盘组织,无论在细胞总的存活率及PG含量上均优于-80℃,1年的液氮保存期间,细胞存活率及功能蛋白PG含量均在一个恒定的水平,能满足异体椎间盘移植的基本要求,可作为组织工程椎间盘的支架材料。2.重组腺相关病毒人BMP7（rAAV2-hBMP7）病毒载体的构建及鉴定目的:探讨能否利用pSNAV2.0质粒构建系统构建pSNAV2.0-hBMP7穿梭质粒,并包装纯化成可供实验用rAAV-hBMP7病毒载体。方法:利用AgeI和NheI酶切pDC316-hBMP7-IRES-EGFP质粒,回收纯化hBMP7基因片段,以AgeI和NheI酶切载体质粒pSNAV2.0-LacZa,回收纯化pSNAV2.0载体质粒片段,利用T4 DNA连接酶将纯化回收的hBMP7基因与pSNAV2.0载体质粒片段连接构建,并转化入感受态大肠杆菌DH-5α进行扩增纯化,测序鉴定;用Lipofectamine 2000将序列正确的pSNAV2.0- hBMP7质粒转染至BHK-21细胞,G418选择培养,并大量扩增至所需并用HSV1-rc/ΔUL2辅助病毒感染,以PEG8000/NaCl沉淀,以氯仿纯化浓缩、检测滴度及纯度。结果:成功构建了pSNAV2.0- hBMP7质粒,经PCR、酶切和测序鉴定构建正确。利用Lipofectamine 2000将序列正确的pSNAV2.0- hBMP7质粒转染至BHK-21细胞,并通过含有G418的培养基,选择性扩增,并浓缩纯化出了滴度达5.1×1011 v.g、纯度>97%的rAAV-hBMP7病毒载体。结论:利用pSNAV2.0质粒包转系统能成功将外源性基因hBMP7包装成滴度及纯度满足实验要求的rAAV-hBMP7病毒载体。3.介导人骨形成蛋白-7的2型腺相关病毒转染髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响目的:以介导外源性人骨形成蛋白-7（hBMP7）基因的2型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus type-2,rAAV2）载体转染犬髓核细胞（canine nucleus pulposus cell, cNP cell）,观察转染后髓核细胞hBMP7蛋白表达,并分析髓核细胞生物功能变化。方法:实验组以最佳感染复数（MOI）1×105 vg/cell转染犬髓核细胞,对照组以相同MOI的不含hBMP7基因的rAAV2-EGFP病毒感染。在转染后4d、7d和14d分别以RT-PCR、Wenstenbloting方法分别对两组髓核细胞中hBMP7的mRNA转录及蛋白表达进行检测。在转染后的第7天,检测两组细胞增殖能力。在转染后的4、7和14d,利用real-time PCR、DMMB及Elisa法分别检测蛋白多糖、Ⅰ和Ⅱ胶原的mRNA含量、蛋白多糖含量及Ⅰ和Ⅱ型胶原蛋白含量。结果:在以1×105 vg/cell转染犬髓核细胞后,在4d、7d和14d时均可检测到实验组髓核细胞中高表达hBMP7 mRNA,而对照组,无论在何时间点均不能检测到hBMP7 mRNA的转录,半定量分析显示,7d时mRNA含量较高。Westenbloting蛋白检测结果显示:7d、14d时,实验组均可检测到分子量为55kd特异性hBMP7蛋白的表达,而对照组均未观察到阳性蛋白条带。半定量分析显示:转染后7d时hBMP7蛋白含量相对较高。在转染7天后,转染组与未转染组细胞增殖能力未见明显区别。对实验组髓核细胞的Real-time PCR定量分析发现:蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA在转染后第4天无明显增加,但在第7天和14天均明显增高。而Ⅰ型胶原mRNA在4、7和14天均未见明显变化。实验组蛋白多糖含量第4天未见明显变化,而第7、14天较对照组分别增高42%及77%。而Ⅰ胶原含量两组间未见明显增加,实验组Ⅱ型胶原含量在第4天未见明显增加,而第7、14天分别较对照组增高63%及94%。结论: rAAV2-hBMP7病毒载体能有效地转染犬髓核细胞并长期稳定表达人骨形成蛋白-7,并能提高犬髓核细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量,这将能为组织工程椎间盘提供可选择的基因修饰的种子细胞。4.组织工程椎间盘的体外构建目的:探讨利用液氮储存异体椎间盘及表达外源性人BMP7的髓核细胞体外构建组织工程椎间盘的方法方法:取储存于液氮中2个月的犬椎间盘24只,分为EGFP对照组、1×104、1×105和1×106四组,每组6只。对照组用16G注射器自椎间盘后正中注入1×105的表达EGFP的髓核细胞20ul, 1×104组注入PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul,其总细胞数为1×104,1×105组为总细胞数1×105的PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul,1×106组为细胞总数1×106的PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul。注射后立即置入50ml离心管中,加入30ml完全培养基,分别于培养4、7、14天,从椎间盘形态、细胞存活、及髓核细胞荧光强度、蛋白多糖及胶原含量等方面进行评价。结果:在储存的第4天及7天,椎间盘外形基本未见明显改变,而在储存至14天时,可见椎间盘上下终板有钙质脱落。在各时间点均可见表达绿色荧光蛋白髓核细胞。对不同组、不同时间点的组织工程椎间盘中荧光强度定量后发现:培养第7和14天时,1×105组荧光强度明显高于1×106组和1×104组。而且1×105组培养第7和14天时蛋白多糖及总胶原含量均较另外三组明显增高。结论:利用液氮储存异体椎间盘同1×105转染髓核细胞复合,体外培养7天能构建出较理想的组织工程椎间盘。小结:1.利用液氮保存椎间盘组织,无论在细胞总的存活率及PG含量上均优于-80℃,1年的液氮保存期间,细胞存活率及功能蛋白PG含量均在一个恒定的水平,能满足异体椎间盘移植的基本要求,可作为组织工程椎间盘的支架材料。2.利用pSNAV2.0质粒包转系统能成功将外源性基因hBMP7包装成滴度及纯度满足实验要求的rAAV-hBMP7病毒载体。3. rAAV2-hBMP7病毒载体能有效地转染犬髓核细胞并长期稳定表达人骨形成蛋白-7,并能提高犬髓核细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量,这将能为组织工程椎间盘提供可选择的基因修饰的种子细胞。4.利用液氮储存异体椎间盘同1×105转染髓核细胞复合,体外培养7天能构建出生物活性较高组织工程椎间盘。这将能被用于进一步动物实验,以研究组织工程椎间盘的生物活性。
刘伟[9]（2009）在《bFGF和BMP12基因联合修饰BMSCs后向韧带成纤维细胞分化的实验研究》文中研究说明[摘要]目的:探索bFGF和BMP12基因的联合修饰使兔骨髓间充质干细胞向韧带成纤维细胞分化的方法。方法:（1）分离、培养兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）和韧带成纤维细胞（Ligament Fibroblast, LF）,通过细胞学和分子生物学方法对两种细胞进行鉴别分析;（2）构建携带人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）基因和人骨形态发生蛋白12（bone morphogenetic protein 12 , BMP12 ）基因的重组腺病毒载体Ad.bFGF-eGFP及Ad.BMP12-eGFP,并进行鉴定、扩增;（3）将Ad.bFGF-eGFP和Ad.BMP12-eGFP联合转染兔BMSCs,观察BMSCs表达、分泌bFGF、BMP12的情况,及转染后对BMSCs增殖、分化及产生韧带特异性细胞外基质的影响。结果: （1）成功分离和培养兔骨髓间充质干细胞和韧带成纤维细胞,两种细胞在细胞形态上相似,但在细胞的超微结构、增殖特性、细胞表型、细胞分子生物学水平上均有显着差异;（2）成功构建和扩增了携带人bFGF基因和BMP12基因的重组腺病毒载体Ad.bFGF-eGFP及Ad.BMP12-eGFP,其中含有eGFP荧光蛋白报告基因;（3） Ad.bFGF-eGFP和Ad.BMP12 -eGFP共转染BMSCs后,bFGF蛋白及BMP12蛋白显着表达,且明显促进BMSCs增殖和向韧带成纤维细胞表型分化,加强韧带特异性细胞外基质产生的能力并诱导韧带特异性转录因子Scleraxis的表达。结论:经Ad.bFGF-eGFP和Ad.BMP12-eGFP共同修饰改造后,兔骨髓间充质干细胞能明显向韧带成纤维细胞表型分化,韧带特异性细胞外基质的能力显着增强,为组织工程韧带的构建提供了一种更优良的种子细胞。
金玲[10]（2009）在《慢病毒载体介导hTERT基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究》文中研究指明组织工程化角膜上皮需要合适的种子细胞,人羊膜上皮细胞（human amnioticepithelium cells,hAECs）容易获得、取材方便,在伦理问题上也不存在任何争议,经研究发现hAECs具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,在不同生长因子和微环境调控下能分化成多种不同组织的细胞,其极可能诱导分化成角膜上皮细胞。因此,hAECs可能是组织工程角膜上皮一种新的细胞来源。但是由于hAECs属于终末分化细胞,体外生存期短、培养困难,限制了其广泛应用。有鉴于此,本研究利用慢病毒载体携带目的基因人端粒酶催化亚基（hTERT）和标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组成的融合基因转染hAECs,使其生长周期延长甚至达到永生化,然后应用转基因hAECs构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料重建角膜表层,探讨转基因hAECs做为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。第一部分人羊膜上皮细胞（hAECs）的体外培养和其生物学鉴定目的:研究人羊膜上皮细胞（hAECs）体外培养的生物学特性,探讨hAECs体外培养的方法及其干细胞特性,为基因转染hAECs并进行角膜表层重建奠定实验基础。方法:1采用酶消化法体外分离培养hAECs,观察细胞在体外培养条件下的生长情况,并对生长良好的原代细胞进行消化传代,在光镜下对细胞进行形态学观察和HE染色观察;2对传代的hAECs进行细胞角蛋白CK7、CK8和CK18免疫组化染色鉴定及免疫荧光检测hAECs中干细胞转录因子OCT-4的表达;3对传代的hAECs进行流式细胞仪检测干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。4免疫组化检测传代hAECs中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达。结果:1在体外培养条件下,hAECs能贴壁生长,细胞呈典型的上皮细胞样外观,正常情况下可传7—8代。HE染色可见细胞大小较均一,呈不规则的多角形,细胞连接成片。2免疫组化结果显示培养的hAECs胞浆中见CK7、CK8、CK18单克隆抗体染色阳性,OCT-4免疫荧光结果显示hAECs的胞浆中有荧光表达。3流式细胞仪检测发现hAECs干细胞标记分子CD29、CD34的表达为阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。4免疫组化结果显示培养的hAECs胞浆中hTERT单克隆抗体染色阴性。结论:1通过酶分离法可成功分离出纯度较高的hAECs,获得的细胞能在体外进行短期内培养。2培养的hAECs是单层上皮细胞来源,并具有干细胞的某些特征。第二部分真核表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的构建目的:利用慢病毒载体构建携带有目的基因人端粒酶催化亚基（hTERT）和标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP,为基因转染hAECs奠定实验基础。方法:1基因重组穿梭质粒pDONR221-hTERT-EGFP的构建和鉴定以PCI-neo-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因hTERT,通过BP反应,将hTERT定向克隆至pDONR221得pDONR221-hTERT;以质粒pEGFP-N1为模板,通过PCR反应得到-linker-EGFP-产物。通过双酶切,T4-DNA连接酶反应,得到pDONR221-hTERT-EGFP产物。然后转化大肠杆菌DH5α,卡那霉素筛选,挑克隆行PCR、酶切及测序鉴定。2 pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP重组载体的构建和鉴定取pDONR221-hTERT-EGFP重组质粒和pLenti6/V5-DEST载体,进行LR重组反应,得到pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP重组质粒,之后转化入大肠杆菌STB13感受态,涂含氨苄霉素的LB平板,挑取单菌落扩增培养,提取质粒,并进行测序鉴定。3含hTERT-EGFP病毒颗粒上清的包装和收集利用脂质体转染法将pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP质粒转入293FT细胞,培养24h后,更换完全培养基,再48 h-72 h后,采用过滤法收集含病毒颗粒的上清液,一80℃保存备用。结果:1慢病毒入门载体pDONR221-hTERT-EGFP的构建和鉴定结果本实验成功扩增出长达约3.4Kbp的attB1-hTERT-attB2片段,行PCR、酶切及测序鉴定,证实hTERT已克隆入入门载体pDONR221,并成功获得pDONR221-hTERT-EGFP产物。2慢病毒入门载体pDONR221-hTERT的1547位点定点突变（将1547位点突变的碱基G变回原序列A）测序结果表明慢病毒入门载体的目的基因hTERT存在1547位点发生错义突变,经设计含1547位点正确碱基的引物,通过定点突变技术将慢病毒入门载体pDONR221-hTERT的1547位点定点突变,经测序证实突变成功。3慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的构建和鉴定结果经LR重组反应构建得慢病毒重组质粒pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP,将重组质粒送去测序,证实重组质粒pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP构建成功。4含hTERT-GFP病毒颗粒上清液的制备结果将pLenti6/V5-DEST-hTERT-GFP与VirapowerTMPackaging Mix利用脂质体共转染包装细胞293FT细胞,终止转染72h后收集上清液,过滤,即得含hTERT-GFP病毒颗粒的上清液。结论:1首次成功构建慢病毒重组质粒pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP。第三部分慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的转染和表达一、pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因转染hAECs目的:在本实验中,利用慢病毒将目的基因人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）和标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞（hAECs）,并扩增培养含hTERT-EGFP基因的克隆细胞,观察转染细胞的生长特性,用流式细胞仪检测转染细胞EGFP阳性表达率和检测hTERT基因转染对hAECs生长周期的影响,为下一步转染细胞的活体移植奠定实验基础。方法:1人羊膜上皮细胞的传代培养2慢病毒载体的转染2.1杀稻瘟菌素筛选浓度的确定2.2慢病毒载体转染人羊膜上皮细胞制成两孔转染实验组（转基因组）、两孔转空载对照组、两孔正常对照组,共六孔,24h后终止转染。3筛选稳定表达的抗性细胞克隆并扩增培养细胞终止转染后,继续培养24 h,加入含杀稻瘟菌素终浓度为1ug/ml的完全培养基,对细胞进行加压筛选,筛选10天左右,直至单个细胞克隆形成。重组细胞克隆形成后,换为不加筛选药物的DMEM完全培养基继续培养,至细胞接近融合时,消化传代,扩增培养。扩增培养时,仍加杀稻瘟菌素进行筛选。4荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达细胞终止转染后,用不加筛选药物的含10%胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养12h、24h、48h、72h、96h,荧光显微镜下观察每个时间段瞬时转染细胞和稳定转染细胞绿色荧光蛋白的表达。5倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态6流式细胞仪检测转染细胞EGFP阳性表达率分别收集未转染的hAECs、瞬时转染12h、24h、48h、96h的hAECs,制成单细胞悬液,行流式细胞仪检测,利用cell-quesL软件分析EGFP阳性细胞表达率。7流式细胞仪检测hTERT基因转染对hAECs生长周期的影响分别收集稳定转染后第2代培养48h的hAECs（转基因组）,常规传1代培养48h的hAECs（正常对照组）,以及转染空载体传1代培养48h的hAECs（转染空载体组）,调细胞浓度为1×106个/ml,用流式细胞仪检测标记细胞,CellQuest软件处理资料,全部数据采用SPSS11.0统计软件包进行处理,PI值比较采用单因素方差分析,以P＜0.05定为差异具有统计学意义。结果:1杀稻瘟菌素的抗性筛选接种于6孔板中的人羊膜上皮细胞,当加入杀稻瘟菌素浓度为1ug/ml时,培养14d细胞全部死亡,从培养时间上考虑选1ug/ml作为杀稻瘟菌素的筛选浓度。2倒置显微镜下所见培养的人羊膜上皮细胞加入转染液12h后,有少数细胞从培养板上脱落下来漂浮于培养液中,大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞均与正常细胞在形态上无显着差异。3荧光显微镜下观察GFP的阳性表达3.1瞬时转染12h后即可见发绿色荧光的人羊膜上皮细胞,但数量较少,强度教弱,每个低倍视野下可见0-2个;24h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞逐渐增多强度增强,每个低倍视野下可见5-8个左右;48h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞继续增多,每个低倍视野下可见10个以上;72h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞与48h的人羊膜上皮细胞差别不大;96h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞逐渐减少,每个低倍视野下可见5个左右,经1ug/ml的杀稻瘟菌素筛选10d后,观察有单细胞克隆出现。3.2消化收集经1ug/ml的杀稻瘟菌素筛选获得稳定表达的人羊膜上皮细胞,接种于6孔板中扩增培养,贴壁后可见密集荧光。4人羊膜上皮细胞pLenti6/V5-DEST-HTERT-EGFP基因转染效率检测结果流式细胞仪检测结果显示:未转染组人羊膜上皮细胞中,GFP阳性细胞数为零,瞬时转染12h、24h、48h、72h、96h组的人羊膜上皮细胞均可见GFP阳性表达,其中48h转染组的人羊膜上皮细胞GFP阳性表达率最高,为18.53%,与12h、24h、96h转染组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,与72h转染组比较差异不显着,无统计学意义（P＞0.05）。5细胞周期检测结果转基因组人羊膜上皮细胞与正常对照组比较,处于S期和G2/M组的细胞比例增加,PI值升高,两者有显着性差异（P＜0.05）,转空载体组人羊膜上皮细胞与正常对照组比较,PI值无显着变化（P＞0.05）。结论:1首次证明目的基因人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）和标记基因EGFP经慢病毒介导转染入人羊膜上皮细胞（hAECs）后,并可在细胞内获得瞬时表达和稳定表达,且瞬时转染48h,人羊膜上皮细胞（hAECs）EGFP阳性表达率最高,为18.53%。2转染入目的基因人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）后,人羊膜上皮细胞（hAECs）的增值指数PI值明显升高,生长周期明显延长。3慢病毒介导的转染方法对人羊膜上皮细胞（hAECs）的形态、分化和增殖能力等生物学特性无明显影响,再次证明是一种相对安全的基因转染方法。二、pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因在转基因hAECs中的表达目的:在本实验中,利用荧光定量PCR和Western blot方法从mRNA和蛋白质水平检测hTERT基因在转基因hAECs中的表达,并通过免疫组织化学法检测转基因hAECs中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达,再通过裸鼠试验检测转染细胞的致瘤性,研究转染有hTERT基因的hAECs的生物安全性,为基因转染人羊膜上皮细胞并进行角膜表层重建奠定实验基础。方法:1应用荧光定量PCR（Real Time-PCR）方法检测hTERT mRNA在转染细胞中的表达1.1总RNA提取（整个过程要求在超净台内进行）分别提取常规传1代培养48h的hAECs（第1组,即正常对照组）、传1代培养48h的HepG2肝癌细胞（第2组,即阳性对照组）、以及稳定转染pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因后第2代培养48h的hAECs（第3组,即稳定转染实验组）、瞬时转染48h的hAECs（第4组,即瞬时转染实验组）、用慢病毒空载体转染48h的hAECs（第5组,即空载转染对照组）的总RNA。1.2总RNA纯度和完整性检测1.2.1纯度检测:取双蒸水99μl加入比色杯中,再加入1μl总RNA样品,在核酸蛋白检测仪上测定OD值。1.2.2总RNA完整性检测:取RNA样品2μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×30min,用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA条带。1.3逆转录:得1st strand cDNA:取上述5组细胞RNA液各2ul,转移到无菌PCR管中,行PCR反应。1.4荧光定量qRT-PCR1.4.1检测序列片段大小1.4.2设计引物1.4.3反应体系:2×2×SYBR green premix10μl+Primers mix0.8μl+cDNA1μl+H2O 8.2μl,总体积为20μl;1.4.4反应条件:95℃10min,95℃15s,65℃30s,72℃30s读板,共40个循环;1.4.5融解曲线分析:温度55℃-95℃,每分钟读1次,每个样设置3个复孔。2 Western blotting法检测转基因hAECs中端粒酶蛋白的表达2.1样品的制备取上述5组细胞,加入单去污剂裂解缓冲液,收集细胞裂解物,加入等体积凝胶加样缓冲液,离心后,将上清夜移至另一管中,待用。2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）2.2.1正确安装电泳槽玻璃板,加入分离胶,待分离胶完全聚合后,再在分离胶上灌注浓缩胶,快速插入干净的梳子,浓缩胶聚合后,小心移出梳子。2.2.2将凝胶固定于电泳装置上,加入电泳缓冲液。按预定顺序加样,连接电泳装置与电流。当染料接近分离胶底部时,关闭电源。卸下玻璃板,分离玻璃板,标记凝胶方位。2.3 Western Blotting法检测电泳完毕后,将凝胶取下,贴于PVDF膜上,将胶、膜、滤纸、海绵和转移夹板夹成“三明治”状,进行转膜,闭膜,加一抗溶液孵育过夜。再加到二抗溶液中,摇床孵育1h。然后显色,感光,显影和定影,与之前预染的Marker对比,观察结果,拍照分析。3免疫组化法检测转基因hAECs中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达采用链酶亲和素-过氧化物酶（SABC）法,检测盖玻片上常规培养的上述五种细胞中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达情况。4裸鼠致瘤实验取稳定转染有目的基因hTERT的hAECs及HepG2肝癌细胞,取BALB/c—nu/nu品系裸鼠12只,6只接种转基因hAECs,6只接种HepG2肝癌细胞,于动物背部皮下无菌接种细胞悬液,屏障环境下饲养两周,观察细胞注射部位有无肿瘤生长以及肿瘤的大小。结果:1实时荧光定量PCR检测结果第1组即正常对照组和第5组即空载转染对照组hTERTmRNA的相对含量为0即不表达hTERT,第2组即阳性对照组hTERT mRNA的相对含量为450,第3组即稳定转染组目的基因hTERT mRNA的相对含量为200,第4组即瞬时转染组目的基因hTERTmRNA的相对含量约为185,说明瞬时转染和稳定转染的hAECs内均有hTERTmRNA基因表达,而没有进行基因转染的hAECs和转染空载体的hAECs内无hTERTmRNA基因表达。2 Western Blotting检测结果第2组即阳性对照组细胞裂解产物,在相对分子量为314KD处呈现一条特异性蛋白条带,而第1组即正常对照组、和第3组即稳定转染组和第4组即瞬时转染组和第5组即空载转染对照组则无相应条带出现,这可能因为稳定转染组细胞中hTERT蛋白表达过少或没有表达。3免疫组化检测结果端粒酶催化亚基hTERT抗体在第1组即正常对照组、第4组即瞬时转染组和第5组即空载转染对照组的hAECs细胞胞浆中不着色,说明这些细胞不表达hTERT蛋白,而端粒酶催化亚基hTERT抗体在第2组即阳性对照组中细胞胞浆中呈深褐色着色,说明其hTERT蛋白表达呈强阳性,,TERT抗体在第3组即稳定转染组的hAECs中呈浅褐色着色,说明其hTERT蛋白表达呈弱阳性。4裸鼠致瘤实验结果裸鼠在屏障环境下饲养一周后,接种HepG2肝癌细胞的裸鼠注射部位即有肿瘤长出,并随着饲养天数的延长逐渐长大,而接种转基因hAECs的裸鼠注射部位无明显变化。结论:1首次从mRNA水平检测到hTERT基因在体外培养的hAECs中成功转染和表达,但蛋白质水平上没有检测到转染细胞中hTERT蛋白的表达,说明hTERT基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达并不平衡。2转染有目的基因hTERT且稳定表达的人羊膜上皮细胞目前尚未发现有致瘤性。第四部分应用转基因hAECs重建角膜表层的研究目的:研究转基因人羊膜上皮细胞（hAECs）在新鲜角膜基质片上的生存情况,并将生长有转基因hAECs的新鲜角膜基质片移植到角膜缘干细胞缺乏的兔眼表面重建角膜表层,观察转基因人羊膜上皮细胞的存活情况及眼表的稳定性,探讨转基因HAECs在活体兔眼表面的转归,为基因转染hAECs并进行角膜表层重建奠定实验基础。方法:1制备兔角膜缘干细胞缺损模型取实验兔12只,麻醉后,开睑器开睑,在兔右眼角膜表面滴用正庚醇数滴去除角膜上皮,环形切除角膜缘内2mm浅板层组织,剪去第3眼睑,结膜下注射庆大霉素及地塞米松,连续观察2个月,对角膜结膜化、新生血管情况进行记录。2转基因pLenti6/V5-DEST-HTERT-EGFP人羊膜上皮细胞克隆的体外扩增培养3新鲜兔角膜基质片的制备取新西兰大白兔眼球,暴露角膜,吸取少量正庚醇,滴加到角膜表面去除角膜上皮层,留下光滑的角膜基质面。然后再在角膜缘处做一小板层切口,用无菌虹膜恢复器分离浅层角膜基质层。用7.5mm环钻钻取角膜基质,将其放在无菌超净台内风干,然后放入96孔板中,备用。4在新鲜角膜基质片上种植转基因pLenti6/V5-DEST-HTERT-EGFP人羊膜上皮细胞并复层化将转基因hAECs消化后,接种到96孔板中的新鲜角膜基质上,小心放入培养箱中静置培养。大约3天后,角膜基质片上的细胞形成单层融合时,取出基质片,放入事先放在6孔板内的带微孔滤膜、三维立体插入式细胞培养器中。置入细胞培养箱中静置培养,大约培养10天左右,自然形成上皮细胞的复层结构。5新鲜角膜基质片上细胞的HE染色观察新鲜角膜基质片上的细胞培养3天后和利用气液界面培养10天后,固定、脱水、包埋、切片,进行HE染色后光学显微镜观察。6转基因hAECs移植片的眼表移植6.1动物分组:将上述12只右眼角膜缘干细胞缺乏模型兔随机分成2组,按构建角膜移植片是否有细胞,分为:A组（对照组,n=6）:新鲜角膜基质片上不种任何细胞,B组（pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因转染组,n=6）:种子细胞为含目的基因hTERT和标记基因EGFP的慢病毒载体转染的hAECs。6.2模型兔麻醉后,开睑器开睑,用7.0mm环钻钻取兔右眼角膜中间组织,钝性分离及板层切除中央角膜组织,将转基因人羊膜上皮细胞移植片平铺于角膜创面,然后间断缝和移植片与角膜上。结膜下注射庆大霉素及地塞米松,局部涂四环素可的松眼膏,间断缝合上下睑缘。7术后处置术后术眼滴氧氟沙星滴眼液于结膜囊内,肌肉注射庆大霉素,并在饲料中加环胞霉素A。每日氧氟沙星滴眼液滴眼,每日观察植片的存活状况及眼表的稳定性。8术后观察及检测8.1大体观察术后第一周内,每天在裂隙灯下观察,以后每周观察2-3次,连续观察2个月。对角膜水肿、混浊、结膜化、新生血管情况进行记录。8.2移植眼角膜组织的HE染色观察8.3移植眼角膜组织细胞角蛋白CK8、CK18、CK12免疫组化检测结果:1兔角膜缘干细胞缺乏模型制备角膜缘干细胞缺乏模型术后观察,两个月后有10只兔眼表现为角膜表面结膜化,新生血管膜形成,全角膜灰白色混浊。另2只兔眼角膜没有出现明显的结膜化,但已长出大量新生血管,并逐渐向角膜中间蔓延。2新鲜角膜基质片上细胞在倒置显微镜下所见转基因hAECs接种到新鲜兔角膜基质片后,3h开始贴壁,12h细胞呈团块状堆积,24h后细胞呈棒状伸展,3d左右变成多角形,部分区域已连接成片。3新鲜角膜基质片上细胞HE染色转基因hAECs在新鲜兔角膜基质上3-5d左右形成致密的单层结构,细胞排列紧密,然后应用插入式细胞培养器形成的气.液界面培养法培养10d左右,转基因人羊膜上皮细胞能形成类似角膜上皮的3-5层复层结构,形成的复层上皮细胞与角膜基质连接紧密,不易脱落。4.移植术后移植片的大体外观所见A组:术后一个月观察,6只兔眼均表现为整个角膜高度水肿,角膜浑浊程度较重,有大量新生血管,角膜炎症反应重,分泌物多。术后两个月观察,角膜结膜化,角膜血管化严重,已向角膜中央侵犯。B组:术后一个月观察,有6只兔眼角膜透明度有不同程度提高,角膜周边有新生血管,6只兔眼缝线已大部分脱落。术后两个月观察,5只兔眼角膜均恢复透明,角膜上皮光滑,只有1只兔眼角膜透明度较低,新生血管较多。5.角膜移植片的HE染色所见角膜上皮重建术后2月,B组角膜组织HE染色可见角膜表面上皮出现部分类似角膜上皮的复层排列,角膜基质层可见新生血管增生。6.移植眼角膜组织免疫组化检测结果角膜上皮重建术后2月,角膜组织免疫组化染色可见上皮细胞角蛋白CK8、CK18和角蛋白CK12均呈阳性表达,角膜表面上皮部分细胞胞浆呈棕黄色,细胞核蓝色。结论:1新鲜角膜基质有利于人羊膜上皮细胞形成类似角膜上皮的复层排列,且表达角膜上皮细胞特异性抗体CK12。2转基因pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP人羊膜上皮细胞可以成为重建角膜表层的一种新的种子细胞。
二、腺病毒载体介导外源性端粒酶在组织工程种子细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒载体介导外源性端粒酶在组织工程种子细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）Sema3A转染牙龈间充质干细胞对大鼠骨缺损修复的促进作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 Sema3A转染对大鼠牙龈间充质干细胞成骨分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 体外共培养体系下Sema3A转染rGMSCs对破骨前体细胞分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 Sema3A修饰rGMSCs促进大鼠骨缺损修复的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 伦理声明 |
| 文献综述 信号素3A调控骨稳态和骨改建的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 发表文章 |
（2）椎间盘退变关键标志物筛选及携载TGF-β3支架对椎间盘修复的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 椎间盘退变关键标志物的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 携载TGF-β3的脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶对椎间盘退变修复的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
（3）3D打印技术构建的新型复合组织工程骨修复骨缺损的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 存在的问题及展望 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染脂肪干细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 主要液体配制方法 |
| 1.2 脂肪干细胞的分离和培养 |
| 1.3 细胞形态学观察 |
| 1.4 CCK8法检测细胞体外增殖能力 |
| 1.5 细胞周期的测定 |
| 1.6 流式细胞术检测ASDCs表面标记 |
| 1.7 ADSCs成脂诱导 |
| 1.8 ADSCs成骨诱导 |
| 2. 结果 |
| 2.1 细胞形态学观察 |
| 2.2 细胞增殖能力检测 |
| 2.3 细胞周期 |
| 2.4 细胞表型特征 |
| 2.5 ASDCs的成脂诱导 |
| 2.6 ASDCs的成骨 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 ADSCs的分离与培养 |
| 3.2 ADSCs的增殖和凋亡 |
| 3.3 ADSCs的表型特征 |
| 3.4 ADSCs的多向诱导分化 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 质粒的扩增与提取 |
| 1.3 PEI/DNA纳米粒凝胶阻滞分析 |
| 1.4 ADSCs培养与鉴定 |
| 1.5 PEI细胞毒性试验 |
| 1.6 PEI及PEI/DNA复合物的微观形态和粒径特征的观察 |
| 1.7 PEI介导的基因转染效率的检测 |
| 1.8 绿色荧光蛋白表达的检测和转染效率的统计 |
| 2. 结果 |
| 2.1 凝胶阻滞分析 |
| 2.2 PEI及PEI/DNA复合物的电镜观察和粒径检测结果 |
| 2.3 绿色荧光蛋白的表达和转染效率的检测 |
| 2.4 荧光显微镜观察 |
| 2.5 细胞毒性检测结果 |
| 3. 讨论 |
| 本部分小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 真核表达质粒pEGFP-N1-BMP-2的构建 |
| 1.2.1 外源目的基因的普通PCR扩增 |
| 1.2.2 限制性内切酶酶切反应 |
| 1.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 1.2.4 PCR产物或酶切产物回收与纯化 |
| 1.2.5 外源目的DNA片段与目的载体的连接反应 |
| 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)及连接产物的转化 |
| 1.2.7 质粒的小量制备 |
| 1.2.8 质粒的大提制备 |
| 1.2.9 质粒DNA的定量 |
| 1.2.10 重组质粒(阳性质粒)的鉴定 |
| 1.2.11 RNA的提取 |
| 1.2.12 逆转录PCR |
| 1.2.13 相对定量PCR |
| 1.3 ADSCs分离培养与鉴定 |
| 1.4 BMP-2基因转染兔ADSCs |
| 1.5 转染后细胞增殖情况检测 |
| 1.6 转染后BMP-2表达的检测 |
| 1.7 转染后ADSCs成骨分化的测定 |
| 2. 结果 |
| 2.1 转染后细胞形态及增殖情况 |
| 2.2 细胞表型特征 |
| 2.3 真核表达质粒pEGFP-N1-BMP-2的构建结果 |
| 2.4 转染后BMP-2基因表达的检测 |
| 2.5 ELISA检测转染后各组细胞BMP-2蛋白的分泌量 |
| 2.6 转染后ADSCs成骨分化的测定结果 |
| 3. 讨论 |
| 部分小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 主要符号和缩略语说明 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 统计审核证明 |
（5）PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文前言 |
| 第一章: 兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第二章: 脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第三章: 支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图表 |
| 6. 讨论 |
| 第四章: 兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第五章: Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 1. 颌骨牵张成骨研究进展 |
| 参考文献 |
| 2. 可注射支架材料在骨和软骨组织工程中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间所发表论文 |
| 攻读博士学位期间所主持的科研项目及课题 |
（6）pAd-bFGF-GFP转染兔骨髓间充质干细胞与脱细胞支架体外构建组织工程韧带的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞和髌韧带成纤维细胞的分离、培养 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Gateway 技术构建携带人 bFGF 基因的重组腺病毒载体 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 pAdbFGFGFP 转染兔骨髓间充质干细胞后细胞增值与细胞外基质分泌的影响及与韧带成纤维细胞的比较 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 pAdbFGFGFP 转染的兔骨髓间充质干细胞与成纤维细胞作为种子细胞与脱细胞支架体外复合培养构建组织工程韧带的比较研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）转基因同种异体组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究（论文提纲范文）
| 一、摘要 |
| (一) 中文摘要 |
| (二) 英文摘要 |
| 二、文献综述 |
| (一) 综述 |
| (二) 参考文献 |
| 三、正文 |
| (一) 前言 |
| (二) 实验一 |
| (三) 实验二 |
| (四) 参考文献 |
| 四、附录 |
| 五、致谢 |
（8）异体椎间盘复合表达外源性hBMP7因子的髓核细胞构建组织工程椎间盘的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 深低温储存温度及时间对异体椎间盘生物活性的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 重组2型腺相关病毒人BMP7(RAAV2-HBMP7)病毒载体的构建及鉴定 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 介导人骨形成蛋白7 腺相关病毒2 转染髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第四部分 组织工程椎间盘的体外构建 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）bFGF和BMP12基因联合修饰BMSCs后向韧带成纤维细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写 |
| 详细摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 兔骨髓间充质干细胞及韧带成纤维细胞的分离、培养及其生物学特性分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 携带人bFGF 基因和BMP12 基因重组腺病毒载体的构建及转染骨髓间充质干细胞后bFGF 和 BMP12 蛋白的表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 bFGF 基因及BMP12 基因联合修饰骨髓间充质干细胞后向韧带成纤维细胞的分化 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 研究生在读期间主要学术活动 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）慢病毒载体介导hTERT基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 组织工程化角膜表层重建的研究现状 |
| 2 人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelium cells,hAECs)的研究进展 |
| 3 人端粒酶催化亚基(hTERT)的研究现状和研究进展 |
| 4 慢病毒载体的简介与研究进展 |
| 5 标记基因-绿色荧光蛋白(GFP) |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 人羊膜上皮细胞(hAECs)的体外培养和其生物学鉴定 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第二章 真核表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的构建 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第三章 慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的转染和表达 |
| 引言 |
| 1 慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP转染hAECs |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 2 pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因在转基因hAECs中的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第四章 应用hTERT基因修饰的hAECs重建角膜表层的实验研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 全文总结 |
| 问题和展望 |
| 英文缩略词 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、腺病毒载体介导外源性端粒酶在组织工程种子细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]Sema3A转染牙龈间充质干细胞对大鼠骨缺损修复的促进作用及相关机制研究[D]. 田恬. 山东大学, 2020(04)
- [2]椎间盘退变关键标志物筛选及携载TGF-β3支架对椎间盘修复的实验研究[D]. 李钟奇. 山东大学, 2020(04)
- [3]3D打印技术构建的新型复合组织工程骨修复骨缺损的研究[D]. 杨家祥. 安徽中医药大学, 2019(02)
- [4]聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染脂肪干细胞的实验研究[D]. 王清富. 南方医科大学, 2013(04)
- [5]PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究[D]. 周诺. 广西医科大学, 2012(08)
- [6]pAd-bFGF-GFP转染兔骨髓间充质干细胞与脱细胞支架体外构建组织工程韧带的实验研究[D]. 黄俊俊. 第二军医大学, 2012(10)
- [7]转基因同种异体组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究[D]. 仲伟俍. 大连医科大学, 2010(12)
- [8]异体椎间盘复合表达外源性hBMP7因子的髓核细胞构建组织工程椎间盘的实验研究[D]. 王超锋. 第四军医大学, 2010(06)
- [9]bFGF和BMP12基因联合修饰BMSCs后向韧带成纤维细胞分化的实验研究[D]. 刘伟. 第二军医大学, 2009(10)
- [10]慢病毒载体介导hTERT基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究[D]. 金玲. 暨南大学, 2009(09)