一、人源性抗TNFα小分子抗体的改构和分析（论文文献综述）
侯石[1]（2020）在《新型STING激动剂的设计、合成及生物活性研究》文中认为固有免疫反应是宿主抵御外来病原微生物的第一道防线。天然免疫系统通过模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）识别外源病原体,激活信号转导通路,诱导干扰素（interferons,IFN）、炎症因子等的分泌,进而使宿主细胞产生防御能力。干扰素激活蛋白（stimulator of interferon genes,STING）是固有免疫反应中一个重要分子,主要通过cGAS-STING通路发挥免疫防御和抗肿瘤作用。环鸟苷酸腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）识别胞质内的各种DNA分子,并将其转换成环二核苷酸（cyclic dinucleotides,CDNs）。然后,CDNs与STING相互作用并使STING蛋白发生构象改变,进而激活下游的TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）、转录因子干扰素调节因子3（interferon regulatory factor,IRF3）和核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）,从而诱导产生Ⅰ型IFN和炎症因子。随着STING晶体结构的报道,为人们通过基于结构的药物设计,发现新型STING激动剂提供了一定的基础。因此,STING是一个非常有意义的药物靶点,可以通过设计STING的激动剂激活STING通路,进而发挥抗肿瘤、抗病毒以及抗菌的作用。本文主要研究工作包括三部分:1.基于STING晶体复合物设计、合成新型的STING激动剂由于STING通路被激活后可产生强效的免疫反应,STING激动剂的研究也受到了科学界的广泛关注,但目前尚处于起步阶段。一般来讲,STING激动剂是指天然配体CDNs类化合物,该类化合物具有天然配体的结构、相对明确的机制和本身强力的诱导作用。但是,CDNs较差的理化性质为其临床研究带来了挑战,具体如下:1)它们不遵循Lipinski规则,较差的膜渗透性将直接影响它们的临床试验结果;2)它们易受磷酸二酯酶的降解;3)由于分子量较大,所以它们的改造空间有限。因此,越来越多的科研工作者致力于开发新型的小分子STING激动剂,统称为非CDNs类STING激动剂。小分子STING激动剂5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸（5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid,DMXAA）可以减少上述CDNs类化合物的不利因素,但是DMXAA只能激活鼠源STING通路。研究结果表明,STING蛋白的氨基酸序列进行微小地突变,可以提高DMXAA对人源STING蛋白的敏感性。其中,162位和266位的突变氨基酸位于配体与STING蛋白直接结合的结合口袋区域,对DMXAA类化合物的设计与改造具有十分重要的意义。综上所述,本文拟以克服鼠源STING激动剂种属的特异性为目的,设计并合成人源STING激动剂。本文全面分析了鼠源STING激动剂DMXAA和10-羧甲基-9-吖啶酮（10-carboxymethyl-9-acridanone,CMA）,发现二者具有很多的相似性,如结构类似、与STING结合的方式相似以及均有种属特异性等等。所以,本文设计新型STING激动剂的思路集中在DMXAA和CMA分子结构的改造上。本文详细总结了DMXAA、CMA与mSTING的晶体结构,并借助计算机辅助药物设计对DMXAA与突变hSTING的共晶结构进行了解析,致力于发现广谱STING激动剂。本文的设计主要遵从以下四点原则:1)需要保留DMXAA和CMA的三个环结构:2)DMXAA中5,6位二甲基的结构是活性必需基团;3)确定了主要的修饰位点,即DMXAA上的C1、C2及C7的位置;4)借鉴DMXAA的结构,可将CMA分子N原子上的羧基转移至C4位。根据上述信息并考虑化合物合成的可行性,本文合理设计了四类相关结构的类似物。最后,本文打通了各类化合物的合成路线,并成功地合成了30多个新颖的XAA类或吖啶酮类衍生物。本文将对所合成的这些化合物进行细胞水平的活性筛选工作,鉴定它们是否具有STING激动活性和跨越物种的非特异性。2.在细胞水平筛选和确定吖啶酮类衍生物为广谱STING激动剂为了满足对已合成化合物活性评价的要求,本文选择了三个细胞系:293T-Dual?hSTING-R232 Cells、293T-Dual?mSTING Cells和THP1-Dual?KO-STING Cells（所有细胞系来源于Invivogen公司,可以间接测量被化学标记的免疫分子来验证STING各通路的活性）。293T-Dual?hSTING-R232 Cells和293T-Dual?m STING Cells均来源于293T细胞,前者用来测试化合物对人源STING通路的激动活性,后者用来考察样品对鼠源STING通路的激活水平。本文用敲除STING蛋白的THP1-Dual?KO-STING Cells,进一步确认化合物是否依赖STING蛋白介导信号的转导。本文使用上述细胞系进行活性筛选,考察化合物激活STING通路的水平、种属特异性以及对STING蛋白的依赖性。本文筛选化合物体外活性的工作分为两个部分,初步活性筛选和效力确定筛选。通过两步的筛选,本文发现了6个活性分子化合物,分别为化合物2、3、11、28、33和34。其中,化合物2、3和33只能在鼠源STING细胞中诱导产生免疫因子。具有吖啶酮骨架结构的化合物11、28和34,都表现出了跨物种的STING激动活性,并且它们通路的激活依赖于STING。令人惊喜的是,筛选活性最好的化合物34的活性水平与天然配体2’3’-cGAMP相当,化合物34在人源和鼠源STING细胞中的EC50值分别为7.45μM和10.23μM。这些体外的活性结果成功地验证了,基于STING晶体复合物设计新型STING激动剂的设计思路是正确的。为了探索吖啶酮类衍生物突破种属特异性的原因,本文还全面分析了各类化合物的构效关系（Structure-Activity Relationships,SARs）,并得到很多非常有价值的信息,可为提高新型STING激动剂的活性提供帮助。最值得注意的是,本文发现去除化合物34中的任何一个取代基,都会使其活性骤减。因此,我们下一步的研究可以化合物34作为先导化合物,主要对N、C-4和C-7位进行修饰,从而增强该类化合物对STING通路的激动活性。3.吖啶酮类STING激动剂的机制研究本文通过蛋白结合实验和细胞因子诱导实验,对吖啶酮类STING激动剂激活STING通路的机制进行了研究。根据STING激动剂是否直接与STING蛋白结合来发挥免疫效应,人们可以将STING激动剂划分为直接和间接两类。CDNs和DMXAA均为直接STING激动剂,它们激动活性强、结合机制明确并且可作为工具分子研究STING通路的新机制。然而,间接STING激动剂的激动活性一般较差,其可能激活STING通路的上游或者下游的蛋白来诱导产生免疫因子,甚至有可能通过激活其他通路来间接激活STING通路。因此,在蛋白水平验证活性化合物是否直接结合STING蛋白,对于STING激动剂的活性评价至关重要。本文首先选用了Cisbio研发的人源STING结合力检测试剂盒,对吖啶酮类STING激动剂进行了测试,实验结果成功地证明了它们为直接STING激动剂。其中,化合物34依然表现出了最强的结合亲和力。等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）是目前小分子化合物与蛋白结合最为认可的测试方法,本文又对化合物34进行了ITC的补充实验,其实验结果与竞争结合力实验的筛选结果相一致。同时,本文还对吖啶酮类分子与STING结合的作用机制进行了初步地探讨。根据分泌细胞因子的不同,STING通路被分为STING-IRF3通路和STING-NF-κB通路。受到STING激动剂的刺激后,STING-IRF3通路主要负责分泌Ⅰ型IFNs,而STING-NF-κB通路则产生炎症因子,如TNFα。因此,通过检测STING激动剂激活通路而诱导产生各种细胞因子的水平,使我们不仅可以了解化合物激活通路的强度,还能初步地探索其诱导机制。本文利用实时荧光定量核酸扩增法（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）,对化合物34激活天然免疫细胞THP-1,从而诱导产生细胞因子的基因表达水平进行了测试,检测免疫因子包括IFNβ、TNFα、IL-6和IP-10。同时,本文在实验中为STING激动剂设定了浓度、时间两个梯度,多元化的实验结果可以更好地量化吖啶酮类STING激动剂的免疫学效应,如激动活性、激活时效和持续效应的时间等等。实验结果显示,化合物34在激活STING通路诱导细胞因子的能力要强于阳性分子2’3’-c GAMP,特别是其分泌炎症因子TNFα。本文推测,化合物34和2’3’-cGAMP诱导细胞因子的作用机制是不同的,化合物34可以有效地激活STING-IRF3和STING-NF-κB两个通路,且其对NF-κB途径的激活效应明显比2’3’-cGAMP更强。本文的创新点为:1)本文基于STING蛋白晶体复合物,以获得广谱STING激动剂为目的,合理设计了四类化合物并成功地合成30余个全新结构的小分子化合物。2)通过不同细胞系对所合成目标化合物进行体外活性评价后,本文鉴定了吖啶酮类化合物为新型小分子STING激动剂;这些吖啶酮类STING激动剂成功地突破了种属特异性,在人源和鼠源STING细胞中都展现了出色的激动活性。3)本文对实验数据进行整理归纳后,分析总结出化合物的基本构效关系;对于吖啶酮类STING激动剂来说,C-2位的甲氧基是活性关键基团,5,6位的双甲基取代是其获得人源性的关键。4)本文还对吖啶酮类化合物激活STING通路的作用机制进行了研究,实验结果证明吖啶酮类STING激动剂是与STING直接结合而激活通路的,同时还可以激活STING-IRF3和STING-NF-κB双通路。本文选用2’3’-cGAMP为阳性对照物,原因如下:1)它是天然的STING激动剂,也是CDNs类化合物的代表;2)它是目前STING激动剂和通路研究的金标准,与它进行比较最具有说服力。值得注意的是,大多数非CDNs类STING激动剂的激动效应与2’3’-c GAMP相差甚远,但是通过多方面的评价后,本文发现吖啶酮类化合物的激动活性比2’3’-cGAMP稍强。综上所述,吖啶酮类STING激动剂具有激动效应强、分子量小、改造空间大以及作用机制明确等优点,其不仅为STING通路新机制的发现奠定了基础,也为抗肿瘤、抗菌以及抗病毒的免疫治疗提供了新的思路。
林婷[2]（2020）在《人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究》文中研究指明单链抗体（scFv:the single-chain variable fragment of antibody）具有分子量小、半衰期短、免疫原性低、结构稳定等特点,在治疗与诊断、实验研究中被广泛应用。然而,scFv需从构建好的抗体库中筛选得到。scFv的生产则需要外源蛋白表达系统的参与。基于此,本人从以下两方面开展研究工作:（1）构建大库容及高多样性的scFv抗体库;（2）利用毕赤酵母表达系统高水平表达scFv。为了构建大库容及高多样性的scFv抗体库,我们收集了120份人体外周血,分离淋巴细胞并提取其RNA,扩增了抗体重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）片段的编码序列。通过多肽链（Linker）序列将重链与轻链成功拼接成scFv片段,scFv片段插入p CANTAB 5E噬菌粒载体后,电转入TG1大肠杆菌中复制,最后利用辅助噬菌体M13KO7感染TG1,形成噬菌体表面展示scFv抗体库。最终获得的人源scFv抗体库的库容为:9.10×105,噬菌体滴定后的库容为:2.15×109 pfu。对阳性TG1进行基因测序得到的结果与理论相符,序列中含有SfiⅠ与NotⅠ酶切位点、Linker（G4S）3、g3信号肽及E标签这5个元素,且阅读框正确。为了提高scFv在毕赤酵母中的蛋白表达量,探究了密码子对上下文序列对scFv表达量的影响。我们根据毕赤酵母密码子对使用情况设计开发了基于密码子对的优化软件。为了确定密码子对上下文序列在毕赤酵母中是否影响scFv的表达,本研究利用了两个蛋白（ADAM17和MT1-MMP）的scFv进行验证。通过开发的密码子对优化软件分别设计了一条得分最高与一条得分最低的序列,得分最低的ADAM17scFv序列没有检测到表达,得分最低的MT1-MMP scFv序列只检测到微弱表达,而ADAM17和MT1-MMP得分最高的scFv序列均有强烈的表达,表明在毕赤酵母中密码子对上下文序列严重影响scFv的表达。目前,在毕赤酵母中对外源蛋白表达序列的优化均基于密码子使用频率。为了比较密码子使用频率和密码子对上下文对scFv序列表达量的影响,设计合成了基于传统密码子使用频率的ADAM17和MT1-MMP scFv优化序列。表达结果显示,基于密码子对上下文进行优化的scFv序列表达水平显着高于基于传统密码子使用频率优化的序列,ADAM17 scFv表达量高出5.37倍,MT1-MMP scFv表达量高出7.37倍。结果表明,在毕赤酵母中表达scFv,密码子对上下文优化方案优越于密码子使用频率优化方案。本研究构建了不可复制的人源scFv抗体库,扩大了已有的scFv抗体库的库容,加大了获得抗新型抗原的人源性scFv的可能性,为后续开发新型人源scFv临床药物奠定了基础;密码子对优化软件的开发以及该策略的确定对于毕赤酵母表达系统具有重大的意义,提高了scFv序列在毕赤酵母中的表达产量,使scFv更容易大量获得,对该领域研究的发展和应用具有一定的推动作用。
张昂[3]（2020）在《靶向CD19和PDL1的新型双亲和力CAR T细胞的功能与机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:肿瘤的免疫抑制微环境（TIME）是影响嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗效（尤其是实体肿瘤）的主要问题之一[1]。程序性死亡-1（PD-1;CD279）是一种位于细胞表面的I型跨膜受体,同时也是T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞甚至活化的血管内皮细胞上表达最广泛的T细胞抑制受体[2]。PD-1通路在所有免疫抑制信号通路上似乎是一个“主开关”,因为在某些情况下,单一剂量的抗PD治疗可以使得肿瘤微环境从最初的高度抑制状态变为高度活跃的炎症部位[3]。许多癌症类型过度表达PD-L1,通过PD-1/PD-L1/2相互作用损害T细胞的抗肿瘤反应以逃避免疫系统的攻击[4]。但是PD1-PDL1通路对于维持正常的外周免疫耐受也非常重要,如果直接靶向PDL1可能会引起非常严重的脱靶效应。如何通过CAR的结构改造使得CAR T细胞以调节CAR对于不同靶点的亲和力,使得CAR T细胞既可以避免PD1的免疫抑制信号,又不至于产生脱靶是一个非常有价值的研究的课题。研究内容和方法:我们将PD1的部分片段插入到针对CD19的二代CAR的结构中,制备靶向CD19和PDL1的新型的双亲和力CAR,分别命名为PD1-BAT1,2,3。第一,我们用慢病毒转染T细胞制备了可稳定表达于T细胞表面的CAR T细胞;第二,我们对新型双特异性CAR T细胞的杀伤功能,细胞因子分泌,体外培养增殖,特异性增殖进行了检测;第三,我们还在NALM-6-PDL1负瘤的NSG小鼠模型上对于新型双特异性CAR T的安全性和有效性进行了进一步验证;第四,为了探索不同的CAR T细胞不同功能的原因我们进一步对CAR T细胞和肿瘤细胞孵育后,CAR T细胞的转录组学和代谢进行分析;最后我们针对不同结构的CAR T细胞所产生的不同生物学效应和其结构之间的关系进行了机制探索。研究结果:1.用流式检测双亲和力的CAR都能稳定的表达于T细胞的表面,但是PD1-BAT2的表达效率要低于其他结构的CAR的表达效率;2.PD1-BAT1,2增强了其对于CD19+PDL1+的细胞的生物学效应,但是PD1-BAT1表现出针对CD19-PDL1+的脱靶性杀伤;3.PD1-BAT2/3相比经典的二代CAR T细胞都表现除了抗原特异性的细胞因子分泌量减少;4.PD1-BAT2/3在NALM-6-PDL1负瘤的NSG小鼠模型中都表现出了抗肿瘤活性的增强并且延长了小鼠的生存曲线,但是PD1-BAT1细胞表现除了对NSG小鼠严重的脱靶效应——辐射样脱毛的不良反应和中枢神经系统受侵犯的偏头症状。5.PD1-BAT2/3在杀伤肿瘤的过程中表现出更“干性”的分化,更少的耗竭性T细胞表型;6.和经典的二代CAR T细胞相比,PD1-BAT3细胞在和NALM6-PDL1孵育之后其线粒体的耗氧率更高。7.相比较针对CD19靶点的经典二代CAR T细胞,PD1-BAT2/3降低了其对于CD19蛋白的亲和力。研究结论:我们在针对CD19靶点的经典的二代CAR T细胞结构的基础上构建出了可逆转PD1免疫抑制信号的二代CAR T细胞。其对于表达CD19和PDL1的肿瘤具有更好的抗肿瘤生物学效应且并不对只表达PDL1的细胞产生杀伤效应。有趣的是新型的双靶点CAR T细胞不仅能逆转PD1的免疫抑制效应同时在杀伤肿瘤的过程中还能分泌更少的细胞因子,因此新型的双亲和力CAR T细胞有可能会避免在CAR T的临床使用中所诱发的CRS。新型的双靶点CAR T细胞对于肿瘤的治疗可能提供一种更加有效且安全的方案。
郝文静[4]（2019）在《碱基切除修复酶OGG1调节炎症因子表达的机制研究》文中研究表明生物有氧呼吸代谢及外界环境因子会导致细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平的升高,细胞内活性氧的生成大于抗氧化酶系的清除速率的状态,被称为氧化应激（Oxidative Stress）。氧化应激引起机体大分子物质发生氧化,其中蛋白质,脂质及RNA的氧化产物会被降解进而被细胞重复利用,而DNA的损伤则必须修复才能保证基因组的保真性及完整性。由于鸟嘌呤（Guanine,G）的氧化还原电势最低,因此DNA最主要的氧化损伤产物是8-羟基鸟嘌呤（8-hydroxyguanine,8-oxoG）。8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）是真核细胞内特异性修复DNA上8-oxoG的修复蛋白,通过起始碱基切除修复途径（OGG1-BER）,识别并切除8-oxoG,随后招募其他蛋白来完成修复。DNA复制过程中8-oxoG既可与胞嘧啶（C）反式配对,也可与腺嘌呤（A）顺式配对,因而,两个细胞周期后,有可能引入GC配对到TA配对的突变。因而,基因组上8-oxoG的积累或OGG1修复能力的失常通常被认为是细胞衰老或癌变的主要诱因。尽管鸟嘌呤极易被氧化,8-oxoG又是潜在的致突变位点,脊椎动物基因的分布却倾向于GC含量较高的区域,而且超过72%的人类基因启动子拥有较高的GC含量。近年来,越来越多的证据表明,8-oxoG以及其特异的修复蛋白8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（OGG1）对基因转录具有表观遗传调控作用。我们实验室对OGG1转录功能的系列研究发现,细胞遭受ROS攻击时,氧化的OGG1与DNA的结合,使DNA发生弯曲,有利于转录因子NF-κB结合到基因的启动子区从而促进炎症因子CXCL1,TNFα转录,然而,OGG1促进基因转录是否依赖其酶切活性,OGG1在全基因组水平的募集情况、参与的生物学过程以及是否能以OGG1为靶点预防及治疗由氧化应激引起的疾病等科学问题依然有待进一步深入揭示。本研究:1)利用OGG1及其突变体质粒进行EMSA,qRT-PCR,RNA FISH,ChIP,Luciferase assay等实验证明了OGG1 K249Q突变体（只结合不切割DNA）可以结合并激活Cxcl2启动子从而促进转录的发生,而OGG1 C253A（结合及切割活性减弱）对Cxcl2启动子的活化及基因表达没有显着影响,说明氧化应激条件下,OGG1促进炎症基因表达不依赖于其酶切活性;2)通过ChIP-Sequencing,IGV和Gorilla软件分析并结合qRT-PCR,ChIP-qPCR和EMSA等技术,发现在全基因组水平上OGG1主要结合在基因的调控区域并参与炎症的调节（P=5.51E-07）,氧化应激（P=1.04E-23）,程序性细胞死亡的负调节（P=1.97E-11）,细胞代谢过程的正向调节（P=4.15E-09）等多个重要的生物学过程;3)根据OGG1的活性位点设计小分子化合物TH5487,利用qRTPCR,ChIP,EMSA,小鼠滴鼻,姬姆萨染色及HE染色等实验,发现TH5487能够阻止OGG1结合到DNA上,从而减少了NF-κB结合到炎症因子启动子区（不影响NF-κB与DNA的结合）,有效的抑制中性粒细胞向小鼠肺部的募集,从而减少肺部急性炎症的发生。而OGG1另一抑制剂O8（不影响OGG1-DNA的结合,只影响其切割活性）不影响炎症因子的表达。本文通过一系列基础研究,更加深入的揭示了OGG1作为表观遗传调控基因表达的分子机制;而我们以OGG1为靶点设计的小分子化合物可以治疗氧化应激引起的炎症反应,为治疗由OGG1引起的其他疾病提供美好的前景。
李研[5]（2019）在《以肿瘤坏死因子α结构为基础的小片段化合物筛选》文中提出1984年首次分离出两种不同的肿瘤坏死因子,发现它们可以诱导小鼠肿瘤消退。三十多年的研究显示TNF超家族包括19个配体和29个受体,这些配体调节正常的生命活动如造血,形态发生和免疫应答的同时,也与移植排斥反应,感染性休克,骨吸收,肿瘤发生,糖尿病,病毒复制和类风湿性关节炎等有关,表明该家族是一把双刃剑,这些细胞因子可诱导细胞存活,分化,增殖和凋亡,在许多国家肿瘤坏死因子阻滞剂已用于治疗各种肿瘤坏死因子相关自身免疫疾病。TNF-α在炎性肠病和类风湿性关节炎等自身免疫疾病中具有重要作用。在重度感染中TNF-α含量超过正常值,血管心肌张力和心肌收缩力降低,可能引起休克或血压降低。此外,高浓度的TNF-αα可降低血糖浓度,引起血管内血栓形成。因此,这些疾病的治疗可依赖于靶向作用于肿瘤坏死因子的药物。在本课题中,我们构建了TNF-α蛋白表达载体并得到了分辨率为3 A的蛋白晶体,我们希望可以利用这个晶体体系筛选到与TNF-α蛋白相互作用的小分子化合物,为与TNF相关疾病药物的开发奠定基础。
米博斌[6]（2019）在《改良型人源性防御素2通过诱导角质细胞增殖和迁移促进创面愈合》文中研究表明第一部分:改良型人源性防御素2的设计合成与检测目的:抗菌肽由于其广谱抗菌性等优点,越来越受到研究人员的广泛关注。然而,由于其高细胞毒性和低结构稳定性,很难在临床中广泛应用。通过对人源性防御素2的结构进行改造,可以有效的提高人源性防御素2的性能。方法:使用氨基酸残基替换,将人源性防御素2氨基酸序列中的GIGDP替换为APLAM,通过网上在线工具预测改良型人源性防御素2（A-h BD-2）的一级和二级结构,并观察改良型人源性防御素2对角质细胞的细胞毒性、耐盐性及其对金黄色葡萄球菌的抗菌作用。结果:在将人源性防御素2的结构改变后,抗菌肽的一级结构中阳离子数量和疏水性增加,其二级结构中也多了一个α螺旋结构。随后的实验也发现与人源性防御素2相比,改良型人源性防御素2对角质细胞的细胞毒性明显降低,对金黄色葡萄球菌的抗菌性能增加,并且其耐盐性也明显提高。结论:改良型人源性防御素2具有细胞毒性降低,抗菌性能高及结构稳定性增强等优点。第二部分:改良型人源性防御素2对角质细胞功能的影响及机制研究目的:成功改造人源性防御素2的结构后,观察其对细胞功能的影响。方法:使用改良型人源性防御素2刺激角质细胞,使用CCK8试剂盒和WB检测其对细胞增殖的影响,通过Transwell小室观察其对角质迁移的影响,并探究其中具体的作用机制。随后,观察人源性防御素2对角质细胞中钙离子的影响。最后,通过PCR和ELISA试剂盒检测人源性防御素2对细胞分泌炎性因子（白细胞介素6,白细胞介素10,α肿瘤坏死因子）和趋化因子（单核细胞趋化因子）的影响。结果:改良型人源性防御素2通过激活EGFR和STAT3信号通路促进角质细胞的增殖和迁移。此外,改良型人源性防御素促进细胞外钙离子向细胞内转移,并通过PLC信号通路影响抗炎因子、促炎因子和趋化因子的分泌。结论:改良型人源性防御素2促进角质细胞的增殖、迁移、刺激钙离子内流和促进炎性因子以及趋化因子分泌的作用。第三部分:改良型人源性防御素2对大鼠皮肤创面愈合的影响目的:改良型人源性防御素在细胞水平取得成功后,需要进行体外实验,观察其对创面愈合的作用。方法:成功构建大鼠皮肤创面模型,将大鼠随机分成三组,分别用PBS,人源性防御素2和改良型人源性防御素2干预创面愈合,分别于第0天,第3天,第5天,第7天和第10天对创面拍照并计算创面愈合的速度,随后通过HE染色测量创面处表皮层的厚度。结果:与对照组相比,改良型人源性防御素可以有效的促进创面愈合,增加创面处上皮层的厚度。结论:我们的实验结果表明A-h BD-2可以促进创面愈合,说明A-h BD-2是一种治疗创面修复的潜在药物。本次实验数据也为后期开展临床实验提供了理论基础。
欧阳清[7]（2017）在《单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定》文中认为HER2(p185erb B2/neu)是EGFR家族的成员,在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞中高表达,是肿瘤恶性行为以及不良预后的标志。靶向治疗是HER2阳性肿瘤的重要治疗手段,主要包括靶向HER2的单克隆抗体、单链抗体偶联效应分子等策略。HER2治疗性单克隆抗体能够有效抑制肿瘤细胞增殖、延长生存期,是HER2阳性进展期乳腺癌及胃癌的一线疗法。这些HER2靶向的治疗性抗体都由鼠源单克隆抗体经人源化改造而来,长期应用未观察到严重的免疫原性相关副作用。HER2单链抗体来源于单克隆抗体,常与生物效应分子融合表达或者表达于T细胞表面（CAR-T）靶向杀伤肿瘤细胞,具有广泛的应用价值。对鼠源单链抗体的人源化改造,是以其为基础的肿瘤靶向杀伤策略走向临床的重要一环。本研究以本组前期系列验证的、靶向效果明确的鼠源单链抗体e23sFv为模板,拟解决两个关键问题:一是在探索单链抗体人源化的技术改进;二是评价该人源化单链抗体用于肿瘤靶向治疗的有效性。针对第一个关键问题,本研究进行了两方面新的摸索。首先,在传统的鼠源互补决定区（CDR）—人源框架区（FR）移植策略的基础上,拓宽了人源化改造FR模板的选择范围,既选了与e23sFv同源性最高的全人抗体特异序列,也选了与e23sFv同源性最高的全人抗体亚类的通用序列,并将二者对比,为抗体人源化的FR模板选择提供线索。其次,针对所选的人源抗体亚类通用序列,将FR关键残基突变回鼠源亲本,以维持抗原构象、避免丧失亲和力。传统的突变策略有两种:一是定点突变,前提是抗体结构信息必须明确;二是随机突变,虽然可提高亲和力的多样性,但筛选工作量大。我们尝试将这二者相结合,选择13个关键氨基酸位点分别设计定点突变引物,同时又通过设计同位点的不突变对照、引物的随机组合分组等方法,增加这13个位点随机突变与组合的几率,最终结合噬菌体抗体展示技术,建立了库容为213的突变抗体库,经4轮亲和力淘选和噬菌体ELISA筛选,获得4株高亲和力的人源化单链抗体。基于上述构建和筛选,本研究得到2株特异序列来源的人源化单链抗体SGF1、SGF2,4株通用序列来源的人源化单链抗体P1h2、P1h3、P2h2、P2h5。通过同源建模的方法,模拟了e23sFv、SGF1、P1h2的结构并与HER2分子进行对接,预测人源化单链抗体的识别表位位于HER2胞外段第IV结构域,且SGF1主链碳原子构象比P1h2更接近e23sFv,而P1h2与HER2相互作用能比SGF1更强。经过原核蛋白表达纯化、包涵体复性,获得蛋白纯度大于90%,进行功能评价:（1）亲和力:通过表面等离子共振实验（SPR）观察人源化单链抗体对人重组HER2的亲和力,结果显示P1h2、P1h3、SGF1比e23sFv提高约10倍,P2h2、P2h5则与e23sFv相当;细胞ELISA观察它们对细胞表面天然表达HER2的亲和力,结果与SPR实验一致。（2）识别表位:荧光素标记人源化单链抗体,竞争性流式细胞术观察到,人源化单链抗体的HER2识别表位与e23sFv相同。（3）内化活性:激光共聚焦显微镜观察结果表明,荧光素标记的人源化单链抗体P1h2、P1h3、SGF1能够特异性结合并内化进入HER2阳性细胞;P2h2、P2h5、SGF2则不能内化。（4）免疫原性:ELISPOT及抗体偶联磁珠技术检测人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平,结果表明,人源化单链抗体刺激PBMCs产生IFN-γ、TNF-α细胞因子的水平较鼠源单链抗体大幅下降,减少到鼠源单链抗体刺激水平的1/20。值得注意的是,特异序列来源的SGF1比通用序列来源的4株人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平更高,提示其免疫原性相对较强。综上,我们从6株不同序列来源的人源化单链抗体中,优选出两株免疫原性低、亲和力高并且具有内化活性的单链抗体P1h2和P1h3,进行后续功能研究。针对第二个关键问题,我们探索了P1h2和P1h3用于两种靶向治疗策略的有效性:一是基于补体依赖的细胞毒作用（CDC）的间接肿瘤杀伤;二是基于本组前期建立成熟的免疫促凋亡策略的直接肿瘤杀伤。（1）CDC策略:在人源化单链抗体的C端融合表达人IgG1Fc,构建获得系列scFv-Fc融合蛋白,进行真核系统表达纯化。流式细胞术和体外CDC实验结果表明,P1h2-Fc、P1h3-Fc融合蛋白均能与HER2阳性肿瘤细胞特异性结合,间接杀伤肿瘤细胞。HER2高表达的乳腺癌细胞及中度表达的肺癌细胞中,P1h2-Fc、P1h3-Fc的杀伤作用均强于e23sFv-Fc。（2）免疫促凋亡策略:将人源化单链抗体构建替换入课题组前期建立的免疫促凋亡分子,获得scFv-Fdt-tBid,进行原核系统可溶表达纯化。流式细胞术和细胞杀伤实验观察到,P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid能够特异性结合HER2阳性肿瘤细胞,有效抑制细胞增殖;在HER2高表达的乳腺癌细胞、胃癌细胞、中度表达的肺癌细胞中,二者对肿瘤细胞的增殖抑制与e23sFv-Fdt-tBid相当。体内实验分别采用NOD-SCID鼠的三种不同荷瘤模型（乳腺癌原位瘤、胃癌原位瘤、肺癌皮下移植瘤）,明确观察到人源化改构免疫促凋亡分子的体内抗肿瘤活性。在乳腺癌和胃癌模型中,P1h2-Fdt-t Bid、P1h3-Fdt-tBid的肿瘤抑制作用强于e23sFv-Fdt-tBid;而肺癌模型中,二者的抗肿瘤作用与e23sFv-Fdt-tBid相当。综上所述,本研究通过优化CDR移植策略,针对抗HER2鼠源单链抗体e23sFv进行人源化改构,成功筛选获得免疫原性降低、亲和力提高并具有内化活性的两株人源化单链抗体P1h2、P1h3,并通过体内外实验验证其用于CDC策略和免疫促凋亡策略的有效性,为单链抗体为导向的融合蛋白的人源化改造、安全性评价提供了实验依据。
李潜[8]（2016）在《抗TNFα抗体的基因工程表达》文中进行了进一步梳理人肿瘤坏死因子（Tumour necrosis factor alpha,TNFα）是一种多功能性的细胞因子,既参与造血、免疫监视和避免细菌感染等正常的生理过程,又在类风湿性关节炎、移植排异和肿瘤发生等病理过程中扮演着重要的角色。因此,目前靶向于TNFα的抗体及其他拮抗剂已成为全球最炙手可热的生物药物。然而,目前我国在抗TNF α抗体的产业化方面还完全处于空白。鉴于此,本课题围绕抗TNFα人鼠嵌合型抗体（英夫利昔单抗）和抗TNFα纳米抗体（TNF60）展开了以下研究:一方面,本课题通过酶联免疫检测方法对前期转染英夫利昔单抗真核表达质粒后得到的一系列中华仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells,CHO）单克隆进行了筛选与鉴定,然后通过亲和纯化方法对所选单克隆细胞株培养上清中的目的抗体进行纯化,并进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。最终,本课题筛选得到了4株高表达英夫利息单抗的CHO细胞克隆,制备了以非聚集体形式存在于溶液中的英夫利息单抗,纯度为87%,浓度为6 mg/mL。另一方面,本课题将TNF60的编码基因连接到pET-22b和pET-28a质粒中,构建获得了 TNF60的原核表达质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）Rosetta（DE3）中,筛选得到了 TNF60的两种基因工程表达菌,通过响应面法优化确定TNF60的最佳培养条件为:SB培养基,0.1mMIPTG,培养温度为22℃,诱导后培养时间为14 h。经过固相Co2+亲和纯化之后得到纯度为95%的TNF60重组蛋白,经质谱分析显示目的蛋白序列正确、免疫印迹（Western blot）证实重组蛋白具有良好的抗原结合活性,能够有效的作用于TNF α。最后,我们用卡拉胶致小鼠足肿胀炎症模型对TNF60的体内抗炎活性进行了分析。结果显示,重组TNF60能够有效抑制小鼠炎症,给药2 h后,其在66 mg/Kg的剂量下的抑制效果与200mg/Kg剂量下的阳性对照药物阿司匹林相当。
刘运超[9]（2012）在《人源化单链抗体噬菌体库的构建及抗TNF-α抗体的筛选》文中研究表明抗体是体液免疫系统的重要组成部分，也在生命科学研究、疫病检测和医药领域发挥着重要作用。噬菌体展示技术是人源治疗性抗体的重要技术来源之一。TNF-α是一种前炎症因子，与风湿性关节炎等多种疾病的发生密切相关。本研究采用噬菌体抗体展示技术构建一个人源噬菌体抗体库，并从中筛选出具有TNF-α细胞毒活性抑制作用的人源单链抗体。依据文献报道的人抗体恒定区序列及人源抗体各胚系基因序列，本研究设计42条引物，以200份人外周血中分离的总RNA为模板，利用这些引物扩增出了抗体的重链（VH）和轻链（VL）可变区基因。抗体重链可变区的扩增和组装采用三轮OE-PCR反应完成：首先分别扩增VH的CDR1、CDR2、CDR3和FR3，然后采用OE-PCR拼接重链的CDR1和CDR2、CDR3和FR3的基因片段，再将两者拼接成完整的人抗体VH基因。VL基因的扩增采用PCR方法从总RNA中经多次反应获得，再将其与VH基因连接形成完整的scFv基因。噬菌体库的构建采用载体pCANTAB5E、E.coli TG1和辅助性噬菌体M13KO7。将scFv基因插入pCANTAB5E载体酶切位点Sfi I和Not I之间，并将新载体转化E.coli TG1。辅助噬菌体M13KO7侵染转化后的TG1，构建scFv噬菌体库。梯度稀释法测得噬菌体库库容为2.5×107，噬菌体滴度为1012pfu。基因测序显示E.coli TG1中转化DNA与预期相符，抗体重链各区域组合正确，VH和VL之间有柔性多肽编码基因相连。采用微孔板筛选法以人TNF-α、禽流感NS1蛋白、人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白OVA和PRRSV病毒GP5蛋白对文库进行淘选，结果显示五种蛋白在淘选过程中均能有效富集。为获得高亲和力的抗TNF-α抗体，依据phage ELISA实验结果从随机挑选的87株重组噬菌体中筛选出4株阳性克隆进行重组蛋白表达和抗TNF-α活性测试。重组蛋白的表达采用pET-28a载体和大肠杆菌BL21（DE3）菌株。IPTG诱导后SDS-PAGE电泳显示scFv重组蛋白在大肠杆菌中大量表达，重组蛋白的表达量占菌体量的40%左右，经镍柱纯化的蛋白纯度在90%以上。MTT法检测TNF-α杀伤L292细胞的活性，显示在放线菌素为10μg/mL时，TNF-α的ED50为0.01ng/mL。重组蛋白B11和A24对TNF-α的IC50分别为70μg/mL和100μg/mL。本研究构建、鉴定了人源scFv噬菌体抗体库，并从中筛选了2株具有抗TNF-α活性的人源scFv，为抗TNF-α抗体药物的研发奠定了基础。
赵小玲,陈伟强,冯红,沈成凤,纪艳,李静梅,张素娟,杨志华[10]（2011）在《基于核糖体展示技术进行抗狂犬病毒人源抗体的制备》文中认为构建了核糖体展示人源抗狂犬病毒单链抗体（scFv）库,筛选制备特异抗狂犬病毒糖蛋白（RVGp）的稳定性人源抗体.应用核糖体抗体库技术,从经狂犬病毒Vero疫苗免疫的志愿者外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示scFv基因库.体外转录翻译后,以RVGp重组蛋白作筛选抗原,采用亲和富集法淘选RVGp特异性scFv抗体基因.在原核系统pET22b（+）/BL21（DE3）中实现scFv抗体片段的可溶性表达,ELISA鉴定阳性克隆.然后对筛选的scFv进行稳定性改构,构建VH-Lc-VK稳定性抗体,并对其生物学活性进行初步研究.成功构建了库容量约为6.2×1012的核糖体展示scFv抗体基因库.在180个筛选克隆中,克隆RB24、RB71、RB109和RB156显示出较高的ELISA值,其基因序列分析结果显示,它们是全新的人源抗RVGp抗体.改构后的抗RVGp VH-Lc-VK抗体的稳定性明显改进,可特异识别RVGp并有效中和狂犬病毒,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染.以上结果表明,人源抗RVGp特异性抗体的获得,为狂犬病的有效预防、诊断和治疗提供了新的途径,而且将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础.
二、人源性抗TNFα小分子抗体的改构和分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源性抗TNFα小分子抗体的改构和分析（论文提纲范文）
（1）新型STING激动剂的设计、合成及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 cGAS-STING信号通路 |
| 1.2 STING激活的结构基础 |
| 1.3 与STING相关的疾病 |
| 1.3.1 STING与微生物感染性疾病 |
| 1.3.2 STING与癌症 |
| 1.3.3 STING和自身免疫性疾病 |
| 1.4 STING调节剂的发展 |
| 1.4.1 STING的激动剂 |
| 1.4.2 STING的拮抗剂 |
| 1.5 本章小结 |
| 第2章 新型STING激动剂的设计思路 |
| 2.1 STING激动剂的研究进展 |
| 2.2 基于STING晶体复合物设计新型STING激动剂 |
| 2.2.1 对DMXAA和 CMA与 mSTING共晶结构的研究 |
| 2.2.2 广谱STING激动剂的设计思路 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 新型STING激动剂的合成 |
| 3.1 化学合成路线 |
| 3.1.1 DMXAA类似物的合成路线 |
| 3.1.2 吖啶酮类化合物的合成路线 |
| 3.2 化学合成方法 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 筛选和确定小分子STING激动剂 |
| 4.1 实验原理 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 预处理 |
| 4.3.2 诱导STING细胞系的实验过程 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 初步活性筛选 |
| 4.4.2 效力确定筛选 |
| 4.4.3 化合物的构效关系分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 分子水平的机制研究 |
| 5.1 蛋白水平的机制研究 |
| 5.1.1 基于均相时间分辨荧光技术的蛋白水平筛选 |
| 5.1.2 等温滴定量热法测定配体与蛋白的结合力 |
| 5.1.3 蛋白水平的机制讨论 |
| 5.2 诱导免疫因子的机制研究 |
| 5.2.1 实验原理 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 实验结果与讨论 |
| 5.3 本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介及博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 SCFV的国内外研究进展 |
| 1.1.1 抗体分子 |
| 1.1.2 抗体多样性依赖于基因重排 |
| 1.1.3 抗体库的类型 |
| 1.1.4 scFv的发展 |
| 1.1.5 scFv的应用进展 |
| 1.2 SCFV的表达研究进展 |
| 1.2.1 scFv的表达系统 |
| 1.2.2 scFv在毕赤酵母中的表达情况 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达菌株 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达载体 |
| 1.4 毕赤酵母的密码子偏好性 |
| 1.5 ADAM17 SCFV及 MT1-MMP SCFV |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 人源单链抗体库的构建 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、噬菌体及血液来源 |
| 2.1.2 常用的培养基 |
| 2.1.3 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 常用仪器 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 人淋巴细胞的分离纯化 |
| 2.2.2 人血淋巴细胞中总RNA提取 |
| 2.2.3 c DNA的合成 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 DNA片段纯化回收 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 噬菌粒p CANTAB5E与 scFv片段的连接 |
| 2.2.8 大肠杆菌TG1 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 辅助噬菌体扩增 |
| 2.2.10 辅助噬菌体的滴定 |
| 2.2.11 大肠杆菌TG1 的电转化 |
| 2.2.12 辅助噬菌体感染TG1 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 人淋巴细胞的分离纯化及总RNA提取 |
| 2.3.2 抗体VH与VL片段的获得 |
| 2.3.3 ScFv片段的获得 |
| 2.3.4 噬菌体scFv抗体库的构建 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 第三章 单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及质粒来源 |
| 3.1.2 常用培养基 |
| 3.1.3 常用试剂及试剂盒 |
| 3.1.4 常用仪器 |
| 3.1.5 引物序列 |
| 3.1.6 重组质粒与菌株 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 PCR反应 |
| 3.2.2 酶切反应 |
| 3.2.3 GS115 感受态细胞的制备 |
| 3.2.4 毕赤酵母电转化 |
| 3.2.5 毕赤酵母外源蛋白诱导表达及收集 |
| 3.2.6 酵母基因组提取 |
| 3.2.7 Western Blot |
| 3.2.8 A17-scFv(HS)的纯化 |
| 3.2.9 A17-scFv(HS)的活性检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 毕赤酵母密码子对优化软件的开发 |
| 3.3.2 ADAM17 scFv及 MT1-MMP scFv基因序列的优化 |
| 3.3.3 密码子对偏好性影响scFv的表达 |
| 3.3.4 ScFv片段密码子对优化相比于传统密码子优化的序列在毕赤酵母中的表达量高 |
| 3.3.5 同义密码子在密码子及密码子对优化序列中的使用情况不同 |
| 3.3.6 在密码子优化序列中存在许多得分低的密码子对 |
| 3.3.7 毕赤酵母表达的A17-scFv具有生理活性 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）靶向CD19和PDL1的新型双亲和力CAR T细胞的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 CART细胞的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 健康供者的PBMC |
| 1.1.2 慢病毒 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 CAR的结构示意图 |
| 1.2.2 CAR结构的序列 |
| 1.2.3 慢病毒载体示意图 |
| 1.2.4 分选PBMC细胞 |
| 1.2.5 分选CD3~+T细胞 |
| 1.2.6 转染CAR的慢病毒 |
| 1.2.7 CAR T细胞的表达效率的检测 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 结果讨论 |
| 第二章 CART的体外功能实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 检测肿瘤细胞系CD19和PDL1的表达 |
| 2.2.2 制备表达CD19和PDL1的细胞系 |
| 2.2.3 CART细胞对表达CD19+/-和或PDL1+/-靶细胞杀伤效率的检测 |
| 2.2.4 CAR T细胞对786o和786o-CD19 细胞的杀伤(显微镜观察结果) |
| 2.2.5 CART细胞和肿瘤细胞孵育24h之后,培养液上清细胞因子的检测(ELAS检测法) |
| 2.2.6 CAR T细胞和肿瘤细胞孵育之后的细胞因子的检测(LEGNplex TM human panel多因子试剂盒检测法) |
| 2.2.7 CAR T细胞和对CD19 蛋白亲和力的检测 |
| 2.2.8 CART细胞的特异性增殖 |
| 2.2.9 CAR T细胞的表型检测 |
| 2.2.10 CAR T 细胞和 NALM-6 细胞孵育之后的抑制 marker 表达 |
| 2.2.11 CAR T 细胞和 NALM-6-PDL1 孵育之后的 CAR T 细胞的转录组分析 |
| 2.2.12 CAR T 细胞的线粒体压力检测 |
| 2.2.13 CAR T 细胞的糖酵解速率检测 |
| 2.2.14 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 肿瘤细胞系 CD19 和/或 PDL1 的表达情况 |
| 2.3.2 CAR T细胞对于CD19-PDL1-和CD19+PDL1-细胞的杀伤效率 |
| 2.3.3 CAR T细胞对于CD19+PDL1+细胞的杀伤效率 |
| 2.3.4 CAR T细胞对于CD19-PDL1+细胞的杀伤效率 |
| 2.3.5 CART细胞对于K562, K562-PDL1, NALM-6-PDL1 和NALM-6-PDL1 细胞的杀伤效率 |
| 2.3.6 PD1-BAT1,2细胞的特异性增殖 |
| 2.3.7 PD1-BAT3细胞的特异性增殖 |
| 2.3.8 倒置显微镜下CART细胞对肿瘤细胞的杀伤效果 |
| 2.3.9 荧光显微镜下CART细胞对肿瘤细胞的杀伤效果 |
| 2.3.10 CAR T细胞IFN-γ,TNF-α和 IL-2 的分泌量的检测 |
| 2.3.11 CAR T细胞IFN-γ,IL-21,TNF-α,IL-10,IL-2和IL-6 的分泌量的检测 |
| 2.3.12 CAR T细胞对于CD19 蛋白的亲和力 |
| 2.3.13 CART细胞在培养过程中的增殖情况 |
| 2.3.14 CART的分化表型检测 |
| 2.3.15 PD1-BAT2/3CART细胞分别和NALM-6 细胞孵育24 小时后其免疫抑制marker的差异检测 |
| 2.3.16 2G-T 和 PD1-BAT2 代谢和分化的转录组的差异 |
| 2.3.17 2G-T 和 PD1-BAT3 代谢和分化的转录组的差异 |
| 2.3.18 残余肿瘤细胞的检测 |
| 2.3.19 PD1-BAT3 的有氧代谢速率比2G-T细胞更高 |
| 2.3.20 PD1-BAT3 细胞和2G-T细胞的ECAR速率类似 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.4.1 不同结构的CART细胞具有不同的靶向性 |
| 2.4.2 铰链区和跨膜区的长度影响CART细胞的功能 |
| 2.4.3 CART细胞对靶蛋白的亲和力影响其功能 |
| 2.4.4 PD1-BAT2/3 和肿瘤细胞孵育后其抑制分子的marker表达量比经典二代CART细胞的表达量更低 |
| 2.4.5 PD1-BAT2/3CART细胞的代谢模式和分化表型预示着更好的抗肿瘤活性 |
| 2.4.6 T细胞的代谢类型和其分化表型有密切的关系 |
| 2.4.7 改变代谢的类型来增强T细胞的功能 |
| 2.4.8 优化CAR的结构促进其抗肿瘤的能力 |
| 2.4.9 通过转染特定类型的T细胞以提高CART细胞的安全性和有效性 |
| 2.4.10 改变CAR T细胞的微环境来增强CAR T细胞的功能 |
| 2.4.11 CART治疗肿瘤过程中不良反应的讨论 |
| 第三章 CART细胞的动物实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验所用小鼠和细胞 |
| 3.1.2 实验试剂,耗材和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PD1-BAT2 细胞回输给NSG负瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型 |
| 3.2.2 PD1-BAT3 细胞回输给NSG负瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 回输不同的CART细胞之后对NSG小鼠的肿瘤负荷的活体成像 |
| 3.3.2 回输不同的CAR T细胞之后对NSG小鼠的肿瘤负荷的荧光强度变化 |
| 3.3.3 小鼠的生存曲线的统计 |
| 3.3.4 PD1-BAT1组NSG小鼠会出现辐射样不良反应 |
| 3.3.5 回输不同CAR T细胞之后NSG小鼠的肿瘤负荷的活体成像 |
| 3.3.6 小鼠的肿瘤负荷的变化 |
| 3.3.7 小鼠的生存曲线 |
| 3.3.8 小鼠体内的细胞因子(IFN-γ和 IL2)变化情况 |
| 3.4 结果讨论 |
| 第四章 探索CAR的结构和CAR T细胞功能的关系 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂和耗材 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法:CART的构建及功能验证 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CART细胞的体外杀伤结果 |
| 4.3.2 CART细胞的细胞因子分泌量 |
| 4.3.3 在NALM-6 的高肿瘤负荷的NSG小鼠中,不同结构的CART细胞对于肿瘤负荷的控制 |
| 4.3.4 流式检测小鼠不同脏器的肿瘤负荷 |
| 4.3.5 在NALM-6 的低肿瘤负荷的NSG小鼠中,不同结构的CART细胞对于肿瘤负荷的控制 |
| 4.4 结果讨论 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 不同CAR的核苷酸序列 |
| 附录 B 综述 改进CAR-T细胞有效性和安全性的设计策略 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（4）碱基切除修复酶OGG1调节炎症因子表达的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词及中文对照 |
| 一、引言 |
| (一)氧化应激 |
| 1.活性氧(ROS)的形成及清除 |
| 2.ROS的作用 |
| (二)DNA的氧化及修复 |
| 1.鸟嘌呤的氧化 |
| 2.碱基切除修复 |
| 3.8 -oxoG修复酶-OGG1 |
| (三)OGG1 的翻译后修饰对其活性的影响 |
| 1.乙酰化修饰 |
| 2.磷酸化修饰 |
| 3.糖基化修饰 |
| 4.氧化修饰 |
| (四)OGG1 与基因转录的关系 |
| 1.OGG1-BER介导的G-quadruplex影响基因表达 |
| 2.OGG1-BER招募拓扑异构酶促进基因表达 |
| 3.OGG1 招募染色质改构复合物影响基因表达 |
| 4.OGG1非BER酶切活性依赖的基因表达调控作用 |
| 5.8 -oxoG·OGG1 复合物作为鸟苷酸交换因子活化小GTP蛋白 |
| (五)本文的立题依据,研究内容及意义 |
| 二、实验材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1.细胞 |
| 2.试剂及试剂盒 |
| 3.抗体 |
| 4.实验仪器 |
| (二)实验方法 |
| 1.细胞培养 |
| 2.定点突变质粒的构建 |
| 3.质粒提取 |
| 4.脂质体转染 |
| 5.总 RNA提取,反转录及荧光实时定量PCR检测 |
| 6.双荧光素酶报告系统检测 |
| 7.全细胞裂解液提取 |
| 8.蛋白质免疫共沉淀 |
| 9.蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 10.凝胶迁移实验(EMSA) |
| 11.寡核苷酸切割实验 |
| 12.RNA原位杂交实验 |
| 13.染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 14.融合蛋白诱导表达 |
| 15.小鼠部分实验 |
| 三、实验结果与分析 |
| (一)氧化应激状态下,OGG1 促进基因转录不依赖其催化活性 |
| (二)OGG1 富集到全基因组的情况及其参与的生物学进程 |
| (三)OGG1 募集到启动子区的生物学功能 |
| 1.在 IIR信号通路中,OGG1与NF-κB共同参与的生物学过程 |
| 2.OGG1 招募转录因子NF-κB促进炎症基因表达 |
| (四)以OGG1 为靶点治疗氧化应激条件下的炎症反应 |
| 四、讨论 |
| (一)OGG1 促进炎症基因表达不依赖其酶切活性 |
| (二)OGG1 在全基因组水平的募集及其参与的生物学进程 |
| 1.氧化应激时,OGG1 可以长时间结合在特定的DNA序列上 |
| 2.OGG1 可参与调节细胞内多种生物学事件 |
| 3.OGG1 促进转录的机制因靶标基因不同而有所差异 |
| (三)以OGG1 为靶点治疗急性炎症反应 |
| 结论 |
| 创新点 |
| (一)直接证明了OGG1 促进炎症基因转录不依赖其酶切活性 |
| (二)揭示了OGG1 在生物学事件中的重要作用 |
| (三)以OGG1 为靶点可以治疗急性肺炎 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（5）以肿瘤坏死因子α结构为基础的小片段化合物筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 TNF家族简介 |
| 1.2 TNF简介 |
| 1.2.1 TNF的发现 |
| 1.2.2 TNF的分类 |
| 1.3 TNFR简介 |
| 1.3.1 TNFR超家族结构特征 |
| 1.3.2 TNFR的结构 |
| 1.4 TNF及TNFR相关生物学功能 |
| 1.4.1 TNFR诱导细胞死亡 |
| 1.4.2 TNFR诱导NF-κB信号通路 |
| 1.4.3 TNFR诱导炎症 |
| 1.4.4 TNFR诱导病毒变异 |
| 1.4.5 TNF抗病毒抗细菌活性 |
| 1.4.6 TNF是炎症的生理介质 |
| 1.4.7 TNF及TNFR相关疾病 |
| 1.5 TNF抑制剂 |
| 1.5.1 大分子抑制剂 |
| 1.5.1.1 奥那西普(ONE) |
| 1.5.1.2 依那西普(IETA)商品名Enbrel |
| 1.5.1.3 CD571(Humicade) |
| 1.5.1.4 格利木单抗(GOL)商品名Simponi |
| 1.5.1.5 阿达木单抗(ADA)商品名Humira |
| 1.5.1.6 赛妥珠单抗(CERT)商品名Cimzia |
| 1.5.1.7 英夫利昔单抗(IFX)商品名Remicade |
| 1.5.1.8 TNF抑制剂作用机理 |
| 1.5.1.9 TNF大分子抑制剂不良反应 |
| 1.5.1.9.1 感染风险 |
| 1.5.9.1.2 免疫原性 |
| 1.5.9.1.3 恶性肿瘤 |
| 1.5.2 TNF小分子抑制剂 |
| 1.5.2.1 沙利度胺 |
| 1.5.2.2 姜黄素 |
| 1.5.2.3 p38 MAP激酶抑制剂 |
| 1.5.2.4 TACE是一种金属蛋白酶 |
| 1.6 TNF-α小分子抑制剂研究进展及立题意义 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.7 结构生物学背景 |
| 1.7.1 结构生物学概述 |
| 1.7.2 晶体结晶过程 |
| 1.7.3 影响晶体结晶的因素 |
| 1.7.4 晶体结晶方法 |
| 1.7.5 蛋白晶体的优化 |
| 1.7.6 X-ray小角散射实验 |
| 1.7.7 动态光散射实验 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 质粒和菌株 |
| 2.4 实验相关试剂配制 |
| 2.4.1 琼脂糖凝胶电泳相关试剂配制 |
| 2.4.2 DNA片段回收与大肠杆菌质粒提取所用试剂配制 |
| 2.4.3 大肠杆菌感受态细胞制备所需的溶液配制 |
| 2.4.4 大肠杆菌表达重组蛋白所需试剂配制 |
| 2.4.5 纯化重组蛋白相关试剂 |
| 2.4.6 SDS-PAGE凝胶电泳相关试剂 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 表达质粒的构建 |
| 2.5.1.1 引物设计 |
| 2.5.1.2 目的基因扩增 |
| 2.5.1.3 PCR产物回收 |
| 2.5.1.4 表达载体构建 |
| 2.5.2 感受态细胞的制备 |
| 2.5.2.1 实验前准备工作 |
| 2.5.2.2 感受态制备过程 |
| 2.5.3 质粒转化 |
| 2.5.4 蛋白试表达 |
| 2.5.5 蛋白大量表达 |
| 2.5.6 重组蛋白纯化 |
| 2.5.6.1 破碎 |
| 2.5.6.2 亲和层析 |
| 2.5.6.3 凝胶过滤层析 |
| 2.5.6.4 离子交换层析 |
| 2.5.6.5 脱盐层析 |
| 2.5.7 SDS-PAGE检测目的蛋白 |
| 2.5.8 蛋白与小分子化合物作用研究 |
| 2.5.8.1 P1217 0212盘小分子筛选 |
| 2.5.8.2 编号为:P1217 0226,0227,0228,0229盘的小分子筛选 |
| 2.5.9 动态光实验 |
| 2.5.10 蛋白结晶 |
| 2.5.10.1 小分子复合物晶体筛选 |
| 2.5.10.2 晶体结构解析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组表达载体的构建 |
| 3.1.1 目的片段的扩增结果 |
| 3.1.2 表达载体的构建 |
| 3.2 不同长度重组蛋白试表达结果 |
| 3.3 不同长度目的蛋白破碎结果 |
| 3.4 不同长度TNF-α蛋白亲和层析结果 |
| 3.5 TNF-α蛋白凝胶过滤层析结果 |
| 3.6 TNF-α蛋白(77-233, PET-28a, C-his tag)结晶初筛 |
| 3.7 TNF-α蛋白(77-233,PET-28a,N-his tag)表达纯化 |
| 3.7.1 脱盐凝胶过滤层析 |
| 3.7.2 阳离子交换层析 |
| 3.8 动态光实验 |
| 3.9 蛋白小角散射实验 |
| 3.10 蛋白结晶 |
| 3.10.1 晶体优化 |
| 3.11 小分子药物筛选 |
| 4 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）改良型人源性防御素2通过诱导角质细胞增殖和迁移促进创面愈合（论文提纲范文）
| 中英文缩写词表 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分:改良型人源性防御素2的设计合成与检测 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分:改良型人源性防御素2对角质细胞的影响及机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分:改良型人源性防御素2对大鼠皮肤创面愈合的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 (攻读博士学位期间发表论文及其他情况) |
| 致谢 |
（7）单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、HER2阳性肿瘤及其靶向治疗 |
| 二、抗体药物的免疫原性 |
| 第一部分 单链抗体e23s Fv的人源化基因构建及噬菌体筛选 |
| 第二部分 人源化单链抗体的原核表达、纯化和功能分析 |
| 第三部分 人源化单链抗体P1h2、P1h3在HER2靶向肿瘤杀伤中的应用 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）抗TNFα抗体的基因工程表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 TNFα、受体及其信号通路与相关疾病 |
| 1.1.1 TNFα简介 |
| 1.1.2 TNFα受体及信号通路 |
| 1.1.3 TNFα参与的病理过程 |
| 1.2 TNFA阻断试剂的研制状况 |
| 1.2.1 TNFα的小分子抑制剂 |
| 1.2.2 阻断TNFα的生物药物 |
| 1.3 纳米抗体概述 |
| 1.3.1 纳米抗体的结构 |
| 1.3.2 纳米抗体的制备 |
| 1.3.3 纳米抗体的应用 |
| 1.4 本课题研究的目的、内容与意义 |
| 1.4.1 课题的目的与意义 |
| 1.4.2 课题的内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.1.6 主要培养基的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 英夫利昔单克隆抗体的制备 |
| 2.2.2 纳米抗体TNF60的制备 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 英夫利昔单克隆抗体的CHO细胞表达制备 |
| 3.1.1 英夫利息单抗高表达稳转细胞系的筛选 |
| 3.1.2 抗体的纯化与定量 |
| 3.1.3 细胞系-3的低血清培养 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.2 纳米抗体TNF60的E.coli制备 |
| 3.2.1 质粒pET22-tnf60和pET28-tnf60的构建 |
| 3.2.2 TNF60的诱导表达 |
| 3.2.3 TNF60蛋白序列的验证 |
| 3.2.4 TNF60蛋白的纯化与定量 |
| 3.2.5 TNF60的表达优化 |
| 3.2.6 TNF60的活性检测 |
| 3.2.7 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（9）人源化单链抗体噬菌体库的构建及抗TNF-α抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 国内外研究进展 |
| 1.1 免疫系统 |
| 1.1.1 免疫器官 |
| 1.1.2 免疫细胞 |
| 1.1.3 免疫相关分子 |
| 1.1.3.1 抗体的种类与结构 |
| 1.1.3.2 抗体多样性的分子基础 |
| 1.1.3.3 抗体的功能与特性 |
| 1.2 抗体药物研究进展 |
| 1.2.1 治疗性抗体的应用 |
| 1.2.2 治疗性抗体的作用机制 |
| 1.2.3 治疗性抗体的制备技术 |
| 1.2.3.1 单克隆抗体技术 |
| 1.2.3.2 基因工程抗体技术 |
| 1.3 噬菌体抗体展示技术 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术原理 |
| 1.3.2 噬菌体抗体展示技术 |
| 1.3.3 噬菌体抗体库分类 |
| 1.3.4 噬菌体抗体库的筛选 |
| 1.4 TNF-α与 TNF-α抑制剂 |
| 1.4.1 TNF-α与 TNF-α受体 |
| 1.4.2 TNF-α的生物学功能 |
| 1.4.3 TNF-α抑制剂 |
| 第二章 研究目的意义及技术方案 |
| 2.1 本研究的目的和意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 天然人源 scFv 噬菌体抗体库的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 载体、菌株及血样来源 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要培养基配方 |
| 3.2.4 主要溶液配方 |
| 3.2.5 引物及其序列 |
| 3.2.6 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 人淋巴细胞的分离纯化 |
| 3.3.2 总 RNA 提取 |
| 3.3.3 cDNA 的合成 |
| 3.3.4 DNA 片段回收 |
| 3.3.4.1 DNA 凝胶电泳检测及切胶回收 |
| 3.3.4.2 反应液中直接回收 DNA |
| 3.3.4.3 DNA 片段的乙醇沉淀 |
| 3.3.5 scFv 基因克隆及拼接 |
| 3.3.5.1 抗体 VH 基因的克隆及装配 |
| 3.3.5.2 抗体 VL 基因的克隆 |
| 3.3.5.3 scFv 拼接 |
| 3.3.6 载体 pCANTAB 5 E 及 scFv 连接产物制备 |
| 3.3.6.1 pCANTAB 5 E DNA 转化感受态细胞 DH5α |
| 3.3.6.2 pCANTAB 5 E 质粒 DNA 的提取 |
| 3.3.6.3 载体 pCANTAB 5 E 及 scFv 酶切片段的制备及连接 |
| 3.3.7 连接产物电转化感受态 TG1 |
| 3.3.7.1 TG1 感受态细胞(Compenent cells)的制备 |
| 3.3.7.2 DNA 片段的连接和转化 |
| 3.3.8 噬菌体 scFv 抗体库的构建 |
| 3.3.8.1 辅助噬菌体毒种制备 |
| 3.3.8.2 噬菌体毒种滴定 |
| 3.3.8.3 电转化及库容鉴定 |
| 3.3.8.4 噬菌体库构建 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 人淋巴细胞总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 |
| 3.4.2 PCR 扩增抗体 VH 基因 |
| 3.4.3 PCR 扩增抗体 V L 基因 |
| 3.4.4 OE-PCR 拼接完整 scFv 分子基因 |
| 3.4.5 pCANTAB 5E-scFv 载体的制备 |
| 3.4.6 噬菌体 scFv 抗体库的构建 |
| 3.4.7 噬菌体 scFv 抗体库多样性 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 噬菌体单链抗体库的富集筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要溶液配方 |
| 4.2.3 仪器设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 噬菌体库的扩增 |
| 4.3.2 微孔板筛选法筛选抗体库 |
| 4.3.3 重组噬菌体的小量制备 |
| 4.3.4 Phage ELISA |
| 4.3.5 梯度 ELSIA |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 噬菌体库富集筛选 |
| 4.4.2 Phage ELISA 法检测抗 NS1 重组噬菌体亲和性 |
| 4.4.3 Phage ELISA 筛选抗 TNF-α重组噬菌体 |
| 4.4.4 噬菌体基因测序 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 scFv 重组蛋白的表达及其 TNF-α抑制活性测定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 常用溶液配方 |
| 5.2.3 引物及其序列 |
| 5.2.4 仪器设备 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 scFv 表达载体构建 |
| 5.3.2 基因工程菌构建 |
| 5.3.3 scFv 重组蛋白表达及分析 |
| 5.3.3.1 重组蛋白表达检测 |
| 5.3.3.2 表达条件优化 |
| 5.3.4 可溶性分析 |
| 5.3.5 scFv 的纯化及变复性 |
| 5.3.6 MTT 法检测 TNF-α活性 |
| 5.3.7 抗 TNF-α scFv 活性测定 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 表达载体及基因工程菌构建 |
| 5.4.2 scFv 重组蛋白表达及分析 |
| 5.4.3 重组蛋白的可溶性分析 |
| 5.4.4 表达蛋白纯化 |
| 5.4.5 TNF-α活性测定 |
| 5.4.6 scFv 抗 TNF-α活性试验 |
| 5.5 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）基于核糖体展示技术进行抗狂犬病毒人源抗体的制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 sc Fv基因库的构建[15]. |
| 1.2.2 核糖体展示单链抗体基因库的构建[17-18]. |
| 1.2.3 体外转录和翻译[17]. |
| 1.2.4 核糖体复合物的亲和筛选[17-18]. |
| 1.2.5 抗体基因的克隆表达. |
| 1.2.6 ELISA鉴定阳性克隆并进行序列分析. |
| 1.2.7 人源抗体的高效表达和纯化. |
| 1.2.8 人源抗体的特异性抗原结合活性检测. |
| 1.2.9 抗RVGp人源抗体的稳定性改构. |
| 1.2.10 抗RVGp人源VH-Lc-VK71抗体的亲和力测定. |
| 1.2.1 1 抗RVGp人源VH-Lc-VK71抗体的相对稳定性研究[19-20]. |
| 1.2.1 2 抗RVGp人源VH-Lc-VK71抗体中和活性的初步评价[21]. |
| 2 结果 |
| 2.1 核糖体展示人源sc Fv抗体基因库的构建 |
| 2.2 核糖体复合物的亲和筛选 |
| 2.3 阳性克隆鉴定及序列分析 |
| 2.4 人源抗体的特异性抗原结合活性检测 |
| 2.5 VH-Lc-VK71稳定性抗体的制备 |
| 2.6 抗RVGp人源VH-Lc-VK71抗体的亲和力测定 |
| 2.7 抗RVGp人源VH-Lc-VK71抗体的稳定性检测 |
| 2.8 抗RVGp人源VH-Lc-VK71抗体的体外中和活性研究 |
| 3 讨论 |
四、人源性抗TNFα小分子抗体的改构和分析（论文参考文献）
- [1]新型STING激动剂的设计、合成及生物活性研究[D]. 侯石. 吉林大学, 2020(01)
- [2]人源单链抗体库的构建及单链抗体在毕赤酵母中高表达策略的研究[D]. 林婷. 福建师范大学, 2020(12)
- [3]靶向CD19和PDL1的新型双亲和力CAR T细胞的功能与机制研究[D]. 张昂. 军事科学院, 2020(02)
- [4]碱基切除修复酶OGG1调节炎症因子表达的机制研究[D]. 郝文静. 东北师范大学, 2019(04)
- [5]以肿瘤坏死因子α结构为基础的小片段化合物筛选[D]. 李研. 厦门大学, 2019(09)
- [6]改良型人源性防御素2通过诱导角质细胞增殖和迁移促进创面愈合[D]. 米博斌. 华中科技大学, 2019(03)
- [7]单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定[D]. 欧阳清. 第四军医大学, 2017(02)
- [8]抗TNFα抗体的基因工程表达[D]. 李潜. 天津科技大学, 2016(05)
- [9]人源化单链抗体噬菌体库的构建及抗TNF-α抗体的筛选[D]. 刘运超. 天津大学, 2012(05)
- [10]基于核糖体展示技术进行抗狂犬病毒人源抗体的制备[J]. 赵小玲,陈伟强,冯红,沈成凤,纪艳,李静梅,张素娟,杨志华. 生物化学与生物物理进展, 2011(10)