一、PTEN与VEGF_(165)基因mRNA在卵巢癌中表达及相关性研究（论文文献综述）
余江涛[1]（2021）在《NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景在妇科恶性肿瘤中,卵巢癌（ovariancancer,OC）是死亡率较高的肿瘤之一。来自美国国家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）的统计报告推测,在2020年美国卵巢癌的新发病例为21750例,占所有新发癌症病例的1.2%,死亡病例为13940例,占所有癌症死亡病例的2.3%。卵巢癌经常发生在55～64岁的女性,确诊时中位年龄为63岁,在首诊或确诊时超过3/4的卵巢癌患者已属晚期（Ⅲ～Ⅳ期）。截至目前为止,卵巢癌的治疗主要是以手术联合铂类和（或）紫杉醇类化疗为主的综合治疗。尽管手术和化疗取得了许多进展,但是由于多数患者在诊断时已属于晚期加之后期的化疗耐药,自上世纪80年代以来,卵巢癌患者的5年总的生存率基本上没有大的变化。根据SEER最新公布的预测数据（2010～2016 年,https://seer.cancer.gov/statfacts/html/ovary.html）,目前在美国卵巢癌患者5年的生存率约为48.6%。因此,寻找潜在的生物标志物和治疗靶点对卵巢癌患者的早期筛查和改善卵巢癌患者的预后具有非常重要的意义。Iovanna等在20年前发现急性胰腺炎可以诱导过表达的NUPR1。人类NUPR1基因可以产生两种蛋白,分别是由100个氨基酸组成的NUPRla,对于此种蛋白目前尚无相关文献报道,另一种是NUPRlb,它是由82个氨基酸多肽组成的小分子核蛋白,其分子量为8872.7 Da,故又被称为P8。后来Ree等通过对裸鼠中乳腺癌细胞转移到脑组织的cDNA分析发现了com1（candidate of metastasis-1）,它是一种帮助癌细胞转移的候选分子,Coker随后发现com1与P8的蛋白完全一样,并通过基因测序发现com1和P8是一个分子,后来统一称为NUPR1。NUPR1与许多刺激相关,许多因素能够导致NUPR1分子的过表达,如内皮素、血管紧张素、肿瘤坏死因子α、脱髓鞘剂、脂多糖（LPS）、CCL4和大麻素等。NUPR1也参与了多种应急相关的功能,研究发现NUPR1在许多良、恶性疾病中异常表达,如急性胰腺炎、心衰、糖尿病系膜细胞肥大、乳腺癌、脑瘤和脑转移瘤、甲状腺肿瘤和垂体瘤等。然而有一项关于胰腺癌的研究发现,NUPR1在大多数胰腺癌标本中过度表达,而另一项研究认为NUPR1是胰腺癌细胞的细胞内生长的抑制因素,对于这两种看似矛盾的结论,一种合理的解释是,一项研究是在体内进行的,另一项研究是在体外进行的,不同的体内外肿瘤微环境导致了 NUPR1的不同生物学功能。NUPR1也在许多恶性肿瘤中表现出抑癌的功能,如在前列腺癌中的研究表明,NUPR1的表达与肿瘤的侵袭和进展负相关。所以NUPR1的复杂的功能可能依赖于不同的肿瘤微环境,在不同的肿瘤微环境中的作用可以完全不同甚至截然相反。总之,NUPR1是一个具有多种生理和生物学功能的复杂分子,它在各种良、恶性肿瘤中的作用不同。可能是一种新型的靶向药物基因,干预NUPR1可以阻止癌症的进展和转移,目前NUPR1在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制,为NUPR1的靶向治疗提供依据。具体研究内容包括以下三部分:第一部分:NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达及其对患者生存率的影响研究目的:检测NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达,以及其表达量与卵巢癌患者的临床病理因素、总的生存率和无复发生存期的相关性。材料与方法1.研究材料:卵巢癌组织芯片的资料:卵巢癌组织芯片总病例数为154例,其中转移灶13例,良性肿瘤或癌旁组织4例,其余137例为原发灶,剔除脱片、切片等原因引起的6例缺陷原发灶病例,后续共纳入分析的卵巢癌病例为131例,采集其临床病理资料,包括NUPR1蛋白的表达量、患者年龄,TNM分期,病理分级,病理类型,最大肿瘤大小,Ki67的表达等进行分析,第一种病理分型分组:非浆液性腺癌组和浆液性腺癌组;第二种病理分型分组:I型（低级别浆液性癌/子宫内膜样癌/透明细胞癌/黏液癌等）和I型（高级别浆液性癌/肉瘤/未分化癌等）;2.研究方法:2.1.免疫组织化学检测卵巢癌组织中NUPR1蛋白的表达应用免疫组织化学染色后染色强度和染色阳性率进行综合判断,分为NUPR1低表达组和NUPR1高表达组;2.2.NUPR1蛋白的表达量和卵巢癌患者临床病理特征的相关性分析应用卡方检验检测NUPR1蛋白的表达量和卵巢癌患者临床病理特征的相关性,应用t-test比较其在卵巢癌原发灶组织、癌转移灶组织、良性肿瘤或者癌旁组织中的差异性表达;2.3.NUPR1蛋白的表达量和卵巢癌患者生存率的相关性分析应用Kaplan-Meier法及Log-Rank统计方法分析,根据卵巢癌患者的随访资料及免疫组化染色结果来分析NUPR1蛋白的表达量与卵巢癌患者总的生存率和无复发生存期的相关性。根据单因素分析和COX多因素回归分析,分析卵巢癌患者总的生存率和无复发生存期相关的预后因素。研究结果:1.NUPR1蛋白在卵巢良性肿瘤或者癌旁组织、卵巢癌原发灶组织、卵巢癌转移灶组织中的表达及意义:应用t-test检测NUPR1蛋白在卵巢良性肿瘤或者癌旁组织、卵巢癌原发灶组织、卵巢癌转移灶组织中的表达,结果显示NUPR1蛋白在癌原发灶和转移灶中的表达高于良性肿瘤或者癌旁组织,差异有统计学意义（P值均<0.05）,表明NUPR1可能与卵巢癌的发生发展有关;2.NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达量与卵巢癌患者临床病理特征的相关性:应用卡方检验检测NUPR1蛋白在卵巢癌患者组织中的的表达量和临床病理特征的相关性,结果显示NUPR1蛋白的表达量与患者年龄（P=0.167）、病理分级（P=0.163）无明显相关性,与TNM分期（P=0.031）、病理类型1（浆液性和非浆液性）（P<0.001）、病理类型2（Ⅰ型和Ⅱ型）（P=0.016）、Ki67的表达（P=0.001）及最大肿瘤大小（P=0.008）有明显的相关性,差异均具有统计学意义。表明NUPR1蛋白在TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、浆液性腺癌、Ⅱ型卵巢癌、Ki67阳性表达、最大肿瘤大小>12cm的患者中的阳性表达占比分别高于TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、非浆液性腺癌、Ⅰ型卵巢癌、Ki67阴性表达,最大肿瘤大小<12cm的患者;3.NUPR1蛋白的表达量与卵巢癌患者总的生存率和无复发生存期的相关性:应用Kaplan-Meier法及Log-Rank统计方法分析发现NUPR1蛋白在卵巢癌患者组织中的表达量与总的生存率和无复发生存期呈负相关,差异均有统计学意义（P值均<0.001）,NUPR1蛋白表达量越高,其总的生存率越低,无复发生存期越短,NUPR1蛋白表达量越低,其总的生存率越高,无复发生存期越长,表明高表达的NUPR1与卵巢癌的不良预后有关;4.NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达量与卵巢癌患者的总的生存率和无复发生存期的相关预后因素分析:应用单因素及多因素回归分析发现,NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达量、TNM分期和最大肿瘤大小是总的生存率的独立预后因素,差异有统计学意义（P值分别为<0.001,<0.001和=0.026）,NUPR1蛋白的表达量越高、TNM分期越晚（Ⅲ/Ⅳ期）、最大肿瘤大小越大（>12cm）的卵巢癌患者较NUPR1蛋白的表达量低、Ⅰ/Ⅱ期和最大肿瘤大小<12cm的卵巢癌患者的总的生存率低。卵巢癌TNM分期和最大肿瘤大小是无复发生存期的独立预后因素,差异有统计学意义（P值分别为<0.001和=0.028）,TNM分期越晚（Ⅲ/Ⅳ期）、最大肿瘤大小越大（>12cm）的卵巢癌患者较Ⅰ/Ⅱ期和最大肿瘤大小<12cm的卵巢癌患者的无复发生存期短。研究结论:NUPR1蛋白在卵巢癌原发灶组织和转移灶组织中呈高表达,与卵巢癌临床不良预后相关,NUPR1的检测有望成为卵巢癌的诊断和预后评估的新指标。第二部分:NUPR1在卵巢癌细胞中的分子生物学功能的研究研究目的:1.检测NUPR1在卵巢表面上皮（ovarian surface epithelium,OSE）细胞及卵巢癌细胞系（A2870和SKOV3细胞）中的表达;2.构建NUPR1低表达及过表达的卵巢癌细胞系,并探讨其对卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响;3.利用体内成瘤实验来验证NUPR1对卵巢癌细胞成瘤的影响。材料与方法1.研究材料卵巢表面上皮细胞、A2780细胞、SKOV3细胞、293T细胞均购自中国上海中科院细胞库。siRNA委托上海吉玛生物有限公司完成,质粒的构建和慢病毒包装委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成,转染部分由自己完成。2.研究方法:2.1.NUPR1在OSE细胞和卵巢癌细胞中的表达:用Western blot方法和逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测OSE细胞、A2780细胞和SKOV3细胞中NUPR1的表达,确定NUPR1在卵巢癌细胞和OSE细胞中的相对表达量;2.2.筛选出干扰效果最好的siRNA系列:用针对NUPR1的3条小干扰系列siRNA-NUPR1（siRNA-337,siRNA-414,siRNA-850）和 1 条 siRNA-NC 系列作用于A2780和SKOV3细胞,并通过Western blot实验和RT-PCR实验来验证siRNA对NUPR1的干扰效率,用MTT实验、平板克隆形成实验来检测小干扰对细胞增殖的影响,用Transwell实验来分析小干扰对细胞迁移和侵袭的影响,用流式细胞术来检测细胞的周期和凋亡,并综合以上因素选择其中1条siRNA来构建稳定低表达NUPR1的短发卡RNA（shRNA-NUPR1）;2.3.构建shRNA-NUPR1并验证NUPR1低表达对卵巢癌细胞系的影响:shRNA-NUPR1作用于A2780细胞,构建NUPR1低表达的稳转的A2780细胞系,用Western blot实验和RT-PCR实验来检测其相关蛋白和mRNA的相对表达量以验证转染效率,用MTT实验、平板克隆形成实验和EdU实验检测细胞的增殖,用Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;2.4.构建NUPR1高表达的卵巢癌细胞系,并验证NUPR1高表达对卵巢癌细胞系的影响:构建NUPR1高表达的质粒,并转染A2780细胞和SKOV3细胞。通过Western blot实验和RT-PCR实验检测相关蛋白和mRNA的相对表达量以验证转染效率,细胞的增殖用EdU实验、平板克隆形成实验和MTT实验检测,Transwell实验被用来检测细胞的迁移和侵袭能力;2.5.裸鼠体内成瘤实验:用稳转NUPR1低表达的A2780细胞系行裸鼠体内成瘤实验,进一步验证NUPR1低表达的卵巢癌细胞对裸鼠体内成瘤的影响。研究结果:1.NUPR1在卵巢癌细胞系和OSE细胞中的表达:Western blot实验表明,NUPR1在卵巢癌细胞系A2780细胞和SKOV3细胞中的表达高于OSE细胞（P值分别为0.0139和0.011）,且在A2780细胞中的表达高于SKOV3细胞（P=0.0481）。RT-PCR实验表明NUPR1 mRNA在卵巢癌细胞系A2780细胞和SKOV3细胞中的表达高于OSE细胞（P值分别为0.0397和0.0372）,且在A2780细胞中的表达高于SKOV3细胞,但两者比较差异无统计学意义（P=0.1926）;2.使用siRNA干扰NUPR1对卵巢癌细胞系的生物学功能的影响:用针对NUPR1 的 3 条小干扰系列 siRNA-NUPR1（siRNA-337,siRNA-414,siRNA-850）和1条siRNA-NC系列作用于A2780细胞和SKOV3细胞。Western blot实验和RT-PCR实验的结果提示,与对照组相比,NUPR1干扰组的NUPR1表达量均显着下降。MTT实验和平板克隆形成实验均提示干扰NUPR1能够抑制卵巢癌细胞的增殖,在A2780细胞中,和siRNA-NC组相比较,siRNA-NUPR1均可以减少细胞克隆数,但是仅siRNA-414组和siRNA-NC组的细胞克隆数相比较差异有统计学意义（P=0.0266）。与对照组相比,NUPR1敲低组能够抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。在A2780细胞中,和对照组相比,siRNA-414和siRNA-850能够抑制细胞的迁移能力（P<0.05）,而siRNA-337和siRNA-414能够抑制细胞的侵袭能力（P<0.05）。在SKOV3细胞中,和siRNA-NC组相比较,siRNA-NUPR1均能显着抑制细胞的迁移和侵袭（P值均<0.05）。流式细胞术实验结果表明,siRNA-NUPR1能够促进A2780细胞和SKOV3细胞的凋亡,但是仅siRNA-414和siRNA-850两个系列作用于A2780细胞后引起的细胞凋亡和siRNA-NC组相比较有统计学差异（P<0.01）。在A2780细胞中,与对照组相比,siRNA-NUPR1组的G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,仅siRNA-414系列引起的细胞周期比例的变化与对照组相比有统计学意义（P<0.05）;根据以上研究结果综合判断,我们选择siRNA-414系列来构建稳定低表达NUPR1的shRNA-NUPR1,并将其应用于后续的实验中;3.使用shRNA沉默NUPR1对A2780细胞的生物学功能的影响:sh-NUPRl包埋的病毒转染A2780细胞后,Western blot实验和RT-PCR实验的结果显示,NUPR1沉默后NUPR1的表达水平下降,细胞凋亡相关分子caspase3、caspase9和Bax表达水平升高,抗凋亡分子Bc12、Bcl-xl表达下降,细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6表达下降。MTT实验表明NUPR1低表达组的A2780细胞在72h和96小时显示出明显的细胞增殖抑制（P值分别为0.0009和0.0001）。平板克隆形成实验提示NUPR1低表达组的细胞克隆数明显低于对照组（P=0.0301）。EdU实验也提示NUPR1沉默组的A2780细胞的细胞增殖明显低于对照组（P=0.0173）。在Transwell实验中,NUPR1的沉默能够抑制A2780细胞的迁移和侵袭（P值分别为0.0297和0.0156）;4.卵巢癌细胞中NUPR1过表达对卵巢癌细胞的生物学功能的影响:在卵巢癌细胞中,Western blot实验和RT-PCR实验的结果显示,NUPR1过表达后的NUPR1的表达水平升高,细胞凋亡相关分子caspase3、caspase9和Bax表达水平下降,抗凋亡分子Bc12、Bcl-xl表达升高,细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6表达升高。MTT实验、平板克隆形成实验和EdU实验显示过表达NUPR1能够促进卵巢癌细胞的增殖。Transwell实验提示过表达NUPR1可以促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭;5.沉默NUPR1对裸鼠体内成瘤的影响:裸鼠成瘤实验结果表明,沉默NUPR1后,肿瘤的体积和重量均明显下降,与NC组比较,均有显着性差异（P值分别为0.0426和0.0443）。研究结论:NUPR1在卵巢癌细胞中呈高表达,高表达的NUPR1能显着促进卵巢癌细胞的生长,低表达的NUPR1能显着抑制卵巢癌细胞的生长,NUPR1可能与卵巢癌的发生发展有关。第三部分:NUPR1在卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移中的分子机制研究研究目的:分别检测NUPR1过表达的A2780细胞和SKOV3细胞经AKT通路抑制剂LY294002处理后,NUPR1蛋白,AKT蛋白和p-AKT蛋白的相对表达量,并比较各组细胞在细胞增殖、迁移和侵袭方面的变化。材料与方法1.研究材料1.1.细胞系:人卵巢癌细胞系同第二部分。培养基用RPMI-1640,加入10%的胎牛血清（FBS）,1%的青霉素和链霉素双抗,37℃下,在5%CO2的孵箱中无菌培养。1.2.实验分组:将本组实验的细胞分为四组,一组为pCMV-NC+DMSO组,即NC组加入DMSO,一组为pCMV-NC+LY294002组,即NC组加入10μM的AKT 抑制剂 LY294002,一组为 pCMV-NUPR1+DMSO 组,即 NUPR1 高表达组加入DMSO,另外一组为pCMV-NUPR1+LY294002组,即高表达NUPR1后加入 10μM 的 AKT 抑制剂 LY294002。2.研究方法:2.1.卵巢癌细胞NUPR1过表达后的相关通路蛋白的变化:用Western blot实验检测NUPR1过表达的A2780细胞和SKOV3细胞经LY294002（10μM）处理后,四组细胞中（pCMV-NC+DMSO 组,pCMV-NC+LY294002 组,pCMV-NUPR1+DMSO 组和 pCMV-NUPR1+LY294002 组）的 NUPR1 蛋白、AKT蛋白和p-AKT蛋白的相对表达量;2.2.卵巢癌细胞的增殖的变化:用MTT实验和平板克隆形成实验检测LY294002作用后细胞的增殖和生长情况;2.3.卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力的变化:用Transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭的变化。研究结果:1.卵巢癌细胞NUPR1过表达后相关通路蛋白的变化:用Western blot实验检测NUPR1过表达的A2780细胞和SKOV3细胞经AKT通路抑制剂LY294002处理后,NUPR1蛋白,AKT蛋白和p-AKT蛋白的相对表达量。在A2780细胞和 SKOV3 细胞中,NUPR1 蛋白在pCMV-NUPR1+DMSO 组和pCMV-NUPR1+LY294002 组明显高于 pCMV-NC+DMSO 组（P 值均<0.05）,NUPR1 蛋白在 pCMV-NUPR1+DMSO组和 pCMV-NUPR1+LY294002 组间比较,无显着性差异（P>0.05）。LY294002能明显抑制pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+LY294002组的p-AKT蛋白的表达。各组间的AKT蛋白的表达量无明显差异（P值均>0.05）;2.抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的增殖的影响:用MTT实验和平板克隆形成实验检测LY294002作用后细胞的增殖和生长情况,提示在NUPR1高表达的A2780细胞中用LY294002（10μM）处理后72h,pCMV-NUPR1+DMSO 组比 pCMV-NUPR1+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO组有高的细胞增殖（P值分别为0.0179和0.0443）,pCMV-NC+DMSO组比pCMV-NC+LY294002 组有高的细胞增殖率（P<0.05）。pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组有相似的细胞增殖,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。用LY294002处理后96h,pCMV-NUPR1+DMSO组比pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组有高的细胞增殖（P值分别为 0.0008 和<0.0001）。和 pCMV-NC+DMSO 组相比较,pCMV-NC+LY294002组能够抑制细胞的增殖（P<0.05）。在NUPR1高表达的SKOV3细胞中,用LY294002处理后72h,pCMV-NUPR1+DMSO 组的细胞增殖明显比 pCMV-NUPR1+LY294002 组和pCMV-NC+DMSO组的细胞增殖要快,结果比较有统计学意义（P值均<0.0001）。和pCMV-NC+DMSO组相比较,pCMV-NC+LY294002组能够抑制细胞的增殖率（P=0.0013）,而 pCMV-NUPR1+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO 组有相似的细胞增殖率（P>0.05）,在LY294002作用于SKOV3细胞的96h时也观察到相似的结果。在LY294002作用于SKOV3细胞后72h和96h,我们对pCMV-NC+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组的细胞的增殖率的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR1+DMSO组的细胞增殖率的比值进行比较,发现两组比值在72h和96h均有统计学意义（P值分别为0.0013和0.0006）,说明LY294002在NUPR1高表达组对细胞增殖的抑制明显高于NC组,表明抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的增殖的影响;平板克隆形成实验形成实验提示,在A2780细胞中,与pCMV-NC+DMSO组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组能够促进细胞的增殖,有显着性差异（P<0.001）,pCMV-NC+LY294002组能够抑制细胞的增殖,两者相比较差异有统计学意义（P<0.05）,pCMV-NUPR1+LY294002组有高的细胞克隆数（P<0.05）。和pCMV-NUPR1+LY294002组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组有更高的细胞克隆数（P<0.05）。对 pCMV-NC+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO 组的细胞的克隆数的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的细胞克隆数的比值进行比较,发现两组比值无统计学意义（P>0.05）。在NUPR1过表达的SKOV3细胞中,与pCMV-NC+DMSO组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组有更高的细胞克隆数,两者比较差异有统计学意义（P=0.0143）。pCMV-NUPR1+DMSO 组较 pCMV-NUPR1+LY294002 组有高的细胞克隆数（P=0.0008）。pCMV-NC+LY294002 组比 pCMV-NC+DMSO 组有更低的细胞克隆数,两者比较差异有统计学意义（P=0.0426）。而pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组的细胞克隆数相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。对 pCMV-NC+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO 组的细胞的克隆数的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的细胞克隆数的比值进行比较,发现两组比值有统计学意义（P=0.0347）,说明LY294002在NUPR1高表达组对细胞增殖的抑制明显高于NC组,这点也验证了抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的增殖的影响;3.抑制AKT通路可以逆转NUPR1过表达对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的影响:用Transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭的变化。pCMV-NUPR1+DMSO组的A2780细胞比pCMV-NC+DMSO组有更强的细胞迁移能力（P=0.0001）,和 pCMV-NUPR1+LY294002 组相比较,pCMV-NUPR1+DMSO组和pCMV-NC+DMSO组有更高的细胞迁移能力（P分别为<0.0001 和=0.0047）,pCMV-NC+DMSO 组比 pCMV-NC+LY294002 组有更高的细胞迁移能力（P=0.0014）,对pCMV-NC+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组的细胞的迁移能力的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的迁移能力的比值进行比较,发现两组比值有统计学意义（P=0.0284）。在侵袭实验中,与pCMV-NC+DMSO组比较,pCMV-NUPR1+DMSO 组的侵袭能力增加（P=0.0158）,而pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NC+DMSO组有相似的细胞侵袭能力（P>0.05）。pCMV-NC+DMSO组比pCMV-NC+LY294002组有更高的细胞侵袭能力（P=0.0237）。pCMV-NUPR1+DMSO 组比 pCMV-NUPR1+LY294002 组有更强的细胞侵袭能力（P=0.0103）,对 pCMV-NC+LY294002 组和 pCMV-NC+DMSO组的细胞的侵袭能力的比值及pCMV-NUPR1+LY294002组和pCMV-NUPR+DMSO组的侵袭能力的的比值进行比较,发现两组比值有统计学意义（P=0.0359）。表明NUPR1过表达的A2780细胞显示出较强的细胞迁移和侵袭能力,而这种细胞迁移和侵袭的能力能够被LY294002逆转。研究结论:NUPR1能够通过AKT通路来促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭从而发挥致癌作用。
张林[2]（2021）在《m6A机制调控子宫内膜癌转移与进展的分子机制研究》文中研究表明背景:N6-methyladenosine（m6A）是RNA上最常见的化学修饰,它调控了 RNA的多种代谢过程。m6A在细胞核内被以METTL3-METTL14为核心的酶催化形成,也可以被FTO或ALKBH5催化去除,这种动态平衡维持了 RNA上m6A的修饰。而细胞质中有一类蛋白质（YTHDFs,IGF2BPs等）可以特异识别m6A修饰发挥对RNA功能的调控。近年来,越来越多的研究发现了多种m6A调控的蛋白在肿瘤中存在异常表达,m6A调控机制在肿瘤进展的过程中发挥了关键作用,但其在子宫内膜癌进展中的调控机制尚不清楚。方法:通过定量PCR,免疫组织化学检测FTO与IGF2BP1在子宫内膜癌组织中表达;使用慢病毒转染技术增强/沉默FTO与IGF2BP1在细胞株中的表达,CCK-8,EdU,细胞周期实验分析肿瘤细胞的增殖,Transwell与划痕实验分析细胞侵袭与转移变化,裸鼠成瘤实验分析其对小鼠成瘤性的变化。通过RNA-seq,RIP-seq,MeRIP-seq等方法分析其下游靶基因的调控网络,以明确m6A调控子宫内膜癌进展的分子机制。结果:FTO与IGF2BP1在子宫内膜癌组织中表达增高,FTO与IGF2BP1的高表达可以分别促进子宫内膜癌细胞的转移与增殖。从机制上来说,FTO可以通过m6A机制调控HOXB13的表达,激活下游WNT信号通路促进肿瘤细胞的转移。此外,IGF2BP1通过识别PEG10 mRNA中的m6A修饰,促进PEG10 mRNA的稳定与蛋白的表达,通过抑制P16,P18的表达,加速细胞周期。结论:本研究证实了 FTO与IGF2BP1可以通过m6A机制调控子宫内膜癌的进展,这为理解子宫内膜癌转移与进展提供了新的分子调控机制。
李晓飞[3]（2021）在《MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究》文中提出上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖道肿瘤中常见的恶性肿瘤,在妇科恶性肿瘤中死亡率最高,其中浆液性囊腺癌是最常见的病理类型。大多数上皮性卵巢癌患者的治疗是采用肿瘤减灭术辅以术后铂类药物化疗。这虽然改善了上皮性卵巢癌患者的预后,但是上皮性卵巢癌患者总体生存率无明显改善,5年生存率只有30%左右。原发性或获得性化疗耐药是成功治疗上皮性卵巢癌的主要障碍。因此,攻克化疗耐药是上皮性卵巢癌研究的主要目标。化疗耐药的发生是由多种调控机制共同作用的结果,但是目前仍有很多潜在分子机制尚不明确。越来越多的证据表明异常的DNA甲基化是与化疗耐药相关的最常见的分子机制之一。本课题组在前期实验中通过简化甲基化测序（reduced representation bisulfite sequencing,RRBS）技术对卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者癌组织及卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织进行全基因组甲基化水平测序及数据分析。结果显示卵巢浆液性囊腺癌化疗敏感患者和化疗耐药患者之间存在明显的基因甲基化差异,其中化疗耐药组中 MGRN1（Mahogunin Ring Finger 1）启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组。因此,本研究选取MGRN1进行深入研究,探索MGRN1基因启动子区异常甲基化参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药发生的可能机制。第一部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系目的:为进一步明确前期RRBS测序结果,探讨MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系。方法:1.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF Sequenom Mass ARRAY）检测卵巢浆液性囊腺癌患者癌组织MGRN1启动子区甲基化水平,分析MGRN1甲基化水平与化疗耐药之间的关系;采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织MGRN1 mRNA及蛋白表达水平,分析MGRN1 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;2.Spearman分析明确MGRN1异常甲基化与mRNA表达的相关性。结果:1.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组MGRN1启动子区甲基化水平明显高于化疗敏感组;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1 mRNA表达水平明显低于化疗敏感组;3.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中MGRN1蛋白表达水平明显低于化疗敏感组;4.Spearman分析显示:MGRN1启动子区甲基化水平与mRNA表达水平呈负相关关系。结论:MGRN1启动子区甲基化水平与MGRN1表达呈负性调控关系,MGRN1启动子区高甲基化通过下调MGRN1表达参与了卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药的发生。第二部分 MGRN1基因在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药过程中的作用及机制目的:为了明确MGRN1在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药中的作用及机制,本研究将探讨MGRN1表达下调对浆液性卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨敲低MGRN1表达引起卵巢癌细胞化疗耐药的机制。方法:1.通过稳定转染技术在SKOV3细胞株中敲低MGRN1的表达,用RT-qPCR和Western Bolt方法检测MGRN1表达水平;2.采用CCK-8实验和细胞凋亡实验观察MGRN1表达下调对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响;3.采用RT-qPCR及免疫组织化学染色方法检测卵巢浆液性囊腺癌癌组织HSP70 mRNA及蛋白表达水平,分析HSP70 mRNA及蛋白表达水平与化疗耐药之间的关系;采用Spearman分析MGRN1 mRNA表达与HSP70 mRNA表达的相关性,并利用TCGA数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中MGRN1 mRNA表达及HSP70mRNA表达水平的相关性分析进行验证。结果:1.敲低MGRN1表达后,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞活力明显升高（P<0.05）,顺铂诱导SKOV3细胞株的细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;2.卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药组中HSP70 mRNA及蛋白表达水平明显高于化疗敏感组;Spearman分析显示:MGRN1 mRNA表达水平与HSP70 mRNA表达水平呈负相关关系。联合TCGA数据库信息明确了 MGRN1与 HSP70的 mRNA水平存在显着相关性（r=-0.5,P=1E-13）。结论:下调MGRN1表达后会引起SKOV3卵巢癌细胞系顺铂敏感性下调;MGRN1可能通过调控HSP70的表达进而调节卵巢癌细胞的化疗耐药。第三部分 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系目的:依据患者临床资料以及随访资料分析MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。方法:1.运用Kaplan-Meier方法以及Cox回归模型方法分析MGRN1基因甲基化水平和mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系;2.运用Kaplan-Meier方法分析HSP70基因mRNA表达水平与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系。利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行验证。结果:1.MGRN1基因启动子区高甲基化和MGRN1 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;2.MGRN1 mRNA低表达是预测患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素（HR=2.18,95%CI:1.07-4.11,P=0.028;HR=1.92,95%CI:0.99-3.79,P=0.045）;3.HSP70 mRNA低表达与卵巢浆液性囊腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;利用Kaplan-Meier plotter数据库对卵巢浆液性囊腺癌组织中HSP70 mRNA表达及1207例卵巢浆液性囊腺癌患者的总生存期的相关性进行分析,结果发现HSP70 mRNA高表达组患者总生存期明显低于低表达组患者（P=0.013）。结论:MGRN1基因高甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;MGRN1 mRNA低表达是预测卵巢浆液性囊腺癌患者无疾病进展生存期和总生存期的独立危险因素;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过下调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后的发生。综上所述,本研究首次探讨了 MGRN1启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系,为DNA甲基化调控基因表达参与卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和不良预后提供了新的实验依据。MGRN1研究表明:1)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中MGRN1启动子区甲基化水平明显低于化疗敏感组;2)MGRN1基因甲基化升高导致的mRNA水平下调与卵巢浆液性囊腺癌患者不良预后相关;3)敲低MGRN1表达可下调卵巢癌细胞株对顺铂敏感性;4)下调卵巢癌细胞MGRN1表达HSP70 mRNA表达水平明显降低;5)卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药患者癌组织中HSP70 mRNA表达水平明显高于化疗敏感组;MGRN1启动子区高甲基化可能是通过上调HSP70基因表达参与了卵巢浆液性囊腺癌的不良预后和化疗耐药的发生。
郭丽[4]（2020）在《RECQL4在浆液性卵巢癌中的生物学功能及其机制研究》文中提出卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,据国际癌症研究机构统计,2018年,全球有295414例卵巢癌新发病例,死亡病例数为184799例,居美国癌症死亡原因的第五位。即使对初始治疗反应良好,70%的患者将在3年内复发,5年生存率不足50%。晚期诊断、高复发率和耐药性是卵巢癌患者高死亡率的主要原因。根据组织学类型,上皮性卵巢癌分为四种常见的亚型:浆液性、子宫内膜样、粘液性和透明细胞性。浆液性卵巢癌是最常见的病理类型,标准治疗为肿瘤细胞减灭术加铂类为基础的联合化疗以及维持治疗。多数铂敏感患者最终会转变成铂耐药,研究表明,DNA修复途径参与了化疗耐药的形成。根据组织学分级,浆液性卵巢癌可分为低级别和高级别两种,不同亚型有不同的分子改变。高级别浆液性卵巢癌最常见的突变基因是TP53,约50%的患者存在同源重组缺陷,NOTCH、RAS/MEK、PI3K和FOXM1信号通路缺陷是其最常见的信号转导途径。低级别浆液性卵巢癌中BRAF和RAS突变频率增加,基因组相对稳定。美国癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）计划发表的卵巢癌全基因组分析结果显示,96%的高级别浆液性肿瘤中存在TP53突变,而其他基因的突变频率远远低于TP53,如BRCA1突变率约为12.5%,PTEN突变率仅有7%。与此相反,基因拷贝数变异反而更为频繁,占比23.1%（113/489）。最常见的卵巢癌驱动基因MYC,CCNE1和MECOM等的拷贝数扩增比例均在20%以上。RECQL4属于DNA解旋酶家族成员,参与调节DNA复制、转录、重组,维持端粒及基因组的稳定性,并广泛参与同源重组、非同源末端连接、碱基切除修复等多种DNA修复途径。研究表明,RECQL4参与多种肿瘤的发生发展,并发挥“双刃剑”功能。RECQL4缺乏导致骨肉瘤或淋巴瘤的发生率增加,相反,在前列腺癌、乳腺癌和肝细胞癌中观察到RECQL4的表达升高。但是,RECQL4在卵巢癌中的表达和生物学功能未见报道。本课题探讨了 RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达,生物学功能和临床意义,并进一步分析了 RECQL4高表达的原因。通过阐述RECQL4发挥癌基因作用的关键下游靶基因及上游调控分子,提出了 miR-10a-5p/RECQL4/MAFB轴在浆液性卵巢癌的诊断、发生发展、治疗及预后中起至关重要的作用。具体研究内容包括以下四部分:1.RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究。2.RECQL4对浆液性卵巢癌细胞铂类及PARP抑制剂敏感性的影响。3.浆液性卵巢癌中RECQL4下游靶基因的筛选与功能研究。4.浆液性卵巢癌中RECQL4的上游分子调控机制研究。第一部分RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究研究目的解旋酶RECQL4除参与DNA复制、重组、转录及修复,维持基因组稳定性外,还参与多种恶性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌及胃癌的发生发展,并与肿瘤的不良预后有关。本部分基于TCGA及GEO数据库的生物学信息分析结果,拟探讨RECQL4在浆液性卵巢癌及正常输卵管伞组织中的表达差异。通过对组织芯片进行免疫组织化学染色,结合芯片患者的临床数据,评价RECQL4对浆液性卵巢癌的预后及临床病理特征的影响。最后利用体内裸鼠成瘤实验及体外细胞学实验,评估RECQL4的表达对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移、周期及凋亡等生物学行为的影响。研究内容及方法应用TCGA数据分析高级别浆液性卵巢癌及泛癌中的拷贝数变异情况,以及RECQL4在高级别浆液性卵巢癌中的拷贝数变异情况。进一步应用数据库分析RECQL4的拷贝数变异对其mRNA表达的影响。应用TCGA及GEO数据库,分析RECQL4在浆液性卵巢癌与正常卵巢、输卵管伞组织中的表达差异。使用qRT-PCR检测RECQL4 mRNA在浆液性卵巢癌和正常输卵管伞组织中的表达差异,使用Western Blot检测RECQL4蛋白在卵巢癌细胞系和正常输卵管伞上皮细胞中的表达差异。应用课题组构建的浆液性卵巢癌的组织芯片进行免疫组化染色,明确RECQL4蛋白在浆液性卵巢癌中的表达状况,分析其表达与临床预后的关系,及与临床病理特征的相关性。应用Kaplan-Meier Plotter网站分析RECQL4与浆液性卵巢癌PFS和OS的关系。构建RECQL4稳定过表达及抑制表达的卵巢癌细胞系,通过体外CCK8增殖实验、平板克隆形成实验及体内裸鼠皮下成瘤实验验证RECQL4对卵巢癌细胞增殖的影响,通过体外Transwell实验、划痕实验及体内裸鼠腹腔成瘤能力检测比较RECQL4对卵巢癌细胞侵袭、迁移的影响,通过流式细胞仪检测RECQL4对卵巢癌细胞周期、凋亡的影响。利用Western Blot检测RECQL4对卵巢癌细胞上皮间质转化、细胞周期和细胞凋亡相关蛋白分子的影响。研究结果TCGA数据分析显示100%的高级别浆液性卵巢癌及97.8%的泛癌中均存在基因拷贝数的变异,且两者拷贝数扩增比例前20位的基因,有19个是相同的。RECQL4在27%的高级别浆液性卵巢癌样本中存在异常的拷贝数扩增,RECQL4拷贝数扩增与其mRNA表达呈正相关。TCGA数据分析发现RECQL4在20余种恶性肿瘤中均呈现高表达。GSE26712数据库及TCGA数据库分析显示RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达高于正常的卵巢及输卵管伞组织。qRT-PCR检测结果表明RECQL4在高级别浆液性卵巢癌中的表达高于正常的输卵管伞组织。Western Blot检测结果提示RECQL4蛋白在卵巢癌细胞系中的表达明显高于正常输卵管伞上皮细胞。对157例浆液性卵巢癌和54例正常输卵管组织组成的组织芯片进行免疫组化染色的结果显示,高表达RECQL4的患者的总生存期显着低于低表达RECQL4的患者。Kaplan-Meier Plotter网站分析发现RECQL4高表达患者的总生存期及无进展生存期均低于RECQL4低表达患者。RECQL4高表达与患者的血CA125水平、腹水量及网膜转移有关,而与年龄、FIGO分期、淋巴结转移无关。且在铂耐药的卵巢癌患者中,RECQL4表达水平明显高于铂敏感的卵巢癌患者。选择卵巢癌BRCA野生型细胞系A2780、HEY、SKOV3及BRCA缺失型细胞系UWB1.289,构建稳定干扰及过表达RECQL4的细胞系。体外CCK8增殖实验、克隆形成验、Transwell及划痕实验结果显示,过表达RECQL4后,细胞增殖、侵袭、迁移能力明显高于对照组,而干扰RECQL4表达后,细胞增殖、侵袭、迁移能力明显低于对照组。裸鼠皮下成瘤实验及腹腔成瘤能力检测表明,注射高表达RECQL4组细胞裸鼠的皮下成瘤的体积及重量,盆腹腔形成的癌灶转移结节的数目及大小均高于对照组。对上皮间质转化相关蛋白的Western Blot检测发现,干扰 RECQL4 表达后,间质表型标志物 N-cadherin、β-Catenin、Vimentin、Slug、Snail及MMP7的表达下调,而过表达RECQL4后,相应的间质表型标志物显着上调。流式细胞仪进行细胞周期检测显示,干扰RECQL4表达后,卵巢癌A2780、HEY细胞G1期所占比例明显升高,而S期所占比例明显下降。细胞凋亡分析显示,降低RECQL4表达可使早期凋亡及晚期凋亡的卵巢癌细胞数增多。Western Blot对细胞周期相关的蛋白进行检测,抑制RECQL4表达后,CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6的表达下降,而可引起细胞周期阻滞的蛋白P21、P27、P53的表达上升,过表达RECQL4具有相反的结果。Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达显示,干扰RECQL4表达后,促进凋亡的相关蛋白Bax、Cleaved-caspase9及Cleaved-caspase3显着上调,而促进RECQL4表达后,上述蛋白的表达下调。研究结论RECQL4在浆液性卵巢癌中高表达,与其不良临床预后有关,有望成为浆液性卵巢癌的新型预后标志物。RECQL4促进浆液性卵巢癌的增殖、侵袭及迁移;干扰RECQL4可引起细胞周期G1/S期阻滞,并导致早期凋亡及晚期凋亡细胞数增多,有望成为卵巢癌治疗的新型药物靶点。第二部分RECQL4对浆液性卵巢癌细胞铂类及PARP抑制剂敏感性的影响研究目的上皮性卵巢癌的标准治疗方法为肿瘤细胞减灭术和辅助化疗以及维持治疗,辅助化疗方案首选铂类+紫杉类。尽管80%的卵巢癌患者对一线化疗有良好反应,仍有70%左右的患者将出现复发,且部分铂敏感复发最终会进展为铂耐药复发。PARP抑制剂的临床应用是近年来卵巢恶性肿瘤治疗领域的最大进展之一,已有多种PARP抑制剂获得卵巢癌NCCN指南推荐,但其耐药性问题也逐渐显现。已有证据表明,上皮性卵巢癌中的DNA修复异常参与对化疗的反应性及耐药性。鉴于RECQL4在多个DNA修复途径发挥重要作用,且前期组织芯片的免疫组化染色显示,铂耐药患者中RECQL4的表达明显高于铂敏感患者,本部分旨在通过体外细胞实验,研究RECQL4的表达对浆液性卵巢癌细胞顺铂及奥拉帕利敏感性的影响。研究内容及方法应用Western Blot检测卵巢癌A2780细胞及铂耐药型A2780/DDP细胞中RECQL4的蛋白表达。应用Western Blot检测,卵巢癌细胞中加入不同浓度的顺铂及奥拉帕利后,RECQL4蛋白水平的变化。选取低表达RECQL4的BRCA野生型卵巢癌A2780、HEY、SKOV3稳定转染细胞系及其对照组。并应用RECQL4小干扰RNA对铂耐药型A2780/DDP细胞、BRCA突变型UWB1.289细胞进行瞬时转染,降低RECQL4的表达。对上述获得的卵巢癌细胞,加入不同浓度梯度的顺铂及奥拉帕利。通过CCK8增殖实验检测加入不同浓度梯度顺铂及奥拉帕利后,卵巢癌细胞的生长活力变化;通过平板克隆形成实验检测加入不同浓度梯度顺铂及奥拉帕利后,卵巢癌细胞克隆形成能力的变化,验证RECQL4的表达对卵巢癌细胞顺铂及奥拉帕利的敏感性。研究结果Western Blot检测结果显示,RECQL4在铂耐药型A2780/DDP细胞中的表达显着高于A2780细胞,随着加入顺铂及奥拉帕利浓度的升高,卵巢癌细胞中RECQL4的蛋白表达水平逐渐升高。显微镜下观察细胞生长状态发现,加入顺铂及奥拉帕利后,细胞呈现不同程度的死亡,随着药物浓度升高,死亡细胞数逐渐增多。CCK8增殖实验结果显示,加入不同浓度顺铂及奥拉帕利后,低表达RECQL4的卵巢癌细胞的IC50,明显低于对照组细胞。克隆形成实验表明,随着顺铂及奥拉帕利浓度的升高,细胞形成克隆的数目逐渐减少。在同一药物浓度作用下,低表达RECQL4的细胞形成的克隆数目少于对照组。研究结论卵巢癌细胞中,RECQL4的表达下调对顺铂和奥拉帕利有增敏作用。RECQL4可作为预测浆液性卵巢癌化疗敏感性的生物标志物和潜在的分子治疗靶点。第三部分浆液性卵巢癌中RECQL4下游靶基因的筛选与功能研究研究目的RECQL4蛋白的结构与其他人类RECQ解旋酶不同,有其独特性。目前,尚不清楚RECQL4的哪些功能域影响其在肿瘤中的作用,了解RECQL4的相互作用蛋白对推断其在癌细胞中的功能、深入了解其作用机制、明确其对肿瘤早期诊断和治疗的影响起至关重要的作用。尽管目前已发现RECQL4在不同肿瘤中与TP53、MCM10、survivin等相互作用,但恶性肿瘤具有高度异质性,RECQL4在浆液性卵巢癌中的下游靶基因未完全阐明。本部分旨在通过高通量转录组测序技术,筛选RECQL4在浆液性卵巢癌中发挥癌基因作用的关键下游靶基因,并探讨靶基因在卵巢癌中的生物学功能。研究内容及方法应用RECQL4小干扰RNA瞬时转染卵巢癌A2780细胞,构建降低RECQL4表达的实验组及对照组细胞,提取RECQL4 mRNA,应用qRT-PCR验证转染效率后,进行高通量测序转录组分析（RNAseq）,获取RECQL4在浆液性卵巢癌中可能调控的下游靶基因。应用qRT-PCR验证测序获得的下游靶基因的mRNA水平变化。选取变化明显者,应用TCGA数据库及qRT-PCR分析下游靶基因在浆液性卵巢癌和正常输卵管伞组织中的表达差异。通过qRT-PCR验证浆液性卵巢癌中靶基因mRNA变化与RECQL4 mRNA变化的相关性。应用Western Blot检测RECQL4蛋白变化后,靶基因的蛋白表达情况,最终筛选出目标靶基因进行研究。应用靶基因的小干扰RNA瞬时转染卵巢癌细胞,构建干扰靶基因表达的细胞及对照组细胞,通过CCK8增殖实验及克隆形成实验检测靶基因对卵巢癌细胞的增殖能力的影响,应用Transwell实验对靶基因对卵巢癌细胞侵袭能力的影响进行检测。在稳定高表达RECQL4的卵巢癌细胞及对照组细胞中,应用siRNA干扰靶基因的表达,进行Rescue实验。通过CCK8增殖实验、平板克隆实验及Transwell实验,检测降低靶基因表达后,对RECQL4促进卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。研究结果高通量测序转录组分析结果显示,差异表达基因共302个,其中表达上调基因179个,表达下调基因123个。选取候选靶基因应用qRT-PCR进行验证,发现干扰 RECQL4 表达后,CBLN2、MAFB、ITGB3、PGPEP1L、GPR78、SKAP2、AHRR、IGFBP3、AREGB的mRNA表达水平均下降。通过TCGA数据分析上述基因在浆液性卵巢癌中的mRNA表达,浆液性卵巢癌中MAFB mRNA的表达明显高于正常输卵管伞中mRNA的表达。qRT-PCR检测显示MAFB在40例浆液性卵巢癌中的表达高于12例正常输卵管伞组织,且MAFB的mRNA表达水平与RECQL4的mRNA表达水平呈现正相关。Western Blot检测表明,卵巢癌细胞中过表达RECQL4后,MAFB蛋白表达上调,而干扰RECQL4表达后,MAFB蛋白表达下调。对MAFB进行细胞学功能实验研究,CCK8增殖实验显示,降低MAFB表达后,卵巢癌细胞的生长速度明显低于对照组。平板克隆形成实验表明,降低MAFB表达后,卵巢癌细胞的克隆形成数目较对照组明显减少。Transwell侵袭实验表明,降低MAFB表达后,卵巢癌细胞的穿膜细胞数明显减少,侵袭能力下降。Rescue实验发现,CCK8增殖实验及平板克隆实验结果显示,降低MAFB的表达,能削弱RECQL4促进卵巢癌细胞的增殖能力。Transwell实验结果表明,干扰MAFB表达能逆转RECQL4过表达引起的卵巢癌细胞侵袭迁移能力增强。研究结论MAFB在浆液性卵巢癌中高表达,并能促进卵巢癌细胞的增殖及转移。干扰MAFB的表达能削弱RECQL4促进卵巢癌细胞的增殖及转移能力。RECQL4在浆液性卵巢癌中通过调控MAFB发挥促癌作用。第四部分浆液性卵巢癌中RECQL4的上游分子调控机制研究研究目的RECQL4通过调控下游靶基因发挥促癌作用的同时,其本身也受到多种因素的调控。本课题第一部分已证实,RECQL4的基因拷贝数扩增可导致其高表达,从而发挥一系列生物学功能。microRNA是一类庞大的非编码RNA家族,在转录后水平负性调控基因的表达。近年来,microRNA在卵巢癌发生发展中的作用越来越受到重视。为探讨RECQL4的上游调控分子,明确RECQL4在浆液性卵巢癌中高表达的原因,本部分通过miRNA预测数据库,筛选可能调控RECQL4表达的上游miRNA,从而为解释RECQL4在卵巢癌中发挥作用的机制提供进一步依据。研究内容及方法借助microRNA靶基因预测数据库TargetScan 7.1和miRDB的在线预测结果,初步选取可能调控RECQL4表达的上游miRNA。应用qRT-PCR检测上游调控分子的mRNA表达水平。Western Blot实验检测卵巢癌细胞中,过表达miRNA后,RECQL4的蛋白水平变化。qRT-PCR实验检测,过表达及抑制miRNA表达后,RECQL4 mRNA水平的变化。数据库TargetScan 7.1查找RECQL4与上游调控分子的可能结合位点,以pmirGLO质粒构建突变型以及野生型载体,实施双荧光素酶报告基因实验,验证选择的miRNA是否与RECQL4直接结合。在稳定高表达RECQL4的卵巢癌细胞及对照组中,瞬时转染mimics过表达上游miRNA,并应用Western Blot进行验证。CCK8增殖实验、平板克隆实验及Transwell实验检测过表达目的miRNA后,对卵巢癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响,同时检测过表达miRNA对RECQL4促进卵巢癌细胞增殖及转移能力的影响。研究结果借助microRNA靶基因预测数据库TargetScan 7.1和miRDB的在线预测结果,初步选取miR-10a-5p作为研究目的分子。qRT-PCR实验表明,浆液性卵巢癌中,miR-10a-5p的表达低于正常输卵管伞组织。Westen Blot 实验显示,卵巢癌细胞中,过表达miR-10a 5p后,RECQL4蛋白的表达水平明显下降。qRT-PCR实验发现,过表达miR-10a-5p后,RECQL4的mRNA表达水平下降,而抑制miR-10a-5p表达引起RECQL4 mRNA水平升高。TargetScan 7.1数据库发现RECQL4的3’ UTR区域存在能与miR-10a-5p直接结合的位点,双荧光素酶报告实验结果显示,转染含有RECQL4 3’ UTR野生型结合位点的pmirGLO载体后,miR-10a-5p过表达组的相对荧光素酶活性较对照组显着下降;将载体上的结合位点突变后,过表达miR-10a-5p组的相对荧光素酶活性较对照组无明显变化。在稳定高表达RECQL4的SKOV3细胞及对照组中,瞬时转染mimics过表达miR-10a-5p。CCK8增殖实验、平板克隆实验、Transwell实验结果显示,过表达miR-10a-5p后,卵巢癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力受到抑制;而且miR-10a-5p的过表达,可使RECQL4促进卵巢癌细胞增殖及转移的能力削弱。研究结论miR-10a-5p在浆液性卵巢癌中表达下调,并能抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。miR-10a-5p能与RECQL4直接结合,负性调控其表达及生物学功能。本研究的创新性1.本研究系统分析了 RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能。2.首次研究证实RECQL4表达下调能增强卵巢癌细胞对顺铂和奥拉帕利的敏感性,可作为卵巢癌的潜在分子治疗靶点。3.首次发现在浆液性卵巢癌中RECQL4通过调控MAFB发挥促癌功能。4.首次发现在浆液性卵巢癌中miR-10a-5p可直接负向调控RECQL4的表达,阐明了 RECQL4的异常高表达与其拷贝数扩增及miR-10a-5p有关。本研究的局限性及不足1.本研究仅分析了浆液性卵巢癌中干扰RECQL4的表达,分别对顺铂和奥拉帕利敏感性的影响,未对顺铂和奥拉帕利联合用药的影响进行分析,也缺乏应用体内模型如PDX模型进行的相关验证研究。2.本研究发现RECQL4通过调控MAFB发挥促癌功能,但尚未证明RECQL4蛋白是否对MAFB蛋白有直接的作用。
连烜晔[5]（2020）在《肿瘤低氧微环境下外泌体miR-199a-5p对卵巢癌转移的作用及机制研究》文中指出研究目的卵巢癌是导致妇科恶性肿瘤死亡的主要原因。虽然早期诊断预后良好,但绝大多数病例诊断为晚期,5年生存率仅为30-40%。这种低存活率主要是由于卵巢癌起始阶段常常缺乏典型的临床症状,大约75%的卵巢癌病人诊断时已经发展为中晚期,常伴远处转移和化疗抵抗,因此深入了解卵巢癌浸润和转移机制,寻找新的肿瘤标记物和治疗靶点是非常重要的。研究方法1.外泌体的提取和鉴定体外培养4种卵巢癌细胞（A2780、UWB、HEY、Anglne）。分别在常氧（5%CO2）和低氧（1%O2）环境下培养,分别收集常氧和低氧条件下的卵巢癌4个细胞系的细胞上清液,通过Exo Isolation Kit提取外泌体,通过透射电子显微镜（TEM）观察Exosomes的形态,纳米颗粒追踪分析技术检测外泌体浓度粒径。采用免疫印迹法分析外泌体（Exosomes）表面特异蛋白CD81和CD63的表达水平。2.筛选差异表达的miRNA及其验证利用高通量技术测序鉴定人类卵巢癌细胞分泌的外泌体miRNA在常氧和低氧环境下的差异表达谱。选取4条miRNA,应用Q-PCR验证测序结果。确定待研的miR-199a-5p并分别在四组卵巢癌细胞系（A2780、UWB、HEY、Anglne）及其分泌的外泌体中验证,征集卵巢癌组织（n=20）,同龄人群正常输卵管组织为对照组（n=20）,Q-PCR检测miR-199a-5p在组织中的表达。购买卵巢癌患者OC-1601组织芯片,通过荧光原位杂交分析miR-199a-5p的表达水平并与卵巢癌患者临床病理特征（年龄、肿瘤浸润、淋巴结转移、肿瘤分期）进行相关分析。3.miR-199a-5p的生物信息学分析采用包含12个数据库的生物信息学分析软件miRwalk预测miR-199a-5p的靶基因。通过DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库进行GO分析和KEGG富集分析预测miR-199a-5p靶基因的生物学功能和参与的信号通路。4.miR-199a-5p对卵巢癌细胞的侵袭转移能力的影响及分子机制将miR-199a-5p过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂分别转染至A2780常氧和低氧培养的细胞系中,通过Transwell侵袭、迁移实验和细胞划痕实验,探讨miR-199a-5p对卵巢癌细胞侵袭转移能力的影响。通过荧光素酶报告实验,验证HIF-2α 与 miR-199a-5p的相互作用,转染 miR-199a-5p 过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂于A2780细胞,Western Blot技术检测HIF-2α、Wnt3a、β-catenin蛋白的变化,检测HIF-2α、Wnt3a、β-catenin在卵巢癌组织及正常输卵管组织中的表达。免疫组化检测HIF-2α在卵巢癌组织芯片中的表达变化。5.miR-199a-5p通过外泌体传递对血管内皮细胞连接的影响FITC标记miR-199a-5p,PKH26标记卵巢癌细胞分泌的外泌体,与内皮细胞共培养,并在共聚焦显微镜下观察内皮细胞吞噬外泌体。将miR-199a-5p过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂分别转染至内皮细胞,通过Western Blot来观察miR-199a-5p对内皮细胞连接蛋白（JAM-A、VE-Cadherin）的影响。并通过免疫组化检测组织芯片中,JAM-A、VE-Cadherin的表达。研究结果1.外泌体的提取和鉴定透射电镜观察到典型的杯状圆形双层膜囊泡。纳米粒子跟踪分析（NTA）显示,这些囊泡的直径范围主要为30～170nm。Western Blot检测显示,Exosome特异性蛋白CD81、CD63阳性。2.miR-199a-5p的筛选和验证高通量测序结果,在卵巢癌细胞系常氧和低氧环境中共找到359条差异表达的miRNA,其中上调的有153条,下调的有206条（FDR<0.05）。选取的4条小RNA,相对于常氧环境,miR-199a-5p,miR-214-5P在低氧环境下相对低表达（miR-199a-5p（Z=-4.438,P=0.0030）;miR-214-5P（Z=-4.1828,P=0.0240））。而miR-216a-5p和miR-216b-5p在低氧培养下相对高表达（miR-216a-5P（Z=2.5317,P=0.0064）miR-216b-5p（Z=2.9195,P=0.0053））。Q-PCR验证结果和高通量测序结果一致。选择差异最显着的miR-199a-5p作为研究对象,发现相对于正常输卵管组织,miR-199a-5p在卵巢癌中低表达;miR-199a-5p在卵巢癌细胞系及其分泌的外泌体中,相对于常氧培养,在低氧培养中低表达。原位杂交结果显示,miR-199a-5p在正常输卵管组织显示强荧光,在卵巢癌组织显示弱荧光。miR-199a-5p的表达与卵巢癌临床病理特征关系表明miR-199a-5p的表达与肿瘤浸润（P<0.0010）、淋巴结转移（P<0.0010）、肿瘤TNM分期相关,与年龄无关（P=0.5740）。3.miR-199a-5p的生物信息学分析通过miRwalk数据库中的至少三个数据库,同时预测miR-199a-5p的靶基因,共获得70个候选靶基因,选择和低氧相关的HIF-2α作为miR-199a-5p的潜在靶基因。此外根据候选靶基因分析miR-199a-5p的生物学功能。GO注释富集靶基因的主要分子功能、生物学过程和细胞成分。KEGG信号通路富集靶基因参与了的癌症相关的多个信号通路如Wnt/β-catenin、p13K、NF-κB通路等。4.通过miR-199a-5p-HIF-2α-Wnt/β-catenin轴,来抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移转染miR-199a-5p质粒后卵巢癌细胞A2780在常氧和低氧环境下的侵袭、转移能力明显降低。加入miR-199a-5p抑制剂后,则逆转这一结果。通过生物信息学发现,HIF-2α是miR-199a-5p的潜在靶点。双荧光素酶报告显示:转染HIF-2α野生型的序列后,miR-199a-5p能显着抑制荧光素酶活性,而对HIF-2α突变型的荧光素酶活性无影响,说明了 HIF-2α是miR-199a-5p的直接靶点。免疫印迹实验表明:过表达miR-199a-5p后,可以显着抑制HIF-2α、Wnt3a和β-cateninmRNA在A2780细胞内的表达;而加入miR-199a-5p抑制后,则逆转这以效果,此外相对于正常输卵管组织,HIF-2α、Wnt3a和β-catenin表达在卵巢癌组织中高表达。免疫组化结果显示HIF-2α在卵巢癌组织中染色强阳性,在正常输卵管组织是阴性或弱阳性。相关分析显示卵巢癌组织中HIF-2α与miR-199a-5p的表达存在负性相关。5.外泌体miR-199a-5p可以增强内皮细胞紧密连接共聚焦显微镜显示,内皮细胞可以吞噬卵巢癌A2780细胞分泌的含有miR-199a-5p的外泌体;吞噬miR-199a-5p后内皮细胞的紧密连接标志VE-Cadherin和JAM-A蛋白的表达增加;相比正常输卵管组织,VE-Cadherin和JAM-A在卵巢癌组织中呈阴性或者弱阳性。结论miR-199a-5p在卵巢癌组织中低表达,miR-199a-5p在卵巢癌组织中的表达与临床分期,淋巴结转移和肿瘤浸润相关。低氧微环境下,卵巢癌细胞分泌的外泌体miR-199a-5p的下调促进了卵巢癌细胞的迁移及转移。miR-199a-5p靶基因为HIF-2α,可能通过wnt/β-catenin信号通路发挥作用。卵巢癌来源外泌体miR-199a-5p通过旁分泌作用于血管内皮细胞,其表达下调,可能抑制了内皮细胞之间的紧密连接。
谭文溪[6]（2020）在《TRP14通过自噬调控卵巢癌细胞对铂类耐药的机制研究》文中提出研究背景:卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系统恶性肿瘤,虽然近年来临床广泛开展的肿瘤细胞减灭术,结合铂类为基础的联合化疗方案,使卵巢癌的治疗效果显着提高,但多数患者在治疗后23年内复发并对以铂类为基础的联合化疗方案产生耐药,使得患者5年生存率仅为40%。因此,明确肿瘤细胞对铂类药物耐药的机制显得尤为重要。自噬（autophagy）是一种将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程。肿瘤细胞可以利用自噬来维持细胞生长,从而抵抗化疗药物。硫氧还蛋白相关蛋白14（Thioredoxin-related protein of 14 kDa,TRP14）是2004年发现的一种二硫还原酶,在多种组织中广泛表达,可参与调控肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）信号途径和细胞自噬。然而,TRP14是否可以通过调控自噬参与卵巢癌细胞铂类耐药的机制尚不明确。研究目的:本研究旨在明确TRP14在卵巢癌组织中的表达情况及其与自噬调控蛋白Beclin 1表达水平的相关性,探讨自噬在卵巢癌细胞铂类耐药机制中的作用,阐明TRP14在自噬调控卵巢癌细胞铂类耐药中的作用及分子机制,进而为TRP14和Beclin 1作为卵巢癌患者化疗反应和预后的检测因子提供理论基础,为TRP14作为铂类耐药卵巢癌的潜在治疗靶标提供实验依据。研究方法:1.TRP14和Beclin l在卵巢癌组织中的表达及其相关性应用Oncomine数据库检测TRP14 mRNA在卵巢癌组织中的表达;应用Kaplan-Meier-Plotter数据库分别检测TRP14 mRNA和自噬调控蛋白Beclin 1 mRNA在卵巢癌组织中的表达,以及与卵巢癌预后的相关性和卵巢癌化疗耐药的相关性;应用免疫组织化学染色的方法检测TRP14蛋白和Beclin 1蛋白在卵巢癌组织及癌旁组织中的表达,并分析二者表达的相关性。2.自噬对卵巢癌细胞铂类药物耐药的影响体外培养卵巢癌细胞亲本株SKOV3、A2780和卵巢癌细胞铂类耐药株SKOV3/DDP、A2780/DDP,通过CCK-8实验检测SKOV3/DDP和A2780/DDP对铂类药物的耐药性;采用蛋白免疫印迹的方法,检测细胞中自噬相关蛋白的表达;利用MDC染色,通过激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中自噬小泡的形成;向细胞内转染RFP-LC3质粒构建RFP-LC3细胞模型,利用激光共聚焦荧光显微镜观察并统计细胞中阳性小泡的数量;利用透射电镜技术,观察细胞内自噬体的超微结构。通过以上实验,评价铂类耐药的卵巢癌细胞的自噬水平。自噬抑制剂3MA处理SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞后,以蛋白免疫印迹方法检测自噬相关蛋白的表达;通过CCK-8实验检测细胞对铂类的耐药性;以基因沉默的方法下调SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中ATG5的表达,利用CCK-8实验分析SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞铂类耐药性的变化;使用自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）作用于SKOV3和A2780细胞,采用蛋白免疫印迹方法检测自噬相关蛋白的表达;MDC染色观察自噬小泡的形成;通过激光共聚焦荧光显微镜观察转染RFP-LC3质粒后阳性小泡的数量;透射电镜观察自噬体的超微结构;CCK-8实验检测细胞的耐药性。通过以上实验,评价自噬对卵巢癌细胞铂类耐药性的影响。3.TRP14对自噬的调控作用及其对卵巢癌细胞铂类耐药的影响体外培养卵巢癌细胞亲本株SKOV3、A2780和卵巢癌细胞铂类药物耐药株SKOV3/DDP、A2780/DDP,利用蛋白免疫印迹的方法检测细胞中TRP14蛋白的表达;分别以基因沉默的方法下调SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中TRP14的表达,以转染pcDNA3.1（+）-TRP14过表达质粒的方法上调SKOV3和A2780细胞中TRP14的表达,采用蛋白免疫印迹方法检测细胞中自噬相关蛋白的表达;以MDC染色方法观察细胞内自噬小泡的生成;利用激光共聚焦荧光显微镜观察转染RFP-LC3质粒后阳性小泡的数量;通过透射电镜观察自噬体的超微结构。通过以上实验,分别评价TRP14对卵巢癌亲本株及耐药株细胞自噬水平的影响。在SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中下调TRP14表达后,利用CCK-8实验检测耐药细胞株对铂类药物的敏感性;以自噬激活剂RAPA处理TRP14表达下调的SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞,CCK-8实验检测耐药细胞株对铂类药物的敏感性;过表达TRP14后,CCK-8实验检测铂类药物对SKOV3和A2780细胞活力的影响;在过表达TRP14的亲本株细胞中,基因沉默自噬调控蛋白ATG5,利用CCK-8实验检测细胞对铂类药物的耐药性。通过以上实验,明确TRP14调控的自噬对卵巢癌细胞铂类耐药的影响。利用蛋白免疫印迹的方法,检测SKOV3/DDP与A2780/DDP细胞中AMPK、mTOR和P70S6K的表达及磷酸化水平;分别以质粒转染的方法上调SKOV3与A2780细胞中TRP14的表达,以基因沉默的方法下调SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中TRP14的表达,检测TRP14对AMPK、mTOR和P70S6K表达及磷酸化水平的影响;使用AMPK抑制剂Compound C处理SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞后,CCK-8实验检测铂类药物对细胞活力的影响。通过以上实验,探讨TRP14调控自噬来影响卵巢癌细胞铂类药物耐药的分子机制。实验结果:1.TRP14和Beclin l在卵巢癌组织中的表达及其相关性生物信息学分析结果显示,与正常卵巢组织相比,TRP14 mRNA在多种亚型的卵巢癌组织中均表达上调。TRP14与Beclin 1的mRNA水平与卵巢癌患者的生存期呈负相关。免疫组织化学染色结果发现,与癌旁组织相比,TRP14与Beclin 1蛋白在卵巢癌组织中均表达上调,且两者的表达水平呈正相关。2.自噬对卵巢癌细胞铂类药物耐药的影响以相同剂量的顺铂处理后,与亲本株细胞SKOV3和A2780相比,耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP的细胞活力明显增加,细胞内自噬调控蛋白Beclin1、LC3 II和ATG5蛋白表达量明显上调,自噬小泡与RFP-LC3阳性小泡的数量显着增多,自噬体及自噬溶酶体结构清晰可见。该结果提示耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP中自噬水平增高。为了验证以上结果,本研究采用自噬抑制剂3MA处理耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP后,自噬相关蛋白Beclin 1、LC3 II和ATG5蛋白表达均明显下调,且细胞对铂类药物的敏感性增加。基因沉默自噬调控蛋白ATG5后,耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP对铂类药物的敏感性明显上升。以自噬激活剂RAPA干预后,亲本株SKOV3和A2780细胞发生自噬,并且降低了对铂类药物的敏感性。上述实验结果表明自噬是卵巢癌细胞对铂类药物产生耐药的重要机制之一。3.TRP14对自噬的调控作用及其对卵巢癌细胞铂类耐药的影响与亲本株SKOV3和A2780细胞相比,铂类耐药细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP中TRP14蛋白的表达明显上调,提示TRP14可能参与卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的调节。基因沉默TRP14蛋白的表达后,耐药株SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中自噬调控蛋白Beclin 1、LC3 II和ATG5的表达明显下调,自噬小泡和RFP-LC3阳性小泡数量显着减少,细胞内自噬体及自噬溶酶体结构减少。过表达TRP14蛋白后,亲本株SKOV3和A2780细胞中自噬调控蛋白Beclin1、LC3 II和ATG5表达明显上调,自噬小泡和RFP-LC3阳性小泡的数量显着增多,细胞内自噬体及自噬溶酶体结构增多。以上结果提示TRP14参与了卵巢癌细胞中自噬的调控。基因沉默TRP14后,耐药株SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞对铂类的敏感性增加,且这一过程可被自噬激活剂RAPA所逆转。过表达TRP14后,亲本株SKOV3和A2780细胞对铂类干预的敏感性下降,且这一效应可被ATG5基因沉默所逆转。以上结果提示TRP14是自噬调控卵巢癌细胞耐药性的关键蛋白之一。通过蛋白免疫印迹检测发现,与亲本株SKOV3与A2780相比,耐药株SKOV3/DDP与A2780/DDP细胞中AMPK的磷酸化水平上调,mTOR和P70S6K的磷酸化水平下调。在亲本株SKOV3和A2780细胞中过表达TRP14后,AMPK的磷酸化水平上调,mTOR和P70S6K的磷酸化水平下调。在耐药株SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中基因沉默TRP14的表达后,AMPK磷酸化水平下调,mTOR和P70S6K的磷酸化水平上调。上述结果提示TRP14通过AMPK/mTOR/P70S6K信号通路诱导自噬,从而增加了卵巢癌细胞对铂类药物的耐药性。结论:1.TRP14在卵巢癌组织中高表达,其表达水平与Beclin l蛋白的表达呈正相关,与患者的生存期呈负相关。2.铂类药物可促进卵巢癌细胞发生自噬,从而诱导卵巢癌细胞对铂类耐药。3.TRP14可以改变卵巢癌细胞的自噬水平,进而影响卵巢癌细胞对铂类药物的耐药性。4.TRP14通过AMPK/mTOR/P70S6K信号通路调控自噬,进而影响卵巢癌细胞对铂类药物的耐药性。
王伟杰[7]（2020）在《ERP29通过mTOR信号通路在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义》文中指出目的研究上皮性卵巢癌患者卵巢组织中ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白的表达水平,探讨其表达水平与临床病理特征之间的关系。分析ERP29对卵巢癌细胞增殖、侵袭及凋亡能力的影响及其在上皮性卵巢癌发生发展中的可能意义。方法1选取2018.112019.09于唐山市工人医院妇产科手术治疗,并经病理证实的上皮性卵巢癌患者卵巢组织37例,同期收集正常卵巢组织32例、良性卵巢肿瘤组织32例作为对照。Western blot技术检测各组卵巢组织中ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表达情况,分析ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1及p4EBP1蛋白的表达水平与患者临床病理特征之间的关系,分析ERP29与AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1及p4EBP1的相关性。2体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,通过细胞转染技术沉默ERP29基因。细胞模型构建成功后作为实验组（siRNA-ERP29组）,空白载体siRNA-NC转染的SKOV3细胞作为阴性对照组（siRNA-NC组）,未经处理的SKOV3细胞作为空白对照组（空白组）。采用RT-qPCR技术检测各组细胞AKT、mTOR、4EBP1 mRNA的表达情况,Western blot技术检测各组卵巢癌细胞ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表达情况,CCK-8实验检测各组细胞的增殖能力,划痕实验检测各组细胞的侵袭能力,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。3实验所得数据由SPSS 17.0软件进行处理分析。结果1 ERP29在上皮性卵巢癌组中的表达明显低于良性肿瘤组及正常卵巢组,且三者间的差异具有统计学意义（F=3052.247,P<0.05）;AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、p4EBP1在上皮性卵巢癌组中的表达明显高于良性肿瘤组及正常卵巢组,且三组间的差异具有统计学意义（F=542.727、F=902.637、F=169.081、F=420.940、F=284.819,P<0.05）;4EBP1在上皮性卵巢癌组、良性肿瘤组及正常卵巢组中的表达无明显统计学差异（F=1.299,P>0.05）。上皮性卵巢癌组织中,ERP29的表达水平与FIGO分期及淋巴转移有关（P<0.05）,与患者年龄、病理分级、组织学类型及腹水无关（P>0.05）;AKT、pAKT、mTOR、pmTOR及p4EBP1的表达水平与FIGO分期、病理分级及淋巴转移有关（P<0.05）,与患者年龄、组织学类型及腹水无关（P>0.05）。在正常卵巢组织、良性肿瘤组织及上皮性卵巢癌组织中,ERP29与AKT、mTOR、4EBP1的表达无明显相关性（P>0.05）,与pAKT、pmTOR、p4EBP1的表达呈负相关（P<0.05）。2细胞实验结果显示:AKT、mTOR、4EBP1 mRNA在siRNA-ERP29组的表达高于空白组及siRNA-NC组,差异具有统计学意义（F=994.687、F=3176.362、F=7.533,P<0.05）,三者在空白组及siRNA-NC组的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。AKT、mTOR、4EBP1在siRNA-ERP29组、空白组及siRNA-NC组的表达差异无统计学意义（F=2.261、F=0.864、F=2.337,P>0.05）;pAKT、pmTOR、p4EBP1在siRNA-ERP29组的表达高于空白组及siRNA-NC组,差异具有统计学意义（F=1256.980、F=1032.555、F=50.572,P<0.05）,三者在空白组及siRNA-NC组的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。细胞转染完成后48h,siRNA-ERP29组细胞显示出较空白组及siRNA-NC组更强的增殖能力（F=35.485,P<0.05）。siRNA-ERP29组较空白组及siRNA-NC组侵袭能力增强（F=52.779,P<0.05）。siRNA-ERP29组较空白组及siRNA-NC组凋亡率下降,但统计学无显着性差异（P>0.05）。空白组和siRNA-NC组细胞的增殖、侵袭及凋亡能力均无统计学差异（P>0.05）。结论1伴随病情的演变,ERP29在上皮性卵巢癌组织中表达降低,AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、p4EBP1在上皮性卵巢癌组织中表达增加,4EBP1在上皮性卵巢癌组织中的表达未见明显改变。2 ERP29与pAKT、pmTOR、p4EBP1的表达呈负相关,与AKT、mTOR、4EBP1无明显相关性。3沉默ERP29可增加SKOV3细胞pAKT、pmTOR及p4EBP1蛋白的表达水平并增强SKOV3细胞的增殖和侵袭能力,而未对AKT、mTOR、4EBP1的表达以及SKOV3细胞的凋亡能力造成明显影响。4 ERP29作为一种抑癌因子在卵巢癌的发生、发展中发挥作用,其机制与抑制mTOR通路的激活有关。图10幅;表22个;参138篇。
汪彩霞[8]（2020）在《转录因子GATA2调控TEM8对卵巢癌恶性生物学行为的影响及机制研究》文中研究表明目的:课题组前期研究发现TEM8在卵巢癌组织中高表达,与卵巢癌患者不良预后有关。本研究构建TEM8过表达和抑制表达卵巢癌细胞系模型,深入探讨TEM8对卵巢癌细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移的影响及相关的分子机制。进一步探究转录因子如何调控TEM8的表达及相关结合位点,为寻找卵巢癌的生物标记物和靶向治疗提供理论依据。研究方法:1、利用Western blot检测TEM8蛋白在4种卵巢癌细胞系（OVCAR3、SKOV3、A2780、CAOV3）的表达情况。构建TEM8过表达和抑制表达的卵巢癌细胞系,qRT-PCR和Western blot验证TEM8的m RNA和蛋白水平的变化。利用MTT、流式细胞仪、划痕、Transwell实验方法检测TEM8基因差异表达前后,卵巢癌细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移能力的变化。Western blot实验检测与上述生物学行为相关分子的变化。构建裸鼠皮下移植瘤,探究TEM8过表达对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响,并利用免疫组化的方法检测TEM8和细胞核增殖相关核抗原Ki-67的表达。2、从UCSC Xena数据库下载TCGA卵巢癌标准化RNAseq数据,并通过GSEA方法进行TEM8相关通路富集分析[1,2]。Western blot检测TEM8基因差异表达后,相关信号通路分子及其磷酸化水平的变化情况。并在TEM8过表达组添加通路抑制剂,检测卵巢癌细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移能力的变化。3、利用JASPAR和PROMO数据库筛选TEM8上游的转录因子GATA2,通过免疫组化检测GATA2在卵巢组织中的表达,分析其表达与卵巢癌临床病理参数的关系及与TEM8表达的相关性。利用starBase＿v3.0数据库验证卵巢癌组织中GATA2与TEM8表达在mRNA水平的相关性。采用免疫染色质共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验进一步探究GATA2是否结合TEM8启动子区及结合位点。构建GATA2抑制表达卵巢癌细胞系,qRT-PCR和Western blot检测TEM8 mRNA和蛋白水平的表达变化。结果:1、TEM8蛋白在SKOV3表达量最高,OVCAR3、A2780次之,CAOV3表达最少,因此利用SKOV3、OVCAR3构建TEM8抑制表达模型,OVCAR3和CAOV3构建TEM8过表达模型。与空白对照和阴性对照相比,MTT结果提示过表达TEM8促进卵巢癌细胞的增殖,细胞周期结果表明TEM8过表达组G0/G1期比例明显降低。细胞凋亡实验证明TEM8过表达组的凋亡率（（OVCAR3）3.05%±0.58%,（CAOV3）1.78%±0.67%）,明显低于阴性对照组（9.51%±1.70%,4.21%±0.59%）及空白对照组（8.58%±2.03%,5.58%±0.19%）。Western blot结果提示Ki-67、cyclin D1、Bcl2/Bax在TEM8过表达组表达增加,而抑制表达组的趋势与之相反。Transwell和划痕实验结果表明TEM8过表达促进卵巢癌细胞侵袭和迁移。而TEM8抑制表达组卵巢癌细胞的增殖、G0/G1期比值、侵袭和迁移能力均降低,细胞凋亡率增加。Western blot结果提示TEM8过表达组,MMP2、MMP9表达增加,抑制表达组的趋势与之相反。体内实验表明TEM8过表达组的肿瘤体积和质量（0.60±0.17cm3,0.81±0.3g）,明显高于阴性对照组（0.24±0.24cm3,0.34±0.28g）。免疫组化结果表明过表达组增殖细胞核抗原Ki-67表达升高。2、通过GSEA富集分析,发现TEM8与RAC1、MAPK、JAK-STAT信号通路相关。Western blot实验表明过表达组,p-Rac1/cdc42、p-JNK、p-MEK、p-ERK、p-STAT3（Ser727）表达增加,抑制表达组趋势与之相反。进一步在TEM8过表达组中添加RAC1（EHop-016）和/或MEK（PD98059）通路抑制剂,发现与DMSO组相比,RAC1i和MEKi单一抑制剂能明显抑制细胞增殖、周期、侵袭、迁移能力,促进细胞凋亡,且两种抑制剂联合使用上述趋势更显着。3、JASPAR和PROMO数据库共同筛选出转录因子GATA2。免疫组化结果表明GATA2在卵巢癌组织中高表达,与卵巢癌不良预后有关。通过分析GATA2和TEM8在同一批卵巢癌组织中表达相关性,结果表明两者表达呈正相关,且具有统计学意义。starBase＿v3.0数据库表明GATA2与TEM8在mRNA水平上亦呈正相关（P<0.05）。ChIP实验结果证实GATA2能结合TEM8上游TAGTTATCTTT序列（位于370-381位点）。且抑制GATA2表达后,TEM8 mRNA和蛋白表达水平均明显降低。结论:1、TEM8促进卵巢癌细胞增殖、G0/G1期转化、抑制凋亡,促进卵巢癌细胞侵袭和迁移。2、TEM8促进卵巢癌细胞Ki-67、cyclin D1、Bcl2/Bax、MMP2、MMP9的表达。3、TEM8通过RAC1和MEK通路促进卵巢癌恶性生物学行为。4、转录因子GATA2在卵巢癌组织中高表达,与卵巢癌患者不良预后有关,其通过调控TEM8的表达,促进卵巢癌恶性生物学行为。
杨雷[9]（2020）在《miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌化疗耐药组织中的表达及相关性研究》文中指出目的:本实验通过研究miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌组织中的表达情况,分析miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌中的临床意义及化疗耐药组织和敏感组织中的表达差异。利用两种生物信息学分析软件并结合文献资料对miR-93-3p和miR-497-5p进行靶基因预测并进行分析,初步探讨miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌化疗耐药中作用,为控制上皮性卵巢癌化疗耐药提供可能的候选基因。方法:收集山西省肿瘤医院上皮性卵巢癌患者的组织标本111例,根据NCCN公布的卵巢癌临床实践指南分为卵巢癌化疗耐药组和化疗敏感组（对照组）。采用RT-PCR检测miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌组织中的相对表达量,分析miR-93-3p和miR-497-5p相对表达量与临床病理特征关系及与化疗耐药相关性。通过生物信息学方法对miR-93-3p和miR-497-5p预测到的靶基因进行GO注释和KEGG通路分析,并查阅文献资料,预测miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌化疗耐药过程中可能的靶基因。采用RT-PCR检测预测靶基因在化疗耐药组和敏感组的表达差异。运用Western-blot进一步检测预测靶基因在两组中的的表达情况。运用spearman等级分析miR-93-3p和miR-497-5p与预测靶基因的相关性。综合分析miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌发生发展过程中可能的靶基因及相关信号通路。结果:1、在上皮性卵巢癌中,随着手术临床分期和组织学分级的升高,miR-93-3p和miR-497-5p表达量呈逐级下降趋势。在是否合并淋巴转移中,淋巴转移者较无淋巴转移者miR-93-3p和miR-497-5p的表达水平明显降低。提示miR-93-3p和miR-497-5p与上皮性卵巢癌发生发展相关。2、miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌化疗耐药组中的表达量相对于化疗敏感组显着低表达,提示miR-93-3p和miR-497-5p与上皮性卵巢癌化疗耐药具有相关性。3、通过生物信息学软件分析及文献总结,参与miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌化疗耐药进程中可能的靶基因分别为CDC42和Wnt3a。4、通过实时定量荧光PCR（RT-PCR）检测CDC42 mRNA和Wnt3a mRNA在上皮性卵巢癌组织中的表达水平并比较在化疗耐药组和敏感组的表达差异。结果显示,相对于上皮性卵巢癌化疗敏感组,CDC42 mRNA和Wnt3a mRNA在化疗耐药组中的相对表达量显着增高。5、通过Weston-blot实验检测CDC42和Wnt3a在上皮性卵巢癌组织中蛋白表达水平并比较在化疗耐药组和敏感组的表达差异。相对于上皮性卵巢癌化疗敏感组,CDC42和Wnt3a蛋白表达在化疗耐药组中的相对表达量显着增高。6、通过spearman等级分析,上皮性卵巢癌组织中miR-93-3p和CDC42 mRNA、miR-497-5p和Wnt3a mRNA的表达呈显着负相关。结论:1、miR-93-3p和miR-497-5p与上皮性卵巢癌发生发展相关。2、miR-93-3p和miR-497-5p与上皮性卵巢癌化疗耐药相关。3、CDC42 mRNA和Wnt3a mRNA与上皮性卵巢癌化疗耐药的发生相关。4、miR-93-3p、miR-497-5p可能分别通过负向调控靶基因CDC42、Wnt3a,参与上皮性卵巢癌化疗耐药过程。
吕瑾[10]（2020）在《GRK5/ACTC1共表达在上皮性卵巢癌中的临床意义》文中认为背景与目的卵巢癌（OC）是中国女性生殖恶性肿瘤死亡的主要原因。全球范围内,每年有23万9千例新发病例和15万2千例死亡病例,使卵巢癌成为全世界第七大最常见癌症和第二大最常见妇科癌症的死亡原因。卵巢癌中最常见的类型是上皮性卵巢癌（EOC）,尽管目前运用了肿瘤细胞减灭术联合化疗的方法来治疗卵巢癌,使得卵巢癌的预后有所改善,但上皮性卵巢癌的预后仍然很差。近年来,临床已经普遍运用了几种肿瘤生物标记物来监测EOC的进展并评估其预后,但是这些生物标记物的准确性有待进一步提高。因此,构建新的预后预测模型,并提供精准或个体化的治疗非常重要。GRK5是G蛋白偶联受体激酶（GRK）家族成员之一。它可以调节G蛋白偶联受体（GPCR）信号,与心力衰竭、糖尿病、高血压、阿尔茨海默氏病和癌症等多种疾病相关。它在成胶质细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和乳腺癌中起致癌作用。然而,GRK5在EOC中的作用尚未有研究报道。ACTC1与GRK5类似,也是与心血管疾病相关的基因,另有研究表明二者共同在肌层收缩与松弛通路中发挥着重要作用。有报道表明ACTC1在人类结肠癌、口腔鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤等中起着重要作用。但是,尚未有报道ACTC1在EOC中的作用,并且GRK5与ACTC1和EOC之间的关系也未探究。因此,实验研究旨在通过检验GRK5和ACTC1在上皮性卵巢癌组织和癌旁组织（石蜡包埋和新鲜样品）中表达的情况,确定GRK5和ACTC1的关系,分析二者共表达与病理参数的相关性,探讨GRK5和ACTC1在EOC中可能的作用以及它们对EOC预后的评估价值。方法与材料通过收集中山大学孙逸仙纪念医院于2009年12月至2017年3月期间被诊断和手术的172例EOC患者的石蜡包埋的癌组织和配对的41个癌旁组织,并使用免疫组织化学（IHC）评估GRK5和ACTC1的表达。另外,收集于2013年8月至2019年11月期间来自南方医科大学中西医结合医院的16例新鲜EOC组织及其匹配的癌旁组织,标本进行定时定量PCR（RT-qPCR）分析以检测GRK5和ACTC1 mRNA的表达情况。结果癌组织中GRK5和ACTC1的表达均高于癌旁组织。GRK5表达与ACTC1表达相关。而GRK5、ACTC1和GRK5/ACTC1共表达与EOC患者的无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）相关。最后,COX回归分析表明,GRK5+/ACTC1+共表达是EOC患者生存不良的独立预测因子。结论GRK5和ACTC1为EOC的候选致癌基因。GRK5+/ACTC1+共表达是EOC患者预后不良的独立预测因子。GRK5+/ACTC1+共表达在EOC的临床治疗和预后评估中提供重要价值。
二、PTEN与VEGF_(165)基因mRNA在卵巢癌中表达及相关性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PTEN与VEGF_(165)基因mRNA在卵巢癌中表达及相关性研究（论文提纲范文）
（1）NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明及缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 :NUPR1蛋白在卵巢癌组织中的表达及其对患者生存率的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 第二部分 :NUPR1在卵巢癌细胞中的分子生物学功能的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 第三部分 :NUPR1在卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移中的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 附图 |
| 创新性与不足之处 |
| 参考文献 |
| 中文综述 NUPR1的功能研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（2）m6A机制调控子宫内膜癌转移与进展的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 FTO通过m6A-HOXB13-WNT机制促进子宫内膜癌转移 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 组织样本 |
| 2. 实验仪器与设备 |
| 3. 主要试剂与耗材 |
| 4. 科研服务 |
| 二、实验方法 |
| 1. 组织与细胞样本RNA提取 |
| 2. RNA逆转录 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 免疫组织化学 |
| 5. 细胞培养 |
| 6. 细胞核-质分离 |
| 7. Western blotting |
| 8. 慢病毒包装,感染与稳转株筛选 |
| 9. 质粒、siRNA合成与转染 |
| 10. WNT信号通路抑制 |
| 11. 划痕实验 |
| 12. Transwell小室实验 |
| 13. RNA结合蛋白免疫沉淀测序与定量PCR实验(RIP-seq/PCR) |
| 14. mRNA纯化(从肿瘤细胞中直接提取纯化) |
| 15. mRNA纯化(从总RNA样品中纯化提取) |
| 16. m6A水平检测 |
| 17. 甲基化RNA免疫沉淀测序与定量PCR实验(MeRIP-seq/PCR) |
| 18. 转录组测序(RNA-seq) |
| 19. RNA pull-down实验 |
| 20. 双荧光素酶报告基因实验 |
| 21. mRNA降解速率分析 |
| 22. 动物实验 |
| 23. 二代测序数据分析 |
| 24. 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、FTO在子宫内膜癌的转移病灶中表达增高 |
| 二、FTO促进子宫内膜癌细胞的转移与侵袭 |
| 三、FTO去除HOXB13 mRNA中3'UTR区的m6A修饰 |
| 四、YTHDF2识别HOXB13 mRNA中m6A修饰促进mRNA降解 |
| 五、HOXB13促进子宫内膜癌细胞的侵袭和转移 |
| 六、HOXB13通过激活WNT信号通路促进细胞的侵袭与转移 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: IGF2BP1通过m6A依赖的方式促进PEG10的表达,促进子宫内膜癌细胞周期进展 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 组织样本 |
| 2. 实验仪器与设备 |
| 3. 主要试剂与耗材 |
| 4. 科研服务 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞增殖实验 |
| 2. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)检测 |
| 3. 细胞周期检测 |
| 4. 免疫荧光 |
| 5. 蛋白质免疫沉淀 |
| 6. CUT&Tag测序 |
| 7. ChIP-PCR实验 |
| 8. 测序数据分析 |
| 9. 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、IGF2BP1的高表达与子宫内膜癌患者的临床预后不良有关 |
| 二、IGF2BP1促进子宫内膜癌细胞增殖,加速细胞周期进展 |
| 三、IGF2BP1通过m6A依赖方式识别PEG10 mRNA |
| 四、IGF2BP1促进PEG10 mRNA的稳定性及表达 |
| 五、PABPC1蛋白与IGF2BP1蛋白协同稳定PEG10 mRNA |
| 六、PEG10促进子宫内膜癌细胞增殖,并与患者不良预后有关 |
| 七、PEG10蛋白抑制肿瘤细胞周期相关基因的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 m6A修饰在妇科肿瘤中的研究进展 |
| 背景 |
| m6A写入,擦除与读取 |
| 妇科肿瘤研究的意义 |
| 妇科肿瘤中的整体m6A修饰水平 |
| 卵巢癌 |
| 子宫内膜癌 |
| 宫颈癌 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文 |
（3）MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 MGRN1 启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者化疗耐药的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MGRN1 基因在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药过程中的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MGRN1 启动子区异常甲基化与卵巢浆液性囊腺癌患者预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 泛素连接酶在肿瘤化疗和预后中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）RECQL4在浆液性卵巢癌中的生物学功能及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 RECQL4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分 RECQL4对浆液性卵巢癌细胞铂类及PARP抑制剂敏感性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第三部分 浆液性卵巢癌中RECQL4下游靶基因的筛选与功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第四部分 浆液性卵巢癌中RECQL4的上游分子调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1. RECQL4, Negatively Regulated by miR-10a-5p, Facilitates Cell proliferationand Invasion via MAFB in Ovarian Cancer |
| 外文论文2. Comparison of the Cook vaginal cervical ripening balloon with prostaglandin E2insert for induction of labor in late pregnancy |
（5）肿瘤低氧微环境下外泌体miR-199a-5p对卵巢癌转移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人类卵巢癌细胞及其分泌的外泌体在常氧和低氧培养下miRNA的筛选及验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 外泌体miR-199a-5p对卵巢癌细胞的生物学行为影响及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 外泌体miR-199a-5p对血管内皮细胞的生物学行为的初步探索 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 低氧对肿瘤转移的促进作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）TRP14通过自噬调控卵巢癌细胞对铂类耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 卵巢癌概述 |
| 2 铂类药物与卵巢癌耐药 |
| 2.1 铂类药物简介 |
| 2.2 铂类的抗肿瘤作用及机制 |
| 2.3 铂类与卵巢癌耐药 |
| 2.3.1 细胞内药物积累减少 |
| 2.3.2 细胞对铂类的转化和解毒功能增加 |
| 2.3.3 细胞的DNA修复能力增加 |
| 2.3.4 细胞凋亡受阻 |
| 2.3.5 表观遗传学的改变 |
| 3 自噬 |
| 3.1 自噬概述 |
| 3.2 自噬的发生过程 |
| 3.3 自噬的分子机制 |
| 3.4 自噬与肿瘤 |
| 3.4.1 自噬与肿瘤的发生发展 |
| 3.4.2 自噬与卵巢癌 |
| 3.4.3 自噬与卵巢癌铂类耐药 |
| 4 TRP14与自噬 |
| 4.1 TRP14概述 |
| 4.2 TRP14与自噬的相关性 |
| 第一部分 TRP14和Beclin1在卵巢癌组织中的表达及相关性 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验仪器与设备 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 应用Oncomine数据库进行生物信息学分析 |
| 1.2.2 应用Kaplan-Meier-Plotter数据库进行生物信息学分析 |
| 1.2.3 免疫组织化学染色 |
| 1.2.4 蛋白免疫印迹分析 |
| 1.2.5 统计方法 |
| 1.2.6 技术路线 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 TRP14 mRNA在卵巢癌组织中的表达 |
| 1.3.2 TRP14 mRNA的表达与卵巢癌预后的关系 |
| 1.3.3 TRP14 mRNA的表达与卵巢癌化疗耐药的关系 |
| 1.3.4 Beclin1 mRNA的表达与卵巢癌预后及化疗耐药的关系 |
| 1.3.5 TRP14与Beclin1蛋白在卵巢癌组织中的表达 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 铂类激活自噬诱导卵巢癌细胞耐药 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏、培养和冻存 |
| 2.2.2 CCK-8实验 |
| 2.2.3 顺铂敏感性检测 |
| 2.2.4 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.5 MDC染色 |
| 2.2.6 质粒抽提 |
| 2.2.7 RFP-LC3 质粒转染 |
| 2.2.8 免疫荧光检测 |
| 2.2.9 透射电镜实验 |
| 2.2.10 shRNA-ATG5质粒构建及慢病毒转染 |
| 2.2.11 耐药指数检测 |
| 2.2.12 统计学方法 |
| 2.2.13 技术路线 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 顺铂对卵巢癌细胞活力的影响 |
| 2.3.2 顺铂耐药卵巢癌细胞的自噬水平 |
| 2.3.3 调控自噬对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 TRP14通过调控自噬诱导卵巢癌细胞对顺铂耐药 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 pcDNA-TRP14质粒的构建和转染 |
| 3.2.2 shRNA-TRP14质粒构建及慢病毒转染 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.2.4 技术路线 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 亲本及耐药的卵巢癌细胞中TRP14的表达 |
| 3.3.2 下调TRP14的表达对SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞自噬的影响 |
| 3.3.3 下调TRP14的表达对SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞顺铂敏感性的影响 |
| 3.3.4 过表达TRP14后对SKOV3和A2780细胞自噬的影响 |
| 3.3.5 过表达TRP14后对SKOV3和A2780细胞顺铂敏感性的影响 |
| 3.3.6 TRP14对AMPK/mTOR/P70S6K信号通路的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）ERP29通过mTOR信号通路在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Western blot技术检测各组卵巢组织ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表达情况 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 细胞转染 |
| 1.2.4 RT-qPCR技术检测各组细胞AKT、mTOR、4EBP1 mRNA的表达情况 |
| 1.2.5 Western blot技术检测各组细胞ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表达情况 |
| 1.2.6 CCK-8实验检测干扰后SKOV3细胞增殖能力的变化 |
| 1.2.7 划痕实验检测干扰后SKOV3细胞侵袭能力的变化 |
| 1.2.8 流式细胞仪检测干扰后SKOV3细胞凋亡情况 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 各组卵巢组织ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表达情况 |
| 1.4.2 各组卵巢组织中pAKT/AKT、pmTOR/mTOR、p4EBP1/4EBP1即AKT、mTOR、4EBP1蛋白的磷酸化情况 |
| 1.4.3 各组卵巢组织中ERP29与AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1及p4EBP1蛋白表达相关性分析 |
| 1.4.4 上皮性卵巢癌组织中ERP29、AKT、pAKT、mTOR、pmTOR及p4EBP1蛋白表达与临床病理特征之间的关系 |
| 1.4.5 SKOV3细胞生长状况 |
| 1.4.6 RT-qPCR检测转染模型是否构建成功 |
| 1.4.7 RT-qPCR检测各组细胞AKT、mTOR、4EBP1 mRNA表达情况 |
| 1.4.8 Western blot技术检测各组细胞AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、4EBP1、p4EBP1蛋白表达情况 |
| 1.4.9 各组细胞中pAKT/AKT、pmTOR/mTOR、p4EBP1/4EBP1即AKT、mTOR、4EBP1蛋白的磷酸化情况 |
| 1.4.10 CCK-8检测各组细胞增殖能力 |
| 1.4.11 划痕实验检测各组细胞侵袭能力 |
| 1.4.12 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 PI3K/AKT/mTOR信号通路与卵巢癌 |
| 2.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 2.1.1 PI3K |
| 2.1.2 AKT |
| 2.1.3 mTOR |
| 2.1.4 4EBP1 |
| 2.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关因子 |
| 2.2.1 PTEN |
| 2.2.2 p53 |
| 2.2.3 ERP29 |
| 2.2.4 Caspase家族 |
| 2.2.5 TANK结合激酶-1（TANK binding kinase-1, TBK1） |
| 2.2.6 其他 |
| 2.3 PI3K/AKT/mTOR信号通路与肿瘤 |
| 2.4 PI3K/AKT/mTOR信号通路与卵巢癌 |
| 2.5 PI3K/AKT/mTOR信号通路对卵巢癌耐药的影响 |
| 2.6 PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂在卵巢癌治疗中的应用 |
| 2.6.1 PI3K抑制剂 |
| 2.6.2 AKT抑制剂 |
| 2.6.3 mTOR抑制剂 |
| 2.6.4 PI3K/mTOR双重抑制剂 |
| 2.6.5 与化疗联合应用 |
| 2.6.6 现状 |
| 2.7 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（8）转录因子GATA2调控TEM8对卵巢癌恶性生物学行为的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:TEM8对卵巢癌恶性生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 慢病毒转染 |
| 2.2.3 SiRNA转染 |
| 2.2.4 qRT-PCR |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 MTT实验 |
| 2.2.7 流式细胞周期实验 |
| 2.2.8 流式细胞凋亡实验 |
| 2.2.9 划痕实验 |
| 2.2.10 Transwell实验 |
| 2.2.11 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.2.12 石蜡包埋、切片及HE染色 |
| 2.2.13 免疫组化 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 构建TEM8过表达和抑制表达的卵巢癌细胞系 |
| 3.2 TEM8对卵巢癌细胞增殖、周期和凋亡能力的影响 |
| 3.3 TEM8对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响 |
| 3.4 TEM8对裸鼠皮下移植瘤增殖能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:TEM8影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养及处理 |
| 2.2.2 GSEA富集分析 |
| 2.2.3 Western blot |
| 2.2.4 MTT实验 |
| 2.2.5 流式细胞周期实验 |
| 2.2.6 流式细胞凋亡实验 |
| 2.2.7 划痕实验 |
| 2.2.8 Transwell实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GSEA富集与TEM8 相关信号通路 |
| 3.2 TEM8 激活Rac1/Cdc42/JNK和 MEK/ERK/STAT3 信号通路 |
| 3.3 添加RAC1 和/或MEK通路抑制剂对TEM8 过表达组细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 添加RAC1 和/或MEK通路抑制剂对TEM8 过表达组细胞侵袭和迁移的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:转录因子GATA2 调控TEM8 的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 免疫组化 |
| 2.2.3 JASPAR和 PROMO网站预测结合位点 |
| 2.2.4 结合位点引物设计 |
| 2.2.5 ChIP实验 |
| 2.2.6 琼脂糖水平电泳 |
| 2.2.7 SiRNA转染 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GATA2在各组卵巢组织中的表达 |
| 3.2 GATA2与卵巢癌临床病理参数的关系 |
| 3.3 GATA2与卵巢癌生存预后的关系 |
| 3.4 GATA2与TEM8 表达的相关性 |
| 3.5 GATA2 结合TEM8 上游启动子区域 |
| 3.6 GATA2 转录调控TEM8 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌化疗耐药组织中的表达及相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 上皮性卵巢癌组织标本 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR测定miR-93-3p和 miRNA-497-5p的表达水平 |
| 2.2 miR-93-3p和 miR-497-5p生物信息学分析 |
| 2.3 RT-PCR测定CDC42 mRNA和 Wnt3a mRNA的表达水平 |
| 2.4 Western-blot检测CDC42 蛋白和Wnt3a蛋白表达水平 |
| 2.5 上皮性卵巢癌组织miR-93-3p、miRNA-497-5p和预测靶基因相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 4.1 结论1 |
| 4.2 结论2 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）GRK5/ACTC1共表达在上皮性卵巢癌中的临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 GRK5及ACTC1 mRNA在上皮性卵巢癌中的表达及相关性 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 GRK5及ACTC1蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及相关性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 GRKS及ACTC1蛋白表达在上皮性卵巢癌中的临床意义 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 成果 |
| 致谢 |
四、PTEN与VEGF_(165)基因mRNA在卵巢癌中表达及相关性研究（论文参考文献）
- [1]NUPR1在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制研究[D]. 余江涛. 山东大学, 2021(12)
- [2]m6A机制调控子宫内膜癌转移与进展的分子机制研究[D]. 张林. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]MGRN1启动子区异常甲基化在卵巢浆液性囊腺癌化疗耐药和预后中的研究[D]. 李晓飞. 河北医科大学, 2021(02)
- [4]RECQL4在浆液性卵巢癌中的生物学功能及其机制研究[D]. 郭丽. 山东大学, 2020(04)
- [5]肿瘤低氧微环境下外泌体miR-199a-5p对卵巢癌转移的作用及机制研究[D]. 连烜晔. 山东大学, 2020(02)
- [6]TRP14通过自噬调控卵巢癌细胞对铂类耐药的机制研究[D]. 谭文溪. 吉林大学, 2020(08)
- [7]ERP29通过mTOR信号通路在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义[D]. 王伟杰. 华北理工大学, 2020(02)
- [8]转录因子GATA2调控TEM8对卵巢癌恶性生物学行为的影响及机制研究[D]. 汪彩霞. 中国医科大学, 2020
- [9]miR-93-3p和miR-497-5p在上皮性卵巢癌化疗耐药组织中的表达及相关性研究[D]. 杨雷. 山西医科大学, 2020(11)
- [10]GRK5/ACTC1共表达在上皮性卵巢癌中的临床意义[D]. 吕瑾. 南方医科大学, 2020(01)