一、植物焦磷酸酶(PPase)的研究进展（论文文献综述）
林杉[1]（2021）在《共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子鉴定及ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价》文中指出紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是主要的饲用牧草之一,因其具有高蛋白、低纤维、适口性好等特点,被誉为“牧草之王”。但紫花苜蓿的抗逆性较弱,在我国西北干旱半干旱地区及盐渍环境中难以获得高产,将荒漠植物的优异抗逆基因转入紫花苜蓿中有望改良其抗逆性。多浆旱生植物霸王（Zygophyllum xanthoxylum）兼具较强的抗旱耐盐性,其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白编码基因ZxNHX1和H+-焦磷酸酶编码基因ZxVP1-1是提高其抗逆性的关键基因。本课题组前期克隆了霸王ZxNHX1和ZxVP1-1,与抗除草剂基因Bar聚合转入紫花苜蓿中,获得了共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿,但对其分子特征尚不清楚。此外,盐渍环境中,除Na+外,Cl-在植物细胞质中积累过多也会产生毒害作用,但目前大多数研究主要关注Na+,对Cl-的研究较少。荒漠植物沙芥（Pugionium cornutum）是一种典型的积氯植物,本课题组前期研究表明,液泡膜Cl-通道基因PcCLCg是沙芥耐氯的关键基因,将PcCLCg与ZxNHX1聚合共同转入紫花苜蓿中并获得了抗性植株,但对其耐盐性尚未进行评定。本研究采用PCR、RT-PCR、Southern Blot、Western Blot和ELISA对共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子特征进行鉴定;并对共表达ZxNHX1-PcCLCg与超表达ZxNHX1紫花苜蓿的耐盐性进行比较分析。取得如下主要结果:1.经PCR鉴定,共筛选到8株共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿阳性株系。经Southern Blot检测,其中8号株系的目的基因ZxNHX1、ZxVP1-1和标记基因Bar均为单一拷贝;Western Blot和ELISA检测结果显示,ZxNHX1和ZxVP1-1蛋白在8号株系整株水平上均能正常表达,叶片中蛋白表达量最高,茎和根中次之。表明外源目的基因ZxNHX1、ZxVP1-1已整合至紫花苜蓿基因组中并在蛋白水平表达。2.经PCR鉴定得到16株共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿阳性株系,对其和超表达ZxNHX1紫花苜蓿阳性株系进行RT-PCR检测,筛选得到ZxNHX1和PcCLCg基因表达量较高和较低的共表达株系各1株（NC-1和NC-2）,以及与NC-1中ZxNHX1表达量相对一致的超表达ZxNHX1株系1株（N-1）,用于后续耐盐性分析。3.50和200 mmol/L NaCl处理10 d后,NC-1株系的株高及地上部鲜干重显着高于N-1株系、空载体及野生型,表明ZxNHX1和PcCLCg的共表达能够显着增强紫花苜蓿的耐盐能力。4.盐处理下,各株系体内的Na+和Cl-含量逐渐增加,K+含量逐渐降低。50mmol/L NaCl处理下,NC-1株系叶片和根中Na+含量分别显着高于NC-2和N-1株系;NC-1株系叶片和茎中Cl-含量显着高于N-1株系、空载体及野生型。200mmol/L NaCl处理下,NC-1株系叶片和茎中Na+含量显着高于NC-2、N-1株系、空载体及野生型,NC-1和N-1株系根中Na+含量均显着高于NC-2株系、空载体及野生型;NC-1株系叶片、茎和根中Cl-含量分别显着高于NC-2和N-1株系。表明共表达ZxNHX1和PcCLCg增强了紫花苜蓿中Na+和Cl-的积累能力。5.对照条件下（0 mmol/L NaCl）,所有株系中Na+对叶片渗透势的贡献较低且无明显差异。50和200 mmol/L NaCl处理下,NC-1株系中Na+对叶片渗透势的贡献分别显着高于NC-2和N-1株系。与Na+一致,对照条件下所有株系中Cl-对叶片渗透势的贡献较低。50 mmol/L NaCl处理下,NC-1株系中Cl-对叶片渗透势的贡献分别显着高于NC-2和N-1株系。200 mmol/L NaCl处理下,NC-1和NC-2株系中Cl-对叶片渗透势的贡献显着高于空载体和野生型。表明共转ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿通过积累Na+和Cl-有助于增加转基因植株在盐胁迫下的渗透调节能力。6.盐处理下,N-1株系、空载体及野生型叶片相对质膜透性随着盐浓度的增加而逐渐升高,NC-1和NC-2株系的叶片相对质膜透性保持稳定。200 mmol/L NaCl处理下,NC-1株系的叶片渗透势显着低于NC-2、N-1株系、空载体及野生型。
陈贞,王逸茹,王晓丽,方婷,甄斯涵,卢嘉雯,郑军,付俊杰[2]（2021）在《玉米可溶性无机焦磷酸酶家族基因的克隆和表达分析》文中研究指明可溶性无机焦磷酸酶（Soluble inorganic pyrophosphatase）通过水解作用调节细胞质中无机焦磷酸盐（PPi,pyrophosphate）的含量使其维持在适当水平。本研究一共克隆了玉米（Zea mays L.）中7个可溶性无机焦磷酸酶基因Zm PPases,分别位于第2、4、5、6、8、10号染色体上。同源基因分子量介于22.8～25.6 kDa之间,等电点介于4.84～6.24之间。可溶性无机焦磷酸酶蛋白的二级结构主要由α螺旋和β折叠构成。系统进化分析表明可溶性无机焦磷酸酶基因在玉米、水稻（Oryza sativa L.）、高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）和拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）物种中可以分为3组。亚细胞定位进一步揭示了玉米可溶性无机焦磷酸酶在细胞膜和细胞核中表达。此外,在不同非生物胁迫（盐和干旱）下Zm PPases基因表现出不同的应激反应,除了Zm PPase2.1（Zm00001d051564）在盐胁迫下表达下调,其余Zm PPases在盐和干旱胁迫下均表达上调。本研究通过对Zm PPases家族成员序列及表达进行全面分析,为进一步探讨Zm PPases的基因功能提供理论基础。
王贝贝,张乐,郭欢,包爱科[3]（2020）在《植物H+-PPase研究进展》文中研究说明植物质子焦磷酸酶（H+-pyrophosphatase,H+-PPase）具有多种功能,在植物生命活动中扮演着重要的角色。该酶不仅能够参与调控糖异生、蔗糖的韧皮部装载和运输,还在植物抵御多种非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。本文综述了近年来植物H+-PPase分子克隆、结构、分类和定位等方面的研究进展,并重点总结了其功能,以期为今后相关研究提供参考。
时俊美[4]（2020）在《披碱草氢离子焦磷酸化酶（EdHPPase1）基因转化小麦的效应分析》文中进行了进一步梳理氢离子转运无机焦磷酸化酶（H+-PPase）是一类区别于H+-ATPase的H+转运酶,对植物体内的生理以及生化过程具有积极的影响。H+-PPase作为质子泵,对植物抗逆起重要作用。EdHPPase1基因的表达在模式作物中的功能已被验证,然而对农作物的生理机制和调控机理很少有表明,为了更好的探究EdHPPase1在农作物中的功能,本研究分别通过水培试验和田间试验两种途径验证EdHPPase1基因在非生物胁迫下的响应。生物信息学分析表明,披碱草焦磷酸化酶（EdHPPase1）基因开放阅读框共有2310bp,编码氨基酸770个,且EdHPPase1有15个跨膜螺旋结构,通过氨基酸序列比对结构显示:含有完整的保守域。蛋白同源性对比发现,与已知羊草、大麦的无机焦磷酸化酶蛋白的同源性高达98%。水培试验下,碱胁迫处理时,生理指标显示,转基因小麦的鲜重含量、相对含水量显着高于野生型,失水率较野生型减慢;根系扫描结果显示,与野生型相比,披碱草无机焦磷酸化酶（EdHPPase1）基因的表达使转基因小麦根的投影面积、表面积、体积等一些根系指标明显增加。而正常处理下,转基因小麦株系无论是株高、地上部鲜重的含量与野生型无差异,根长、根鲜重的含量低于野生型株系;生化指标测定结果显示,转基因小麦的可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白等含量与野生型相比明显增加,而丙二醛含量、相对电导率的含量较野生型降低;抗氧化酶指标显示:碱胁迫下,转基因小麦的SOD、CAT、POD以及超氧阴离子自由基的含量与野生型相比,均明显增加。田间试验下,低磷处理时,测定的各项指标显示:转基因小麦秸秆和籽粒中全氮、全磷含量均显着高于野生型株系;正磷处理下,与野生型相比,转基因小麦秸秆和籽粒含量以及产量的变化与低磷处理变化趋势一致,产量增产幅度略低于低磷处理。综上,低磷处理时,氢离子无机焦磷酸化酶EdHPPase1基因的表达增加了收获期小麦的养分含量。
梁靖雯[5]（2020）在《鸟巢蕨对干旱胁迫的响应及AVP1基因的挖掘与鉴定》文中进行了进一步梳理鸟巢蕨（Asplenium nidus L.）为热带森林重要附生大型蕨类植物,在其中发挥着重要生态功能。在野生条件下,鸟巢蕨表现了一定的耐旱能力。在园艺生产过程中,鸟巢蕨有一定的产业基础。因此,鸟巢蕨逐渐成为研究的热点。为了探索鸟巢蕨的干旱胁迫响应机制、挖掘鸟巢蕨的干旱响应基因,本研究在海南大学物联网大棚内进行了盆栽实验,将长势均匀一致的鸟巢蕨六盆分为一组并进行不同程度的干旱处理,分别为对照组CK每天浇水、中度干旱组T1两周浇一次水、重度干旱组T2不浇水,每周分别对三组鸟巢蕨进行了一系列生理生化指标的测定,并挖掘了四个鸟巢蕨中的AVP1家族基因,通过RT-qPCR技术进行了这些基因的表达量分析。实验结果如下:1.不同干旱程度鸟巢蕨叶片生长参数本实验分别测定了叶长、叶宽的周增长量、叶片含水量和气孔密度这四个生长参数。其中叶长、叶宽增长量和叶片含水量这三个指标,T1组按浇水时间波动,复水后三个指标均几乎立刻恢复至正常值,T2组叶长叶宽几乎停止生长,含水量也大幅下降,复水后叶片含水量迅速恢复至正常值而叶长叶宽虽立即恢复增长但稍显缓慢,而气孔密度在T1组没有显着变化,只在T2组干旱处理后期有显着升高。2.不同干旱程度鸟巢蕨叶片光合指标本实验分别测定了净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度、气孔导度这四个光合指标。其中净光合速率、蒸腾速率、气孔导度这三个指标表现出相似的变化趋势,对照组仅在合理范围内小幅度变化,T1、T2组在失水后这三个指标都降至零附近,复水后恢复;而胞间CO2浓度这个指标变化趋势与其他三个指标相反,失水后T2组叶片胞间CO2浓度大幅度升高,复水后下降至正常值,T1组随浇水频率呈周期性变化。3.不同干旱程度鸟巢蕨叶片生化指标本实验分别测定了可溶性蛋白质、脯氨酸、甜菜碱这三个耐旱相关化合物含量和SOD、POD、CAT三个耐旱相关酶的活性。其中可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和SOD、POD的酶活性在干旱处理后均有升高,而甜菜碱含量和CAT的活性不受干旱胁迫诱导。4.耐旱相关基因的鉴定本实验选择了已在其他物种中多次被证明与植物耐旱相关的基因AVP1基因,通过对该基因蛋白保守结构域的鉴定、基因挖掘、序列比对、进化树的构建筛选出了四条鸟巢蕨中的AVP1家族基因,命名为AVP1-1、AVP1-2、AVP1-3、AVP1-4,经过实时荧光定量检测分析其在三组实验材料不同时期的表达量发现,AVP1-1、AVP1-2、AVP1-3,、AVP1-4四个基因对干旱和复水表现出不同的响应模式。四个基因都在干旱胁迫诱导下表达上调,但只有AVP1-1、AVP1-2两个基因在复水后表达量下调。综上所述,鸟巢蕨具有一定抗旱性,可以在完全不浇水的情况下存活六周,干旱胁迫下虽然导致叶片停止生长,干旱相关的化合物含量和酶活性变化,但是复水后均可恢复。上述结果初步阐述了鸟巢蕨的干旱响应机制,进一步丰富了鸟巢蕨的干旱调控机制和分子生物学的研究,为鸟巢蕨耐旱机制与耐旱基因深入研究奠定了基础,为鸟巢蕨观赏栽培提供了理论依据,为加强野生鸟巢蕨保护提供了有益参考。
张晓芳[6]（2018）在《矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）的异源表达提高玉米耐旱性》文中指出干旱制约着玉米的生产及发展,严重影响玉米生长发育及籽粒产量。传统育种方法选育耐旱品种周期长、效率低,更由于玉米自身耐旱种质资源狭窄,难以选育成能满足生产需求的耐旱品种。因此,挖掘具有自主知识产权的抗旱抗逆基因是玉米抗逆转基因研究的必须之路。转基因技术可克服物种间的生殖障碍,转化利用其他物种的耐旱基因,是克服干旱威胁最为经济有效的措施。在前期研究中,课题组从残遗超旱生植物矮沙冬青中,克隆了液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）,转化酵母和拟南芥突变体验证其对非生物逆境的抗性后,用农杆菌介导法转化玉米自交系,共获得47个T1代转基因株系。本研究对AnVP1基因推导蛋白进行安全性预测后,结合除草剂抗性筛选、特异PCR扩增、高效热不对称交错式PCR（High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,hiTAIL-PCR）、反转录PCR（Reverse-transcription PCR,RT-PCR）和RNA测序（RNA-sequencing,RNA-seq）、盆栽和田间耐旱性鉴定等方法,对这47个转基因株系进行了繁育和鉴定,主要结果如下:（1）数据库比对结果,AnVP1基因推导蛋白与所有已知毒蛋白、过敏原和抗营养因子均不同源,说明我们克隆的AnVP1基因是安全的,可用于转化玉米等作物。（2）在自交繁育的同时,结合田间抗除草剂筛选和特异PCR鉴定,繁育获得26个T3代株系,其中12个株系在T2代的阳性率即达100%,表明这12个T3代株系已经纯合,可用于后续抗性鉴定（3）用hiTAIL-PCR扩增出A1、A16和A49三个T2代株系T-DNA整合位点右边界的侧翼序列,将这三个株系T-DNA整合位点分别定位于第5、6和6号染色体,并且发现A31、A33和A37三个株系T-DNA的整合携带了部分表达载体骨架。（4）用RT-PCR方法可从12个纯合的T3代株系中均检测到AnVP1基因的表达,表明AnVP1基因不仅整合进玉米基因组,也在玉米中异源表达。（5）在T2和T3代株系反复多次的盆栽试验中,标记为A31、A33和A37的三个株系的幼苗在干旱胁迫15 d后复水,能全部恢复生长,耐旱性显着高于未转基因对照,而其余株系只有部分恢复生长,与未转基因对照差异不明显。（6）RNA-seq分析表明,A31、A33和A37株系分别有285、169和288内源基因较未转基因对照差异表达。其中,上调表达的分别有149、92和115个,下调表达的分别有136、77和173个基因,在3个转基因株系中共同上调和下调表达的分别有6和12个。GO分析表明,在差异表达基因中,分子功能相关基因有326个,涉及催化活性、结合和转录调控等代谢途径,归分为12个种类;细胞组分相关基因有115个,涉及细胞和细胞器成分等,归分为11个类型;生物学过程相关基因有245个,涉及代谢过程、细胞进程、应激反应、生物调节和发育过程等,分为17类。由此说明,T-DNA的整合还可能通过对内源基因表达的影响间接调控胁迫应答、糖代谢及生长发育。（7）田间试验表明,转基因株系A765的单株粒重及其在干旱胁迫条件下的耐旱系数均显着高于未转基因对照和优良自交系郑58,转基因株系A737在非胁迫条件下的单株粒重也显着高于未转基因对照。上述结果表明,矮沙冬青AnVP1基因已整合到玉米基因组中,其异源表达提高了转基因株系的耐旱性。经进一步筛选繁育、表型鉴定和安全性评价后,所获转基因株系有望应用于耐旱玉米品种培育。
于好强[7]（2017）在《矮沙冬青四个抗逆基因的功能研究》文中进行了进一步梳理矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus）又名新疆沙冬青,与蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）同属豆科沙冬青属,是第三纪古地中海消失后的残遗物种。沙冬青对干旱、盐碱、贫瘠和极端温度等非生物逆境耐受性极强,是抗逆性极好且极珍贵的遗传资源。目前,关于沙冬青非生物逆境抗性基因的研究主要集中在蒙古沙冬青,鲜有关于矮沙冬青抗逆基因克隆及功能解析的报道。甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）是甜菜碱合成途径的关键酶,而甜菜碱是植物细胞中重要的渗透调节物质。钼辅助因子硫酸化酶（Molybdenum cofactor sulfurase,MCSU）催化钼辅助因子硫酸化,而硫酸化后的钼辅助因子则与脱落酸醛氧化酶一起在脱落酸（Abscisic acid,ABA）合成最后一步反应中催化脱落酸醛氧化生成ABA。磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）催化磷脂降解产生磷脂酸,在植物生长发育及逆境应答中起重要作用。液泡膜氢离子焦磷酸酶（Vacuolar H+-pyrophosphatase,H+-PPase或V-PPase）是液泡膜上的氢离子泵之一,水解焦磷酸盐产生势能,促进离子向液泡内转运。这4种酶参与不同生理代谢途径,与植物生长发育及逆境应答紧密相关。目前,已有关于其基因克隆、功能验证及转基因利用的报道,但尚未从抗逆性极强的矮沙冬青中克隆并研究其基因功能。为避免转基因抗逆品种培育方面的专利纠纷,本研究在前期用cDNA末端快速扩增技术从矮沙冬青中克隆得到AnBADH、AnMCSU、AnPLDα和AnVP1基因的基础上,综合运用实时定量PCR、原核表达、亚细胞定位、酵母或拟南芥突变体功能互补或过表达等技术,解析这4个基因的抗逆功能,以期为作物抗非生物逆境的转基因改良提供优异的基因资源。研究结果如下:（1）AnBADH基因cDNA序列全长1868 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）1512 bp,编码503个氨基酸,分子量54.71 kDa,等电点pH5.39,不稳定系数28.36,总平均亲水指数-0.015,具有一个BADH蛋白典型的磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型醛脱氢酶超家族保守结构域,不具有跨膜区和信号肽。AnBADH基因在矮沙冬青中的内源表达受高盐、干旱、高温、低温胁迫和ABA诱导。转AnBADH基因的大肠杆菌菌株,在高盐胁迫下的生长速度和高温胁迫下的存活率显着高于未转化对照。在高盐及干旱胁迫条件下,AnBADH基因在拟南芥中的异源表达显着促进根系发育,转基因株系相对含水量、甜菜碱及游离脯氨酸含量显着高于未转基因对照,相对电解质渗出率及丙二醛含量显着低于未转基因对照。（2）AnMCSU基因cDNA序列全长2544 bp,ORF长2289 bp,编码762个氨基酸,分子量84.85 kDa,等电点pH6.02,不稳定系数37.95,总平均亲水指数-0.255,具有MCSU蛋白典型的结构域,不具有跨膜区和信号肽。生物信息学预测和在烟草叶片中的瞬时表达检测表明,AnMCSU蛋白定位于细胞质。AnMCSU基因在矮沙冬青中的内源表达受高温、干旱、高盐及ABA诱导,受低温抑制,在拟南芥中异源表达促进种子发芽和根系发育。在高盐和低温胁迫条件下,转基因株系ABA含量和游离脯氨酸含量显着高于未转基因对照,表现较强的耐盐和抗冻性。（3）AnPLDα基因cDNA序列全长2832 bp,ORF长2427 bp,编码808个氨基酸,分子量91.58 kDa,等电点pH5.47,不稳定系数43.82,总平均亲水指数-0.418,具有PLDα蛋白典型的C2结构域和HKD基序,不具有跨膜区和信号肽。生物信息学预测和在烟草叶片中的瞬时表达检测表明,AnPLDα蛋白定位于细胞质。AnPLDα基因在矮沙冬青中的内源表达受干旱、高盐、低温及ABA诱导,受高温抑制,在拟南芥中的异源表达促进根系发育,在胁迫条件下抵制种子发芽。在高盐胁迫及ABA诱导条件下,转基因株系的丙二醛含量显着低于未转基因对照,表现较强的耐盐性,抗逆相关基因AtABI、AtNCED、AtRD29A、AtRD29B和AtADH的内源表达上调。（4）AnVP1基因cDNA序列全长2684 bp,ORF长2298 bp,编码765个氨基酸,分子量80.13 kDa,等电点pH5.46,不稳定系数23.02,总平均亲水指数0.631,具有5个V-PPase蛋白典型的保守结构域和13个跨膜区。AnVP1基因在矮沙冬青中的内源表达受高盐、干旱及ABA诱导,受高温和低温抑制,在酵母突变体中的异源表达可抑制其对高盐和渗透胁迫的敏感性,拟南芥中的异源表达促进根系发育。在高盐和干旱胁迫条件下,转基因株系Na+/K+离子、相对水和游离辅氨酸含量显着高于未转基因对照,丙二醛含量和相对电解质渗出率显着低于未转基因对照。上述结果表明,AnBADH、AnMCSU、AnPLDα和AnVP1四个基因在矮沙冬青非生物逆境抗性中起重要作用,在模式植物中的异源表达可显着增强其抗逆性,可用于作物抗逆转基因研究。
苗苗[8]（2016）在《VP基因表达载体构建及转化分析》文中研究说明小麦（Triticum aestivum Linn）是我国重要的粮食,也是世界上起源最早和种植最广泛的谷类作物之一,其属于被子植物门单子叶植物纲禾本科。小麦的颖果含有淀粉、脂肪、蛋白质、多种维生素及酶类,具有极高的营养价值及药用价值。然而,干旱和土壤盐渍化使小麦大幅减产,阻碍了我国农业现代化进程。据统计,我国可用耕地面积的百分之十均有不同程度的盐渍化,另外我国还有四亿多亩的盐碱荒地和盐渍化土壤,占全国总耕地面积的百分之二十五。尤其是近几十年来,随着生态环境的恶化以及耕地的锐减,水资源的匮乏已成为农业生产的最大障碍。针对土地干旱、盐碱越来越严重并且小麦育种中优质的抗逆资源匮乏等情况,本试验利用分子生物学方法,根据拟南芥、水稻、大麦、玉米的H+-PPase（H+-pyrophosphatase）基因设计兼并引物,在抗逆小麦品种中进行扩增,得到小麦液泡膜H+-PPase基因,从pCAMBIA 1380载体中设计引物得到CAMV 35S基因,从pEGFPN1中设计引物得到GFP基因,分别构建克隆载体后接着构建表达载体,酶切鉴定正确后将最终构建好的pCAMBIA 1380-35S-TVP-GFP载体通过农杆菌转化法转入拟南芥,并筛出纯合株系,接着进行萌发试验与绿苗率统计测定、幼苗脯氨酸含量测定、成苗脯氨酸含量测定、成苗电导率的测定等对拟南芥进行耐盐、抗旱功能分析。我们的研究证明该基因能够帮助植物提高抗盐及抗旱能力,从而为培育优质的小麦抗逆新品系奠定基础。
刘雪,张少英,王晓娇[9]（2015）在《植物液泡膜H+-Pyrophosphatase基因功能研究进展》文中提出植物液泡膜H+-PPase是一种区别于H+-ATPase的质子泵,广泛存在于生物体内.该文重点介绍植物液泡膜H+-PPase基因及同源基因的结构和功能方面的研究进展,以及该基因在不同植物上遗传转化体系的建立,并展望了该基因应用于植物耐盐抗旱基因工程中的前景.
杨云云[10]（2015）在《Tc和Tb无机焦磷酸酶的纯化和晶体结构分析》文中研究表明锥虫病是由锥虫引起的一种寄生虫病,广泛流行于南撒哈拉非洲和美洲地区,引发了严重的公共卫生问题,造成巨大的经济损失。市场上仅有的数种化学药物治疗方案严苛,毒性巨大,抗药性明显,开发新的抗寄生虫药物迫在眉睫。锥虫酸钙小体细胞器中的可溶性焦磷酸酶（VSP）,对锥虫感染哺乳动物宿主至关重要,并且与人类蛋白具有更低的同源性,可作为治疗锥虫病的重要药物靶点。但目前对锥虫VSP的分子结构、催化机理、尤其是N端钙调蛋白结构域的功能了解甚少,VSP特异性抑制剂的结构特征也尚不明确。因此对锥虫VSP的研究至关重要。本课题所研究的是来源于克氏锥虫（Trypanosoma cruzi,Tc）和布氏锥虫（Typanosoma brucei,Tb）的可溶性焦磷酸酶,通过Ni柱和DEAE柱,得到了高纯度的TcVSP蛋白、截短N端的VSP蛋白（ΔN1-TcVSP）和TbVSP蛋白,用于蛋白结晶,并最终通过X-光晶体衍射技术获得TcVSP与二磷酸盐抑制剂（BPH1260）的复合体结构、ΔN1-TcVSP与PPi及SO42-的复合体结构及TbVSP的晶体结构,其结构都为四聚体结构,并且TcVSP和TbVSP蛋白形成有趣的头对尾式的结构模型,即一条链的EF-hand域与另一条链的焦磷酸酶域相互作用。此蛋白结构是目前可溶性焦磷酸酶家族Ⅰ中首个含两个结构域的蛋白。同时,利用分子尺寸排阻色谱多角光散射仪（SEC-MALS）检测分子量的结果表明,TcVSP和TbVSP的N端结构域对分子聚集状态的影响不同。TbVSP在无钙离子存在时,为多种聚体的混合物,当存在钙离子时,则全部形成八聚体;而TcVSP分子的聚集状态与钙离子无关。表明虽然锥虫VSP具有相似的N端钙调蛋白结构域（EF-hand域）,但其功能具有多样性。本研究建立了无机焦磷酸酶重组表达与纯化方法,获得了锥虫焦磷酸酶的晶体并解析其晶体结构,阐明了其结构功能关系,对研究其在寄生虫病防治上的应用奠定了坚实的基础。
二、植物焦磷酸酶(PPase)的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、植物焦磷酸酶(PPase)的研究进展（论文提纲范文）
（1）共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子鉴定及ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 国内外研究进展 |
| 1.1 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白 |
| 1.1.1 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白概述 |
| 1.1.2 液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐性中的作用 |
| 1.2 液泡膜H~+-焦磷酸酶 |
| 1.2.1 液泡膜H~+-焦磷酸酶概述 |
| 1.2.2 液泡膜H~+-焦磷酸酶在植物耐盐性中的作用 |
| 1.3 液泡膜Cl~-通道蛋白 |
| 1.3.1 液泡膜Cl~-通道蛋白概述 |
| 1.3.2 液泡膜Cl~-通道蛋白在植物耐盐性中的作用 |
| 1.4 多基因聚合改良植物抗逆性的研究进展 |
| 1.4.1 抗非生物胁迫 |
| 1.4.2 抗生物胁迫 |
| 1.5 转基因紫花苜蓿研究进展 |
| 1.5.1 抗非生物胁迫 |
| 1.5.2 抗生物胁迫 |
| 1.6 外源基因在受体植物中的整合检测 |
| 1.6.1 PCR检测 |
| 1.6.2 外源基因拷贝数检测 |
| 1.7 外源基因表达产物检测 |
| 1.7.1 Western Blot检测 |
| 1.7.2 酶联免疫吸附法 |
| 1.7.3 免疫试纸条法 |
| 第二章 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的分子鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 植物DNA及质粒DNA提取 |
| 2.1.3 PCR检测 |
| 2.1.4 Southern Blot检测 |
| 2.1.5 植物总RNA提取及cDNA制备 |
| 2.1.6 RT-PCR检测 |
| 2.1.7 植物总蛋白提取 |
| 2.1.8 Westhern Blot检测 |
| 2.1.9 ELISA检测 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的PCR检测结果 |
| 2.2.2 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的Southern Blot检测结果 |
| 2.2.3 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的Western Blot检测结果 |
| 2.2.4 共表达ZxNHX1-VP1-1 紫花苜蓿的ELISA检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 PCR检测 |
| 3.1.2 RT-PCR检测 |
| 3.1.3 盐处理方案 |
| 3.1.4 生长指标的测定 |
| 3.1.5 生理指标及测定方法 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的分子检测 |
| 3.2.2 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿长势的影响 |
| 3.2.3 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿生物量的影响 |
| 3.2.4 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿叶片相对质膜透性的影响 |
| 3.2.5 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿叶片渗透势的影响 |
| 3.2.6 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿Na~+、K~+、Cl~-的影响 |
| 3.2.7 盐胁迫对共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿根部Na~+和Cl~-净吸收速率的影响 |
| 3.2.8 盐胁迫下共表达ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿中Na~+、K~+和Cl~-对叶片渗透势的贡献 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）玉米可溶性无机焦磷酸酶家族基因的克隆和表达分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 玉米可溶性无机焦磷酸酶家族基因的鉴定 |
| 1.4 玉米可溶性无机焦磷酸酶基因的生物信息学分析 |
| 1.5 玉米可溶性无机焦磷酸酶基因克隆和表达载体构建 |
| 1.5.1 Zm PPases基因克隆 |
| 1.5.2 载体构建 |
| 1.5.3 电转法转化农杆菌GV3101 |
| 1.6 烟草转化试验 |
| 1.7 亚细胞定位 |
| 1.8 转录组数据定量比对 |
| 1.9 实时荧光定量PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 玉米可溶性无机焦磷酸酶家族基因的生物信息学分析 |
| 2.2 系统进化树及基因结构分析 |
| 2.3 玉米可溶性无机焦磷酸酶的亚细胞定位 |
| 2.4 玉米可溶性无机焦磷酸酶基因对盐和干旱胁迫的响应 |
| 3 讨论 |
（3）植物H+-PPase研究进展（论文提纲范文）
| 1 植物H+-PPase的分子克隆、结构、分类和定位 |
| 1.1 植物H+-PPase的分子克隆 |
| 1.2 植物H+-PPase的结构 |
| 1.3 植物H+-PPase的分类和定位 |
| 2 植物H+-PPase的功能 |
| 2.1 维持胞质PPi稳态,进而参与调控糖异生、蔗糖的韧皮部装载和长距离运输过程 |
| 2.2 质子泵及促进液泡酸化 |
| 2.3 提高植物耐盐和抗旱能力 |
| 2.4 增强植物耐低磷、低氮胁迫的能力 |
| 2.5 其他功能 |
| 2.5.1 参与调控植物花色 |
| 2.5.2 与植物气孔的关闭和发育相关 |
| 2.5.3 植物耐高镁胁迫的关键酶 |
| 2.5.4 参与植物抵御低温、低氧胁迫过程 |
| 3 展望 |
（4）披碱草氢离子焦磷酸化酶（EdHPPase1）基因转化小麦的效应分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 植物液泡质子泵的功能 |
| 1.2 氢离子焦磷酸化酶(H~+-PPase)的研究现状 |
| 1.2.1 氢离子焦磷酸化酶(H~+-PPase)的发现 |
| 1.2.2 H~+-PPase家族酶的活性部位和机理 |
| 1.2.3 H~+-PPase的分子结构中的保守片段 |
| 1.2.4 H~+-PPase的多样性 |
| 1.2.5 H~+-PPase的主要功能 |
| 1.2.6 H~+-PPase的细胞定位 |
| 1.2.7 H~+-PPase组织的特异性分布 |
| 1.3 小麦的现状 |
| 1.3.1 小麦的分布 |
| 1.3.2 小麦抗逆基因研究现状 |
| 1.4 磷的利用现状 |
| 1.5 披碱草的分布和功能 |
| 1.6 立题目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 披碱草无机焦磷酸化酶基因(EdHPPase1)的生物信息学分析以及阳性株系鉴定 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.1.3 序列分析软件及引物的设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA的提取 |
| 2.2.2 转基因小麦的PCR检测 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 披碱草焦磷酸化酶基因EdHPPase1 的结构域及蛋白质结构分析 |
| 2.3.3 转基因株系的阳性鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 水培试验条件下碱胁迫对转EdHPPase1 基因小麦株系生理指标的分析 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 野生型(WT)与转EdHPPase1 基因小麦幼苗培养条件 |
| 3.2.2 野生型(WT)与转EdHPPase1 基因小麦碱处理 |
| 3.2.3 野生型(WT)与转EdHPPase1 基因小麦生物量指标测定 |
| 3.2.4 野生型(WT)与转EdHPPase1 基因小麦根系扫描 |
| 3.2.5 野生型(WT)与转EdHPPase1 基因小麦含水量及失水率的测定 |
| 3.3 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 野生型与转EdHPPase1 基因小麦在碱处理下表型特征的变化 |
| 3.4.2 野生型株系与转基因株系M_1、M_7 在碱处理下生物量的变化 |
| 3.4.3 野生型株系与转基因株系M_1、M_7 在碱处理下根系形态表型特征的变化 |
| 3.4.4 转EdHPPase1 基因小麦株系根系参数在碱胁迫下的变化 |
| 3.4.5 转EdHPPase1 基因小麦株系的相对含水量及失水率在碱胁迫下的变化 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 水培试验条件下转EdHPPase1 基因小麦株系的生化指标的分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验试剂及配制 |
| 4.1.3 实验仪器及设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 幼苗培养条件及实验处理 |
| 4.2.2 丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量的测定 |
| 4.2.3 相对电导率的测定 |
| 4.2.4 叶绿素含量的测定 |
| 4.2.5 可溶性蛋白含量的测定 |
| 4.2.6 抗氧化酶物质(SOD、POD、CAT)活性的测定 |
| 4.2.7 超氧阴离子自由基(O~(2-))产生速率的测定 |
| 4.3 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 转基因小麦渗透调节物质含量在碱胁迫下的变化 |
| 4.4.2 转基因小麦叶绿素含量在碱胁迫下的变化 |
| 4.4.3 转基因小麦质膜透性在碱胁迫下的变化 |
| 4.4.4 转基因小麦抗氧化酶系统在碱胁迫下的变化 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 田间试验条件下转EdHPPase1 基因小麦的养分含量分析 |
| 5.1 试验材料选择 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验地概况与布置 |
| 5.1.3 实验仪器及设备 |
| 5.1.4 实验药品 |
| 5.2 实验测定内容及方法 |
| 5.2.1 土壤基本理化指标的测定 |
| 5.2.2 植物养分含量的测定 |
| 5.3 数据处理与统计分析 |
| 5.4 结果分析 |
| 5.4.1 收获期转EdHPPase1 基因小麦株系养分含量对磷肥用量的应答 |
| 5.4.2 转EdHPPase1 基因小麦株系产量对磷元素的应答 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 讨论和结论 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）鸟巢蕨对干旱胁迫的响应及AVP1基因的挖掘与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 鸟巢蕨研究概况 |
| 1.1.1 鸟巢蕨植物学特性 |
| 1.1.2 鸟巢蕨的应用价值 |
| 1.1.3 鸟巢蕨的生态功能 |
| 1.2 植物的干旱应答机制 |
| 1.2.1 干旱胁迫对植物的伤害 |
| 1.2.2 植物对干旱的适应 |
| 1.3 质子焦磷酸酶基因(AVP1)与植物的耐旱性 |
| 1.3.1 质子焦磷酸酶的功能 |
| 1.3.2 AVP1 基因的研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 不同干旱程度对鸟巢蕨叶片生理指标的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 干旱处理对鸟巢蕨叶长、叶宽增长量的影响 |
| 2.2.2 干旱处理对鸟巢蕨叶片含水量的影响 |
| 2.2.3 干旱处理对鸟巢蕨光合指标的影响 |
| 2.2.4 干旱处理对鸟巢蕨叶片下表皮气孔密度的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 3 不同干旱程度对鸟巢蕨叶片生化指标的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 干旱处理对鸟巢蕨叶片可溶性蛋白含量的影响 |
| 3.2.2 干旱处理对鸟巢蕨叶片脯氨酸含量的影响 |
| 3.2.3 干旱处理对鸟巢蕨叶片甜菜碱含量的影响 |
| 3.2.4 干旱处理对鸟巢蕨叶片抗氧化酶活性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 4 鸟巢蕨质子焦磷酸酶编码基因的挖掘 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 基因模型数据库下载及修正 |
| 4.1.2 结构域鉴定 |
| 4.1.3 基因挖掘 |
| 4.1.4 进化树构建 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 AVP1 蛋白结构域 |
| 4.2.2 AVP1 家族进化分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 不同干旱程度鸟巢蕨叶片AVP1 基因表达情况分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 鸟巢蕨叶片总RNA的提取 |
| 5.2.2 干旱处理对鸟巢蕨AVP1 家族基因的相对表达量的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）的异源表达提高玉米耐旱性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 干旱对玉米生产的影响 |
| 1.2 转基因耐旱玉米 |
| 1.3 液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 |
| 1.3.1 氢离子焦磷酸酶 |
| 1.3.2 氢离子焦磷酸酶的功能 |
| 1.3.3 液泡膜氢离子焦磷基因 |
| 1.3.4 V-H~+-PPase基因在植物中的遗传转化 |
| 1.4 矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 |
| 1.4.1 矮沙冬青 |
| 1.4.2 矮沙冬青的抗逆性 |
| 1.4.3 矮沙冬青抗逆相关基因 |
| 1.4.4 矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 |
| 1.5 外源基因整合位点的精确定位 |
| 1.5.1 TAIL-PCR |
| 1.5.2 高效TAIL-PCR |
| 1.6 T-DNA的整合机理及特征 |
| 1.6.1 T-DNA |
| 1.6.2 T-DNA的整合特征 |
| 1.7 外源基因的安全性评价 |
| 1.8 本研究的目的意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 AnVP1基因安全性的生物信息学预测 |
| 2.1.1 与毒蛋白的同源性比对 |
| 2.1.2 与过敏原的同源性比对 |
| 2.1.3 与抗营养因子的同源性比对 |
| 2.2 转基因株系的筛选繁育 |
| 2.2.1 抗除草剂筛选 |
| 2.2.2 基因组DNA提取 |
| 2.2.3 特异PCR检测 |
| 2.3 T3代株系T-DNA整合位点分析 |
| 2.3.1 hiTAIL-PCR扩增 |
| 2.3.2 连接pMD19-T载体与转化 |
| 2.3.3 T-DNA整合位点侧翼序列分析 |
| 2.4 T3代株系的RT-PCR检测 |
| 2.4.1 总RNA提取 |
| 2.4.2 基因组DNA去除和反转录合成cDNA |
| 2.4.3 RT-PCR检测 |
| 2.5 转基因株系耐旱性鉴定 |
| 2.5.1 T_2代株系的田间鉴定 |
| 2.5.2 T_3代株系的盆栽鉴定 |
| 2.6 转基因株系的RNA测序 |
| 2.6.1 RNA测序 |
| 2.6.2 基因表达差异分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AnVP1基因的预测安全性 |
| 3.1.1 与已知毒蛋白没有同源性 |
| 3.1.2 与已知过敏原没有同源性 |
| 3.1.3 与已知抗营养因子没有同源性 |
| 3.2 转基因株系世代繁育及阳性检测 |
| 3.2.1 T1代株系筛选繁育 |
| 3.2.2 T2代株系繁育与检测 |
| 3.3 转基因株系T-DNA整合位点 |
| 3.3.1 hiTAIL-PCR扩增的特异片段 |
| 3.3.2 T-DNA整合位点 |
| 3.3.3 T-DNA侧翼序列与表达载体的同源性 |
| 3.4 AnVP1基因的异源表达 |
| 3.5 转基因株系的耐旱性 |
| 3.5.1 T_2代株系的田间耐旱性 |
| 3.5.2 T_3代株系盆栽耐旱性 |
| 3.6 转基因株系内源基因的差异表达 |
| 3.6.1 RNA样品质量 |
| 3.6.2 RNA测序质量 |
| 3.6.3 基因差异表达分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）矮沙冬青四个抗逆基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 沙冬青 |
| 1.1.1 沙冬青的分布 |
| 1.1.2 矮沙冬青的抗逆性 |
| 1.1.3 沙冬青抗逆基因克隆 |
| 1.2 甜菜碱醛脱氢酶基因研究进展 |
| 1.2.1 甜菜碱 |
| 1.2.2 甜菜碱合成途径 |
| 1.2.3 甜菜碱合成相关基因 |
| 1.3 钼辅助因子硫酸化酶基因研究进展 |
| 1.3.1 脱落酸合成途径 |
| 1.3.2 钼辅助因子硫酸化酶基因克隆 |
| 1.3.3 钼辅助因子硫酸化酶基因在基因工程中的利用 |
| 1.4 磷脂酶D基因研究进展 |
| 1.4.1 磷脂酶 |
| 1.4.2 PLD基因 |
| 1.4.3 PLDα基因对逆境胁迫的响应 |
| 1.5 氢离子焦磷酸酶基因研究进展 |
| 1.5.1 氢离子焦磷酸酶 |
| 1.5.2 氢离子焦磷酸酶的功能 |
| 1.5.3 氢离子焦磷酸酶基因的转基因研究 |
| 1.6 目的意义及技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 四个抗逆基因的内源表达检测 |
| 2.2.1 材料处理 |
| 2.2.2 RNA提取及cDNA制备 |
| 2.2.3 qRT-PCR内参基因扩增 |
| 2.2.4 qRT-PCR分析 |
| 2.3 AnMCSU和AnPLDα蛋白的亚细胞定位 |
| 2.3.1 瞬时表达载体构建 |
| 2.3.2 农杆菌介导的渗透法注射烟草 |
| 2.4 AnBADH基因在大肠杆菌中的异源表达 |
| 2.4.1 原核表达载体构建 |
| 2.4.2 目的蛋白诱导表达及SDS-PAGE分析 |
| 2.4.3 重组菌株的耐盐性分析 |
| 2.4.4 重组菌株的耐热性分析 |
| 2.5 AnVP1基因在酵母中的异源表达 |
| 2.5.1 酵母表达载体构建 |
| 2.5.2 酵母感受态制备 |
| 2.5.3 酵母感受态细胞转化 |
| 2.5.4 重组菌株的耐盐性分析 |
| 2.5.5 重组菌株的耐旱性分析 |
| 2.6 四个抗逆基因在拟南芥中的异源表达 |
| 2.6.1 植物表达载体构建 |
| 2.6.2 农杆菌介导法浸染拟南芥 |
| 2.6.3 阳性株系的筛选 |
| 2.6.4 转基因株系的PCR检测 |
| 2.6.5 转基因株系的RT-PCR检测 |
| 2.6.6 转基因株系的抗逆性鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AnBADH基因的功能 |
| 3.1.1 AnBADH基因及其编码蛋白 |
| 3.1.2 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.1.3 异源表达增强大肠杆菌抗逆性 |
| 3.1.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 3.2 AnMCSU基因的功能 |
| 3.2.1 AnMCSU基因及其编码蛋白 |
| 3.2.2 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.2.3 亚细胞定位 |
| 3.2.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 3.3 AnPLDα基因的功能 |
| 3.3.1 AnPLDα基因及其编码蛋白 |
| 3.3.2 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.3.3 亚细胞定位 |
| 3.3.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 3.4 AnVP1基因的功能 |
| 3.4.1 AnVP1基因及其编码蛋白 |
| 3.4.2 异源表达增强酵母抗逆性 |
| 3.4.3 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.4.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附图 |
| 作者简历 |
（8）VP基因表达载体构建及转化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 VP基因简介 |
| 1.2 拟南芥 |
| 1.2.1 拟南芥简介 |
| 1.2.2 拟南芥的研究意义 |
| 1.3 转基因常用的方法 |
| 1.3.1 农杆菌转化法 |
| 1.3.2 基因枪转化法 |
| 1.3.3 花粉管通道法 |
| 1.4 植物的生理鉴定方法 |
| 1.4.1 萌发试验 |
| 1.4.2 绿苗统计测定 |
| 1.4.3 幼苗脯氨酸含量测定 |
| 1.4.4 成苗脯氨酸含量测定 |
| 1.4.5 成苗电导率测定 |
| 1.5 TAIL-PCR |
| 1.6 课题研究的意义与主要研究内容 |
| 1.6.1 课题研究的意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第2章 VP基因的获得及表达载体的构建 |
| 2.1 试验材料及试剂 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 小麦液泡膜H~+-PPase基因的扩增 |
| 2.2.2 CAMV 35S、GFP片段的扩增 |
| 2.2.3 克隆载体的构建 |
| 2.2.4 液泡膜质子焦磷酸酶基因的表达载体构建 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 小麦液泡膜H~+-pyrophosphatase基因的获得 |
| 2.3.2 鉴定结果 |
| 2.4 分析讨论 |
| 2.4.1 PCR引物的设计原则 |
| 2.4.2 酶切反应体系 |
| 2.4.3 酶连体系 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 转基因拟南芥的获得及功能鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验所用培养基及试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 pCAMBIA 1380-35S-TVP-GFP对农杆菌的转化 |
| 3.2.2 拟南芥的处理 |
| 3.2.3 农杆菌转化 |
| 3.2.4 含目的基因拟南芥的鉴定方法与纯合体的获得方法 |
| 3.2.5 含目的基因拟南芥基因表达量分析 |
| 3.2.6 转基因拟南芥功能验证 |
| 3.3 试验结果及讨论 |
| 3.3.1 含目的基因拟南芥基因表达量分析 |
| 3.3.2 萌发试验与绿苗率统计 |
| 3.3.3 幼苗脯氨酸含量测定 |
| 3.3.4 成苗脯氨酸含量测定 |
| 3.3.5 成苗电导率测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 拟南芥突变体侧翼序列分析 |
| 4.1 试验材料及试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 分析讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间所发表的论文 |
| 致谢 |
（9）植物液泡膜H+-Pyrophosphatase基因功能研究进展（论文提纲范文）
| 1液泡膜H+-PPase |
| 1.1液泡膜H+-PPase基因基本结构特征 |
| 1.2液泡膜H+-PPase的拓扑结构 |
| 1.3液泡膜H+-PPase的生化性质 |
| 2液泡膜H+-PPase的功能 |
| 2.1质子泵功能 |
| 2.2影响植物生长发育 |
| 2.3增强植物抗逆性 |
| 2.4参与蔗糖的生物合成 |
| 3液泡膜H+-PPase基因的遗传转化 |
（10）Tc和Tb无机焦磷酸酶的纯化和晶体结构分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 锥虫病 |
| 1.1.1 锥虫 |
| 1.1.2 锥虫病 |
| 1.2 锥虫病治疗靶点的选择 |
| 1.3 焦磷酸酶作为锥虫病治疗靶点的研究 |
| 1.4 焦磷酸酶的研究现状 |
| 1.4.1 焦磷酸酶的分类 |
| 1.4.2 焦磷酸酶的酶学性质 |
| 1.4.3 焦磷酸酶的底物 |
| 1.4.4 焦磷酸酶所在细胞器 |
| 1.4.5 焦磷酸酶的EF-hand域 |
| 1.4.6 焦磷酸酶的结构研究现状 |
| 1.5 本课题研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验试剂 |
| 2.1.2 晶体试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 培养基配制 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛋白表达与纯化 |
| 2.2.2 蛋白结晶 |
| 2.2.3 蛋白晶体的X-射线衍射数据收集和处理 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 蛋白的生物学信息 |
| 3.2 表达系统的构建 |
| 3.3 目的蛋白的纯化 |
| 3.3.1 Ni柱第一次亲和层析 |
| 3.3.2 Ni柱第二次亲和层析 |
| 3.3.3 DEAE亲和层析 |
| 3.4 蛋白超滤浓缩及浓度测定 |
| 3.5 硒带蛋白表达与纯化 |
| 3.6 蛋白结晶条件的筛选和优化 |
| 3.6.1 蛋白结晶条件的筛选 |
| 3.6.2 蛋白结晶条件的优化 |
| 3.7 蛋白结构确定 |
| 3.7.1 蛋白晶体的X射线衍射数据收集及处理 |
| 3.7.2 蛋白相位的确定及结构修正 |
| 3.8 结构分析 |
| 3.8.1 TcVSP结构分析 |
| 3.8.2 △N1-TcVSP结构分析 |
| 3.8.3 TbVSP结构分析 |
| 3.8.4 复合体结构分析 |
| 3.8.5 TcVSP和TbVSP蛋白的N端功能分析 |
| 4 总结 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
| 附录 主要符号表 |
四、植物焦磷酸酶(PPase)的研究进展（论文参考文献）
- [1]共表达ZxNHX1-VP1-1紫花苜蓿的分子鉴定及ZxNHX1-PcCLCg紫花苜蓿的耐盐性评价[D]. 林杉. 兰州大学, 2021(12)
- [2]玉米可溶性无机焦磷酸酶家族基因的克隆和表达分析[J]. 陈贞,王逸茹,王晓丽,方婷,甄斯涵,卢嘉雯,郑军,付俊杰. 植物遗传资源学报, 2021(02)
- [3]植物H+-PPase研究进展[J]. 王贝贝,张乐,郭欢,包爱科. 植物生理学报, 2020(06)
- [4]披碱草氢离子焦磷酸化酶（EdHPPase1）基因转化小麦的效应分析[D]. 时俊美. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [5]鸟巢蕨对干旱胁迫的响应及AVP1基因的挖掘与鉴定[D]. 梁靖雯. 海南大学, 2020(07)
- [6]矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）的异源表达提高玉米耐旱性[D]. 张晓芳. 四川农业大学, 2018(02)
- [7]矮沙冬青四个抗逆基因的功能研究[D]. 于好强. 四川农业大学, 2017(03)
- [8]VP基因表达载体构建及转化分析[D]. 苗苗. 河北科技大学, 2016(06)
- [9]植物液泡膜H+-Pyrophosphatase基因功能研究进展[J]. 刘雪,张少英,王晓娇. 华南师范大学学报(自然科学版), 2015(04)
- [10]Tc和Tb无机焦磷酸酶的纯化和晶体结构分析[D]. 杨云云. 天津科技大学, 2015(05)