一、日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定（论文文献综述）
马晓晓[1]（2021）在《华支睾吸虫病诊断抗原的筛选与间接ELISA方法的建立》文中研究表明华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）是一种重要的人兽共患病原,寄生在人及多种动物的肝胆管和胆囊中引起华支睾吸虫病。全球有超过2亿人存在感染华支睾吸虫的风险,而仅中国的感染人数就达1 300万之多,其中又以广东、广西和黑龙江尤为严重,对华支睾吸虫病的防控刻不容缓。粪便中检出虫卵是诊断华支睾吸虫病的金标准,但该方法敏感性低,容易漏诊,且无法进行早期诊断,临床亟需建立高效、准确的方法用于华支睾吸虫病的早期诊断。本研究利用蛋白质组学将华支睾吸虫排泄分泌抗原与不同宿主的血清互作,以期筛选出具有诊断潜力的抗原,初步建立间接ELISA诊断方法,为华支睾吸虫病诊断试剂盒的研发奠定基础。本研究主要包括三部分。（1）华支睾吸虫排泄分泌抗原（Excretory secretory products,ESPs）的制备及诊断抗原的筛选。体外培养华支睾吸虫,收集ESPs,分别与兔7 d、14 d、35 d、77 d的华支睾吸虫阳性血清、兔肝片吸虫阳性血清、兔日本血吸虫阳性血清、兔阴性血清进行免疫共沉淀联合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析。ESPs中共获得了334个非冗余蛋白,通过同源比较及Uniport鉴定,在华支睾吸虫蛋白库中获得注释的有254种。将阳性血清与阴性血清结果进行第一轮差异筛选,以剔除阴性血清的成分,分别鉴定出32、18、39、35种与兔7 d、14 d、35 d、77 d阳性血清结合的差异蛋白。在一轮筛选的基础上,进行第二轮不同物种间阳性血清差异筛选,以筛除日本血吸虫及肝片吸虫的非特异性抗原,其中存在于兔7 d、14 d、35 d、77 d的特异蛋白分别有13、9、16、15种,四个时期都存在的差异蛋白有3种。（2）目的蛋白的克隆、表达及反应原性分析。结合蛋白相对表达量及生物信息学分析,初步筛选出6种具有潜在诊断价值的蛋白,分别为Dynein light chain-1（D1）、Dynein light chain-2（D2）、Myoferlin（MY）、Acetylornithine deacetylase（AD）、Phosphomethylpyrimidine synthase（PS）和Calcium-binding protein（Ca）,其中D1、D2、MY存在于华支睾吸虫生长发育的各个时期。经RT-PCR得到华支睾吸虫c DNA,设计引物分别扩增7种蛋白（选取Myoferlin抗原表位丰富位置将其截短为MY1、MY2两部分）序列,经双酶切后连接至p ET-32a载体,构建重组质粒。转化进BL21感受态细胞内,诱导表达后SDS-PAGE鉴定,其中D1、D2、Ca、PS为可溶性表达,其余为包涵体形式表达。Western Blot显示七种蛋白均与兔华支睾吸虫阳性血清反应,而不与阴性血清反应,均表现出良好的反应原性。（3）华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法的建立与初步应用。对七种蛋白的诊断效果进行初步筛选,由P/N值得出CSD2蛋白最为适合用于间接ELISA方法的建立。同时对ELISA反应条件进行优化:最佳包被液为磷酸盐缓冲液、抗原最佳包被浓度为5μg/m L,最佳显色条件为37℃恒温显色20 min,一抗及二抗最佳稀释倍数分别为1:200及1:40 000。建立的ELISA方法不与东毕吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫和大片吸虫的阳性血清发生交叉反应,表现出良好的特异性。最早能够识别人工感染7 d的华支睾吸虫阳性血清,可应用于早期诊断。本研究利用蛋白质组学在华支睾吸虫ESPs中鉴定出254个与宿主血清互作的已知蛋白,建立了可用于诊断抗原筛选的蛋白库。经生物信息学分析后,筛选出6种具备诊断候选潜力的抗原,并成功地对其进行表达及纯化,其中CSD2蛋白抗原表位丰富,具有良好的特异性和敏感性,具备成为华支睾吸虫病诊断抗原的潜力。以CSD2为诊断抗原建立的华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法,与传统虫卵检测相比,检出率更高,为华支睾吸虫病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。
袁方园[2]（2017）在《细粒棘球绦虫六钩蚴M26基因的克隆、表达及阳性杂交瘤细胞的筛选》文中研究表明细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）主要寄生于犬、狼、狐狸等犬科动物终末宿主体内,其虫卵和孕节随粪便排出体外,污染草料和饮水,牛、羊以及人等中间宿主吞食虫卵后感染此病,进入消化道的六钩蚴钻入肠壁经血流或淋巴散布到体内各处,主要在肝和肺脏引起病变导致生长缓慢,严重危害人的健康和畜牧业的快速发展,给世界经济造成严重损失。因此,防治此病在人类健康和畜牧业发展方面非常重要。长期以来,各国研究者都在探索快速诊断此病的方法,但是并未在早期诊断方面取得突破性成果。绵羊是该寄生虫的中间宿主,若在绵羊感染早期,即在六钩蚴进入血液,早期分泌蛋白时诊断出此病,并采取有效治疗措施,将对控制此病流行具有重要意义。目前,包虫病的诊断方式主要通过影像检测（X线射片,CT,超声,MR,DSA/SCA）,皮内试验及血象检测等。但这些方法多为后期诊断（即形成包囊后）。而本试验的方法是采用六钩蚴分泌蛋白为抗原通过ELISA法对包虫病进行早期诊断,目前针对包虫病早期诊断的相关研究国内外尚未有过报道。因此选择特异性高的抗原,建立敏感性高以及特异性强的早期诊断方法十分必要。本研究为了探索在感染早期能够检测出此病的抗原,在实验室前期研究基础上选择了六钩蚴差异表达蛋白——副肌球蛋白（M26）作为研究对象,经原核表达制备多克隆抗体和筛选阳性杂交瘤细胞,建立ELISA方法检测感染早期宿主血清中的抗原,即六钩蚴分泌的蛋白。为寻找有效的诊断抗原和建立高效、特异的诊断方法进行了如下试验。1.细粒棘球六钩蚴抗原基因的筛选及原核表达:在本实验室以细粒棘球绦虫的成虫,六钩蚴,原头蚴为材料,通过i TRAQ方法分离检测差异蛋白,其中六钩蚴的差异表达蛋白可作为早期诊断抗原的前期研究基础上,本研究在这些差异表达蛋白中筛选出具有高效免疫保护性的副肌球蛋白（M26）,扩增其基因并成功构建克隆载体和表达载体,经原核表达得到大小约为41k Da的重组蛋白,蛋白浓度为0.5 mg/mL,纯度达85%。2.M26多克隆抗体的制备与纯化:以M26为抗原免疫新西兰大白兔,成功制备了M26多克隆抗体,抗体效价为1:12800。经过Western blot验证,有且只有一条带,表明该抗体能够特异性识别M26。采用间接ELISA法利用多克隆抗体检测人工感染绵羊包虫病早期各时间点（5-10h,24 h和48 h）血清中副肌球蛋白,结果表明,当多抗的稀释倍数在1:3200-1:12800时,各时间点的样品孔与阴性孔的数据比值均大于或等于2.1,即为阳性,说明各时间点都有该蛋白。3.M26阳性杂交瘤细胞筛选:以M26作为抗原免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、杂交瘤筛选和ELISA法,筛选出2株阳性杂交瘤细胞,通过间接ELISA法利用此细胞株检测人工感染绵羊细粒棘球绦虫早期各时间点（5-10 h,24 h和48 h）血清中副肌球蛋白,在10 h和24 h检测出该蛋白,结果说明此检测方法成功建立,可以表明利用该蛋白作为抗原采用间接ELISA法能够有效诊断出绵羊感染早期包虫病。
汪礼文[3]（2011）在《pcDNA3.1（+）-SjP14和SjGST真核表达载体的构建、鉴定及其保护作用研究》文中认为目的:构建pcDNA3.1+-SjP14及SjGST真核表达载体,并利用重组质粒免疫小鼠,探讨其对小鼠血吸虫感染的保护作用。方法:1. pcDNA3.1+-SjP14及SjGST真核表达载体的构建和鉴定:从日本血吸虫成虫中提取总RNA,逆转录生成cDNA,以其为模板扩增出SjP14和SjGST编码基因,将扩增产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,用双酶切鉴定质粒构建成功与否。该重组质粒转染Hela细胞,RT-PCR和Western blotting检测其体外表达,以验证其能表达出重组蛋白。2. DNA疫苗的制备及保护作用研究:制备无内毒素DNA疫苗,用于免疫小鼠。将雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,生理盐水组给予100μl/鼠/次;空质粒组100μg/鼠/次;pcDNA3.1+-SjP14组,给予100μg/鼠/次;pcDNA3.1+-SjP14+ pcDNA3.1+-SjGST组分别给予100μg/鼠/次,每2周免疫一次,共3次。末次免疫后2周,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（30±1）条/鼠。尾蚴攻击6周后用颈稚脱臼法处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率,部分肝脏用于组织病理学分析（HE染色法）,观察肝细胞变化及肉芽肿情况。结果:本实验从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出两个DNA片段（SjP14和SjGST基因）,大小分别约1070bp和670bp,并成功地将其克隆入pcDNA3.1+载体;将重组质粒pcDNA3.1+-SjP14和pcDNA3.1+-SjGST进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,分别得到一个大小与PCR扩增产物一致的片段;测序证实均具有完整开放读码框,且为无突变。纯化上述质粒,转染至Hela细胞,经新霉素筛选得出阳性单克隆细胞株,扩大培养。RT-PCR和Western blotting结果显示,两种质粒转染至Hela细胞内均可表达。分别制备无内毒素SjP14和SjGST核酸疫苗,以该疫苗免疫BALB/c小鼠,结果表明:pcDNA3.1+-Sj P14核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6%和61.6%;SjP14核酸疫苗与SjGST核酸疫苗联合免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2%和73.5%。大体解剖可见,生理盐水和空质粒组肝脏呈暗褐色,质硬,表面可见弥漫性粟粒样虫卵结节分布,结节隆起密集,体积较大。pcDNA3.1+-SjP14组小鼠肝脏色泽略带暗红色,质地较软,表面较光滑,隐约可见少量灰白色小点,虫卵结节较少;SjP14+SjGST核酸疫苗联用组,肝脏颜色呈鲜红色,表面光滑,虫卵结节少,质软。肝组织切片镜下显示,生理盐水和空质粒组小鼠肝组织中可见大量的虫卵肉芽肿形成,肉芽肿体积较大,周围有大量炎细胞浸润,大量的肝细胞变性坏死,pcDNA3.1+-SjP14组肝脏病变较生理盐水组明显减轻,pcDNA3.1+-SjP14 + pcDNA3.1+-SjGST组肝脏损伤程度最轻,肝小叶结构基本完整,虫卵肉芽肿周围炎症反应轻,肉芽肿面积较小。结论:本研究成功地构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1+-SjP14和pcDNA3.1+-SjGST,且均可在体内外表达,pcDNA3.1+-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用, pcDNA3.1+-SjP14与pcDNA3.1+-SjGST疫苗联合免疫能增强小鼠对血吸虫感染的保。
赵犇鹏[4]（2011）在《日本血吸虫童虫期抗原分子的筛选及其Th细胞表位的鉴定》文中指出日本血吸虫病为我国危害严重的人兽共患寄生虫病,严重影响人类健康和社会经济发展,因此控制血吸虫病的扩散和预防血吸虫病的发生意义重大。控制日本血吸虫病流行的主要措施是对人、畜进行药物（吡喹酮）化疗,同时结合传染源控制、环境改造、健康教育等综合防制策略。但实施这一措施费用昂贵,需要大批专业技术人员,且存在不能预防再感染和可能出现耐药性等问题。因此,亟待开发血吸虫疫苗以替代传统的药物治疗方法。但怎样高效合理地筛选和鉴定出抗血吸虫的保护性抗原一直是个亟待突破的瓶颈。大量研究表明,辐照致弱尾蚴或童虫免疫在多种动物模型上均获得较高的保护性效果;另有研究用经照射尾蚴转变而来获得的童虫在体外培养至肺期,将此时童虫注射进小鼠真皮内,也可刺激引起高水平的保护性免疫反应,表明童虫期某些特殊蛋白抗原可被看作重要的保护性免疫反应的诱导物。此外,一些含有信号肽的分子序列可能分泌到胞外,因而有可能与宿主的免疫系统直接接触诱导产生抗血吸虫的免疫应答,也可能成为潜在的保护性候选抗原。因此,为高效合理地发现抗血吸虫的保护性抗原候选分子,筛选和鉴定在辐照虫体富集的、童虫期高表达的以及具有信号肽等特征的分子序列,可能是个值得探索的方向。在本研究中,我们采用反向疫苗学策略,从已发表文献中得到的日本血吸虫转录本组数据以及蛋白质组数据并结合中国国家人类基因组南方研究中心公布的日本血吸虫序列筛选出一些目标序列,主要筛选出日本血吸虫肺期童虫表达的分子,辐照的曼氏血吸虫童虫期（4天）富集的分子并通过BLAST方法找到与之同源性最高的日本血吸虫分子序列;通过在线服务器找出这些序列中含有信号肽的序列。然后把能够在肺期童虫中表达的,与辐照曼氏血吸虫童虫（4天）富集分子同源的,以及含有信号肽等特征的日本血吸虫分子序列进行分析比较,结果得到具有如下三方面特征的候选分子:（1）既是肺期童虫高表达又含有信号肽的分子序列21条;（2）既与辐照后曼氏血吸虫4天虫体富集的序列同源又含有信号肽的分子序列2条;（3）既与辐照后曼氏血吸虫4天虫体富集序列同源又是肺期童虫高表达的序列3条。为后续保护性Th细胞表位的预测分析提供了基础。为筛选候选上述候选分子中可能的保护性Th细胞表位,应用免疫信息学技术对上述26条候选序列进行了Th细胞表位的预测。使用分别基于矩阵和结构算法的HLAPRED和MHCPred服务器预测同HLAⅡ类等位基因分子结合的Th细胞表位;使用基于基序分析原理发展的位置矩阵法的SYFPEITHI服务器预测同HLAⅡ类等位基因分子结合的15肽Th细胞表位;使用MHCPred服务器预测同鼠源H2d型MHCⅡ分子的结合表位;应用基于分子动力学算法的受体配体嵌合空间结合模拟服务器,模拟肽与MHCⅡ类分子的锚定情况,最后得到候选的Th细胞表位:NH-NNSVVIEKSHFLNVL-COOH[AAW26577]; NH-MFGYDKVLPMNSGVE-COOH[AAW26182]; NH-ISVFLFVLTFQYIIS-COOH[AAW24929]; NH-SFFFFLIIHNKIGLA-COOH[AAW25469]; NH-GRVWQVIILTGSYWM-COOH[EZ000175]; NH-MEAFKTFDREGQGFI-COOH[AAW26398]为后续实验鉴定奠定了理论基础。为实验证实上述序列分析和表位预测结果,用人工合成多肽法（四分臂偶联法合成到多聚赖氨酸骨架上）合成上述表位肽进行下述实验鉴定:RT-PCR法检测各候选表位肽的源分子序列在日本血吸虫肺期童虫（3天）的表达情况;用流式细胞术检测出其中四条肽与小鼠抗原递呈细胞（APCs）的直接结合情况;用改良的MTT法（CCK-8试剂）测定候选表位肽体外刺激免疫小鼠淋巴细胞增殖;流式细胞术检测免疫小鼠淋巴细胞中CD4+T细胞内细胞因子的分泌情况。实时定量PCR测定结果表明,这些肽的源序列分子都可以在3天正常童虫期表达。用其中的四条预测肽（P1、P2、P5和P6）体外直接结合鼠脾细胞实验结果表明,43%–88%的细胞被生物素化的肽标记上,用竞争性未标记肽检测显示对标记肽的结合抑制率在56%-93.66%之间,用抗I-Ad和抗I-Ed的抗体竞争孵育检测,结果抑制率分别为68%–87%和49%–75%,分别相似于和高于阳性对照组的抑制率,都可以很好地与小鼠抗原递呈细胞直接结合。淋巴细胞增殖结果表明,除P3肽外,其余5个肽的刺激指数显着高于佐剂对照组的,P2、P4和P6肽组的刺激指数则显着高于多聚赖氨酸骨架组的,说明它们可以不同程度的刺激免疫鼠脾淋巴细胞的增殖。免疫鼠CD4+T细胞内细胞因子的分泌图式测定显示,P1、P2和P5肽体外刺激免疫鼠脾淋巴细胞后,分泌Th1细胞因子IFN-γ的CD4+T细胞的比例要高于分泌Th2细胞因子IL-4的CD4+T细胞的比例,而P4肽诱导的免疫鼠CD4+T细胞分泌细胞因子的图式与上述肽的相反,P3和P6肽则没能诱导免疫鼠产生肽特异的CD4+T细胞相关细胞因子的分泌,初步说明P1、P2和P5肽可能是潜在的Th1细胞表位,P4肽可能是潜在的Th2细胞表位。总之,我们通过日本血吸虫转录本组学数据的分析和免疫信息学预测,筛选得到了26个日本血吸虫童虫期表达的分子和来源于这些分子中的6个Th细胞表位,并且通过分子与细胞免疫学实验初步鉴定了候选表位肽的免疫原性,为高效快速地筛选日本血吸虫保护性T细胞抗原或表位奠定了基础。
王敏,李文桂[5]（2010）在《日本血吸虫Sj97疫苗研究进展》文中指出日本血吸虫疫苗研制已作为我国防治该病的重要组成部分。副肌球蛋白是WHO提出的血吸虫疫苗较为理想的候选抗原之一,已用于日本血吸虫疫苗的研究。本文主要对日本血吸虫副肌球蛋白的概况、重组蛋白疫苗和DNA疫苗研究进展进行综述。
贾侃[6]（2010）在《基于功能基因组学数据的日本血吸虫候选疫苗分子的预测及初步鉴定》文中认为血吸虫病是指由血吸虫感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病,可引起严重的病理损害,严重危害人类健康。预防和控制血吸虫病的传统方法有控制传染源、切断传播途径、管理粪便、保护水源和保护易感人群等。治疗日本血吸虫病的主要方法是应用化疗药物吡喹酮。这需要昂贵的费用和大批专业技术人员,但不能预防再感染,而且血吸虫耐药性问题也愈来愈得到关注。因此,人们开始寻找更有效的控制血吸虫病的辅助或替代方法——血吸虫疫苗的研发。大量研究证实,用适宜剂量射线（包括紫外线、X射线和其他射线）致弱尾蚴免疫多种动物可以诱导出高水平的免疫抵抗力。在射线致弱（RA）尾蚴疫苗模型中,一般认为是滞留于肺中的虫体释放多种抗原诱生了高水平的Th1型的CD4+T细胞介导的效应,并通过记忆细胞群对再感染的正常童虫进行杀灭,而特异性抗体介导的保护效应可能由皮肤期童虫所诱生。迄今,尽管应用常规免疫学筛选技术鉴定了几个与RA免疫相关的抗原分子,但由于RA模型中所释放的抗原种类复杂、数量众多,使得保护性抗原分子的鉴定难以取得突破性的进展,有必要探索新的方法与技术以加快保护性抗原分子鉴定的步伐。近年来,随着血吸虫功能基因组学理论与技术的发展,研究者为我们提供了大量的血吸虫基因组、转录本组和蛋白质组等方面的信息,能否从这些信息中挖掘到RA模型中保护性抗原分子的信息,并进一步通过实验技术鉴定出疫苗候选分子,是血吸虫疫苗研发中值得探索的课题。因此,本研究拟应用数据挖掘和反向疫苗学等技术筛选能够模拟射线致弱尾蚴疫苗模型中诱导宿主产生Th1型的CD4+T细胞介导的免疫反应的候选分子,为进一步鉴定血吸虫保护性抗原或表位奠定了基础。本研究参考血吸虫辐照疫苗免疫效应机制,基于已发表的辐照尾蚴转化的童虫的特征性转录本组（曼氏血吸虫）和蛋白质组（日本血吸虫）序列,用BLASTP算法搜寻来源于正常日本血吸虫童虫和成虫的转录本组和蛋白质组中的序列；应用在线软件、相关数据库及文献对这些序列进行序列注释分析。结果获得了与辐照尾蚴转化的童虫特征性表达的分子同源或一致的日本血吸虫序列131条,进一步文献分析预测得到了52个日本血吸虫候选疫苗分子,它们的序列特征与存在于血吸虫体被的一些分子和已知的抗血吸虫疫苗分子相类似,有些是对虫体的生长、发育、移行等功能起到重要作用的分子,为进一步鉴定抗血吸虫疫苗奠定了基础。在上述52个候选疫苗分子中挑选结构蛋白SJCHGC01894分子进行T细胞表位的预测和鉴定。选取了基于三种不同方法的服务器进行Th细胞表位的预测,并采用Boston大学Comeau等开发的ClusPro服务器将得到的序列表位和MHC II分子进行空间模拟结合验证。结果获得了最后的序列表位：NH-MEAFKTFDREGQGFI-COOH[源序列号：AAW26398.1; similarity to myosin light chain]。进一步采用人工合成多肽法合成预测多肽,通过流式细胞术测定免疫小鼠CD4+T细胞内细胞因子的分泌情况,进而鉴定预测的表位。流式细胞术结果显示,预测肽免疫组和阳性肽对照组在抗原肽诱导前后,显示出不同的分化能力。抗原肽诱导后,两组中向Th1和Th2分化的细胞比例有所增加,并且Th1所占的比例更高。本研究通过分析血吸虫转录本组和蛋白质组数据,筛选得到了一批与血吸虫RA模型中保护性免疫相关的候选抗原分子,进一步采用免疫信息学预测结合体外试验检测技术,初步鉴定了预测序列中的表位NH-MEAFKTFDREGQGFI-COOH[源序列号：AAW26398. 1; similarity to myosin light chain]为有效的Th细胞表位。探索了应用基于血吸虫功能基因组学的数据挖掘技术和反向疫苗学技术筛选保护性抗原或表位的新方法,为进一步鉴定与血吸虫RA模型中保护性抗原或Th细胞表位相关的候选分子奠定了基础。
童晶晶,沈际佳[7]（2009）在《血吸虫副肌球蛋白疫苗的研究进展》文中进行了进一步梳理 血吸虫病（schiscosomiasis）广泛流行于亚非、南美等76个国家和地区。目前,全球约2亿人受感染。6亿人受感染威胁。近50年来我国在血吸虫病防治工作上取得了巨大成就。全国血吸虫发病率从解放前的0.81/10万下降至2007年的0.06/10万。但近几年钉螺感染率下降不明显或有反复,可能与水利工程设施的建设、洪水、气候变化等有关。农民和渔、船民感染率仍较高。目前治疗血吸虫病的常用药物为吡喹酮,另外还有环孢菌素A,青蒿素及其衍生物如蒿甲醚、
陶方方,王慧,孙新娟,刘丰,王勇,苏川,吴海玮,张兆松[8]（2009）在《日本血吸虫副肌球蛋白合成肽的免疫学鉴定》文中研究指明目的鉴定日本血吸虫副肌球蛋白合成肽Sj97-P22。方法27只雌性C57BL/6小鼠随机均分为合成肽Sj97-P22免疫组、无关肽免疫组和PBS免疫组,分别于尾基部皮下注射与完全福氏佐剂等体积充分混匀的合成肽Sj97-P22（100μg）乳化物、无关肽（100μg）乳化物和PBS乳化物,抗原免疫剂量为100μg/（只.次）,共免疫2次,间隔1周。于免疫后7～10d分离各组小鼠脾单个核细胞,运用流式细胞技术三色标记法检测其CD4+T细胞胞内因子干扰素γ（IFN-γ）和白介素4（IL-4）。将Sj97-P22免疫小鼠或PBS免疫小鼠的脾单个核细胞分别与Sj97-P22、无关肽或PBS共培养,采用3H-TdR掺入法观察细胞增殖效果,并用ELISA法检测细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-4的浓度。结果Sj97-P22免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞中胞内分泌IFN-γ的细胞百分率为（8.05±0.54）%,显着高于无关肽免疫组[（4.74±1.04）%]和PBS免疫组[（6.51±0.49）%]（P<0.05）;而分泌IL-4的细胞百分率[（0.60±0.11）%]显着低于PBS免疫组[（1.31±0.27）%]（P<0.05）,与无关肽免疫组[（0.84±0.08）%]间的差异则无统计学意义（P>0.05）。Sj97-P22可明显刺激Sj97-P22免疫小鼠脾单个核细胞增殖,增殖指数达到3.12±1.59,细胞培养上清中IL-2和IFN-γ浓度分别为（9.13±1.54）和（39.75±9.69）pg/ml,与无关肽和PBS刺激相比显着升高（P<0.05）,而IL-4浓度在3个刺激物间的差异无统计学意义（P>0.05）。Sj97-P22不能刺激PBS免疫鼠脾单个核细胞增殖及培养上清中IL-2、IFN-γ及IL-4浓度变化。结论Sj97-P22可能是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。
蔡鹏飞[9]（2008）在《日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定》文中研究说明血吸虫病是世界上严重危害人类健康的寄生虫病之一,流行于世界上76个国家和地区,目前有2亿感染者。流行于我国的日本血吸虫病是所有血吸虫病中防治难度最大的一种。利用吡喹酮治疗在控制该病的过程中起到重要作用,但治疗后的反复感染,及反复化疗可能产生抗药性问题,使得仅靠单一药物治疗无法从根本上控制血吸虫病的传播。研发安全有效的抗血吸虫疫苗,单独使用或结合化疗将极大地推动血吸虫病的防治工作。但早期研制的疫苗,从安全性或保护效果来看并不令人满意。因此,新型抗原的鉴定和新型疫苗的研制是一项十分紧迫的任务。本研究通过生物信息学方法,从日本血吸虫的8个关键抗原中筛查18个表位,其中5个在日本血吸虫中鉴定,其余13个为曼氏血吸虫中鉴定的表位在日本血吸虫中的同源序列。利用表位改组技术成功构建5个不同长度的随机串联多表位人工抗原文库,并证明文库具有良好的表位串联多态性。不同文库免疫小鼠后抗体水平的检测,表明多表位基因的长度对文库的抗原性具有显着的影响。保护性实验结果显示5个文库的保护效果并不理想,可能与所选的多数表位并未在日本血吸虫中得到有效证实有关。文库L2取得部分的抗生殖作用,表明只有合适长度的多表位基因文库才有可能诱导较好的免疫保护作用。通过上述工作,证实新型表位改组技术能应用于不同病原体多表位文库的构建,确定可能诱导保护性免疫反应的多表位基因长度;同时提示要构建具有高保护性的日本血吸虫多表位人工抗原文库,仍有待于保护性表位的鉴定。曼氏血吸虫表膜四次跨膜蛋白家族成员被认为是具有保护潜力的抗原分子,其中是曼氏血吸虫新型抗原TSP-2更是获得高达～60%的保护力,本研究对Sm-TSP-2在日本血吸虫中的同源分子展开鉴定和评估。研究证实日本血吸虫Sj-TSP-2分子存在广泛变异,根据C、D变异区不同,可分为七个亚类,同时存在不同亚类之间重组的杂合分子;三级结果预测显示主要变异区暴露于分子的表面,表明此分子受正选择作用,并提示其配体的多样性;单一成虫RT-PCR显示Sj-tsp-2亚类表达谱在个体成虫中存在极大的差异,以上研究结果提示Sj-stp-2可能参与日本血吸虫的免疫逃避。半定量RT-PCR表明Sj-tsp-2基因在日本血吸虫尾蚴、童虫、雌雄成虫和虫卵中都有不同水平的转录;但Western blot分析显示Sj-TSP-2蛋白并不在虫卵期表达。免疫荧光定位实验表明Sj-TSP-2定位于肺期童虫的表膜,但在天然状态下并不暴露;而活体成虫及冰冻切片免疫荧光实验则证实Sj-TSP-2分子暴露于雌雄成虫的体表。免疫保护实验显示单一Sj-TSP-2亚类重组蛋白不能获得任何的保护效果,所有亚类重组蛋白的混合物也只获得较低的保护力,再次提示Sj-TSP-2分子与免疫逃避相关,变异如此广泛的Sj-TSP-2并不适合成为日本血吸虫的候选抗原。以上工作显示表膜蛋白TSP-2在曼氏血吸虫和日本血吸虫中极大的差异性,说明曼氏血吸虫的保护性抗原,其在日本血吸虫中的同源分子并不一定同样具有保护性;提示在不同环境压力下,日本血吸虫可能采取了不同于曼氏血吸虫的免疫逃避策略,在一定程度上佐证了前一部分的结果,进一步强调日本血吸虫特异的保护性抗原和表位的鉴定对于日本血吸虫疫苗的研制的重要性。
陶方方[10]（2008）在《PDDV诱生内源性IFN-γ对小鼠血吸虫病肝纤维化下调作用的研究》文中研究表明血吸虫病是一种世界性的主要公共卫生疾病,流行于全球74个国家和地区,主要分布于亚洲、非洲和拉丁美洲。我国历经半个多世纪的积极防治取得了巨大的成绩,但是近年来,我国血吸虫病有卷土重来之势。目前全国共有血吸虫病人67万多人,主要是慢性和晚期血吸虫病人（慢血和晚血）。慢血病人多发生肝纤维化继而发展为晚血的肝硬化,治愈非常棘手。血吸虫病是一种免疫性疾病。血吸虫不同虫期释放的抗原均能诱发宿主的免疫应答,尤以虫卵引起的肝肠虫卵肉芽肿最为严重,并进而发生纤维化、甚至硬化,是慢血和晚血病人的主要病理表现。由此导致的肝脾肿大、门脉高压和其他并发症是晚血病人死亡的主要原因。肝纤维化的治疗涉及祛除病因、抗氧化抗炎、调节肝脏胶原代谢、改善微循环及代谢障碍、减少并发症（如门脉高压等）等诸多环节,现今尚缺乏很有效的抗纤维化药物及方法。因此,探索阻遏肝纤维化发生、发展的新途径、新方法,不仅对血吸虫病肝纤维化,而且对其他慢性肝病引起的肝纤维化的治疗都极具价值。肝纤维化是肝脏对多种病因慢性刺激所致的损伤后修复反应,其特征是细胞外基质（ECM）的过度沉积。CD4+T细胞在纤维化发展过程中发挥关键作用,其亚型作用不同并相互抑制。基因芯片研究亦表明,Th1与Th2极化在慢性炎症反应中呈现不同的基因表达类别。Th1型极化主要涉及急性期反应和细胞凋亡,Th1型应答的持续进行可造成大量细胞死亡及组织损伤,主要细胞因子如IFN-γ。与之相反,Th2型极化涉及损伤修复与纤维化反应,主要细胞因子如IL-4,IL-5和IL-13。研究集中在如下基因中,如Ⅰ型溶胶原、Ⅲ型溶胶原、精氨酸酶、赖氨酰、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）。许多研究证明,与曼氏血吸虫的研究报道相似,日本血吸虫感染小鼠同样存在Th1-Th2免疫漂移现象:Th1型细胞因子（如IFN-γ）与血吸虫肉芽肿的诱导和形成密切相关,而Th2型细胞因子（如IL-4,IL-13）可抑制Th1型细胞因子,在纤维化进程中起重要作用。因此在肝纤维化形成过程中,如何上调Th1型应答以恢复机体正常的Th1/Th2应答平衡,对预防、减轻甚至阻止肝纤维化的进程可能将起到关键作用。本室李光富、王新军等先前在执行国家自然科学基金项目——“诱导Th1应答的日本血吸虫复合表位抗原对小鼠的保护作用的研究”（No.30271166）中,用C57BL/6（H-2b）小鼠从日本血吸虫疫苗候选分子Sj22.6（表膜抗原）、Sj28GST（谷胱甘肽-S-转移酶）、SjTPI（磷酸丙糖异构酶）、Si97（副肌球蛋白）中分别筛选并鉴定出Th1型P4和P6,以及多个T细胞表位,本研究中进一步鉴定其中诱导较强Th1型应答的抗原表位P18、P22。先前也已筛选出种属特异性强、引发C57BL/6小鼠高Th1型应答的免疫佐剂CpG ODN1826。本研究借鉴PDDV（peptide-DNA dual vaccine）技术,将Th1型表位肽P4、P6、P18、P22分别与含相应编码DNA和佐剂CpG ODN（CpG oligodeoxynucleotide）1826的重组质粒结合而制备混合多价疫苗PDDV,以期用混合PDDV免疫小鼠,上调其Th1型应答,诱导内源性IFN-γ产生,从而最终达到下调血吸虫病肝纤维化的目的。第一部分:进一步鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶和副肌球蛋白的Th1型表位,为构建复合多价疫苗奠定基础。磷酸丙糖异构酶（TPI）是WHO/TDR提出的针对曼氏血吸虫（Sehistosoma mansoni,Sm）的6个最具潜力的疫苗候选分子之一。Reynolds等发现重组的TPI（rTPI）在较强的Th2微环境下仍可诱导产生Th1型细胞因子,并从SmTPI序列中进一步筛选出了C57BL/6J小鼠特异的T细胞表位SmTPI-P18,以及CBA小鼠而非C57BL/6J小鼠特异性的T细胞表位SmTPI-P9。日本血吸虫中国大陆株的TPI（SjTPI）与SmTPI有84%的同源性,成虫来源的TPI、重组rSjTPI以及SjTPI DNA疫苗等多种形式都显示了较好的抗感染和一定的抗病理损伤作用。先前王新军等根据Reynolds等报道的SmTPI-P18及SmTPI-P9,设计了SjTPI同源序列部分的相应表位SjTPI-P18及对照表位SjTPI-P9,并已鉴定SjTPI-P18是C57BL/6J小鼠特异的T细胞表位。本研究中用重组rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激经重组rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞,检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平;再用高纯度的合成表位肽SiTPI-P18刺激经SjTPI-P18加完全弗氏佐剂（CFA）免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞,检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平。副肌球蛋白是人和家畜多种寄生虫的候选疫苗抗原,曼氏血吸虫副肌球蛋白（Sm97）也是WHO确定的6个最具潜力的疫苗候选分子之一。副肌球蛋白能激发较强的体液免疫和细胞免疫,其诱导的抗感染免疫保护力与其诱导机体Th1/Th2型免疫应答向Th1型偏移的程度及水平成正相关,同时具有一定的抗虫卵肉芽肿及肝纤维化作用。王新军等用SYFPEITHI软件预测Sj97的5个T细胞表位,重组并表达为硫氧还蛋白（TRX）融合蛋白,用此融合蛋白体外刺激C3H/HeJ和C57BL/6小鼠淋巴细胞,通过3H-TdR掺入法检测,发现P22刺激C57BL/6小鼠致敏淋巴细胞的增殖指数最高,提示P22可能是Sj97较好的T细胞表位。本研究中用人工合成肽Sj97-P22刺激经Sj97-P22加弗氏佐剂免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞,采用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果;ELISA法检测其细胞培养上清中IL-2、IFN-γ、IL-4水平。结果:SjTPI-P18及rSjTPI-P18均可刺激经rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高（P均＜0.05）及IL-4水平降低;SjTPI-P18可刺激经SjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高及IL-4水平降低（P均＜0.05）。因此,SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位,而且在相同免疫剂量情况下人工合成肽的免疫原性优于重组肽。Sj97表位鉴定中,Sj97-P22可刺激经Sj97-P22免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖,其细胞培养上清中IL-2和IFN-γ分泌水平升高（P均＜0.05）,IL-4分泌水平降低。因而表明Sj97-P22也是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。第二部分:借鉴PDDV技术,用筛选鉴定出的Th1型抗原表位P4、P6、P18、P22及Th1型免疫佐剂CpG ODN1826,构建混合PDDV并进行免疫学鉴定。PDDV是Wu YZ等首先在治疗乙肝病毒的研究中构建的一个新的疫苗形式,借鉴基因治疗方法中阳离子肽作为DNA的非病毒载体的技术,将表位肽疫苗和DNA疫苗结合构建的一种新的疫苗形式。本研究第一部分及本室先前工作已经从疫苗候选分子中共筛选鉴定了4个Th1型表位肽——P4、P6、P18、P22,还筛选出种属特异性强、引发C57BL/6小鼠高Th1型应答的免疫佐剂CpG ODN1826。我们借鉴PDDV技术,设计在pCI-neo表达载体中重组含有Th1型抗原表位基因和诱导Th1型应答的免疫佐剂CpG ODN1826的核苷酸序列,并合成18个赖氨酸与其相应表位肽抗原的阳离子聚合物,在特定条件下使阳离子聚合物吸附在含有抗原表位和佐剂的重组载体周围,成功制备了符合要求的颗粒状PDDV。本研究进一步观察4个表位肽等量混合物刺激经4种PDDV等量混合物免疫小鼠后的淋巴细胞增殖效果及淋巴细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-4分泌水平,并观察混合PDDV的免疫原性及诱导优势Th1型应答的特征。结果:通过沉淀试验得出阳离子肽能够有效结合DNA的盐浓度范围;阻滞试验及DNaseⅠ消化试验得出阳离子肽有效保护DNA免受DNA酶降解的较适盐浓度及电荷比值（r）条件;用透射电镜观察证实:在r=4、150 mM NaCl、40 mM HEPES时可以获得形态均一、直径约为20 nm的符合要求的PDDV颗粒。在用P4、P6、P18、P22分别制备的4种PDDV等量混合物免疫C57BL/6小鼠后,观察到P4、P6、P18、P22表位肽等量混合物可刺激免疫小鼠淋巴细胞增殖,分泌IL-2和IFN-γ水平升高（P均＜0.05）,IL-4水平降低。本研究初步证实:混合PDDV可优势诱导C57BL/6小鼠体内的Th1型免疫应答,刺激机体产生高水平的内源性IFN-γ,为进一步观察混合PDDV对血吸虫慢性感染小鼠肝纤维化下调作用的影响奠定基础。第三部分:混合抗原表位PDDV对血吸虫感染小鼠肝纤维化下调作用的研究肝纤维化的发生、发展涉及多种复杂因素的刺激和调节,其根本原因是胶原的合成多于降解。主要的胶原生成细胞是肝星状细胞（HSC）,而且纤维生成和溶解中基质重建的主要成分是基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制因子（MMPs/TIMPs）,MMP-9/TIMP-1平衡起关键作用。众多研究表明,Th2型细胞因子能够下调MMP-9/TIMP-1表达的平衡致使ECM沉积增多,并通过对HSC活化的调节等诸多关键环节促进肝纤维化发展。而以IFN-γ为主的Th1型细胞因子则能通过多种途径抑制已活化的HSC,使其向静息型转变,并双相调节MMP-9,主要对纤维化起下调作用。血吸虫感染后形成虫卵肉芽肿直至发生肝纤维化,存在着Th1型应答向Th2型应答漂移现象而使Th1/Th2平衡紊乱。因此通过上调Th1型应答恢复Th1/Th2平衡,上调MMP-9/TIMP-1平衡,从而抑制HSC活化,促使ECM的溶解和重建,对减轻肝纤维化发展有着重要意义。在第二部分研究中,已经成功构建能够诱导小鼠体内Th1型优势应答的混合PDDV,本部分的研究旨在用此混合PDDV免疫日本血吸虫感染14w并经吡喹酮治疗的C57BL/6小鼠,通过最直观的肝脏病理学指标（肝纤维化评分、肝脏虫卵肉芽肿面积）观察其肝纤维化程度变化;通过免疫组化观察HSCs活化标志物α-SMA、胶原及相关酶谱CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1、MMP-9以及细胞因子IFN-γ的表达情况;通过RT-PCR方法观察α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、IL-4、IL-13、TGF-β1、IFN-γ在mRNA水平上的表达丰度;通过检测血清中IFN-γ和IL-4含量以及SWAP特异的抗体IgG、IgG1、IgG2a和IgG1/IgG2a比值以观察不同时间点（0 w,10 w,14 w,25 w）免疫小鼠体内细胞免疫及体液免疫应答的变化。并试图探讨混合PDDV对血吸虫慢性感染小鼠肝纤维化形成过程中肝纤维化发展产生影响的原因。结果:混合表位-CpG PDDV组小鼠肝脏的纤维化程度减轻,肝脏虫卵肉芽肿面积减小;免疫组化结果显示肝脏的α-SMA、CollagenⅠ、TIMP-1表达下降,肝脏的MMP-9表达升高,与溶剂对照组比较均有统计学意义（P＜0.05）;且肝脏的IFN-γ表达水平升高以及CollagenⅢ表达水平下降,但与溶剂对照组比较无统计学意义。半定量RT-PCR显示观察肝脏组织胶原和细胞因子的mRNA表达水平时发现,混合表位-CpG PDDV组的α-SMA、CollagenⅢ、TGF-β1、IL-4、IL-13的mRNA表达水平下降与溶剂对照组比较均有统计学意义（P＜0.05）;而CollagenⅠ的mRNA表达水平下降及IFN-γ的mRNA表达水平上升,与溶剂对照组比较无统计学意义。血清细胞因子检测显示,混合表位-CpG PDDv免疫组小鼠血清中分泌IFN-γ水平在治疗后显着增高（P＜0.05）,分泌IL-4水平未见明显变化,第25w时以混合表位-CpG PDDV组分泌IFN-γ水平为最高,但各组间比较无统计学意义。血清中SWAP特异的抗体IgG、IgG1、IgG2a检测显示,混合表位-CpG PDDV组的IgG、IgG2a水平随时间点逐渐上升,IgG1水平在第14 w比第10 w显着上升但第25 w与第14 w水平接近,第25 w的IgG1/IgG2a比值比第14 w降低。综上,本研究观察到混合表位-CpG PDDV免疫的血吸虫慢性感染小鼠,其汇管区及虫卵肉芽肿周围纤维增生和炎性浸润明显减轻,肝纤维化程度减轻;肝脏细胞因子IL-4、IL-13、TGF-βmRNA水平显着下降,IFN-γmRNA水平上升;肝脏的蛋白表达水平上,IFN-γ表达相应增高,MMP-9表达明显增高,TIMP-1表达明显下降;血清细胞因子和抗体检测都显示了Th1/Th2上调现象。并同时观察到混合表位-CpG PDDV免疫后小鼠肝脏α-SMA在蛋白和mRNA水平上的表达量均显着降低,Ⅰ型、Ⅲ型胶原在蛋白和mRNA水平上表达量均减少,提示混合表位-CpG PDDV可抑制HSC的激活并减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生。因此,混合表位-CpG PDDV可能是通过诱导表达IFN-γ为主的Th1型应答促进Th1/Th2平衡上调,从而使MMP-9/TIMP-1的平衡上调;并调控HSC的活化及ECM的生成,导致对肝纤维化的下调作用。本研究已成功制备了可诱导C57BL/6小鼠体内产生较高水平IFN-γ的呈现优势Th1型应答的混合多价疫苗——混合表位-CpGPDDV;并观察到其能减轻血吸虫慢性感染小鼠肝纤维化的发展,对其他因素引起的肝纤维化的下调研究亦具重要意义。
二、日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定（论文提纲范文）
（1）华支睾吸虫病诊断抗原的筛选与间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 华支睾吸虫病 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 流行与防控 |
| 1.2 华支睾吸虫病诊断技术 |
| 1.2.1 病原学检查 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 分子生物学检测 |
| 1.2.4 免疫学诊断 |
| 1.3 华支睾吸虫互作抗原的筛选方法 |
| 1.3.1 免疫共沉淀 |
| 1.3.2 双向凝胶电泳 |
| 1.3.3 质谱分析 |
| 1.3.4 色谱分离技术 |
| 1.4 蠕虫ESPs蛋白质组学研究进展 |
| 1.4.1 吸虫ESPs蛋白质组学研究 |
| 1.4.2 绦虫ESPs蛋白质组学研究 |
| 1.4.3 线虫ESPs蛋白质组学研究 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 虫体的采集 |
| 2.1.2 血清的获取 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 ESPs的制备 |
| 2.2.2 差异蛋白的筛选 |
| 2.2.3 差异蛋白的克隆表达 |
| 2.2.4 间接ELISA方法的建立与初步应用 |
| 2.2.5 间接ELISA效果评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 华支睾吸虫的鉴定 |
| 3.1.1 形态学鉴定结果 |
| 3.1.2 分子生物学鉴定结果 |
| 3.2 ESPs的制备 |
| 3.2.1 最佳培养液的筛选 |
| 3.2.2 分泌排泄抗原SDS-PAGE分析 |
| 3.3 差异蛋白的筛选 |
| 3.3.1 免疫共沉淀SDS-PAGE分析 |
| 3.3.2 质谱数据分析 |
| 3.4 差异蛋白克隆表达 |
| 3.4.1 目的基因扩增结果 |
| 3.4.2 生物信息学分析结果 |
| 3.4.3 重组载体质粒构建 |
| 3.4.4 诱导表达鉴定 |
| 3.4.5 蛋白纯化及浓度测定 |
| 3.4.6 蛋白反应原性分析 |
| 3.4.7 诊断抗原的筛选 |
| 3.5 间接ELISA方法的建立及初步应用 |
| 3.5.1 包被液的选择 |
| 3.5.2 蛋白包被浓度的选择 |
| 3.5.3 血清稀释倍数的选择 |
| 3.5.4 二抗稀释倍数选择 |
| 3.5.5 显色时间的优化 |
| 3.5.6 阴阳临界值的判定 |
| 3.6 间接ELISA方法效果评价 |
| 3.6.1 敏感性实验 |
| 3.6.2 特异性实验 |
| 3.6.3 重复性实验 |
| 3.6.4 符合性实验 |
| 3.6.5 不同时期阳性血清的检测 |
| 3.6.6 临床样本的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 华支睾吸虫体外培养 |
| 4.2 华支睾吸虫ESPs |
| 4.3 华支睾吸虫病的诊断抗原 |
| 4.4 华支睾吸虫病的诊断方法 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）细粒棘球绦虫六钩蚴M26基因的克隆、表达及阳性杂交瘤细胞的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 棘球蚴病的研究进展 |
| 1 病原学形态 |
| 2 生活史 |
| 3 种类及基因型 |
| 4 流行病学 |
| 4.1 中间宿主流行病学研究进展 |
| 4.2 终末宿主-家畜包虫病流行病学研究进展 |
| 5 致病作用 |
| 6 诊断CE |
| 6.1 血清测定 |
| 6.2 成像 |
| 6.3 放射学 |
| 6.4 超声波 |
| 6.5 MRI |
| 7 治疗 |
| 7.1 化学药物治疗 |
| 7.2 外科手术管理 |
| 8 防治 |
| 第二章 副肌球蛋白在寄生虫病诊断方面的研究进展 |
| 1 副肌球蛋白的分布与特征 |
| 2 副肌球蛋白的分子生物学特征 |
| 3 副肌球蛋白疫苗研究 |
| 3.1 天然蛋白疫苗 |
| 3.2 重组蛋白疫苗 |
| 3.3 核酸疫苗 |
| 4 本试验的目的意义 |
| 第二篇 试验内容 |
| 第一章 细粒棘球绦虫六钩蚴M26基因的克隆及原核表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 构建M26克隆载体 |
| 2.2 构建M26表达载体 |
| 2.3 pET-30a-M26重组蛋白SDS-PAGE分析小量表达 |
| 2.4 pET-30a-M26重组蛋白SDS-PAGE分析大量表达 |
| 2.5 蛋白质纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 M26序列合成结果 |
| 3.2 pMD19-T-M26克隆载体测序结果 |
| 3.3 pET-30a-M26表达载体双酶切鉴定 |
| 3.4 pET-30a-M26重组蛋白SDS-PAGE分析小量表达 |
| 3.5 pET-30a-M26重组蛋白SDS-PAGE分析大量表达 |
| 3.6 pET-30a-M26重组蛋白的纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 M26多克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 相关试剂的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔阴性血清的制备 |
| 2.2 M26免疫新西兰大白兔 |
| 2.3 M26多抗血清效价检测 |
| 2.4 Western blot验证 |
| 2.5 M26多克隆抗体的纯化 |
| 2.6 人工模型的建立 |
| 2.7 多克隆抗体检测各个时间点血清中副肌球蛋白 |
| 3 结果 |
| 3.1 M26多抗血清效价的测定 |
| 3.2 重组蛋白M26制备的多抗血清Western blot验证 |
| 3.3 M26多隆抗体的纯化 |
| 3.4 M26多克隆抗体效价的测定 |
| 3.5 人工模型的建立 |
| 3.6 多克隆抗体检测各个时间点血清中副肌球蛋白 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 M26阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验仪器与耗材 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.4 相关试剂的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 骨髓瘤细胞的饲养 |
| 2.3 免疫后小鼠脾细胞的制备 |
| 2.4 细胞融合 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的第一次筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的第二次筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的亚类鉴定 |
| 2.8 阳性杂交瘤细胞检测各个时间点血清中副肌球蛋白 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠免疫后的抗体水平测定 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞的第一次筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞的第二次筛选 |
| 3.4 阳性杂交瘤细胞亚型分析 |
| 3.5 阳性杂交瘤细胞检测各个时间点血清中副肌球蛋白 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）pcDNA3.1（+）-SjP14和SjGST真核表达载体的构建、鉴定及其保护作用研究（论文提纲范文）
| 中英文词汇对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 阳性钉螺 |
| 实验动物 |
| 质粒、细胞株 |
| 引物 |
| 试剂及来源 |
| 部分试剂配制 |
| 实验主要仪器 |
| 方法 |
| SjP14 和 SjGST 基因真核表达质粒的构建和鉴定 |
| 重组质粒的转染和鉴定 |
| DNA 疫苗的制备及其免疫保护性的研究 |
| 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一（个人简历） |
| 附录二（致谢） |
| 附录三（综述） |
| 参考文献 |
（4）日本血吸虫童虫期抗原分子的筛选及其Th细胞表位的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫致病机理 |
| 1.2 血吸虫疫苗的研究 |
| 1.3 T 细胞表位与细胞免疫 |
| 1.4 血吸虫反向疫苗学研究现状 |
| 1.4.1 理论预测表位方法 |
| 1.4.2 实验验证技术 |
| 1.5 结语与展望 |
| 第二章 日本血吸虫转录本组序列数据的分析 |
| 2.1 数据来源 |
| 2.2 序列筛选方法与注释 |
| 2.3 序列筛选结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 疫苗候选分子的Th 细胞表位预测 |
| 3.1 表位肽的预测主要工具 |
| 3.2 T 细胞表位预测步骤 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 序列筛选结果 |
| 3.3.2 表位肽在ClusPro 服务器上的对接验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 疫苗候选分子的Th 细胞表位的免疫原性鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 实验动物 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 人工合成多肽 |
| 4.1.2.2 动物免疫 |
| 4.1.2.3 细胞培养 |
| 4.1.2.4 RT-PCR 验证目标抗原肽在各期别的表达量 |
| 4.1.2.5 生物素标记的抗原肽与BALB/c 小鼠脾脏抗原提成细胞 MHCⅡ类分子的结合率以及不同抑制剂的抑制率 |
| 4.1.2.6 CCK8 试剂盒检测细胞增殖 |
| 4.1.2.7 流式细胞术检测细胞内细胞因子 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 预测肽源序列分子在血吸虫肺期童虫(3 天)的表达 |
| 4.2.2 预测肽与MHCⅡ类分子细胞结合实验 |
| 4.2.3 预测肽体外刺激免疫鼠小鼠脾淋巴细胞增殖 |
| 4.2.4 肽体外刺激免疫鼠CD4+T 细胞分泌细胞因子的图式 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 读硕士学位期间取得的研究成果 |
（6）基于功能基因组学数据的日本血吸虫候选疫苗分子的预测及初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 英文缩略表 |
| 第一章 综述 |
| 1.血吸虫概述 |
| 1.1 血吸虫生物学介绍、生活周期和迁移特点 |
| 1.2 血吸虫病 |
| 1.3 血吸虫病免疫预防研究的战略意义 |
| 2.血吸虫疫苗研究进展 |
| 2.1 血吸虫引起的免疫病理反应 |
| 2.1.1 保护性免疫应答的效应机制及调节 |
| 2.1.2 免疫逃避 |
| 2.2 血吸虫疫苗候选抗原及其抗原分子 |
| 2.3 血吸虫转录本组和蛋白质组水平研究进展及意义 |
| 2.3.1 血吸虫基因组 |
| 2.3.2 血吸虫转录本组和蛋白质组水平的研究进展 |
| 2.3.3 血吸虫转录本组和蛋白质组研究对疫苗研发工作的推进作用 |
| 3.基于转录本组和蛋白质组数据筛选疫苗候选分子的技术与方法 |
| 3.1 理论预测方法 |
| 3.2 鉴定实验技术 |
| 4.问题与展望 |
| 第二章 基于转录本组和蛋白质组数据的日本血吸虫候选疫苗分子序列的预测和分析 |
| 1.方法 |
| 1.1 原始数据 |
| 1.2 序列数据整理和分组 |
| 1.3 日本血吸虫候选疫苗分子序列的筛选 |
| 2.结果 |
| 2.1 预测序列在日本血吸虫期别转录本组和蛋白质组中的分布 |
| 2.2 预测序列的注释分析 |
| 2.3 日本血吸虫疫苗候选分子的预测 |
| 3.讨论 |
| 第三章 疫苗候选分子的Th细胞表位预测 |
| 1.序列表位的预测步骤 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第四章 疫苗候选分子的Th细胞序列表位的初步鉴定 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.1.2 抗原及淋巴细胞培养液的配制 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 人工多肽合成 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 表面抗原及细胞因子染色 |
| 1.2.3 流式细胞术检测及分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 1.基于转录本组和蛋白质组数据的日本血吸虫候选疫苗分子序列的预测和分析 |
| 2.疫苗候选分子的Th细胞表位预测 |
| 3.疫苗候选分子的Th细胞表位的初步鉴定 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
（8）日本血吸虫副肌球蛋白合成肽的免疫学鉴定（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 实验动物和主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 表位肽序列的设计及合成 |
| 2.2 实验动物分组及免疫 |
| 2.3 制备脾单个核细胞悬液 |
| 2.4 流式细胞术检测细胞因子 |
| 2.5 细胞增殖实验 |
| 2.6 ELISA检测细胞因子 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 脾单个核细胞中Th1、Th2细胞所占比例 |
| 2 脾单个核细胞增殖试验 |
| 3 Sj97-P22诱导的Th1型应答 |
| 讨论 |
（9）日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 一、基本材料 |
| 1 主要化学试剂及部分耗材 |
| 2 生物学试剂 |
| 3 引物 |
| 4 合成肽 |
| 5 质粒载体 |
| 6 菌株 |
| 7 阳性钉螺 |
| 8 实验动物 |
| 9 血清 |
| 二、主要仪器设备 |
| 三、分析软件 |
| 四、主要溶液配制 |
| 实验方法 |
| 1 常用的分子生物学方法 |
| 2 表位基因DNA人工合成及克隆 |
| 3 多表位基因的随机重组表达文库的构建 |
| 4 多肽合成 |
| 5 RT-PCR |
| 6 日本血吸虫尾蚴、肺期童虫、成虫及虫卵的分离收集 |
| 7 日本血吸虫尾蚴、肺期童虫、成虫及虫卵膜蛋白抽提与分离 |
| 8 SWAP(Soluble worm antigen preparation)制备 |
| 9 重组蛋白表达以及纯化前的细菌处理 |
| 10 蛋白质去内毒素 |
| 11 蛋白质浓度的检测 |
| 12 多克隆抗血清的制备和纯化 |
| 13 普通SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 14 Western Blot |
| 15 酶联免疫吸附测定 |
| 16 间接免疫荧光分析 |
| 17 细胞生物学方法 |
| 18 酶联免疫斑点(ELISPOT) |
| 19 免疫及保护性评估 |
| 实验结果 |
| 第一部分:日本血吸虫随机重组多表位抗原文库构建及保护性评估 |
| 1 单表位基因的选择、设计及克隆 |
| 2 表达B表位-乙肝核心抗原重组蛋白进行表位抗原性分析 |
| 3 利用人工合成多肽分析B表位抗原性 |
| 4 多表位基因的随机组装 |
| 5 多表位基因真核表达文库的构建 |
| 6 多表位基因文库的免疫原性 |
| 7 多表位基因文库的保护性 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分:日本血吸虫新型表膜蛋白TSP-2鉴定、表征及评估 |
| 1 日本血吸虫Sj-tsp-2分子的克隆和序列分析 |
| 2 单个成虫Sj-tsp-2亚类转录谱分析 |
| 3 Sj-tsp-2分期转录 |
| 4 Trx-TSP-2亚类重组蛋白的表达和纯化 |
| 5 多克隆抗体制备 |
| 6 各期表膜蛋白制备及Western Blot |
| 7 Sj-TSP-2在肺期童虫和成虫中的定位 |
| 8 免疫学评价 |
| 9 保护性评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一:血吸虫候选抗原表位鉴定 |
| 文献综述二:四次跨膜蛋白分子相互作用及其功能研究进展 |
| 附录Ⅰ:本论文所用的英文缩略语 |
| 附录Ⅱ:硕博连读期间发表的文章和参加的会议 |
| 致谢 |
（10）PDDV诱生内源性IFN-γ对小鼠血吸虫病肝纤维化下调作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词的中英文全文对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫磷酸丙糖异构酶及副肌球蛋白TH1型表位的免疫学鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 日本血吸虫混合抗原表位PDDV疫苗的构建及免疫学鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 日本血吸虫混合抗原表位PDDV对小鼠血吸虫病肝纤维化下调作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| REFERENCES |
| 附录 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
四、日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定（论文参考文献）
- [1]华支睾吸虫病诊断抗原的筛选与间接ELISA方法的建立[D]. 马晓晓. 黑龙江八一农垦大学, 2021
- [2]细粒棘球绦虫六钩蚴M26基因的克隆、表达及阳性杂交瘤细胞的筛选[D]. 袁方园. 石河子大学, 2017(01)
- [3]pcDNA3.1（+）-SjP14和SjGST真核表达载体的构建、鉴定及其保护作用研究[D]. 汪礼文. 安徽医科大学, 2011(11)
- [4]日本血吸虫童虫期抗原分子的筛选及其Th细胞表位的鉴定[D]. 赵犇鹏. 上海师范大学, 2011(11)
- [5]日本血吸虫Sj97疫苗研究进展[J]. 王敏,李文桂. 中国病原生物学杂志, 2010(03)
- [6]基于功能基因组学数据的日本血吸虫候选疫苗分子的预测及初步鉴定[D]. 贾侃. 上海师范大学, 2010(09)
- [7]血吸虫副肌球蛋白疫苗的研究进展[J]. 童晶晶,沈际佳. 热带病与寄生虫学, 2009(03)
- [8]日本血吸虫副肌球蛋白合成肽的免疫学鉴定[J]. 陶方方,王慧,孙新娟,刘丰,王勇,苏川,吴海玮,张兆松. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2009(01)
- [9]日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定[D]. 蔡鹏飞. 中国协和医科大学, 2008(07)
- [10]PDDV诱生内源性IFN-γ对小鼠血吸虫病肝纤维化下调作用的研究[D]. 陶方方. 南京医科大学, 2008(01)