一、腺病毒介导的AFP基因修饰树突状细胞的体外生物学特性（论文文献综述）
尹良伟[1]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中研究说明自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
刘志礼[2]（2019）在《预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究》文中提出复杂的生理屏障、耐药性以及肝癌组织抑制性的微环境导致肝细胞癌成为恶性程度高、临床治疗难度大的恶性肿瘤。绝大多数患者在确诊时已属于疾病的中晚期,能通过根治手术获益的病人仅有10%-20%。免疫治疗,特别是基于甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）的免疫疗法在肝细胞癌治疗过程中显示出较大潜力,然而其临床效果依然有限。因此,亟需寻找一种新的治疗策略以提高AFP特异性的抗肿瘤免疫应答。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是激发获得性免疫应答最重要的抗原提呈细胞,它可以刺激未致敏的初始T淋巴细胞引发初次免疫应答。而慢病毒在转染非分裂细胞（尤其是DC）方面优于逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。最近,高迁移率族核小体结合域蛋白1（High Mobility Group Nucleosome Binding Domain Protein 1,HMGN1）作为抗肿瘤免疫的增强分子,已被用作一种新型的免疫佐剂,其在胞外可活化DC,并诱导DC的趋化性募集。然而,HMGN1在增强肝细胞癌AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的潜力尚不清楚。因此,本课题在三种肝癌小鼠模型和人肝癌细胞系上对表达有融合蛋白HMGN1和AFP慢病毒疫苗的抑瘤效果进行了系统测试,深入评估了HMGN1在增强AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的应用潜力,并对慢病毒疫苗的体内分布及抗肿瘤机制进行了初步探索,以期为肝细胞癌的治疗提供一种新的思路和策略。为进一步提高AFP特异性抗肿瘤免疫应答,我们构建了一种编码HMGN1和AFP融合蛋白的慢病毒疫苗（Lenti-HA）。WB检测结果显示:慢病毒可以在宿主细胞中高丰度地表达其携带的靶抗原,并且可以在胰岛素信号肽的引导下将融合蛋白分泌到细胞外发挥作用。通过流式细胞术和细胞毒实验证明:Lenti-HA可以显着提高小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的成熟度,并增强T淋巴细胞的活化能力,以起到更强的杀伤效果。并且在三种小鼠肝细胞癌模型上,包括皮下、原位和原发肝癌模型,系统测试了Lenti-HA的抗肿瘤效果及对免疫和肿瘤微环境的调控作用进行了检测。为验证这一新型疫苗在肝癌患者上应用的可行性,我们在人肝癌细胞系上对Lenti-HA的杀伤能力进行了测试。结果显示:在皮下、原位及原发肝细胞癌小鼠模型以及人肝癌细胞系上,Lenti-HA能够有效抑制肿瘤生长、延长荷瘤小鼠的生存期并且对人肿瘤细胞进行有效杀伤,说明Lenti-HA能够激活DC进而诱发抗原特异性免疫杀伤。尤为重要的是,Lenti-HA对原发肝癌小鼠的治疗,可以显着改善荷瘤小鼠抑制性的免疫和肿瘤微环境及有效抑制肝脏肿瘤向肺部转移。Lenti-HA能够有效提高AFP表达慢病毒疫苗（Lenti-AFP）的免疫原性。与Lenti-AFP相比,Lenti-HA免疫原性的提高可以显着降低慢病毒的使用剂量达6倍,从而显着提高慢病毒体内治疗的安全性。通过对慢病毒体内分布的检测发现,慢病毒主要分布于腹股沟淋巴结,并且未显示出明显的细胞倾向性。对其作用机制的初步解析发现Lenti-HA可能通过在腹股沟淋巴结招募和活化具有迁移活性的DC细胞尤其是CD103+DC,从而诱发AFP抗原特异性的抗肿瘤免疫应答。此外,我们发现在Lenti-HA治疗过程中CD8+T淋巴细胞起主导作用,并且记忆性T淋巴细胞和自然杀伤细胞也在Lenti-HA所介导的抗肿瘤免疫应答过程中起重要作用。我们的研究表明:HMGN1是一种有效的抗肿瘤免疫佐剂,能够显着增强AFP介导的抗肿瘤免疫应答,在三种不同的肝细胞癌小鼠模型上,能够有效抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的生存期。尤为重要的是,可以显着提高Lenti-AFP的免疫原性达6倍。并且在原发肝癌小鼠模型上,可以显着的改善免疫和肿瘤微环境。对其机制初探发现:CD8+T淋巴细胞在Lenti-HA治疗过程中起主要作用,但记忆T细胞及NK细胞也起重要作用。在人肝癌细胞系上也表现为AFP特异性抗肿瘤免疫应答反应的增强。本研究为肝细胞癌的免疫治疗提供了一种新型候选药物和治疗策略,可加速慢病毒疫苗的临床转化。
黄方[3]（2018）在《TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究》文中指出背景和目的:白血病复发的根源主要在于体内残存的白血病细胞（Minimal residual leukemia cells,MRL）。清除MRL以进一步延长患者治疗后的长期生存时间是如今白血病治疗的主要攻坚方向。针对白血病细胞的特异性免疫治疗既克服了传统化疗及造血干细胞移植的非靶向性,同时也为患者避免长期接受具有明显毒副作用的放化疗等传统治疗手段提供了新的治疗途径,因而近年来愈加受到关注。外泌体是真核细胞所分泌的,直径为30-100nm之间的微小囊泡。白血病细胞同样也可分泌外泌体,像其它肿瘤细胞源性外泌体（Tumor cell derived exosomes,TEX）一样,白血病细胞源性外泌体（Leukemia cell derived exosomes,LEX）富集有肿瘤细胞相关抗原（Tumor cell associated antigen,TAA）以及热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）、MHC分子等重要的参与免疫应答相关分子,并可被抗原递呈细胞（Antigen presenting cells,APC）高效摄取从而诱导一定强度的特异性抗白血病免疫应答。此外,外泌体（Exosomes,EXOs）具有提取方便,便于储存,便于运输,不受MHC分子限制,可透过血脑屏障等优势,因而可被开发成潜在的白血病免疫治疗疫苗。然而临床前期研究显示,未经修饰的TEX作为肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤免疫反应相对较弱,且易出现免疫耐受,因而限制了其进一步的临床应用。同时研究发现,TEX中往往负载了一些具有免疫抑制效应的相关因子。其中TGF-β1是其主要的免疫抑制因子,可通过影响多种免疫细胞的表型及功能来削弱TEX诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,是影响TEX免疫原性的重要因素之一。本研究拟通过基因修饰的手段缄默白血病细胞TGF-β1的表达,从而获得TGF-β1低表达的LEX,通过体外及体内实验验证TGF-b1缄默的白血病细胞来源的外泌体抗白血病免疫效应。研究方法:通过携带shRNA的慢病毒感染L1210白血病细胞缄默白血病细胞中TGF-β1的表达,利用密度梯度超高速离心法获得来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs（LEXTGF-?1si）。经扫描电镜、流式细胞技术及蛋白免疫印迹技术对LEXTGF-?1si的形态学特征与表型特征进行鉴定。利用共聚焦显微镜与流式细胞技术观察树突状细胞（dendritic cells,DC）对LEXTGF-?1si的摄取及其时效动力学。利用流式细胞技术、ELISA技术与混合淋巴反应检测LEXTGF-?1si对DC表型及功能的影响,并利用Real-time PCR及Western blot技术分析LEXTGF-?1si对DC表型调控的相关机制。通过细胞增殖实验、细胞毒杀伤实验及ELISA法分别检测了LEXTGF-?1si靶向结合的DC（DCLEX-TGF-?1si）所诱导的特异性CD4+T细胞增殖反应、CTL反应与Th1细胞因子分泌水平。应用动物模型研究了DCLEX-TGF-?1si所诱导的抗白血病免疫效应。实验结果:1.利用携带shRNA慢病毒载体感染L1210白血病细胞株可有效地缄默其TGF-β1的表达。通过对来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs（LEXTGF-?1si）形态学及表型的鉴定,结果提示LEXTGF-?1si符合EXOs的特征性形态,并表达EXOs特异性标志蛋白CD63、CD9与HSP70。与未经基因修饰的LEX比较,LEXTGF-?1si所负载的TGF-?1蛋白水平明显下调。2.LEXTGF-?1si可被DC高效摄取,并可较对照LEX更有效地上调DC表面共刺激分子（CD80和CD86）及MHC II类分子的表达水平,促进其IL-12p70和TNF-α的分泌并下调TGF-β1分泌。此外,在混合淋巴细胞实验中,DCLEX-TGF-?1si也可更高效地刺激T细胞增殖。同时本研究发现,LEX在DC成熟分化过程中通过降解转接蛋白Myd88从而影响TLRs/My D88/NF-κB通路活性,因而无法有效促进DC成熟,而LEXTGF-?1si则可有效逆转对Myd88蛋白的降解效应,从而保证DC中TLRs/My D88/NF-κB通路活性,这可能是LEXTGF-?1si相较于LEX可更有效地诱导DC成熟的机制之一。3.相较于未经修饰的LEX靶向结合的DC（DCLEX）,DCLEX-TGF-?1si可更有效地诱导抗原特异性CD4+T细胞增殖、Th1细胞因子分泌。细胞毒杀伤实验显示,在效/靶比为12.5:1以上时,经DCLEX-TGF-?1si诱导产生的CD8+T组对特异性靶细胞杀伤率明显高于DCLEX诱导的CD8+T细胞。4.在小鼠模型中,以DCLEX-TGF-?1si作为肿瘤预防疫苗及肿瘤治疗疫苗行免疫治疗,均可较DCLEX更显着地延长小鼠中位生存期并减缓肿瘤生长。DCLEX-TGF-?1si作为肿瘤治疗性疫苗时,可有效提高荷瘤小鼠外周血中CD4+T,CD8+T,Th1,Tc1细胞比例,并下调Treg细胞比例。结论:应用慢病毒载体在母细胞层面进行基因修饰以缄默TGF-β1从而下调白血病细胞EXOs中TGF-β1蛋白的改造手段是有效可行的。来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs可通过逆转EXOs源性TGF-?1对TLRs/My D88/NF-κB通路活性的抑制效应从而更有效地促进DC表型及功能成熟。而应用TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs靶向结合的树突状细胞（DCLEX-TGF-?1si）为成分的抗白血病疫苗通过诱导更强大的抗原特异性CD4+T细胞增殖反应、CTL反应和Th1细胞因子分泌从而在体内诱导较DCLEX更强有力的特异性抗肿瘤免疫应答效力,可开发成为高效的抗白血病免疫疫苗。
郁心[4]（2016）在《IL-24在髓系白血病生物疗法基础研究中的应用》文中研究说明第一部分含IL-24的培养体系对CIK细胞生物学活性的影响目的:观察IL-24对CIK细胞生物学活性的影响,探寻增强CIK细胞毒活性的有效方法。方法:分离人外周血单个核细胞,用含有或不含IL-24的培养体系体外诱导培养CIK细胞,观察细胞增殖情况,FCM和ELISA法分析CIK表型及分泌细胞因子能力的差别,溶血试验和FCM法评价CIK细胞产生颗粒酶等毒性颗粒和IFN-γ的能力,将培养获得的CIK细胞和白血病细胞共培养,MTT法和FCM法检测各组CIK细胞对白血病细胞的细胞毒活性。结果:成功诱导培养获得CIK细胞,CIK细胞呈集落样生长,增殖速度较快,未添加IL-24的对照组CIK细胞的增殖率高于添加IL-24培养组。与对照组相比,培养体系中添加IL-24后CIK细胞中CD3+、CD4+和CD3+CD56+细胞的比例无明显改变,而CD3+CD8+、CD8+CD62L+和CD8+CCR7+细胞的数量呈一定程度增加,同时CD4+CD25+CD127-细胞比例有所下降。IL-24可上调CIK细胞表面CD107a和CD54分子以及胞内颗粒酶B的表达,此外,IL-24还可使CIK细胞分泌TNF-α和IFN-γ的能力显着增强。诱导培养的各组CIK细胞均能不同程度诱导K562、K562/A02及新鲜分离的原代白血病细胞凋亡,IL-24组的CIK细胞比常规方法培养的CIK细胞的肿瘤杀伤活性更强。结论:成功从健康人外周血单个核细胞中诱导培养了CIK细胞,所获得的CIK细胞具有正常的生物学功能。IL-24可通过增加CD3+CD8+细胞和中央型记忆T细胞（CD8+TCM）的数量,上调CIK细胞表面粘附分子、CD107a和胞内颗粒酶等毒性颗粒的表达,以及促进CIK细胞分泌Th1型细胞因子,减少CIK细胞中Treg调节性T细胞的比例等途径来改变CIK细胞的生物学特性,增强CIK细胞的抗肿瘤作用。第二部分il-24基因修饰的树突细胞促进cik细胞对白血病细胞的杀伤作用目的:研究cik细胞与il-24基因修饰的同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其作用机理。方法:从外周血单个核细胞中常规诱导培养dc和cik细胞,同时构建重组腺病毒载体advgfp/il-24（ad-il-24）,将il-24基因通过重组病毒导入已负载肿瘤抗原的dc,所构建的细胞称为dc-il-24,rt-pcr和elisa法检测dc-il-24中il-24基因的表达。重组病毒感染72h后在培养体系中加入il-10,fcm和elisa法分别检测dc表型和细胞因子分泌能力的变化,将各组dc和cik细胞混合培养,fcm法检测与dc共培养的cik细胞对白血病细胞杀伤活性的变化。结果:成功从健康人外周血单个核细胞中诱导培养了dc和cik细胞,重组腺病毒ad-il-24能有效将il-24基因导入dc,il-24可上调dc表面cd80、cd83、hla-dr、cd40、cxcr4分子的表达。基因转染后的dc分泌il-12、tnf-α的能力显着提高。il-10能够抑制dc表型成熟,促使其向单核-巨噬细胞方向分化,并降低dc分泌il-12、tnf-α的能力,但il-10对已转入il-24基因的dc并无明显抑制作用。cik细胞与dc-il-24共培养后对白血病细胞的细胞毒活性明显增强,且这种作用不受il-10的抑制。结论:通过重组病毒将il-24基因导入dc后,il-24基因的表达能有效活化dc,促进dc表型成熟,分泌th1型细胞因子,进而增强共培养的cik细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用,且这种转基因dc能抵抗il-10的免疫抑制作用。第三部分rgd修饰的il-24重组腺病毒载体对髓系白血病目的:构建rgd修饰的il-24重组腺病毒载体,观察它对白血病细胞的抑制效应及其作用机制。方法:构建重组腺病毒ad.rgd-il-24,观察它对髓系白血病细胞thp-1、k562、k562/a02、meg-01的感染效率,瑞氏-姬姆萨染色和fcm检测白血病细胞的分化情况。mtt法检测重组腺病毒对白血病细胞生长的影响,流式细胞仪检测il-24基因表达对白血病细胞周期和凋亡的影响。real-timepcr和westernblot法检测转染il-24基因后细胞凋亡相关基因grp78/bip、gadd153、gadd34、gadd45α、bax、bcl-2和mcl-1在thp-1细胞中的表达,分光光度法检测caspase-3活性的变化。结果:我们成功构建并获得rgd修饰的重组腺病毒载体ad.rgd-il-24,ad.rgd-il-24对meg-01等髓系白血病细胞的感染效率较高。异位过表达il-24能通过细胞周期阻滞来抑制靶细胞生长,并对髓系白血病细胞有一定诱导分化的作用。ad.rgd-il-24重组腺病毒能显着诱导thp-1细胞凋亡,但不能明显诱导k562和k562/a02细胞凋亡。ad.rgd-il-24能明显上调thp-1细胞grp78/bip、gadd153、gadd34、gadd45α和bax基因的表达,并下调bcl-2和mcl-1基因的表达,同时增强caspase-3的活性。结论:rgd修饰的重组腺病毒载体ad.rgd-il-24对某些种类的髓系白血病细胞具有较高的基因转导能力,内源性il-24的过表达可明显抑制白血病细胞生长,并一定程度地诱导分化。ad.rgd-il-24能通过调节凋亡相关蛋白的表达,诱导thp-1细胞凋亡。第四部分il-24基因表达对髓系白血病细胞的免疫调变作用目的:观察il-24基因表达对髓系白血病细胞免疫原性的调变作用。方法:为观察il-24对髓系白血病细胞的免疫调变作用,fcm检测il-24对白血病细胞表面cd80、cd86、hla-abc、hla-dr、mica/b、cd137、cd137l、cd200等免疫分子表达的影响,elisa检测ad.rgd-il-24对白血病细胞分泌vegf、tnf-α、il-6和il-8细胞因子的影响,细胞毒试验检测白血病细胞感染重组病毒后对cik细胞毒敏感性的变化。体内成瘤试验观察转基因白血病细胞在裸鼠体内的生长和成瘤情况,免疫组织化学法检测vegf、cd31、cd34、collageniv、cd147、mt1-mmp、mmp-2和mmp-9等因子的表达。结果:髓系白血病细胞低表达上述分子,而IL-24可影响部分免疫分子的表达,并对白血病细胞分泌某些与免疫相关的细胞因子具有一定的调节作用。IL-24基因修饰可提高白血病细胞对免疫杀伤细胞的敏感性,并抑制裸鼠白血病细胞移植瘤的生长。分子机制检测结果显示:Ad.RGD-IL-24重组腺病毒能明显下调与肿瘤血管生成密切相关的蛋白分子VEGF、CD31、CD34和collagen IV的表达,同时下调肿瘤侵袭相关分子CD147和基质金属蛋白酶MT1-MMP、MMP-2和MMP-9的表达。结论:IL-24对髓系白血病细胞的免疫原性具有调变作用,能增加白血病细胞对CIK细胞体外杀伤作用的敏感性,还能通过抑制肿瘤血管生成和降低其侵袭性,抑制裸鼠白血病细胞移植瘤的生长。
黄胜兰[5]（2014）在《AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究》文中提出【目的】原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中国常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌起病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，而且复发率高、预后差，因而总的治疗效果并不理想，目前肝癌生物治疗逐渐成为研究热点之一。其中，树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗的实验研究已取得相当大的进展，然而在实际应用仍存在很多不足，效果往往不如预期理想,其中缺乏有效抗原刺激是重要的影响因素之一，为此众多学者尝试运用不用抗原负载方式增强DC疫苗诱导抗肿瘤免疫反应,这其中包括人工合成的抗原肽、全肿瘤裂解物、基因载体转染DC等等，虽然基因转染DC可在一定程度上解决抗原来源问题，但基因载体在人体应用的安全性未能得到保障，因此最近人们尝试用新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是DC细胞分泌一种膜性囊泡,其重要特性是携带DC细胞的各种功能蛋白,因而具有相应的诱导主动免疫应答功能，其抗肿瘤作用已经在非小细胞肺癌、黑色素瘤等治疗中取得一定的效果,但应用于肝癌的研究尚处于探索阶段。本实验首先构建携带AFP基因慢病毒质粒，包装成慢病毒感染DC，分离纯化DC分泌的exosome，分析exosome的特异性抗肿瘤免疫作用。为开拓新型非细胞性肝癌疫苗提供实验依据，避免直接病毒基因导入人体，以便研制出更具临床应用前景的肿瘤疫苗。【方法】1.应用慢病毒质粒系统和包装细胞Lenti-X293T，构建包装能使AFP稳定表达的重组慢病毒颗粒。2.取健康人外周血，分离培养单核细胞，用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及LPS诱导培养DC，显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪鉴定DC表型。3.分别用合成的已知序列的AFP肽、肝癌细胞株HepG2反复冻融全抗原、携带AFP重组慢病毒颗粒负载DC，分别制备DC疫苗。4.用超滤及密度梯度离心法提取纯化DC分泌的exosome，制备exosome疫苗，透射电镜下观察exosome形态，western blot分析其功能蛋白分子。5. WST-1法比较三种DC疫苗、exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖情况，LDH法比较三种DC疫苗、exosome疫苗诱导的CTL对HepG2特异性细胞毒效应，ELLSA法比较DC疫苗、exosome疫苗活化T淋巴细胞培养上清中分泌INF-γ的浓度。6．将携带AFP抗原的exosome致敏DC，WST-1法、LDH法、ELISA法检测DC抗肿瘤免疫学活性。【结果】1.成功构建了慢病毒表达载体PRV3-AFP，能有效的感染树突状细胞并使其分泌AFP蛋白。2.mDC成典型的树突状细构，表面HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD1a分子的表达明显高于imDC。3.成熟DC分泌的exosome（Dex）在电镜下为直径在50nm-100nm之间圆形或椭圆形小体，携带与DC功能相关的分子：ICAM-1、HLA-DR、CD86分子。4.慢病毒感染的DC刺激T淋巴细胞增殖能力显着高于AFP肽、全抗原处理组（P<0.05），前者刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ和对肝癌细胞HepG2特异性杀伤作用显着高于其他两组（P<0.05）。5.慢病毒处理组制备的DC疫苗和其分泌exosome疫苗比较，exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖能力和诱导的T细胞对HepG2细胞特异性杀伤能力稍强于DC疫苗（P<0.05），exosome疫苗刺激T细胞分泌IFN-γ能力和与DC疫苗比较差别无显着意义（P>0.05）。6. exosome致敏的DC能更有效的刺激T淋巴细胞增殖和产生细胞毒作用。【结论】1.成功构建AFP慢病毒，慢病毒负载DC和AFP肽、细胞裂解抗原负载方式比较能更有效的诱导抗肿瘤免疫，是一种更为有效的制备DC疫苗方式。2. Dex作为一种具有抗原提呈能力的亚细胞结构，可诱导外周血中T细胞增殖并发挥特异性抗肿瘤作用。exosome致敏的DC能产生更有效的抗肿瘤免疫作用。
王辉[6]（2014）在《rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究》文中研究指明树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是体内已知功能最强的抗原递呈细胞（antigenpresenting cell,APC），在体内外唯一能直接激活初始型T细胞（na ve T cell），进行加工、处理和递呈到组织相容性抗原（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类分子上，并激活细胞毒T细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL），在抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用。而肿瘤患者体内DCs存在数量和功能上的缺陷，无法诱导初次免疫应答和激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应，使机体无法对肿瘤抗原产生再次免疫应答。原发性肝癌（因主要是肝细胞肝癌，故称为hepatocellular carcinoma，HCC，简称“肝癌”）一种高度恶性的肿瘤，我国是肝癌高发的国家，每年的发生率占全世界的54%。肝癌的评价生存期一般不超过6个月，对放、化疗均不敏感，故现行治疗肝癌的方法主要还是以手术等局部治疗为主的综合治疗，尽管如此，目前我国肝癌患者总体的五年生存率仅在10％左右，中晚期肝癌的五年生存率更低。近年来，肿瘤的免疫治疗成为肿瘤研究的新热点，其中以DCs为基础的肿瘤疫苗（简称DC瘤苗）在实验性肝癌免疫治疗中取得了良好效果。目前，国内外学者大多采用肿瘤细胞冻融裂解物、AFP多肽等负载DCs治疗肝癌，也都取得了一定的疗效，但因负载物单一、免疫原性低，其产生的免疫反应较低，疗效也有限，因此，探索新的负载物，构建新的高效DC瘤苗对肝癌的临床治疗有着重要的意义。HBV感染与HCC的发生密切相关，进一步的研究表明HBV X基因的编码蛋白HBx蛋白（HBxAg）在HCC的发生过程中起着重要的作用。HBxAg在肝癌组织中的阳性表达率达70%－80%,因此HBxAg可作为理想的抗原识别靶点，将HBxAg作为抗原负载DC，制备DC疫苗将可能成为肝癌生物免疫治疗的一个新的思路。热休克蛋白70（HSP70）家族是一类重要的应激蛋白，在肿瘤勉一中发挥免疫佐剂的功能，通过分子载体的作用将抗原肽呈递至APC表面，激活CD8+T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的目的，HSP70对开发肿瘤疫苗也有重要的意义。本研究采用以HBV病毒抗原多肽HBxAg作为靶抗原，利用rhHSP70结合多肽的生物学活性，体外制备rhHSP70-HBxAg复合物增强多肽的稳定性与抗原性，采用人体专职性抗原递呈细胞DCs作为rhHSP70-HBxAg复合物的承载体，增加疫苗的免疫原性，制备rhHSP70-HBxAg-DC活细胞瘤苗，并进一步研究该瘤苗对HBxAg表达阳性的肝癌细胞的杀伤效能。第一部分构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能目的：构建rhHSP70-HbxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能。方法：（1）采集HLA-A2+健康献血员外周血，经Ficoll分离获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），其中贴壁细胞经体外诱导产生DCs，每日观察DCs形态变化；（2）DCs生长第7日开始负载不同浓度的rhHSP70、HBxAg及rhHSP70-HBxAg复合物，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR的表达，ELISA检测细胞培养上清中IL-12的分泌，寻找出最适抗原负载浓度；（3）未贴壁细胞经尼龙毛柱分离获得T淋巴细胞，以最适抗原浓度体外构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并将T淋巴细胞与rhHSP70-HBxAg-DC共培养诱导效应细胞及特异性CTL细胞，CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。结果：（1）随着培养时间的延长，DCs出现拉长，呈细树枝状典型形态；（2）不同浓度的rhHSP70及HBxAg负载DCs后流式细胞仪检测DC表型的表达及ELISA检测IL-12的分泌显示两种抗原的最适浓度分别为rhHSP70:20μg/ml，HbxAg:5μg/ml；（3）负载抗原的DCs，高表达CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR，细胞因子IL-12的分泌也显着增加，其中rhHSP70-HBxAg组最高；（4）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可明显刺激T淋巴细胞的增殖。结论：外周血来源的DCs负载rhHSP70和（或）HBxAg后，可分化为成熟DCs，促进T淋巴细胞的增殖。第二部分rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能研究目的：研究rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能。方法：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导T淋巴细胞产生CTL细胞，体外杀伤靶细胞，LDH释放试验检测CTL细胞对不同处理组靶细胞的杀伤效能；（2）用转染了HBx基因的HepG2（HBx-HepG2）建立小鼠皮下移植瘤模型，将30只小鼠随机分为rhHSP70-HBxAg-DC组、未负载抗原的DC组、PBS组，每3日测量瘤体体积，比较各组对裸鼠移植瘤生长的抑制作用；（3）治疗后第28d处死小鼠，分离瘤体，行免疫组化检测瘤体HBx蛋白、AFP以及Bcl-2、PCNA、Fas、Bax、Caspase的表达。结果：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导的CTL细胞能有效杀伤HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞，其中对HBx-HepG2细胞的杀伤最明显，而对NK细胞敏感的K562细胞及正常肝细胞L02无明显杀伤作用，同时对被抗MHC-Ⅰ类复合物抗体处理过的HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞杀伤效能明显下降；（2）rhHSP70-HBxAg-DC组和对照组的移植瘤生长受到明显抑制，其中rhHSP70-HBxAg-DC组最明显；（3）免疫组化结果显示瘤体组织中有HBx蛋白、AFP的表达；Bcl-2、PCNA的表达较对照组下调，而凋亡相关基因Fas、Bax和Caspase较对照组表达上调。结论：rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可诱导产生特异性抗HBV相关肝癌细胞效应，有一定的临床应用前景。
孙龙昊[7]（2014）在《AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究》文中研究说明第一部分：AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的构建目的：构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞并鉴定其功能。方法：采集基因型HLA-A0201的健康志愿者单核细胞,制备负载AFP158-166表位肽的成熟树突状细胞（DC）,体外激活T细胞通过流式分选建立AFP158-166特异性T细胞克隆,获取并扩增AFP158-166特异性TCR基因,构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体,感染多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例,以ELISPOT和细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT,可转染多克隆T细胞使其表达AFP158-166特异性TCR,构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞；（2）FCM检测Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例为1.8%；（3）ELSPOT检测显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中分泌IFN-γ的细胞数是DC诱导的AFP158-166特异性T细胞中的1.8倍。（4）细胞毒性实验显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在效靶比10：1,20：1,30：1时分别从6.3±1.3%,17.9±5.2%,39.2±3.7%上升至11.3±2.9%,27.9±7.8%,62.7±10.4%,而对AFP-细胞无明显杀伤作用。结论：AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT可转染多克隆T细胞构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第二部分：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建目的：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞并鉴定其功能。方法：以AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达质粒,构建慢病毒载体VA15转染人B细胞淋巴瘤细胞BJAB,以放射辐照抑制增殖,建立安全且稳定表达IL-15并递呈AFP158-166表位肽的人工抗原递呈细胞,通过ELISA、FCM和液相色谱-质谱联用分别鉴定IL-15、MHC分子、CD80、CD86、AFP158-166抗原肽的稳定表达,于体外诱导AFP158-166抗原特异性T细胞增殖,并以细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达慢病毒载体VA15,可转染BJAB细胞,获得协同表达AFP158-166抗原表位肽和IL-15的BJAB细胞单克隆BA15；（2）BA15可稳定表达AFP158-166抗原肽和IL-15；（3）20Gy剂量的137Csγ射线辐照可诱导凋亡有效阻滞BA15细胞增殖但不会使其迅速死亡；（4）20Gy剂量的137Csγ射线辐照不会影响BA15细胞表面MHC分子及协同刺激分子CD80、CD86的表达。（5）BA15可有效激活扩增AFP158-166抗原特异性T细胞,其功能较负载AFP158-166的DC无明显差异；（6）细胞毒性实验显示BA15诱导的AFP158-166特异性T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在各效靶比无明显差异。结论：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞可有效激活AFP158-166特异性T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第三部分AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究目的：以AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞鉴定其功能变化。方法：体外非特异性激活HLA-0201健康志愿者淋巴细胞,以AFP158-166特异性TCR慢病毒VAT感染,制备AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,并以本实验建立的AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BAl5刺激扩增,通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例变化,以细胞毒性实验进行体外实验功能鉴定。利用HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型,进行AFP158-166特异性T细胞过继免疫治疗实验,观察治疗效果。结果：（1）经BA15刺激,AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例从1.8%上升至4.2%,CD8+T细胞/CD4+T细胞比例由0.42上升至1.10,但对AFP+人肝癌细胞HepG2的杀伤作用无明显变化。（2）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较负载AFP158-166表位肽DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对于HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型具有更好的治疗效果。结论：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞可提高转基因T细胞比例。AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗有效。
尹良伟,马海英,王苏平[8]（2013）在《基因修饰DC在抗肿瘤免疫治疗中的应用》文中研究指明DC是目前已知人体内功能最强的免疫提呈细胞（antigen presenting cell,APC）,成熟的DC通过诱导细胞免疫、参与体液免疫以及分泌多种细胞因子等多种途径,在抗原的捕获、加工、提呈和激活T细胞产生抗肿瘤免疫效应中发挥重要作用。恶性肿瘤患者往往存在一定的DC功能缺陷,基因修饰的DC可为机体免疫系统提供多个可供识别的抗原表位,是加强抗肿瘤免疫的重要手段之一。基因修饰的DC疫苗种类较多,如肿瘤相关抗原基因、细胞因子基因、共刺激分子基因、黏附分子基因、免疫调控分子基因、凋亡相关基因、癌基因以及多种基因共同修饰的DC疫苗等,这些经基因修饰后的DC疫苗在抗肿瘤免疫的基础研究方面已经证实了其免疫增强作用,而且部分DC疫苗在临床试验中也取得了一定的抗肿瘤疗效,这些都将为基因修饰的DC在临床中的应用提供重要的理论基础。本文将从DC的生物学特征、DC的抗肿瘤机制以及基因修饰的DC疫苗在抗肿瘤免疫中的基础研究和相关临床试验等几个方面做一综述。
章由贤[9]（2011）在《体外诱导甲胎蛋白抗原肽表位肽AFP158-166特异性T细胞的研究》文中进行了进一步梳理目的：体外培养刺激AFP特异性T细胞,检测其杀伤功能,为研究AFP158-166特异性T细胞免疫治疗奠定基础。方法：采用带FITC荧光标记的HLA-A2抗体,流式细胞技术筛选HLA-A2阳性健康志愿者,通过HLA-A2基因分型高分辨检测试剂盒（PCR-SSP）,选择其中基因型为HLA-A0201者,取其外周血,密度梯度离心法分离获取外周血单核细胞（PBMC）,通过加入人GM-CSF、IL-4及TNF-α等细胞因子贴壁粘附培养法培养收获树突状细胞（DC）,将DC负载HLA-A0201表位态AFP158-166后,按1：10比例将其与新鲜淋巴细胞混合培养,并加入人细胞因子IL-2刺激,出现细胞大量增殖后收获细胞,行细胞毒性试验,用MTT法分别检测其杀伤肝癌细胞、负载AFP的T2细胞,以及未负载AFP的T2的能力。结果：从13例健康志愿者中筛选出基因型HLA-A0201阳性者4例,每50ml外周血培养的细胞中可收获DC细胞2×106个,培养至第7天检测表面抗原：CD83、CD80和CD86阳性率分别为（81.3±2.4）%、（92.8±1.4）%和（70.5±1.9）%。将DC负载AFP与淋巴细胞混合培养14d左右出现大量细胞增殖,行细胞毒性试验结果示,其对肝癌细胞、负载AFP的T2细胞有明显杀伤作用,而对未负载AFP的T2细胞杀伤作用不明显。结论：通过加入GM-CSF、IL-4及TNF-α等细胞因子体外贴壁粘附培养人PBMC可收获树突状细胞,将树突状细胞负载AFP158-166后与淋巴细胞混合,加细胞因子IL-2可刺激AFP158-166特异性T细胞增殖,并且可杀伤AFP+肝癌细胞以及负载AFP的T2细胞,为研究肝癌的过继细胞免疫治疗提供了实验基础。
武立华,艾军[10]（2011）在《基因修饰的树突状细胞应用于肿瘤免疫治疗的研究进展》文中研究表明树突状细胞（dendritic cells,DC）被认为是目前人体内最重要的、抗原呈递能力最强的抗原呈递细胞（antigen-presentingcell,APC）,是体内唯一能活化静息T淋巴细胞的APC,是机体免疫应答的始动者,在抗肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。近些年来,基因修饰DC疫苗的出现,弥补了单纯DC功能的不足,增强了其抗肿瘤作用,本文将对基因修饰DC疫苗的抗肿瘤作用作一简要综述。
二、腺病毒介导的AFP基因修饰树突状细胞的体外生物学特性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒介导的AFP基因修饰树突状细胞的体外生物学特性（论文提纲范文）
（1）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（2）预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、HA慢病毒(Lenti-HA)对肝细胞癌免疫治疗的作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验使用细胞系 |
| 1.1.2 实验模式动物 |
| 1.1.3 实验用的主要仪器设备 |
| 1.1.4 实验用的主要试剂及耗材 |
| 1.1.5 试剂配制 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.1.7 数据分析及图像绘制软件 |
| 1.1.8 统计学分析 |
| 1.1.9 所用的引物序列 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 Lenti-HA的构建及体内外抑瘤效果的测试 |
| 1.2.2 在肝癌皮下瘤模型上对Lenti-HA的治疗剂量进行优化 |
| 1.2.3 Lenti-HA在肝癌原位瘤模型上治疗效果的测试 |
| 1.2.4 Lenti-HA在原发肝癌模型上治疗效果的测试 |
| 1.2.5 Lenti-HA抗肿瘤机制的初步探索 |
| 1.2.6 Lenti-HA对人肝癌细胞系体外杀伤效果的测试 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 Exosome在肝细胞癌免疫治疗中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分:LEX的基因修饰及鉴定 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分:LEX_(TGF-β1si)锚定DC后对其性状的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 第三部分:DC_(LEX-TGF-β1si)疫苗体外及体内抗白血病效应的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录:博士期间发表的学术论文 |
（4）IL-24在髓系白血病生物疗法基础研究中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 含IL-24的培养体系对CIK细胞生物学活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IL-24基因修饰的树突细胞促进CIK细胞对白血病细胞的杀伤作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 RGD修饰的IL-24重组腺病毒载体对髓系白血病细胞的生长抑制效应及其作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 IL-24基因表达对髓系白血病细胞的免疫调变作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的学术论文 |
| 本论文受下列课题资助 |
| 中英文缩略词汇表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：AFP 慢病毒表达载体的构建与包装 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：AFP 抗原以不同方式修饰 DC 体外诱导抗肿瘤作用的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：AFP 基因修饰 DC 分泌的 exosome 体外诱导抗肿瘤作用的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建 rhHSP70-HBxAg-DC 瘤苗，并鉴定其生物学功能 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 rhHSP70-HBxAg-DC 瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间发表的论文 |
| 本研究所获得基金资助 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 筛选基因分型HLA-A0201健康志愿者 |
| 1.2.2 建立AFP_(158-166)特异性T细胞克隆 |
| 1.2.3 克隆AFP_(158-166)特异性TCRα和TCRβ基因,构建表达特异性TCR的慢病毒载体 |
| 1.2.4 体外制备并扩增AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞 |
| 1.2.5 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞功能检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 肝细胞肝癌的生物治疗 |
| 1.3.2 AFP在肝细胞肝癌诊治中的意义 |
| 1.3.3 人树突细胞的培养与生物学功能 |
| 1.3.4 抗原特异性T细胞的激活增殖与检测分离 |
| 1.3.5 TCR多样性及AFP_(158-166)抗原特异性TCR基因克隆 |
| 1.3.6 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的体外制备和功能检测 |
| 1.4 小结 |
| 二、AFP_(158-166)抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 流式细胞术鉴定BJAB细胞表型 |
| 2.2.3 辐照对BJAB细胞表型,增殖及存活影响 |
| 2.2.4 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)浓度 |
| 2.2.5 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)的鉴定 |
| 2.2.6 质粒CCS-IL15-Lv201的鉴定 |
| 2.2.7 荧光倒置显微镜评估细胞转染情况 |
| 2.2.8 FCM评估细胞转染情况 |
| 2.2.9 ELISA检测BA15对IL-15表达 |
| 2.2.10 BA15对eGFP,IL-15与AFP158-166抗原肽的稳定表达 |
| 2.2.11 BA15体外刺激AFP特异性T细胞克隆性增殖 |
| 2.2.12 AFP特异性T细胞对AFP~+肝癌细胞特异性杀伤作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 人工抗原提呈细胞与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.2 IL-15与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.3 AFP抗原与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建和鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFP_(158-166)特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 体外实验 |
| 3.2.2 体内实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 肿瘤特异性TCR转基因T细胞免疫治疗进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）基因修饰DC在抗肿瘤免疫治疗中的应用（论文提纲范文）
| 1 DC的生物学特征 |
| 2 DC的抗肿瘤机制 |
| 2.1 诱导细胞免疫 |
| 2.2 参与体液免疫 |
| 2.3 分泌细胞因子参与免疫 |
| 3 基因修饰的DC疫苗 |
| 3.1 肿瘤相关抗原基因修饰的DC疫苗 |
| 3.2 细胞因子基因修饰的DC疫苗 |
| 3.3 共刺激分子、黏附分子、免疫调控分子基因转染的DC疫苗 |
| 3.4 凋亡相关基因修饰的DC疫苗 |
| 3.5 癌基因修饰的DC疫苗 |
| 3.6 多基因共同修饰的DC疫苗 |
| 4 结语 |
（9）体外诱导甲胎蛋白抗原肽表位肽AFP158-166特异性T细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 目的及方法 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 综述 肝癌的免疫治疗研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、腺病毒介导的AFP基因修饰树突状细胞的体外生物学特性（论文参考文献）
- [1]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [2]预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究[D]. 刘志礼. 天津医科大学, 2019(02)
- [3]TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究[D]. 黄方. 上海交通大学, 2018(01)
- [4]IL-24在髓系白血病生物疗法基础研究中的应用[D]. 郁心. 苏州大学, 2016(08)
- [5]AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究[D]. 黄胜兰. 福建医科大学, 2014(02)
- [6]rhHSP70联合HBxAg负载树突状细胞治疗HBV相关肝癌的实验研究[D]. 王辉. 苏州大学, 2014(11)
- [7]AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究[D]. 孙龙昊. 天津医科大学, 2014(01)
- [8]基因修饰DC在抗肿瘤免疫治疗中的应用[J]. 尹良伟,马海英,王苏平. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2013(05)
- [9]体外诱导甲胎蛋白抗原肽表位肽AFP158-166特异性T细胞的研究[D]. 章由贤. 天津医科大学, 2011(04)
- [10]基因修饰的树突状细胞应用于肿瘤免疫治疗的研究进展[J]. 武立华,艾军. 癌变·畸变·突变, 2011(01)