一、应用RT-PCR试验诊断牛BCV感染（论文文献综述）
赵巧雅,宋丹丹,刘丽萍,郭效珍,刘存霞,盛媛,史玉颖,黄兵[1]（2021）在《兔轮状病毒、兔肠冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用》文中研究指明兔轮状病毒（lapine rotavirus, LaRV）和兔肠冠状病毒（rabbit enteric coronavirus, RECV）是引起兔腹泻的重要病原,2种病毒引起的仔兔腹泻症状极为相似。为建立能同时鉴别LaRV、RECV的方法,根据LaRV和RECV基因组的保守区段设计2对特异性引物,预期特异性扩增LaRV和RECV的片段大小分别为291 bp和163 bp,经优化反应条件,成功建立了LaRV和RECV的双重RT-PCR检测方法。特异性检测结果显示,能特异性的扩增出LaRV和RECV的目的条带,与兔瘟、大肠杆菌、魏氏梭菌、沙门菌、泰泽菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、链球菌、支气管败血波氏杆菌均无交叉反应;LaRV和RECV的最低检出限分别为2.73×105,1.22×104拷贝/μL,在相同条件下重复可获得一致的结果。对采自山东部分地区的107份兔腹泻样品的检测结果显示,LaRV和RECV的阳性率分别为10.28%和7.48%,两者与单一RT-PCR检测结果相一致。结果表明,所建立的双重RT-PCR方法能够快速、准确的对LaRV和RECV单一或混合感染的样品进行检测,为LaRV和RECV的鉴别诊断和流行病学调查提供新的技术手段。
拜小强[2]（2021）在《牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立》文中研究表明牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起牛病毒性腹泻病,也是导致牛呼吸道疾病综合征（BRDC）主要病原之一。牛病毒性腹泻病临床表现复杂,以孕牛流产、胎牛木乃伊化、犊牛先天性缺陷,染疫牛只呈双向热、腹泻脱水、共济失调、免疫抑制和持续感染为主。该病在世界范围内广泛流行,目前我国20多个省、市、自治区的牛群中检测到病原,牛、羊﹑猪和鹿等偶蹄类动物也存在不同程度地感染,严重影响着畜牧业的健康发展。BVDV基因组中ORF编码结构蛋白和非结构蛋白,结构蛋白包括核心蛋白C和糖基化囊膜蛋白Erns、E1、E2,在病毒适应环境和维持自身稳定方面发挥着重要的作用。本实验利用MDBK细胞对BVDV毒株培养增殖和滴度测定,设计全序列引物对编码结构蛋白的基因进行克隆和鉴定,在此基础上应用生物信息学分析工具对基因组序列以及蛋白结构、性质和功能进行预测分析。结果显示MDBK细胞接毒培养至24h开始出现细胞病变,测定BVDV TCID50=10-5.112/0.1m L,PCR扩增出结构蛋白基因条带分别为306bp、681bp、585bp和1122bp,测序结果与NCBI数据库中BVDV-1、BVDV-2、CSFV和BDV共17株同源性比对显示,与BVDV-1 NADL株同源性最高,分别为100%、99.71%、97.78%和100%;构建系统进化树显示,与BVDV-1 NADL株进化关系密切,与同属的CSFV和BDV进化关系较为疏远。BVDV Npro和Erns蛋白较为保守且具有特征性功能,是与同科不同属病毒进行鉴别的差异化蛋白,Npro和ErnsRNase在阻断干扰素诱导和引起宿主持续感染中发挥重要的作用。本实验构建BVDV Npro和Erns重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对Npro和Erns蛋白进行表达。成功构建了p CMV-Myc-Npro和p CMV-Myc-Erns真核表达质粒,并将重组质粒瞬时转染至HEK 293细胞中,经Western blot验证后,分别在21k D和27k D处出现目的条带。BVD常用的诊断方法包括临床诊断、病原学检验、免疫学检验和分子生物学检验技术。本实验建立了BVDV RT-PCR、q RT-PCR和RT-LAMP三种核酸检测方法,并对检测方法进行优化、验证和比较。实验证实建立的三种检测方法均有良好的特异性;对不同浓度标准质粒样品检测显示,q RT-PCR方法灵敏度最高（8.134×101copies/μL）,分别是RT-LAMP和RT-PCR的10和1000倍,RT-LAMP灵敏度次之（8.134×102copies/μL）,RT-PCR灵敏度最低（8.134×104copies/μL）;对67份临床样本检测结果进行Kappa和Mc Nemar校正检验分析,得出三种方法临床检出率高、检测结果一致性较好。诊断BVDV时建议在条件有限的情况下采用RT-LAMP检测方法,实验室条件允许时进一步采用q RT-PCR检测方法复检确诊。
刘勃兴[3]（2021）在《河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及BVDV抗体检测方法建立》文中研究说明在河北省,犊牛腹泻病是造成肉犊牛死亡和经济损失的主要疾病。在犊牛腹泻病的病因中,大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCo V）和牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）是主要致病原。为了解上述四种传染性病原在河北地区犊牛腹泻病料中的阳性率,本研究自2018年至2020年收集河北省秦皇岛市、唐山市、石家庄市等市患腹泻病肉犊牛样品共计804份,19.28%（155/804）的样品检测出上述四种病原。肉犊牛腹泻样品中共计分离E.coli 649株,分离数量最多,进一步通过小鼠致病性试验验证分离E.coli的致病性,共计有120株E.coli具有致病性,检出率为14.93%（120/804）。其中,O114型是致病性E.coli检出率最高的血清型,其次为O86型。通过RT-PCR检测样品中BVDV、BCo V和BRV三种病毒性病原,BCo V检出率为3.61%（29/804）、BRV检出率为2.99%（24/804）、BVDV检出率为0.87%（7/804）。混合感染样品数量占比14.84%（23/155）,检出率较高的病原混合感染组合形式为:致病性E.coli+BCo V、致病性E.coli+BRV、BCo V+BRV。在国内,BVDV抗体ELISA检测试剂盒主要进口于国外,而国内商品化试剂盒的品牌和种类较少,这导致我国BVDV抗体检测成本较高。BVDV的Erns蛋白可诱导产生中和抗体,是疫苗和诊断试剂研发的靶蛋白。为了降低BVDV抗体检测成本,了解河北地区牛群BVDV抗体阳性率,本研究以河北地方BVDV毒株为试验材料,用E.coli原核表达系统成功获得了Erns蛋白。以该蛋白为包被抗原建立BVDV抗体间接ELISA检测方法,并应用该方法检测河北地区牛血清样品的BVDV抗体阳性率。试验结果显示,本研究建立的BVDV抗体ELISA检测方法能特异性识别BVDV抗体阳性血清,具有较高的灵敏度（阳性血清最大稀释倍数为1 600倍）和重复性（批内和批间的变异系数均小于10%）,与IDEXX试剂检测同一批样品的总符合率为93.33%。应用该方法对河北地区18家牛场的477份血清样品进行检测,其中接种疫苗牛场的血清阳性率为30.43%～92.86%,未接种免疫牛场抗体阳性率为0～100%。本研究通过对河北地区肉犊牛腹泻样品中四种病原进行流行病学调查,为河北地区由四种病原引起的肉犊牛腹泻病的防控提供数据参考,同时本研究建立的BVDV抗体ELISA检测方法为河北地区BVDV的监测和防控提供技术支持。
彭志豪[4]（2021）在《牛轮状病毒的分离鉴定和诊断方法的建立》文中研究指明牛轮状病毒（Bovine Rotavirus,BRV）,属于呼肠病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）,是引起犊牛腹泻病的主要病原之一。自1969年该病首次被报道以来,已相继在各国发生和流行,给养牛业造成严重的经济损失。该病以1月龄内犊牛腹泻、脱水为主要症状,且该病与其他病原引起的牛腹泻临床症状相似,难以区分,因此建立快速的诊断方法对BRV的防控具有重要的意义。本研究从河北省不同地区规模化牛场收集牛腹泻粪便样品,成功分离到一株可以稳定传代的细胞毒株,并对其VP6基因进行遗传进化分析和体外表达,并以表达的重组VP6蛋白为基础建立了检测BRV抗体的ELISA诊断方法,另外,据BRV、BCV的保守序列VP6、N基因建立双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究对我国BRV检测提供了快速有效的诊断方法,并对今后疫苗研发奠定了基础。为了解河北省牛群的BRV感染情况,本研究采用RT-PCR方法对2019年3月～6月采自河北省不同规模化牛场的72份腹泻样品进行检测,并选取经鉴定仅BRV为阳性,而能引起牛腹泻的其他病毒均为阴性的腹泻粪便样品处理后接种到Marc-145细胞上,进行病毒的分离,并对分离的毒株进行细胞病变观察,PCR鉴定、TCID50测定以及理化特性鉴定,结果显示,细胞在盲传5代后出现皱缩、变圆、边界不明显等病变,且RT-PCR鉴定为阳性,同时根据Reed-Muench法算得第15代毒TCID50为10-5.24/0.1mL,并对氯仿、乙醚和强酸耐受,但对热较敏感60℃ 10min即可使病毒完全失活,表明本研究成功分离出BRV毒株并命名为CH-HB-BD株。为了了解分离毒株的遗传变异情况,本研究对BRV CH-HB-BD株VP6基因进行了扩增和序列测定,并与国内外A型轮状病毒（RVA）VP6基因进行序列和氨基酸同源性进行分析,结果显示,分离株与来自美国的RVA G1 P8-3-50（登录号:KU956011）、RVAWC3（登录号:AF411322）和德国RVA 88977（登录号:KJ940164）亲缘关系最近,其中RVAWC3（登录号:AF411322）的同源性最高为96.4%,与氨基酸同源性分析结果一致,表明分离株VP6基因可以作为目的基因用于诊断方法的建立。此外,分离株同疫苗常用株RVANCDV（登录号:DQ870496）亲缘关系较近,序列同源性为95.8%,氨基酸位点仅发生3处改变,第122（I→L）、211（V→I）、349（I→V）。为了建立检测BRV抗体的血清学检测方法。本研究将分离株的VP6蛋白基因进行了表达,用Western对蛋白进行了反应原性的鉴定,并以重组VP6蛋白建立了检测牛血清中IgG抗体的间接ELISA方法,通过反应条件的优化确定了蛋白的最适包被条件为6μg/mL 4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂牛奶,同时将不同浓度的一抗二抗进行试验,确定最佳一抗稀释为1:500,二抗的稀释浓度为1:10000;此外,重复性试验和特异性试验结果显示,本试验建立的ELISA方法具有良好的重复性和特异性,组内组间变异系数均小于7%,且与牛冠状病毒（BCV）、牛病毒性腹泻（BVDV）和牛诺如病毒（BNoV）无交叉反应;通过检测30份BRV阴性血清算得临界值为0.290,临床285份样品检测结果显示144份样品为阳性,占50.1%（144/285）。本研究根据GenBank中已登录的BRV VP6基因和BCV N基因设计引物和探针,通过方阵法优化体系后,建立了一种可以同时检测BRV和BCV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。该方法特异性强,与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛细小病毒（BPV）、牛肠道病毒（BEV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对BRV和BCV重组质粒标准品的最低检测限分别为41.8拷贝/μL和3.55拷贝/μL,敏感性高;组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性较好。用已建立好的方法对本实验室于2019年3月～9月在河北省内采集的72份牛腹泻样品进行检测,检测结果显示BRV的阳性率为50.0%（36/72）,BCV的阳性率为75.0%（54/72）,BRV和BCV共感染率为33.3%（24/72）,优于常规PCR方法。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对BRV和BCV的临床病原检测和流行病学调查具有重要意义。
房立春[5]（2020）在《基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证》文中指出牛结核病（Bovine tuberculosis）是一种主要由牛型分枝杆菌（M.bovis）感染引起的危害严重的人畜共患病。结核病牛可通过鼻腔或泌乳等方式向外排菌,呼吸道飞沫传播是牛分枝杆菌的主要传播方式。世界动物卫生组织（OIE）推荐的巢式PCR方法可以有效检测牛鼻拭子中分枝杆菌DNA,有研究报道基于此方法发现超过15%的结核病牛向外排菌。为了筛选牛结核病特别是不同感染状态牛结核病的诊断用分子标志物,本研究采用皮内变态反应（TST）和IFN-γ释放试验（IGRA）在临床上筛选结核病阳性牛（bTB,n=40）和健康牛（NC,n=20）,并采用OIE推荐的巢式PCR方法将结核病阳性牛分为PCR阳性结核病牛（bTB PCR-P,n=20）和PCR阴性结核病牛（bTB PCR-N,n=20）。以牛型提纯结核菌素PPD-B刺激牛外周血淋巴细胞（PBMCs）6 h,并设PBS刺激组为对照。采用RNA-Seq技术对PBMCs总RNA进行高通量测序,描绘不同感染状态结核病牛的转录表达谱。结果显示在PPD-B刺激和非刺激条件下,不同感染状态结核病牛PBMCs的mRNA表达谱显着不同,组间鉴定到数目可观的差异表达基因,差异表达基因功能和所涉及的信号通路揭示了结核病牛在不同感染状态下特有的生理特征。本研究基于转录组学结果,筛选了12个有潜力的牛结核病分子标志物。以临床筛选的51头牛为独立样本,扩群验证了分子标志物的诊断能力。qRT-PCR结果表明PPD-B刺激条件下IL-8,和LTA在结核病阳性牛（包括PCR阳性和PCR阴性结核病牛）中的mRNA表达水平显着高于健康牛,受试者特征曲线（ROC曲线）显示IL-8（AUC=0.9991）和LTA（AUC=0.9343）具有较高的诊断应用价值;PPD-B刺激条件下BCL2（AUC=0.9100）,CRP（AUC=0.9619）和CHI3L1（AUC=0.8893）可以将临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛进行有效区分。由于商品化的牛ELISA试剂盒的限制,我们评价了分子标志物IL-8和CRP在结核病牛血浆中的蛋白含量并确定了诊断用cutoff值。双盲试验以244头牛为实验动物,分别用TST,IGRA,nest-PCR和PPD-B刺激的IL-8与CRP ELISA进行检测,结果表明PPD-B刺激下血浆IL-8与TST（κ=0.877）和IGRA（κ=0.926）均具有很高的吻合度,可以用于区分结核病牛与健康牛;PPD-B刺激下血浆CRP与nest-PCR（κ=0.9117）有较高吻合度,可以区分临床上PCR阳性和PCR阴性的结核病牛。本研究成功构建了牛分枝杆菌BALB/c小鼠感染模型。以牛分枝杆菌AN5静脉注射小鼠,同时设对照组。连续观察56天,不论是脏器系数,组织病理学观察还是脏器载菌量均表明感染模型建模成功。利用qRT-PCR和ELISA在mRNA和蛋白水平验证了牛结核病分子标志物在小鼠模型上不同感染时间的表达情况。结果证实,LTA,CRP,BCL2等分子标志物在小鼠感染模型与牛上的表达水平基本一致,该结果进一步提高了分子标志物的可靠性。综上所述,本研究首次描绘了不同感染状态结核病牛PBMCs的转录表达谱,阐明了不同感染状态结核病牛生理状态的异质性,证实了PCR阳性与PCR阴性结核病牛不同的免疫应答反应。同时筛选并验证了IL-8、LTA、CRP、BCL2和CHI3L1是具有诊断价值的牛结核病分子标志物。本研究提供了新的视角来认识牛结核病发病进程,为牛结核病不同感染状态的区分提供了理论支持,新型分子标志物的成功筛选和验证为牛结核病的临床诊断提供了客观依据。
耿金静,魏锁成[6]（2020）在《牛病毒性腹泻病原的分子生物学与检测技术研究进展》文中认为腹泻是牛群中最常出现的疾病。病毒引起的牛病毒性腹泻是一种传染性腹泻,会给牧场造成巨大的经济损失。目前研究发现,引起牛腹泻的病毒主要有牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）、牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEnV）等。此外,牛凸隆病毒（Bovine torovirus,BToV）、牛诺如病毒（Bovine norovirus,BNoV）、牛纽布病毒（Bovine nebovirus,BNebV）、牛星状病毒（Bovine astrovirus,BoAstV）及牛嵴病毒（Bovine kobuvirus/aichivirus B,BKoV）也可诱发牛腹泻。随着病原检测技术,尤其是分子检测技术的进步,许多检测方法如IEM、RT-PCR、ELISA和PAGE已用于病毒的检测和疾病诊断。本文结合国内外文献资料,对牛病毒性腹泻的病原分子生物学特征及诊断技术进行概述,以期为牛腹泻的致病原因和检测技术的进一步研究提供基础。
赵洪哲[7]（2019）在《牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立》文中研究说明本研究为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体间接ELISA方法,根据GenBank公布的BVDVE2基因序列,利用DNAstar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列,将其进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后送公司合成并连接到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-Opti-E2,鉴定正确后,转化至E.coli BL21（DE3）宿主菌,IPTG 诱导表达,经 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析,成功获得大小为43 kDa BVDV E2基因的可溶性蛋白。应用可溶性表达的E2蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BVDV抗体的间接ELISA方法,命名为Opti-E2-ELISA。采用受试者工作特征曲线方法对203份血清的S/P值进行分析,确定Opti-E2-ELISA的阴阳性临界值为0.21。当S/P值为0.21时,此方法的敏感性为96.97%,特异性为97.65%。用Opti-E2-ELISA方法检测牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、牛口蹄疫病毒阳性血清、布鲁菌阳性血清、牛副结核分支杆菌阳性血清,结果均为阴性,表明此方法特异性良好。批间批内重复性试验结果显示:变异系数均小于10%,表明所建立的Opti-E2-ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性。与商品化的BVDV抗体检测试剂盒IDEXX对比,符合率为97.5%。
阿比克哈莫（Keha ABI）[8]（2019）在《奶牛冠状病毒的分子检测、基因组特征及ELISA试剂盒的研制》文中研究指明牛冠状病毒（Bovine Coronavirus,BCoV）主要引起新生犊牛腹泻、成年牛冬季腹泻和牛呼吸道疾病,在全球范围内造成了严重的经济损失。血清流行病学资料显示国内BCoV阳性率高且分布广泛,但关于BCoV的病原流行病学资料欠缺。本研究的目的是开展国内部分地区奶牛BCoV分子检测及基因组研究,同时研制基于重组N蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒,取得如下成果:1.国内部分省区奶牛冠状病毒的分子检测2017年9月到2018年5月,采集了6省14个奶牛场的190份犊牛腹泻粪便样本,采用特异性RT-PCR方法检测BCoV的阳性率,并选取代表性样本同时克隆纤突蛋白（S）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、核衣壳蛋白（N）和跨膜蛋白（M）的完整基因,分析其分子特征。结果表明,BCoV的检测率为18.95%,场阳性率为92.86%（13/14）,表明BCoV在采样省区的奶牛中广泛流行;从4个省8个牛场的13个阳性样本中同时成功扩增出完整的S、HE、N和M基因,与GenBank中的全部163条完整BCoV S基因相比,本实验克隆的12条序列和中国其它13个毒株（12株牦牛和1株奶牛）在进化树上聚为独立一大支,且在S2亚基上均具有相同的氨基酸突变（N1192Y）;另外1条S基因与3个美国BCoV毒株独立聚为一小支。与GenBank中的115条完整BCoV HE基因相比,本实验克隆的10条和中国其它2个毒株（1株牦牛和1株奶牛）在进化树上聚为独立一大支,在HE的R2-loop上具有1个相同的氨基酸突变（F181V）。值得注意的是,13株毒株中有10株被鉴定为HE重组毒株且重组事件相同,重组区域位于HE酯酶和凝集素结构域之间,可能对HE的受体结合功能产生影响;并且这10株重组毒株来自4个省8个牛场,表明这种重组毒株已在国内广泛流行。这是首次在奶牛中发现BCoV HE重组事件,也是首次在国内对奶牛BCoV进行分子检测,有助于进一步了解BCoV的流行和遗传进化,为国内奶牛腹泻的防控提供了重要参考。2.奶牛冠状病毒的基因组研究为进一步研究奶牛BCoV HE重组毒株的分子特征,根据GenBank中公布BCoV基因序列设计了44对引物,扩增BCoV SWUN/A10/2018分离株的基因序列,使用SEQMAN软件（version 7.0;DNASTAR Inc.,WI,USA）组装病毒基因组,分析其基因组特征。结果表明,该毒株完整基因组全长为31028 bp,G+C%的含量为37.0%。该分离株与GenBank中唯一的国内BCoV毒株AKS-01遗传关系最近,其核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.0%和98.3%。与已知的全部177个BCoV完整S基因（包括本研究克隆的13个完整的S基因）相比,该毒株在S1区有一个独特的氨基酸突变（G411A）。该毒株HE基因在酯酶和凝集素结构域发生重组,并且在受体结合域R3-loop上有12个核苷酸的插入导致4个氨基酸插入。基于BCoV HE血凝素酯酶的晶体结构建立的3D模型显示,该毒株在R结构域与已知BCoV毒株相比变化明显。鉴于BCoV HE基因在病毒感染过程中参与受体识别和诱导中和抗体的产生,这种HE基因独特的变化可能对其功能的产生影响。这是首次发现BCoV HE基因受体结合域的氨基酸插入事件,对深入了解牛BCoV的遗传进化有重要意义。3.基于重组N蛋白检测BCoV抗体的间接ELISA试剂盒的研制对国内BCoV流行毒株N基因序列进行大肠杆菌的密码子偏好性优化,合成两端增加酶切位点BamH1和Xho1的N基因编码框序列,构建了pET28H表达质粒,转化Rosetta（DE3）中进行了表达。结果表明,BCoV N基因在DE3表达系统中获得了高效表达,Western blot检测证明重组N蛋白具有良好的反应原性。以纯化的N蛋白作为包被抗原,通过反应体系和反应条件的优化,成功建立了基于重组N蛋白的间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性和稳定性,灵敏度高。在此基础上组装的试剂盒与瑞典Svanova公司商品化冠状病毒抗体检测试剂盒的符合率为100%。对来自川西北571份牦牛血清进行了BCoV抗体检测,阳性率为98.1%,表明川西北牦牛的BCoV感染非常普遍,为牦牛腹泻的防控提供了参考。
段进刚,雷程红,葛婷,阿热阿依·海依拉提,卞赛赛,高窦,代婧[9]（2018）在《牛病毒性腹泻病诊断技术的研究进展》文中研究指明牛病毒性腹泻病（BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种牛重要传染病,该病以腹泻、急慢性黏膜病、免疫耐受和持续感染、免疫抑制、繁殖障碍等为主要特征。由于该病分布广泛,世界大多数养牛国家都存在,并且该病的防控尚无有效的牛病毒性腹泻病毒疫苗,给世界养牛业带来了巨大的经济损失。目前,用于诊断牛病毒性腹泻病毒的方法很多,病原学检测主要用电镜技术和病毒分离鉴定,血清学诊断主要有琼脂扩散试验、微量中和试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验,分子生物学诊断技术主要有聚合酶链式反应技术、实时荧光定量聚合酶链式反应技术、环介导等温扩增技术和数字聚合酶链式反应技术。文章就近年来国内外对该病在分子生物学诊断技术方面的最新研究成果进行了简要介绍。
段进刚,樊新丽,葛婷,卞赛赛,高窦,代婧,阿热阿依·海依拉提,雷程红[10]（2017）在《荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较》文中指出为建立一种快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）的方法,试验采用RT-LAMP和荧光定量RT-PCR两种检测方法,与通用RT-PCR方法在特异性、灵敏性、样品检出率、试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单程度和检测成本高低七个方面对BVDV进行了综合性比较分析。结果表明:试验建立的RT-LAMP方法与荧光定量RT-PCR、通用RTPCR方法相比具有特异性强、灵敏度高、样品检出率和扩增反应效率高、操作简便快速、低成本等特点。说明RT-LAMP方法对快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病、防止疫情的扩散具有重要意义。
二、应用RT-PCR试验诊断牛BCV感染（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用RT-PCR试验诊断牛BCV感染（论文提纲范文）
（1）兔轮状病毒、兔肠冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品、病毒及菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 核酸提取及反转录 |
| 1.5 PCR扩增 |
| 1.6 特异性试验 |
| 1.7 敏感性试验 |
| 1.8 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 双重RT-PCR体系的构建及优化 |
| 2.2 特异性试验 |
| 2.3 敏感性试验 |
| 2.4 临床样本检测 |
| 3 讨论 |
（2）牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛病毒性腹泻病概述 |
| 2 BVDV病原学特性 |
| 2.1 病毒培养及理化性质 |
| 2.2 病毒分型 |
| 3 BVDV分子生物学特性 |
| 3.1 病毒基因组 |
| 3.2 病毒的结构蛋白 |
| 3.3 病毒的非结构蛋白 |
| 3.4 病毒生物型NCP向CP转化 |
| 4 流行病学与临床表现 |
| 4.1 流行病学 |
| 4.2 流行特点 |
| 4.3 临床表现 |
| 4.4 BVDV感染对机体免疫系统的影响 |
| 5 BVDV检测技术 |
| 5.1 病原学检查 |
| 5.2 免疫学诊断技术 |
| 5.3 分子生物学检查技术 |
| 6 防控措施 |
| 6.1 预防与治疗 |
| 6.2 疫苗免疫 |
| 6.3 牛场BVD的净化 |
| 7 研究内容及意义 |
| 第二章 BVDV结构蛋白的基因克隆及生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞、质粒和病毒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液及培养基配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒的增殖及滴度测定 |
| 2.2 C、E~(rns)、E1和E2 基因扩增 |
| 2.3 目的基因克隆及序列测定 |
| 2.4 目的基因及蛋白的生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的增殖 |
| 3.2 病毒TCID_(50)测定 |
| 3.3 C、E~(rns)、E1和E2 基因全序列扩增 |
| 3.4 C、E~(rns)、E1和E2 生物学信息分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 BVDV N~(pro)、E~(rns)蛋白的真核表达 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 N~(pro)和E~(rns)基因扩增 |
| 2.2 真核表达载体的构建及双酶切鉴定 |
| 2.3 N~(pro)和E~(rns)蛋白真核表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 BVDV N~(pro)、E~(rns)基因PCR扩增 |
| 3.2 菌液PCR筛选 |
| 3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.4 转染细胞目的基因检测 |
| 3.5 Western blot蛋白表达验证 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 BVDV三种核酸检测方法的建立、比较与应用 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计合成 |
| 2.2 临床样品处理 |
| 2.3 重组质粒标准品的构建 |
| 2.4 RT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.5 qRT-PCR方法的建立及条件优化 |
| 2.6 RT-LAMP方法的建立及条件优化 |
| 2.7 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2 qRT-PCR检测方法的建立 |
| 3.3 RT-LAMP检测方法的建立 |
| 3.4 BVDV三种核酸检测方法的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（3）河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及BVDV抗体检测方法建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 犊牛腹泻病及四种传染性病原的研究进展 |
| 1.1.1 犊牛腹泻病的E.coli的研究进展 |
| 1.1.2 BVDV引起的犊牛腹泻病的研究进展 |
| 1.1.3 BCoV引起的犊牛腹泻病的研究进展 |
| 1.1.4 BRV引起的犊牛腹泻病的研究进展 |
| 1.2 研究的目的及意义 |
| 第二章 河北地区致肉犊牛腹泻四种病原流行病学调查 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 肉犊牛腹泻样品采集及来源 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂与试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 肉犊牛腹泻样品中致病E.coli的分离鉴定 |
| 2.2.2 肉犊牛腹泻样品中三种病毒病原的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 患腹泻病肉犊牛临床症状 |
| 2.3.2 河北地区肉犊牛腹泻四种病原总检出情况 |
| 2.3.3 肉犊牛腹泻E.coli的分离鉴定 |
| 2.3.4 致肉犊牛腹泻三种病毒病原的检测 |
| 2.3.5 河北地区肉犊牛四种病原混合感染情况 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒E~(rns)蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 病毒株、质粒、血清 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 E~(rns)蛋白的基因扩增及分析 |
| 3.2.2 E~(rns)蛋白的原核表达 |
| 3.2.3 重组His-E~(rns)蛋白的浓度测定 |
| 3.2.4 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法建立 |
| 3.2.5 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法的应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 E~(rns)蛋白的基因扩增及分析 |
| 3.3.2 E~(rns)蛋白的原核表达 |
| 3.3.3 重组His-E~(rns)蛋白的浓度测定 |
| 3.3.4 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法建立 |
| 3.3.5 BVDV的 E~(rns)抗体间接ELISA检测方法的应用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 论文受资助情况 |
| 致谢 |
（4）牛轮状病毒的分离鉴定和诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 轮状病毒 |
| 1.1.1 轮状病毒概述 |
| 1.1.2 轮状病毒的传播 |
| 1.1.3 轮状病毒的致病机理 |
| 1.1.4 轮状病毒的疫苗研究进展 |
| 1.2 牛轮状病毒 |
| 1.2.1 牛轮状病毒流行病学 |
| 1.2.2 牛轮状病毒的临床表现 |
| 1.2.3 牛轮状病毒的培养特性 |
| 1.3 牛轮状病毒的诊断 |
| 1.3.1 常规PCR检测 |
| 1.3.2 荧光定量PCR检测 |
| 1.3.3 ELISA检测 |
| 1.3.4 LAMP检测 |
| 1.3.5 其他检测 |
| 1.4 目的意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 细胞及抗体 |
| 2.1.3 主要试剂和配方 |
| 2.1.4 主要试剂及耗材 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 BRV CH-HB-BD株的分离与鉴定 |
| 2.2.2 BRV CH-HB-BD株VP6基因序列分析 |
| 2.2.3 VP6基因原核表达载体的构建及诱导表达 |
| 2.2.4 BRV VP6蛋白IgG抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.2.5 牛轮状病毒和牛冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 BRV临床检测结果 |
| 3.2 病毒分离鉴定 |
| 3.2.1 细胞病变鉴定 |
| 3.2.2 细胞毒RT-PCR鉴定 |
| 3.2.3 TCID_(50)的测定 |
| 3.2.4 病毒的理化特性结果 |
| 3.3 BRV CH-HB-BD株VP6基因序列分析 |
| 3.3.1 BRV CH-HB-BD株VP6基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 VP6基因序列分析 |
| 3.3.3 BRV CH-HB-BD株VP6基因序列变异情况分析 |
| 3.3.4BRV CH-HB-BD株VP6氨基酸变异情况分析 |
| 3.4 BRV VP6蛋白IgG抗体间接ELISA方法的建立 |
| 3.4.1 VP6蛋白表达引物的扩增 |
| 3.4.2 原核表达重组载体pET32a-VP6的构建及鉴定 |
| 3.4.3 ELISA检测方法条件的确定及优化 |
| 3.5 TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.5.1 BRV和BCV重组质粒标准品的鉴定结果 |
| 3.5.2 双重荧光定量PCR反应条件的优化结果及标准曲线的建立 |
| 3.5.3 特异性试验结果 |
| 3.5.4 敏感性试验结果 |
| 3.5.5 重复性试验结果 |
| 3.5.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BRV CH-HB-BD株的分离鉴定 |
| 4.2 BRV CH-HB-BD株VP6基因序列分析 |
| 4.3 BRV VP6蛋白IgG抗体间接ELISA方法的建立 |
| 4.4 牛轮状病毒和牛冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛结核病的概述 |
| 1.2 牛结核病的危害与防控 |
| 1.2.1 牛结核病的危害 |
| 1.2.2 国内外牛结核病的防控现状 |
| 1.3 牛结核病的诊断方法 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 尸检诊断 |
| 1.3.3 组织病理学诊断 |
| 1.3.4 免疫学诊断 |
| 1.3.5 分子生物学诊断 |
| 1.4 牛结核病诊断标志物的研究进展 |
| 1.5 RNA测序技术概况 |
| 1.6 目的与意义 |
| 第二章 不同感染状态结核病牛外周血淋巴细胞转录组学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂与耗材 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品制备 |
| 2.2.2 测序文库构建和转录组测序 |
| 2.2.3 高通量测序数据处理及差异表达基因的筛选 |
| 2.2.4 不同感染状态结核病牛差异表达基因分析 |
| 2.2.5 应用qRT-PCR验证转录组数据 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 实验动物的筛选及测序样品的制备 |
| 2.3.2 高通量测序相关质控结果 |
| 2.3.3 差异表达基因的识别 |
| 2.3.4 非刺激条件下不同感染状态结核病牛PBMCs差异表达基因的筛选与分析 |
| 2.3.5 PPD-B刺激条件下不同感染状态结核病牛PBMCs差异表达基因的筛选与分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 牛结核病分子标志物的筛选及验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂与耗材 |
| 3.1.2 主要设备和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 牛结核病分子标志物的筛选 |
| 3.2.2 牛结核病分子标志物的扩群验证 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛结核病分子标志物的筛选 |
| 3.3.2 牛结核病分子标志物的扩群验证 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 牛分枝杆菌感染BALB/c鼠模型的建立及分子标志物的验证 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 主要设备和仪器 |
| 4.1.4 主要试剂的配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株的复苏与定量 |
| 4.2.2 感染模型的建立 |
| 4.2.3 样品采集及处理 |
| 4.2.4 脏器载菌量测定 |
| 4.2.5 小鼠脾淋巴细胞分离及体外刺激培养 |
| 4.2.6 脾细胞总RNA提取 |
| 4.2.7 反转录 |
| 4.2.8 荧光定量PCR |
| 4.2.9 小鼠IL-8 ELISA |
| 4.2.10 小鼠CRP ELISA |
| 4.2.11 小鼠C1q ELISA |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体重及主要脏器系数监测 |
| 4.3.2 主要脏器病变及组织病理学观察 |
| 4.3.3 感染小鼠肺、脾的载菌量 |
| 4.3.4 牛结核病分子标志物验证 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）牛病毒性腹泻病原的分子生物学与检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 牛病病毒性腹泻的主要致病病毒 |
| 1.1 牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV) |
| 1.2 牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV) |
| 1.3 牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV) |
| 1.4 牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEnV) |
| 1.5 牛凸隆病毒（Bovine torovirus,BToV) |
| 1.6 牛诺如病毒（Bovine norovirus,BNoV) |
| 1.7 牛纽布病毒（Bovine nebovirus,BNebV) |
| 1.8 牛星状病毒（Bovine astrovirus,BoAstV) |
| 1.9 牛嵴病毒（Bovine kobuvirus/aichivirus B,BKoV) |
| 2 诊断技术 |
| 2.1 电镜技术 |
| 2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA) |
| 2.3 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR) |
| 2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) |
| 3小结 |
（7）牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 牛病毒性腹泻概述 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒概述 |
| 1.2.1 病原特性 |
| 1.2.2 BVDV基因组特征 |
| 1.2.3 BVDV的分型 |
| 1.3 BVDV E2蛋白的研究进展 |
| 1.4 BVD诊断技术研究进展 |
| 1.4.1 病毒学检测技术 |
| 1.4.2 血清学检测 |
| 1.5 鉴定PI牛的诊断策略 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 血清及质粒 |
| 2.1.2 主要试验耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 溶液的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 E2基因生物信息学分析 |
| 2.2.2 E2基因密码子优化合成及重组载体的构建 |
| 2.2.3 E2基因诱导表达 |
| 2.2.4 E2蛋白的纯化 |
| 2.2.5 Western Blot鉴定 |
| 2.2.6 E2蛋白的透析及浓缩 |
| 2.2.7 E2蛋白浓度的测定 |
| 2.2.8 Opti-E2 ELISA方法的建立 |
| 2.2.9 临界值的确定与IDEXX试剂盒的对比 |
| 2.2.10 特异性试验 |
| 2.2.11 重复性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 E2基因基本理化性质分析结果 |
| 3.2 Protean分析结果 |
| 3.3 E2基因密码子优化合成及鉴定结果 |
| 3.4 E2重组菌诱导表达结果 |
| 3.5 E2蛋白的纯化结果 |
| 3.6 Western Blot鉴定结果 |
| 3.7 E2蛋白的透析及浓缩结果 |
| 3.8 E2蛋白浓度的测定结果 |
| 3.9 Opti-E2 ELTSA方法的优化结果 |
| 3.9.1 方阵法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释浓度结果 |
| 3.9.2 最佳抗原包被液、包被条件的优化结果 |
| 3.9.3 最佳封闭液和封闭时间的优化结果 |
| 3.9.4 最佳血清稀释液和作用时间的优化结果 |
| 3.9.5 最佳酶标抗体的稀释液、工作浓度和作用时间的优化结果 |
| 3.9.6 最佳TMB作用时间的优化结果 |
| 3.9.7 ELISA最终反应条件的确定结果 |
| 3.9.8 临界值与IDEXX比较结果 |
| 3.10 特异性试验结果 |
| 3.11 重复性试验结果 |
| 3.11.1 蛋白批间重复试验结果 |
| 3.11.2 批内人员重复性试验结果 |
| 3.11.3 板间板内重复性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）奶牛冠状病毒的分子检测、基因组特征及ELISA试剂盒的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 牛冠状病毒流行特征及其S和HE基因的研究进展 |
| 1 牛冠状病毒的流行情况 |
| 1.1 牛冠状病毒引起的新生犊牛腹泻 |
| 1.2 牛冠状病毒引起的成年牛冬痢疾 |
| 1.3 牛冠状病毒引起的牛呼吸道疾病 |
| 1.4 牛冠状病毒国内外的流行情况 |
| 1.5 牛冠状病毒跨中间传播 |
| 2 牛冠状病毒S蛋白的研究进展 |
| 2.1 牛冠状病毒S蛋白的分子特征 |
| 2.2 牛冠状病毒S蛋白的功能 |
| 3 牛冠状病毒HE蛋白的研究进展 |
| 3.1 牛冠状病毒HE蛋白的起源 |
| 3.2 牛冠状病毒HE蛋白的分子特征 |
| 3.3 牛冠状病毒HE蛋白功能 |
| 4 小结 |
| 第二章 国内部分省区奶牛冠状病毒分子检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床样本 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物的设计与合成 |
| 1.5 RNA的提取与c DNA的合成 |
| 1.6 BCoV阳性质粒的制备 |
| 1.7 PCR扩增与测序 |
| 1.8 序列的拼接及进化关系分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 2017 ~2018 年中国部分省区奶牛BCo V分子流行学调查 |
| 2.2 BCoV S、HE、N和 M完整基因的克隆结果 |
| 2.3 BCoV S、HE、N和 M基因序列、系统发育和重组分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 部分省区奶牛BCoV的病原流行病学 |
| 3.2 BCoV S、HE、N和 M基因的分子特征 |
| 4 小结 |
| 第三章 奶牛冠状病毒SWUN/A10/2018 的基因组研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒样本 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物的设计与合成 |
| 1.5 病毒RNA的提取与c DNA的合成 |
| 1.6 BCoV阳性质粒的制备 |
| 1.7 PCR扩增与测序 |
| 1.8 全基因序列的拼接及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 分离株SWUN/A10/2018 基因组序列及结构特征 |
| 2.2 分离株SWUN/A10/2018 毒株S基因分子特征 |
| 2.3 分离株SWUN/A10/2018 毒株HE基因分子特征 |
| 2.4 分离株SWUN/A10/2018 毒株N、M和 E基因分子特征 |
| 2.5 分离株SWUN/A10/2018 毒株ORF1a和 ORF1b基因分子特征 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SWUN/A10/2018 基因组特征 |
| 3.2 SWUN/A10/2018 S基因的分子特征 |
| 3.3 SWUN/A10/2018 HE基因变异 |
| 4 小结 |
| 第四章 基于重组N蛋白检测BCoV抗体的间接ELISA试剂盒的研发 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要质粒、试验用血清 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 BCoV重组N蛋白的表达 |
| 1.5 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化 |
| 1.6 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定 |
| 1.7 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价 |
| 1.8 试剂盒的组装 |
| 1.9 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组原核表达载体的构建结果 |
| 2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE凝胶电泳结果 |
| 2.3 表达蛋白的回收、纯化及Western blot鉴定结果 |
| 2.4 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化结果 |
| 2.5 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定结果 |
| 2.6 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价结果 |
| 2.7 试剂盒的组装结果 |
| 2.8 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BCoV的间接ELISA方法 |
| 3.2 BCoV的重组N蛋白的表达 |
| 3.3 基于重组N蛋白检测BCo V抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 4 小节 |
| 结论及创新 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）牛病毒性腹泻病诊断技术的研究进展（论文提纲范文）
| 1 聚合酶链式反应技术 |
| 1.1 PCR检测BVDV的研究进展 |
| 1.2 PCR技术的优缺点 |
| 2 实时荧光定量PCR技术 |
| 2.1 实时荧光定量PCR检测BVDV的研究进展 |
| 2.2 实时荧光定量PCR技术的优缺点 |
| 3 环介导等温扩增技术 |
| 3.1 环介导等温扩增技术检测BVDV的研究进展 |
| 3.2 环介导等温扩增技术的优缺点 |
| 4 数字PCR技术 |
| 4.1 数字PCR检测技术的研究进展 |
| 4.2 数字PCR技术的优缺点 |
（10）荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与病料 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 引物的设计和合成 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒RNA提取和模板制备 |
| 2.2 通用RT-PCR |
| 2.3 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 |
| 2.4 RT-LAMP反应条件的优化 |
| 2.5 通用RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP特异性比较试验 |
| 2.6 通用RT-PCR、实时定量RT-PCR和RT-LAMP灵敏性比较试验 |
| 2.7 通用RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP样品检出率比较试验 |
| 2.8 通用RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测方法综合比较 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 通用RT-PCR |
| 3.2 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.3 RT-LAMP反应条件的优化 |
| 3.4 通用RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP特异性比较试验 |
| 3.5 通用RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP灵敏性比较试验 |
| 3.6 通用RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP样品检出率比较试验 |
| 3.7 通用RT-PCR、荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测方法综合比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
四、应用RT-PCR试验诊断牛BCV感染（论文参考文献）
- [1]兔轮状病毒、兔肠冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 赵巧雅,宋丹丹,刘丽萍,郭效珍,刘存霞,盛媛,史玉颖,黄兵. 中国兽医学报, 2021(07)
- [2]牛病毒性腹泻病毒结构蛋白克隆表达及核酸检测方法的建立[D]. 拜小强. 西北民族大学, 2021(08)
- [3]河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及BVDV抗体检测方法建立[D]. 刘勃兴. 河北科技师范学院, 2021
- [4]牛轮状病毒的分离鉴定和诊断方法的建立[D]. 彭志豪. 河北农业大学, 2021(06)
- [5]基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证[D]. 房立春. 中国农业科学院, 2020
- [6]牛病毒性腹泻病原的分子生物学与检测技术研究进展[J]. 耿金静,魏锁成. 西北民族大学学报(自然科学版), 2020(01)
- [7]牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA方法的建立[D]. 赵洪哲. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [8]奶牛冠状病毒的分子检测、基因组特征及ELISA试剂盒的研制[D]. 阿比克哈莫（Keha ABI）. 西南民族大学, 2019
- [9]牛病毒性腹泻病诊断技术的研究进展[J]. 段进刚,雷程红,葛婷,阿热阿依·海依拉提,卞赛赛,高窦,代婧. 黑龙江畜牧兽医, 2018(01)
- [10]荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较[J]. 段进刚,樊新丽,葛婷,卞赛赛,高窦,代婧,阿热阿依·海依拉提,雷程红. 黑龙江畜牧兽医, 2017(19)