一、抗Ⅰ型菌毛单克隆抗体抗粘附作用机制的研究（论文文献综述）
王思权[1]（2021）在《抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体制备的一种简捷方法与初步应用》文中指出沙门氏菌（Salmonella）是全世界面临挑战的传染性人畜共患病原菌,主要通过消化道感染,主要存在于宿主肠道,可引起腹泻、呕吐等疾病,至今已发现沙门氏菌包含2600多种血清型,不仅给养殖业带来较大损失,还对人类健康和全球公共卫生构成一定威胁。准确而快速的沙门氏菌诊断方法,是防止该病的关键。沙门氏菌Peg菌毛通过介导细菌与宿主黏附定植的互作,作为影响沙门氏菌致病性的重要黏附定植因子存在于D群沙门氏菌如鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型中,而上述三种病原菌严重影响家禽业的发展;鉴于展呈Peg菌毛后细菌自身的颗粒抗原性,使其有望成为检测沙门氏菌的潜在靶标。单克隆抗体由于其特异性强、纯度高、均一性好等优点,在病原检测和疾病诊断方面显示出极大的优势。传统单克隆抗体制备程序较为繁琐,本研究旨在以一种简便快捷的方式制备抗沙门氏菌Peg菌毛蛋白的单克隆抗体,并建立可检测鸡白痢沙门氏菌的玻板凝集方法。具体内容如下:1.抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体的简捷制备方法为研发沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体,本研究首次利用实验室构建的一种S9H-Peg靶标抗原重组菌株（其中S9H是一种泛性惰性载体菌株,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCCNo.2091）作为免疫原,调整浓度至5×109 cfu/mL对6周龄BALB/c小鼠进行免疫,不需添加任何佐剂,剂量100μL/只,共免疫4次,每次间隔10 d。选取凝集抗体效价最高的3只小鼠,利用鼠杂交瘤细胞融合技术,获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。以S9H-Peg为阳性对照,以S9H作为阴性对照,通过玻板凝集试验技术筛选出能够产生特异性抗Peg菌毛单克隆抗体的5 株杂交瘤细胞,分别为:72-Ⅰ-F8、97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、112-Ⅱ-F5、152-Ⅰ-D4。连续传代40代,测试杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性,最终获得3株稳定分泌抗Peg菌毛单克隆抗体杂交瘤细胞,其细胞上清凝集效价经检测均可稳定在1:2,依次命名为:97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、152-Ⅰ-D4。分别制备小鼠腹水,并纯化。对三株单克隆抗体的特性进行测定包括:（1）抗体亚类测试,结果显示,三株单抗均为IgG2b/κ链;（2）抗体效价测定,玻板凝集法（S9H-Peg菌株作为凝集抗原,浓度为:5×109 cfu/mL）检测,结果显示,3株单克隆抗体效价分别为1:320、1:160和1:320;（3）特异性检测:①采用玻板凝集方法,利用实验室前期构建的,11种携带靶标抗原（包括沙门氏菌菌毛Peg、沙门氏菌菌毛Sef14、沙门氏菌菌毛Saf、沙门氏菌菌毛SipD、沙门氏菌Ⅰ型菌毛、大肠杆菌菌毛K88ac、大肠杆菌菌毛K99、大肠杆菌菌毛987P、大肠杆菌菌毛F18ab、大肠杆菌菌毛F18ac和大肠杆菌菌毛Sfm）的惰性载体菌株,对单克隆抗体的特异性进行验证。结果显示,三株单克隆抗体,都能够与Peg靶标（携带Peg菌毛的S9H-Peg）发生特异性凝集反应,而不与10种携带其他靶标抗原发生特异性凝集反应,与阴性对照菌株S9H（不携带Peg菌毛）也不发生凝集反应,显示了高度的特异性。②间接免疫荧光试验中,将所制备的单克隆抗体作为一抗,以羊抗鼠IgG-HRP为二抗,分别与S9H-Peg和S9H菌株对照共孵育,在荧光显微下观察,结果显示,制备的单抗能够特异性识别并结合S9H-Peg菌株,能够观察到菌体发绿色荧光;而不与S9H菌株对照结合,观察不到荧光。③Western blot分析显示,制备的单克隆抗体与表达Peg菌毛的阳性菌株（S9H-Peg）发生特异性反应,单克隆抗体可识别Peg菌毛的主要亚单位蛋白PegA,在20kDa处出现特异性条带;而与对照菌株S9H不发生反应,无特异性条带产生。本研究采用简捷方法成功制备了针对沙门氏菌Peg菌毛的单克隆抗体,该方法的简捷性主要体现在以下几个方面:（1）免疫原制备的简便（无需进行抗原的抽提或原核表达与蛋白纯化等复杂过程）;（2）免疫程序简单、耗时短,且无需佐剂;（3）抗体筛选过程方便快捷（仅需进行玻板凝集测试,而无需进行ELISA检测等复杂流程）。一定程度的简化了单克隆抗体的制备流程,减少了工作量,提高了单克隆抗体的制备效率。2.鸡白痢沙门氏菌玻板凝集检测方法的建立和初步应用上一章研究中成功获得了三种针对沙门氏菌Peg菌毛的单克隆抗体,经测试,三株单抗均具有玻板凝集特性,且前期试验表明,三株单抗叠加使用由于靶标抗原多个结合决定族,可以使抗原抗体结合更充分,提高反应敏感性,所以效果优于单独使用。基于上述试验背景,本章利用第一章制备的三株单克隆抗体（97-Ⅰ-E4、97-Ⅱ-B9、152-I-D4）,经稀释1:100倍,混合后建立了鸡白痢沙门氏菌玻板凝集方法。首先,对建立方法的敏感性进行测试,结果显示,该方法对鸡白痢沙门氏菌NCTC5776纯培养物的检出限为104cfu/反应。其次,对所建立检测方法的特异性进行验证,通过玻板凝集试验,利用表达Peg菌毛的沙门氏菌（包括:鸡白痢沙门氏菌NCTC5776、鸡白痢沙门氏菌ATCC700623）、不表达Peg菌毛的沙门氏菌（包括:鼠伤寒沙门氏菌STM 43-3、鼠伤寒沙门氏菌W32、圣保罗沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌36、猪霍乱沙门氏菌29、猪霍乱沙门氏菌U80、田纳西沙门氏菌）以及非沙门氏菌（包括:大肠杆菌APEC TW-XM、大肠杆菌ETEC C83901、大肠杆菌ETEC C83902、大肠杆菌ETEC C83903、大肠杆菌ETEC987P、大肠杆菌ETEC987P、大肠杆菌ETEC987P-X进行测试）,结果显示,该方法能够特异性检测表达Peg菌毛的沙门氏菌,而与不表达Peg菌毛的沙门氏菌及非沙门氏菌不存在任何交叉反应,特异性好。接着,进一步对该方法的临床应用进行了初步探索:（1）对模拟污染无菌饮用水的检测,向样品中人工污染不同浓度的沙门氏菌,再用所构建的方法进行检测,结果显示,当样品中污染量为102cfu/mL时,即可在预增菌后通过本方法检出鸡白痢沙门氏菌;（2）对模拟污染鸡饲料样品的检测,向无菌无抗生素的饲料样品中添加鸡白痢沙门氏菌NCTC5776单细菌。增菌后,对模拟污染的饲料进行检测,结果显示,经10小时增菌,该方法能够检测出饲料中的鸡白痢沙门氏菌污染,敏感度为4×104cfu/反应;（3）对临床疑似鸡白痢沙门氏菌感染的18只病鸡进行剖检病检测,无菌环境下研磨病灶脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胆囊）制备样品,分别用传统方法和本研究构建的方法对样品中的沙门氏菌进行检测。结果表明,经过预增菌过程,应用建立的玻板凝集方法,从18份样品中共检出5份鸡白痢沙门氏菌阳性样品,经传统分离鉴定方法复检,二者结果相符。此外,传统分离鉴定方法过程较为繁琐,而本方法仅需对样品进行前增菌,即可用于检测,且玻板凝集反应仅需2min即可得到结果,方便快捷。显示了本方法良好的实用性。综上,利用实验室构建的S9H-Peg靶标抗原重组菌株,建立了一种单克隆抗体制备的简捷方法,该方法在抗原准备、免疫程序以及杂交瘤细胞筛选方面,均显示了极大的简便性。利用该方法,成功制备出3株针对沙门氏菌Peg菌毛的特异性凝集性单克隆抗体。此外,以三株单抗作为检测抗体,利用玻板凝集的方式建立鸡白痢沙门氏菌的快速检测方法,该方法特异性强、敏感度高。而后进行了人工模拟污染样品检测和临床样品检测,比较传统国标检测方法,新建立的方法能够实现对鸡白痢沙门氏菌的快速、准确检测。本研究提供了将携带外源抗原（Peg）的惰性载体应用于单克隆抗体制备与筛选的成功案例,为单克隆抗体的制备策略提供了新的思路与现实依据。同时,为以Peg菌毛为靶标的鸡白痢沙门氏菌诊断技术提供了物质材料与试验基础。
李茜[2]（2021）在《APEC O1型E516摄铁基因c2515和c2516缺失株的生物学特性及C2515单克隆抗体的研制》文中提出禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是在禽类中广泛传播,可引起禽类严重的局部和/或全身性感染的重要肠道外致病菌,给养禽业造成巨大经济损失。APEC抗原分型复杂多样,一般以O抗原为主要分型依据,常见致病性菌株包括O1、O2、O78等血清型。在肠外环境中摄取铁的能力是APEC生存的前提,为了适应贫铁环境,APEC进化出多种铁摄取系统,以满足对铁的需求,包括:SitABCD铁转运系统,血红素,肠菌素、气杆菌素、沙门菌素和耶尔森菌素等铁载体系统,然而这些铁摄取系统的许多组成部分功能仍不清楚。前期研究对本室分离、鉴定、保存的APEC O1型强毒株E516菌株进行基因组测序,以本室分离、鉴定、保存的E058（02）和E522（O78）菌株基因组序列为参考,发现了只存在于E516菌株而不存在于E058（02）和E522（O78）菌株的两个假定的铁转运基因,由于它们与尿道致病性大肠杆菌CFT073的c2515（768bp）和c2516（1059bp）基因100%同源,因此我们亦将其命名为c2515和c2516。在本研究中,我们构建了 E516 c2515和c2516基因缺失株及回补株,并通过体外和体内试验研究了它们的生物学特性和致病性。本研究通过逆转录PCR（RT-PCR）、生长特性测定、CAS试验、HD11胞内存活试验、致病性试验等方法,分析了c2515、c2516基因功能及各菌株生物学特性。RT-PCR分析表明破坏目标基因阅读框可终止其转录;CAS试验显示E516Δc2515、E516△c2516和E516Δc2515Δc2516产生铁载体的能力较E516相比有所减弱;生长曲线显示各缺失株生长速度在贫铁条件下较野生株缓慢,而在补铁后及普通LB培养基中生长速度基本一致;铁摄取试验显示与野生菌E516相比,各缺失株胞内铁含量降低;细胞感染试验表明,HD11细胞更容易清除铁摄取缺陷型的突变株。上述各试验中双基因缺失株E516Δc2515△c2516与野生株E516相比差异最为显着,E516Δc2515次之,E516Δc2516差异较小。1日龄SPF鸡半数致死量（LD50）及细菌体内定殖试验显示,与野生菌株相比,c2515和c2516基因的缺失影响了 E516菌株在鸡组织中的定殖能力,并且双基因缺失株比野生株毒力下降10倍左右。荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明,在E516Δc2515Δc2516双基因缺失株中,铁摄取相关基因entA,fepC和iutA的转录水平显着低于野生株。总体而言,c2515和c2516可能参与铁载体介导的铁摄取并参与APEC O1菌株E516的致病过程。以上结果提示c2515基因对E516毒力影响更大,为了从蛋白水平研究该基因的功能,我们研制了 C2515蛋白的单克隆抗体（Monoclonalantibody）。通过构建原核表达载体pET11b-c2515-His并导入E.coli BL21（DE3）,诱导表达后,对包涵体形式表达的重组蛋白进行尿素梯度变复性,纯化得到蛋白分子量为28.2 kDa的重组蛋白,与预期一致。C2515蛋白免疫BALB/c小鼠,经过方阵滴定试验,确定间接ELISA（Enzyme linked immunosorbent assay）的最佳适包被抗原浓度为:1.5 μg/mL,选择血清抗体效价最高的小鼠进行细胞融合,经三次亚克隆筛选出3株能稳定分泌C2515特异性抗体的杂交瘤细胞株:1C4、3D6、4B9,经抗体亚类试剂盒鉴定,1C4属于IgG2b亚类,3D6、4B9属于IgG1亚类,3株均属于κ轻链。Western blot结果表示,3株单克隆抗体均可与免疫原C2515蛋白特异性结合,并只能在E516菌株中检测出天然C2515蛋白而在E058和E522中未检测出,与PCR检测结果一致。C2515单抗的获得为其后续功能研究提供了可靠材料,也为进一步研究其在铁摄取系统中的作用奠定了基础。
海永慧[3]（2021）在《牛源致脑炎大肠杆菌多表位抗原的制备及免疫效果评价》文中指出目的:筛选牛源致脑炎大肠杆菌S9922 FimD、PilN和PilV蛋白的优势B细胞表位,将筛选出的优势B细胞表位序列进行串联优化,构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,并进行诱导表达和纯化。用重组蛋白免疫动物后,进行免疫保护效果评价。方法:采用生物信息学分析工具Prot Param、TMHMM、Net Phos、DNAstar软件、S OPMA、SWISS-MODEL、Bepi Pred、Immunomedicine Group等对FimD、PilN和PilV蛋白进行理化性质、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构和B细胞表位预测,并进行综合分析,最终得出优势B细胞表位。串联牛源致脑炎大肠杆菌S9922 FimD、PilN和PilV蛋白优势B细胞表位,并进行序列优化。构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,并转化到BL21（DE3）大肠杆菌中进行表达,利用PCR技术和双酶切技术进行鉴定。转化后的BL21（DE3）大肠杆菌,加入IPTG,在细菌振荡培养箱中以37℃,180 rpm进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳,分析重组蛋白的表达形式,并进行重组蛋白纯化,用Western-blot进行检测。制备弗氏佐剂与重组蛋白混合多表位疫苗,免疫小鼠后,制备鼠多克隆抗血清,利用间接ELISA方法检测抗体效价;测定牛源致脑炎大肠杆菌S9922 LD50,进行攻毒保护试验,记录小鼠攻毒后7天内的整体状况,并进行肝脏、脾脏和脑载菌量测定。结果:对FimD、PilN和PilV蛋白进行理化性质、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构等多种参数综合分析得到最终的优势B细胞表位,FimD蛋白:7-18、144-152、307-315、365-373;PilN蛋白:77-86、138-149、516-524;PilV蛋白:265-275、312-323、402-415。成功构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western-blot结果显示出现一条特异性条带,与预期的重组蛋白大小相符;制备的小鼠多克隆抗血清效价高达1:204800,Western-blot结果显示该血清可与重组表达蛋白发生特异性反应;试验组小鼠攻毒后存活率为66%;对照组小鼠肝脏、脾脏和脑载菌量均显着高于试验组。结论:本试验通过对牛源致脑炎大肠杆菌S9922 FimD、PilN和PilV蛋白进行综合分析,最终得出优势B细胞表位,成功构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,重组蛋白以包涵体形式表达,制备多表位疫苗后,对其进行免疫效果的评价,结果显示该疫苗可以提高小鼠对牛源致脑炎大肠杆菌S9922的免疫力,可为牛源致脑炎大肠杆菌多表位疫苗的进一步研究奠定基础。
高嵩[4]（2020）在《Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中的作用与机制研究》文中研究说明蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus,B.cereus）是一种机会致病菌,可引起食源性疾病,主要症状是呕吐和腹泻。除此之外,对于免疫功能低下甚至免疫功能正常的人群,蜡样芽孢杆菌还可引起局部或全身性的非胃肠道感染。这些非胃肠道感染包括菌血症,肺炎,眼内炎,中枢神经系统感染等。在有些情况下,蜡样芽孢杆菌感染甚至会引起患者死亡,特别是对于出现菌血症的患者死亡率会更高。乳糖三糖糖苷脂（Globotriaosylceramide,Gb3）,又被称为CD77,是一种重要的细胞表面分子,可以与多种病原体组分结合,如志贺毒素,大肠杆菌P型菌毛,猪链球菌Fhb,铜绿假单胞菌的凝集素I（Lec A）等,在多种细菌感染过程中发挥重要作用。尽管Gb3在不同病原体感染期间发挥的功能不尽相同,我们推测Gb3可能是多种细菌共用识别受体,但是Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中是否发挥作用,以及如果发挥作用其作用机制是什么尚不清楚。为了回答以上科学问题,我们利用Gb3缺失小鼠建立蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,发现Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染。之后筛选鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合。粘附实验证明了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用有助于蜡样芽孢杆菌粘附。利用蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株和抗鞭毛蛋白抗体,通过小鼠体内实验发现,在Gb3存在的情况下,鞭毛蛋白参与了蜡样芽孢杆菌感染小鼠的过程,并且抗鞭毛蛋白抗体具有免疫保护作用,最后我们还对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究。本研究主要实验内容和结果包括以下三部分。一、Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染为了探究Gb3在蜡样芽孢杆菌HN001感染小鼠中的作用,我们利用Gb3缺失小鼠建立蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,结果发现,Gb3缺失小鼠的死亡率、脏器细菌载量和血清内细胞因子IL-1β,IL-6、TNFα均显着低于野生型小鼠,这说明Gb3促进了蜡样芽孢杆菌导致的急性感染。为了研究蜡样芽孢杆菌分泌的毒力因子对蜡样芽孢杆菌感染的影响,我们构建了毒力因子表达受到抑制的蜡样芽孢杆菌菌株HN001-Δplc R。然后再分别用HN001和HN001-Δplc R菌株及其培养菌液上清去感染小鼠,发现蜡样芽孢杆菌分泌的毒力因子是导致小鼠急性死亡的直接原因。然后,我们用HN001培养菌液上清分别注射野生型和Gb3缺失小鼠,两种小鼠均发生急性死亡,但之前实验用HN001感染野生型和Gb3缺失小鼠时Gb3缺失小鼠死亡率较低,这表明分泌型毒力因子介导的小鼠死亡可能并不是直接通过Gb3发挥作用。所以,我们推测蜡样芽孢杆菌某种表面成分与宿主细胞Gb3之间发生了相互作用。之后我们测定了蜡样芽孢杆菌对野生型和Gb3缺失型h CMEC/D3细胞的粘附能力,结果发现蜡样芽孢杆菌可能通过Gb3实现了粘附,这表明可能某种蜡样芽孢杆菌表面成分与宿主细胞Gb3之间发生了相互作用。二、蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与宿主细胞表面Gb3的相互作用Gb3作为细胞表面分子,可以嵌入细胞膜脂双层结构,但亲水的寡糖链可暴露在细胞膜外侧。Gb3的寡糖链包含Galα1-4Gal（galabiose）二糖结构,是多种病原体成分的结合位点。我们将含有Galα1-4Gal二糖结构的鸽卵类粘蛋白标记到磁珠上来钓取与之结合的蜡样芽孢杆菌表面蛋白,之后利用质谱技术鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可能是与Gb3结合的配体,并利用生物膜层表面干涉技术测定亲和常数进行了验证。然后利用流式细胞技术证明了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与细胞表面Gb3结合,并通过扫描电子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察蜡样芽孢杆菌可通过鞭毛粘附到细胞表面。为了研究蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用,我们构建了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株HN001-Δfla,并且利用Gb3合成抑制剂,鞭毛蛋白,Lec A,二糖Galα-4Gal处理进行粘附实验,结果发现HN001-Δfla组、处理组与对照组相比蜡样芽孢杆菌粘附能力显着降低,这说明鞭毛蛋白与细胞表面Gb3结合有助于蜡样芽孢杆菌的粘附。为了进一步探究鞭毛蛋白与Gb3的相互作用对蜡样芽孢杆菌感染小鼠的影响,我们分别用HN001和HN001-Δfla感染野生型小鼠和Gb3缺失小鼠。结果发现,对于野生型小鼠,HN001-Δfla感染组小鼠的死亡率、脏器细菌载量和血清中IL-1β,IL-6、TNFα水平均显着低于HN001感染组小鼠;而对于Gb3缺失小鼠,HN001-Δfla感染组与HN001感染组小鼠结果没有显着差异。这些结果说明在Gb3存在的情况下,鞭毛蛋白参与了蜡样芽孢杆菌感染小鼠的过程。目前被动抗体治疗已被用于治疗多种细菌感染性疾病,抗体的作用靶标包括细菌分泌的毒力因子和细菌表面分子,抗细菌抗体发挥作用方式之一就是抑制细菌的粘附。在本研究中,我们用蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白免疫新西兰兔,获取抗鞭毛蛋白血清,并纯化出抗鞭毛蛋白抗体。通过蜡样芽孢杆菌小鼠腹腔感染模型,探究抗鞭毛蛋白抗体对小鼠的保护作用,结果显示,抗鞭毛蛋白抗体处理组小鼠死亡率,脏器细菌载量和血清中IL-1β、IL-6和TNFα水平均显着降低,这表明抗蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白抗体可以缓解蜡样芽孢杆菌对小鼠的感染,在蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程中起到保护作用。三、蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶作用机制初步研究鉴于已发现蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合,我们对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究。文献报道大肠杆菌P型菌毛、志贺毒素与细胞表面Gb3结合后会使细胞神经酰胺含量显着升高,进而激活TLR4信号通路;重组表达的蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶Bc-SMase可以水解宿主细胞表面的鞘磷脂从而使神经酰胺含量升高,所以我们推测蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3结合后,可能通过其产生的Bc-SMase水解细胞表面鞘磷脂从而产生神经酰胺。因此我们构建了Bc-SMase敲除株HN001-Δsmase,并发现蜡样芽孢杆菌感染细胞时Bc-SMase可以使细胞神经酰胺水平明显升高,并且此过程是依赖于Gb3的存在,这说明其可能是通过Bc-SMase使神经酰胺升高从而激活相关信号通路介导宿主炎症反应,但还有待于进一步研究证实。在本研究中我们发现了Gb3可以促进蜡样芽孢杆菌导致的急性感染,筛选鉴定出了蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白可以与Gb3结合,并且这种相互作用有助于蜡样芽孢杆菌粘附。除此之外还发现鞭毛蛋白与Gb3的相互作用可能还参与了蜡样芽孢杆菌对小鼠的感染过程,抗鞭毛蛋白抗体在蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程中能够起到保护作用。最后,我们还对鞭毛蛋白与Gb3结合后可能影响的信号通路进行了初步研究,发现其可能通过Bc-SMase使神经酰胺升高从而激活相关信号通路。总之,本研究除了证明蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与Gb3的相互作用之外,还为蜡样芽孢杆菌感染的防治提供了有价值的信息。
戴鼎震,崔生玲,程泽信,徐世永,茅慧华,陈玉华[5]（2017）在《运用生物信息分析软件筛选鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白粘附作用功能表位》文中研究指明本研究根据已发表的人源大肠杆菌1型菌毛fimH基因序列,以产1型菌毛菌株MG2（011）、YR5（078）、MG12（018）基因组DNA为模板,对大肠杆菌1型菌毛fimH基因进行了扩增并与国外同源菌株基因序列进行了比较。结果表明:核酸同源性分别为97.8%、99.7%、97.8%,氨基酸序列的相似性分别达到98.7%、99.3%、98.0%。运用DNASTAR对fimH蛋白二级结构图谱、抗原位点图谱、亲水性图谱进行预测分析,我们发现它们二级结构、抗原位点及亲水性基本相似,这说明fimH基因序列及氨基酸序列的变异并未影响fimH蛋白的结构。据此认为筛选fimH航原表位制备的抗体应该可以针对大部分的1型菌毛fimH蛋白起反应,本研究筛选了氨基酸序列第111124位的序列合成多肽,多肽纯度为81.0%。将合成的该序列多肽免疫小鼠制备单克隆抗体,用单克隆抗体进行了对带有1型菌毛的鸡大肠杆菌气管纤毛上皮的粘附抑制试验,结果显示该单抗对4个血清型的1型菌毛菌株的抑制效率达到了82.98%97.67%,说明该单抗可显着抑制1型菌毛大肠杆菌对鸡气管上皮的粘附,而未加单克隆抗体作用的鸡大肠杆菌对气管粘膜上皮的粘附度很高,二者差异极显着。试验结果表明,该多肽为与菌毛粘附作用密切的功能表位。
李丽丽[6]（2014）在《禽源大肠杆菌主要毒力因子的分子流行病学分析及F1与P菌毛单克隆抗体的制备》文中指出禽大肠杆菌病（Avian colibacillosis）是由大肠埃希氏菌的某些血清型引起的一种常见细菌性传染病。自1894年首次报道后,目前呈全球性分布,普遍存在感染及继发感染大肠杆菌病,给世界养禽业造成了严重的经济损失。近年来,在许多病原菌中发现了毒力岛（PAI）的存在,并可能与其毒力进化有关,使得大肠杆菌的致病力更具复杂性；因此做好鸡大肠杆菌的检测与毒力分析十分必要。菌毛是大肠杆菌的重要毒力因子,建立快速特异的检测方法,尤其是研制其单克隆抗体,将有助于禽大肠杆菌菌毛的特性分析。本研究根据文献合成了检测大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（E. coli type three secretion system2, ETT2）毒力岛、肠细胞脱落位点（locus of enterocyte effacement, LEE）毒力岛、耶尔森菌强毒力岛（high-pathogenicity island,HPI）、F1菌毛和P菌毛基因的八对引物。采集江苏省苏北地区疑似大肠杆菌感染病鸡（41例）的病料,运用所合成的引物进行PCR快速检测,结果表明其中4例（9.76%）为LEE+大肠杆菌感染、22例（53.7%）为HPI+大肠杆菌感染、10例（24.4%）为Pap+菌毛大肠杆菌感染、20例（48.8%）为F1+菌毛大肠杆菌感染、17例（41.5%）为ETT2+大肠杆菌感染。通过比较后发现41例临床样品中有14种不同的毒力基因类型。此外,不同类型的大肠杆菌在不同脏器中具有相似的流行病学,在肺脏、十二指肠中,HPI+、ETT2+、Pap+、F1+携带率明显高于肝脏。通过分离获得137株大肠杆菌,检测发现其中56株（40.88%）为F1+大肠杆菌,10株（7.3%）为Pap+大肠杆菌,2株（1.5%）为LEE+大肠杆菌,35株（25.55%）为ETT2+大肠杆菌,34株（24.82%）为HPI+大肠杆菌及确定了分离株有11种不同的毒力因子类型。为了建立F1与P菌毛快速特异的检测方法,根据文献报道合成两对特异性引物,经PCR方法从研究一分离的鸡大肠杆菌菌株（CLu1223-3与CLu1220-6）中分别扩增出相应的基因片段。将两目的片段分别插入到原核表达载体PGEX-6p-1中,获得两个重组菌pGEX-PilA和pGEX-papA,测序结果表明与GenBank己收录的序列同源性分别为97%和100%。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,由SDS-PAGE分析证实PilA与papA基因获得了表达,重组蛋白分子量分别约为44ku和45ku。融合蛋白在大肠杆菌中都以包涵体的形式出现,通过Western-blot分析证明两种蛋白可与鼠抗GST标签单抗发生特异性结合,说明该融合蛋白具有较好的免疫原性。以大肠杆菌表达的重组蛋白（GST-PilA与GST-PapA）为抗原,以一定的免疫程序分别接种BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按常规杂交瘤技术进行融合,经间接ELISA筛选获得了稳定分泌的抗F1菌毛重组蛋白GST-PilA的杂交瘤细胞株D7、E6和抗P菌毛重组蛋白GST-PapA的杂交瘤细胞株F9；抗体亚类鉴定重链分别为IgG1、IgG1、 IgG2b,轻链均为Kappa型及其腹水抗体效价分别为1：64000、1：128000、1：64000。Western-blot特异性检测结果显示D7、E6分别能与鸡大肠杆菌F1菌毛提取物和F9单抗与P菌毛提取物反应,识别分子量为17-17.5ku、18ku左右的菌毛蛋白,且相互之间无交叉反应。利用单抗检测研究一中分离的鸡大肠杆菌阳性菌株,为进一步建立特异性强、敏感度高、简便快捷的菌毛检测方法奠定了基础。
周洋[7]（2013）在《胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛结构蛋白ApfA功能及免疫原性研究》文中认为猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种高度传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。APP通过飞沫传播或感染动物接触传播,定植于猪下呼吸道表皮细胞。APP血清型众多,根据表面多糖抗原性差异可将该病原分为15个血清型。胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区的流行情况具有一定差异,我国已分离到APP血清1、2、3、4、5、7和8型菌株,其中以7型最多,其次为1型、2型和3型。APP致病过程涉及众多毒力因子,目前围绕其致病机制开展了大量研究工作,然而APP早期定植感染的致病机理尚不明确。Ⅳ型菌毛在多种病原菌致病过程中发挥重要作用,其中包括介导粘附定植、突破免疫屏障、影响生物被膜形成、颤搐运动、DNA摄取等。为了更好地控制和预防APP导致的疾病,研究APP致病机理,尤其是APP早期粘附定植的作用机制具有重要意义。本课题对APPⅣ型菌毛的功能和在致病过程发挥的作用进行探讨,并对Ⅳ型菌毛结构蛋白白ApfA的免疫原性与免疫保护力进行了研究。1.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛介导粘附和定植粘附是细菌建立感染的第一步,在致病过程中起着决定性作用。因此本课题对APPⅣ型菌毛是否参与APP宿主粘附定植过程进行研究,研究结果如下：首先,通过荧光定量PCR的方法对APP与猪肺上皮细胞（SJPLC）互作后Ⅳ型菌毛操纵子基因表达水平进行检测,发现与细胞互作后apf操纵子整体表达水平显着上升。其次,本研究构建了Ⅳ型菌毛结构蛋白基因缺失突变株4074△apfA,以及互补菌株C40740△apfA。以猪髋动脉内皮细胞（PIEC）和SJPLC为粘附模型,通过粘附和粘附抑制实验共同证明Ⅳ型菌毛在APP粘附宿主细胞的过程中发挥作用。同时,通过共聚焦显微镜对粘附结果进行观察,发现4074ΔapfA基因缺失突变株粘附能力显着减弱,而互补菌株与野生株粘附能力相当,再次证明Ⅳ型菌毛参与粘附过程。最后,在小鼠活体感染模型中证明Ⅳ型菌毛在APP肺部定植过程中发挥重要作用,并影响APP致病力。以上结果表明APPⅣ型菌毛是细胞接触诱导表达型,参与了APP定植感染过程,在致病过程中发挥重要作用。2.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛负调控生物被膜的形成Ⅳ型菌毛参与粘附外的多种致病机制,本研究对APPⅣ型菌毛可能参与的其他致病机制进行探讨。为了研究Ⅳ型菌毛是否与APP生物被膜形成调控相关,我们通过结晶紫染色方法对野生菌株和4074ΔapfA基因缺失突变株的生物被膜形成能力进行定量比较,结果发现4074ΔapfA基因缺失突变株生物被膜形成能力显着增强。该结果表明Ⅳ型菌毛负调控APP生物被膜的形成,我们推测Ⅳ型菌毛可能参与了群体感应调节因子LuxS对于生物被膜形成的负调控过程。此外,我们还对比了野生菌株和4074ΔapfA基因缺失突变株溶血活性和细胞毒性的差异,结果发现Ⅳ型菌毛的缺失不影响APP溶血毒素和细胞毒素的分泌。3.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛潜在受体的寻找以上研究证明了Ⅳ型菌毛主要是通过介导细胞粘附在APP早期感染过程中发挥重要作用。在奈瑟球菌属中,Ⅳ型菌毛的已知细胞粘附受体是CD46分子,为了验证CD46分子是否为APP Ⅳ型菌毛的特异性受体,我们进行了以下研究：首先,构建pcDNA-CD46真核表达质粒并转染幼仓鼠肾传代细胞（BHK）（CD46分子阴性细胞）,通过流式细胞术检测转染效率,证明CD46分子在BHK细胞中表达。通过粘附实验发现,CD46分子的表达并没有显着提高APP对细胞的粘附效率。其次,用CD46抗体处理SJPLC和PIEC细胞（CD46分子阳性细胞）,进行粘附抑制实验,结果显示CD46分子抗体封闭不影响APP对细胞的粘附作用。因此,上述结果证明CD46并非APP特异性粘附受体。为了进一步寻找Ⅳ型菌毛的可能性受体,我们通过酵母双杂交的方法来进行研究：构建pGBKT7-apfA作为诱饵载体,转化酵母Y187菌株后与猪肺部cDNA酵母文库进行杂交,经过三轮筛选获得4个阳性克隆。对阳性克隆进行测序并分析,结果发现其中一个可能是Ⅳ型菌毛互作受体蛋白。该蛋白与猪Talinl蛋白同源,是一种细胞骨架蛋白,其与APPIV型菌毛的互作关系还有待进一步的验证。4.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA是良好的保护性抗原本研究对Ⅳ型菌毛基因簇在APP13个血清型中的分布情况和同源性进行比较分析,结果发现编码ap/A基因的结构蛋白在12个血清型中高度保守；Ⅳ型菌毛基因簇在11个血清型中高度保守。为了检测Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA的免疫原性,我们首先表达纯化了重组ApfA （rApfA）蛋白,然后用纯化的rApfA免疫小鼠,发现能够诱发小鼠产生免疫应答,产生较高抗体水平。其次,我们用rApfA-ELISA对猪APP感染血清和阴性血清中anti-ApfA抗体水平进行检测,发现感染血清中的抗体水平显着高于阴性血清。以上结果说明Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA不仅存在于所有血清型中,序列高度保守,并且具有很强的免疫原性。以上研究发现APP IV型菌毛结构蛋白ApfA具有较好的免疫原性并且高度保守,有可能发展成为是良好的保护性抗原。因此,我们接下来对菌毛结构蛋白ApfA能否提供有效的免疫保护力进行评估。首先,通过rApfA主动免疫小鼠后感染致死剂量APP,发现该抗原能够对APP血清1型4074菌株感染提供90%的保护,对APP血清7型WF83菌株感染提供80%的保护。其次,对免疫血清中anti-rApfA抗体进行分型,发现rApfA能够诱导Th2型主导的免疫反应。用rApfA免疫血清通过静脉注射被动免疫小鼠,发现该免疫血清能够对APP血清1型4074菌株感染提供40%的保护,对APP血清7型WF83菌株感染提供60%的保护。以上结果表明Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA不仅是一种高效的保护性抗原,能够激发小鼠产生Th2型为主导的免疫应答,对于中国流行血清型1型和7型APP感染提供有效保护,而且ApfA诱导的抗体也具有被动免疫保护力,对于APP不同血清型的感染能够提供一定保护。
石蕾[8]（2010）在《猪源肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立》文中研究说明肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是人与动物肠道和呼吸道常见的定植菌种,属于肠杆菌科,是一种条件性致病菌。菌毛是其重要的致病因子之一,与细菌的粘附定植相关,细菌可借助于菌毛尖端的粘附素（Adhesin）对宿主粘膜上皮细胞的粘附作用粘附到宿主组织器官,这是机体致病的首要条件。本试验以临床分离的猪源肺炎克雷伯菌菌株Kpn4为研究对象,首先通过甘露糖敏感血凝与抵抗血凝试验、PCR鉴定该菌生长表达的菌毛类型为Ⅲ型菌毛,并改良了Ⅲ型菌毛的体外表达条件,后经SephsdexG—100凝胶过滤法、热洗脱法及酸盐沉淀法纯化得到Ⅲ型菌毛蛋白。然后以Kpn4为抗原免疫4～6周龄BALB/C雌性小鼠,运用PEG融合法,经两次细胞融合,以Ⅲ型菌毛蛋白为一抗,通过间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆3次,得到3株可分泌Ⅲ型菌毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3A1、5D8、4F2,并对其效价、亚类、特异性、中和性、稳定性和相对亲和力进行了测定;结果表明制备出的三株稳定分泌肺炎克雷伯菌Kpn4 McAb的杂交瘤细胞株3A1、5D8和4F2腹水效价依次为1∶3.2×106、1∶2.8×105和1∶1.8×105,培养上清效价依次为1∶3002、1∶2119、1∶1769。3A1为IgG2b亚型,5D8和4F2为IgM亚型。三株McAb的相对亲和力为3A1>5D8>4F2;特异性测定结果表明,本试验所制备的肺炎克雷伯Ⅲ型菌毛McAb特异性反应显示与大肠埃希菌,副伤寒沙门菌,铜绿假单胞菌,产单核细胞李斯特杆菌,胸膜肺炎放线杆菌均无交叉反应性,具有较好的特异性。稳定性试验显示三株杂交瘤细胞都能稳定分泌Kpn4 McAb的能力。筛选效价高、中和活性好的1株单克隆抗体（3A1）,建立双抗夹心ELISA检测方法,建立标准曲线,其标准曲线的回归方程为y =0.4333x -0.2223,最低检测限为62.5ng/mL,最适检测范围为62.5～4000 ng/mL。为该菌的快速诊断、噬菌体文库的展示和阻断菌毛粘附蛋白的作用机制及分子流行病学调查提供基础。
朱春红[9]（2010）在《肠炎沙门氏菌SEF14菌毛功能探索》文中研究说明沙门氏菌属于肠杆菌科细菌,由此类细菌引起的各种动物疾病称为沙门氏菌病,除初生动物,人畜感染后一般呈无症状带菌状态,长期排菌,污染肉蛋产品,同时它们也可表现为有临床症状的致死疾病,可能加重病情或者增加死亡率,或者降低动物生产力等,对养殖业的经济效益影响重大。目前,鸡肠炎沙门氏菌污染禽蛋肉产品在全球范围内已是很严重的食品卫生问题。日、美等发达国家发生的食物中毒事件中很多都是由沙门氏菌引起的,而肠炎沙门氏菌感染渐渐超越鼠伤寒沙门氏菌成为其最主要的病原菌。SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌以及相近的D-群沙门氏菌中,主要是肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌中,而都柏林沙门氏菌属于偏嗜性沙门氏菌,其临床感染的报道较少,主要发生于牛羊。SEF14菌毛,与某些广泛分布于革兰氏阴性菌中的菌毛结构共性功能不同,这种特异性分布的菌毛结构可能有其独特的功能。目前,关于SEF14菌毛功能研究相对较少,对其在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用存在一定争议。本试验拟以SEF14菌毛为研究对象,从染色体基因序列变化上探寻SEF14菌毛特异性表达于某些D-群沙门氏菌,特别是肠炎沙门氏菌的原因；鉴于目前临床上无简单易行的肠炎沙门氏菌特异性检测方法,根据SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌这一特点,本试验体外重组表达SEF14菌毛主要亚单位蛋白SEFA,并以此建立间接ELISA方法特异性检测临床肠炎沙门氏菌感染；构建肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位突变株,通过动物感染试验以及体外系列细胞试验揭示其在肠炎沙门氏菌致病过程中的一定作用,旨在阐述肠炎沙门氏菌的隐性带菌感染相关性,借助构建的突变株探索中国地方品种家禽与肠炎沙门氏菌的易感性之间的关联,试图为家禽的抗病育种寻找新的线索。1 SEF14菌毛操纵子在肠炎沙门氏菌和相近D-群沙门氏菌中的变异本试验部分用PCR方法检测了18株鸡白痢沙门氏菌,11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌株中SEF14菌毛操纵子亚单位基因sefA, sefD以及调控基因sefR存在与变异情况。结果表明：从11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌染色体DNA中能成功扩增sefA, sefD以及sefR基因；从18株鸡白痢沙门氏菌能成功扩增sefA基因,但只有分离于1980年之前的7株分离菌能成功扩增sefD和sefR基因,而另11株1980年后分离菌PCR扩增却无任何产物。PCR产物测序结果表明,11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌株中sefA, sefD以及sefR基因和已发表的序列100%同源；分析比对分离于1980年之前的7株鸡白痢沙门氏菌sefD基因测序结果,发现在196位点发生碱基缺失,造成阅读框移码,在氨基酸71位点处产生终止密码子。优化体外菌毛表达的培养条件,体外菌毛抽提和鉴定试验证明：肠炎沙门氏菌以及都柏林沙门氏菌体外能很好表达SEF14菌毛,但鸡白痢沙门氏菌却无任何表达迹象。SEF14菌毛操纵子结构基因sefA, sefD以及调控基因sefR在不同沙门氏菌中的变异情况可能是SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌中特异性表达的原因之一。2肠炎沙门氏菌SEF14菌毛主要亚单位sefA的克隆、表达以及免疫活性检测据肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物,利用PCR技术从国内标准株50336中扩增sefA基因,并按预定的阅读框插入表达性载体pET22b+中,获得重组质粒pETsefA,经限制性内切酶酶切消化结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列大小为498bp,与已发表的sefA结构编码序列完全一致。重组质粒pETsefA转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）并能获得高效诱导表达,对菌体裂解上清液通过SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,该重组菌可以表达大小为15.2kD的可溶性重组蛋白rSEFA。纯化rSEFA免疫小鼠得到的高免血清与标准株50336感染小鼠血清一样,在Western-blotting中,均能识别标准株肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,说明体外表达的rSEFA蛋白有较好的免疫原性和反应原性,为后续建立肠炎沙门氏菌特异性检测方法提供基础。3肠炎沙门氏菌间接ELISA检测方法的建立建立和优化了重组蛋白rSEFA介导的间接ELISA方法特异性检测肠炎沙门氏菌血清抗体。确定了其抗原最佳包被量为7.5μg/ml,血清最适稀释度1：100,作用时间为60min;酶标二抗最适稀释度为1：4000,作用时间为60min;判定标准为OD值≥0.346,基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,能特异性识别肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌感染血清,不能识别相近的鸡白痢沙门氏菌感染血清,此方法与菌体凝集反应同时检测临床随机血清样品100份,两者阳性率分别为67%和54%,结果符合率为80.6%。这一方法的建立对肠炎沙门氏菌特异性抗体检测有潜在的应用前景,试剂盒的完善将填补国内相关研究的空白,为家禽种群肠炎沙门氏菌净化工作以及日常血清筛查提供了极大的便利。4基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位突变株Red同源重组系统和高效自杀性载体系统都能对革兰氏阴性菌染色体直接进行修饰,本试验利用上述两种系统敲除4株不同来源肠炎沙门氏菌（X） SEF14菌毛操纵子亚单位sefD或sefA基因,包括国际国内标准株（SD-2,50336）,鸡源以及人源临床分离株（S.09,SE43）,并对构建肠炎沙门氏菌突变株方法进行比较。基于含sefD基因同源臂片段和抗生素表达盒的PCR扩增产物,利用Red同源重组系统,电转化PCR扩增产物至不同源肠炎沙门氏菌各菌株,通过同源臂发生同源重组交换缺失sefD基因,一步法构建各菌株sefD基因突变株XAsefD::Cat（氯霉素抗性基因）。在二次重组中利用携带FLP位点特异性重组酶的温度敏感性质粒,去除上述突变株中的筛选用抗性基因标志,获sefD基因突变株X△sefD,结合PCR扩增和序列鉴定,证明上述各突变株正确构建。在高效自杀性载体系统中,根据sefA基因两端的已知序列,PCR扩增邻近sefA基因左右两侧各1000bp大小的同源臂DNA片断,然后将其克隆入自杀性载体质粒pRE112中,将成功构建的含同源臂DNA片断的重组自杀质粒pRE1122电转化至不同源肠炎沙门氏菌各菌株,重组质粒和染色体DNA通过同源臂发生同源重组交换缺失sefA基因,自杀性载体质粒含有sacB基因,在蔗糖存在时不能稳定传代,在二次重组中通过蔗糖培养基传代筛选抗性敏感的sefA突变株,PCR扩增和测序鉴定sefA突变株的正确构建。目前已成功构建国际、国内标准株,鸡源和人源国内分离株SEF14菌毛操纵子亚单位sefD、sefA和sefAsefD基因缺失株。比较两个系统在肠炎沙门氏菌基因缺失株构建上的应用：Red同源重组系统能将PCR产物一步法直接转化肠炎沙门氏菌,在重组酶的作用下,通过较短同源臂发生同源重组交换,但对PCR产物和感受态细胞的质量要求很高,一次重组效率很低,而二次重组过程中去除抗性选择标志则相对简单、高效。自杀性载体系统若将构建好的含同源臂DNA片断的重组质粒转化宿主菌,其一次重组效率高,二次重组也只需蔗糖培养基中传代丢失抗性质粒。但Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点；而自杀性载体系统在染色体中可不留任何痕迹。两个系统都能对不同源肠炎沙门氏菌染色体进行直接修饰,且易删除抗性选择标志,但传统的高效自杀性载体系统需构建含同源臂的打靶质粒,多次酶切连接,操作繁琐,Red同源重组系统更方便快捷,省时省力。基于SEF14菌毛操纵子亚单位sefD、sefA和sefAsefD双基因缺失株成功获得,为进一步深入研究肠炎沙门氏菌SEF14菌毛与机体相互作用的分子致病机理及对该病防制奠定了一定基础。5肠炎沙门氏菌和其SEF14菌毛突变株对Balb/c小鼠和中国地方品种鸡的感染以肠炎沙门氏菌标准株50336和突变株50336△sefA、50336△sefD和双突变株50336△sefA△sefD为生物材料,以腹腔注射和颈部皮下注射为感染途径,测定标准株及突变株对6周龄Balb/c小鼠的半数致死量（LD50）以及上述菌株对中国地方品种鸡-清远麻鸡（1日龄）的感染情况,以探讨SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用。结果显示,标准株50336以及突变株50336△sefA、50336△sefD6周龄Balb/c小鼠的LD50分别为19.95 cfu,7.94 cfu,7.94cfu,说明SEF14菌毛不同亚单位蛋白影响肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠的LD50,SEF14菌毛亚单位基因突变株50336△sefA和50336△sefD增强肠炎沙门氏菌对Balb/c小鼠毒力。对1日龄清远麻鸡的感染结果显示亚单位基因突变株50336△sefA和双突变株50336△sefA△sefD感染力更强,与标准株50336感染组相比,其死亡率增高,并严重影响雏鸡的增重。肠炎沙门氏菌以及相应突变株感染小鼠和清远麻鸡后,感染菌脏器分布广泛,细菌的分离鉴定结果表明,试验期间在感染动物脏器肝、肾、脾、肺、盲肠以及小肠中都能成功分离攻毒菌株。中国地方鸡品种资源丰富,遗传背景多样,抗病能力差异较大,根据肠炎沙门氏菌以及相应SEF14菌毛突变株对地方品种鸡的感染试验,检测清远麻鸡对不同菌株的感染力,为中国地方品种鸡的抗病育种提供线索。6SFF14菌毛在肠炎沙门氏菌致病过程中作用初探致病菌黏附于易感宿主细胞是成功感染的第一步,巨噬细胞在肠炎沙门氏菌感染中有着重要作用,肠炎沙门氏菌入侵巨噬细胞并能在其中正常生长繁殖,可能是肠炎沙门氏菌在感染宿主体内长期存在并扩散的原因之一。本试验基于上述构建的突变株,分析比较4株肠炎沙门氏菌（X）和其对应的SEF14菌毛亚单位基因突变株X△sefA、X△sefD以及双突变株X△sefAsefD与肠上皮细胞系IPEC-J2的黏附作用,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用和野生菌以及相应突变株在小鼠腹腔巨噬细胞内的存活作用。肠上皮细胞的黏附试验结果表明,所有野生株及其相应的突变株在1h和4h内都能很好的黏附上皮细胞,且随着时间的增加,黏附数量增多,但此时间内,野生株以及相应突变株在黏附数量上差异不显着。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验和存活试验结果表明：活化的小鼠腹腔巨噬细胞对相应突变株X△sefA、X△sefD以及双突变株X△sefA△sefD的吞噬作用加强,其在小鼠巨噬细胞中的存活能力提高,这一结果可能意味着SEF14菌毛并不特异性介导肠炎沙门氏菌与肠上皮细胞的粘附作用,或者不是粘附的主要作用因子,可能与其在巨噬细胞中的作用有关,借助SEF14菌毛的作用,肠炎沙门氏菌能更好的作用于巨噬细胞并在巨噬细胞中存活,利于其隐性感染和长期排毒。
张成栋[10]（2009）在《Ⅰ型菌毛介导鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力及对抗原递呈细胞侵袭力的研究》文中进行了进一步梳理鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enteria serovar Typhimurium）为肠杆菌科沙门氏菌属成员,是条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌,具有广泛的宿主感染谱,如小鼠、家禽、猪、羊、牛、马和人,能引起人和动物的沙门氏菌病,具有重要的公共卫生意义。沙门氏菌菌毛是细菌表面的纤细结构,与细菌粘附上皮细胞及在小肠粘膜定植有关。Ⅰ型菌毛是静止培养时唯一表达的菌毛,其结构与功能是各种菌毛中研究最为清楚的一种。前期体外研究证明,沙门氏菌Ⅰ型菌毛与细菌粘附与侵袭宿主细胞有关。本研究在此基础上,以小鼠为模型,进行体内研究,通过LD50与侵袭试验,证实鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌毒力和侵袭的影响。本研究针对沙门氏菌Ⅰ型菌毛,主要进行以下几个方面的研究:1.以鼠伤寒沙门氏菌SR-11衍生株AJB3为参考菌株,三重突变的重组鼠伤寒沙门氏菌AJB3fim-lpfinvA-（标记为117#）和稳定表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ44-h及不表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ33-h为对照菌株进行粘附细胞能力的研究。结果表明:三重突变的重组沙门氏菌AJB3fim-lpfinvA-粘附HEp-2细胞和体外培养的骨髓源DC的能力显着下降,说明突变株构建成功;稳定表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ44-h比不表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ33-h粘附HEp-2细胞和体外培养的骨髓源DC的能力显着升高,而且比野生性菌株的粘附能力略有增加,说明Ⅰ型菌毛特异性介导鼠伤寒沙门氏菌粘附上皮细胞和骨髓源树突状细胞。2.通过灌胃和尾静脉注射两种方法接种小鼠进行动物试验,探索Ⅰ型菌毛体内对鼠伤寒沙门氏菌的毒力及侵袭力的影响。研究结果表明:灌胃攻毒小鼠时,Ⅰ型菌毛能明显降低细菌的毒力,两者LD50相差42倍。细菌117#-pAZ33-h在各器官的菌量多于细菌117#-pAZ44-h,细菌在体内扩散途径是首先在肠Peyer结定植,然后经肠系膜淋巴结,最后到脾脏的途径在体内扩散。在脾脏中,树突状细胞能特异性结合表达Ⅰ型菌毛的重组细菌,而单核-巨噬细胞对细菌的识别没有选择;鼠伤寒沙门氏菌通过尾静脉侵袭小鼠时,表达Ⅰ型菌毛的重组鼠伤寒沙门氏菌毒力比不表达Ⅰ型菌毛的重组鼠伤寒沙门氏菌要强,两者LD50相差19倍。细菌117#-pAZ44-h在各器官的菌量多于细菌117#-pAZ33-h,细菌在体内扩散途径与灌胃时相反。在脾脏中,树突状细胞能特异性结合表达Ⅰ型菌毛的重组细菌,并且其感染水平随细菌增殖而升高。单核-巨噬细胞对细菌的识别没有选择性,并且被活化后一直保持在相对稳定感染水平。表达Ⅰ型菌毛能特异性介导细菌对B细胞的侵袭,但随着体液免疫活性的降低,B细胞感染率下降。3.用小鼠全基因组芯片（32256个基因）,对两株细菌刺激小鼠骨髓源树突状细胞60min后基因表达谱进行检测。以117#-pAZ33-h（fim-）刺激组基因差异表达谱为参照,对117#-pAZ44-h（fim+）刺激组基因差异表达基因进行归类分析,表达Ⅰ型菌毛的重组鼠伤寒沙门氏菌使细胞基因表达下调为主;差异表达的基因主要集中在蛋白质代谢相关基因、转录翻译等与细胞增殖相关基因和信号转导相关基因,分别占到差异表达基因总数的24.1%、21.6%和13.8%;说明沙门氏菌刺激细胞时,通过抑制一系列相关基因表达而降低其免疫活性。总之,本研究阐明了沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌体内毒力及对抗原递呈细胞的侵袭力的影响,从而为设计更加安全高效的弱毒沙门氏菌疫苗载体及有效防制人畜重要传染病提供了理论与实验依据。
二、抗Ⅰ型菌毛单克隆抗体抗粘附作用机制的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗Ⅰ型菌毛单克隆抗体抗粘附作用机制的研究（论文提纲范文）
（1）抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体制备的一种简捷方法与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 综述一 沙门氏菌Peg菌毛研究进展 |
| 1 peg基因特点 |
| 2 Peg菌毛分泌组装过程 |
| 3 Peg菌毛的表达 |
| 4 Peg菌毛致病性 |
| 5 Peg菌毛潜在应用前景 |
| 综述二 单克隆抗体的研究进展 |
| 1 单克隆抗体的特征 |
| 2 单克隆抗体制备技术 |
| 2.1 鼠杂交瘤技术 |
| 2.2 噬菌体展示技术 |
| 2.3 转基因小鼠技术 |
| 2.4 新兴单B细胞RT-PCR技术 |
| 3 单克隆抗体的溯源分类 |
| 3.1 鼠源性单克隆抗体 |
| 3.2 嵌合型单克隆抗体 |
| 3.3 人源化单克隆抗体 |
| 3.4 全人源单克隆抗体 |
| 4 单克隆抗体的应用 |
| 4.1 单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.2 双特异性单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.3 携带式单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.4 纳米单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.5 Fc修饰性单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 4.6 DNA/RNA编码单克隆抗体在病原体检测中的应用 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体的简捷制备方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系、实验动物与细菌菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 相关溶液的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 免疫实验动物 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 杂交瘤细胞株筛选 |
| 2.5 杂交瘤细胞的亚克隆与效价检测 |
| 2.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 2.7 腹水的制备与纯化 |
| 2.8 单克隆抗体特性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清效价监测结果 |
| 3.2 细胞融合 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 3.4 阳性细胞亚克隆与效价检测 |
| 3.5 腹水的制备 |
| 3.6 单克隆抗体的特性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门氏菌玻板凝集检测方法的建立和初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细菌菌株、材料、样品 |
| 1.2 培养基与配方 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 沙门氏菌玻板凝集检测方法的建立 |
| 2.2 玻板凝集检测方法敏感性测定 |
| 2.3 玻板凝集检测方法特异性测定 |
| 2.4 玻板凝集检测方法的初步临床应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 敏感性检测结果 |
| 3.2 特异性检测结果 |
| 3.3 对模拟污染瓶装水检测结果 |
| 3.4 对模拟污染饲料的检测结果 |
| 3.5 对临床鸡场病鸡样品中沙门氏菌的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）APEC O1型E516摄铁基因c2515和c2516缺失株的生物学特性及C2515单克隆抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 禽致病性大肠杆菌的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 临床症状与病理变化 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 毒力因子 |
| 1.1.5 防治措施 |
| 1.2 摄铁系统的研究进展 |
| 1.2.1 铁载体的合成 |
| 1.2.2 铁载体的转运 |
| 1.2.3 铁载体对APEC毒力的影响 |
| 1.2.4 血红素摄取系统 |
| 1.3 单克隆抗体技术研究进展 |
| 1.3.1 单克隆抗体技术的发展 |
| 1.3.2 单克隆抗体的制备技术 |
| 1.3.3 单克隆抗体的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第2章 c2515、c2516基因缺失株及回补株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验菌株、质粒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及溶液配方 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCR方法鉴定c2515、c2516基因在E516、E058、E522中的存在 |
| 2.2.2 c2515、c2516基因缺失株的构建 |
| 2.2.3 E516菌株c2515-c2516双基因回补株的构建 |
| 2.2.4 遗传稳定性分析 |
| 2.2.5 细菌生长曲线测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 c2515、c2516基因鉴定结果 |
| 2.3.2 缺失株和回补株的构建 |
| 2.3.3 遗传稳定性分析结果 |
| 2.3.4 细菌生长曲线测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 E516及其c2515、c2516基因缺失株和回补株的生物学特性 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验菌株和动物 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配方 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 分子生物学软件及数据分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RNA提取和逆转录RT-PCR分析 |
| 3.2.2 qRT-PCR |
| 3.2.3 CAS法检测铁载体产出 |
| 3.2.4 铁摄取检测 |
| 3.2.5 1日龄鸡的半数致死量(LD50)测定 |
| 3.2.6 21日龄SPF鸡体内定居试验 |
| 3.2.7 组织病变观察 |
| 3.2.8 鸡巨噬细胞感染试验 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.3.2 qRT-PCR检测结果 |
| 3.3.3 CAS固体培养基检测结果 |
| 3.3.4 铁摄取检测结果 |
| 3.3.5 LD_(50)试验结果 |
| 3.3.6 体内定居试验结果 |
| 3.3.7 组织病变观察结果 |
| 3.3.8 鸡巨噬细胞感染试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 E516菌株C2515摄铁蛋白单克隆抗体的研制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验菌株、动物和载体 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配方 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计与合成 |
| 4.2.2 pET11b-c2515-His原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 4.2.3 C2515-His蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.2.4 单克隆抗体的制备 |
| 4.2.5 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PCR扩增及质粒酶切鉴定结果 |
| 4.3.2 C2515-His蛋白的诱导表达结果 |
| 4.3.3 表达条件的优化结果 |
| 4.3.4 C2515-His蛋白大量表达与纯化结果 |
| 4.3.5 抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度 |
| 4.3.6 免疫小鼠血清抗体效价测定结果 |
| 4.3.7 阳性孔杂交瘤细胞的克隆化结果 |
| 4.3.8 单抗鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）牛源致脑炎大肠杆菌多表位抗原的制备及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 大肠杆菌概述 |
| 2.2 肠外致病性大肠杆菌研究进展 |
| 2.3 致脑膜炎E.coli致病机理 |
| 2.4 大肠杆菌疫苗研究进展 |
| 2.5 表位疫苗研究进展 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 FimD、PilN和 PilV蛋白的生物信息学分析和 B细胞优势抗原表位预测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 FimD、PilN和 PilV蛋白的理化性质分析 |
| 2.2 FimD、PilN和 PilV蛋白的跨膜区、信号肽和磷酸化位点分析 |
| 2.3 FimD、PilN和 PilV蛋白的二级结构分析 |
| 2.4 FimD、PilN和 PilV蛋白的三级结构分析 |
| 2.5 FimD、PilN蛋白和PilV蛋白的优势B细胞表位预测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 FimD、PilN和 PilV蛋白优势B细胞表位的串联表达和纯化 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白表达载体的PCR鉴定 |
| 2.2 重组蛋白表达载体的双酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.4 重组蛋白的表达形式分析与纯化 |
| 2.5 Western Blot检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 基于FimD、PilN和 PilV蛋白设计的多表位抗原抗感染免疫保护效果评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 间接ELISA法检测血清抗体 |
| 2.2 Western blot检测血清抗体 |
| 2.3 半数致死量测定结果 |
| 2.4 小鼠攻毒保护试验 |
| 2.5 小鼠肝、脾、脑载菌量的测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（4）Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 Gb3促进蜡样芽孢杆菌导致的急性感染 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 细胞和动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 蜡样芽孢杆菌培养 |
| 1.2.2 蜡样芽孢杆菌感染小鼠 |
| 1.2.3 小鼠存活实验 |
| 1.2.4 小鼠脏器细菌载量计数 |
| 1.2.5 细胞因子测定 |
| 1.2.6 组织病理学评估 |
| 1.2.7 蜡样芽孢杆菌基因plc R敲除株的构建 |
| 1.2.8 细菌粘附实验 |
| 1.2.9 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 小鼠存活实验 |
| 1.3.2 小鼠脏器细菌载量和血清细胞因子的测定 |
| 1.3.3 小鼠组织病理切片分析 |
| 1.3.4 蜡样芽孢杆菌基因plc R敲除株的构建 |
| 1.3.5 蜡样芽孢杆菌分泌毒力因子导致小鼠急性死亡 |
| 1.3.6 某蜡样芽孢杆菌表面成分与Gb3相互作用 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与宿主细胞表面Gb3的相互作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 细胞和动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 纯化和分析与Galα1-4Gal二糖结构结合的蜡样芽孢杆菌蛋白 |
| 2.2.2 重组鞭毛蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.3 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与鸽卵类粘蛋白亲和常数的测定 |
| 2.2.4 流式细胞计数检测鞭毛蛋白与细胞表面Gb3结合 |
| 2.2.5 电子显微镜观察蜡样芽孢杆菌粘附 |
| 2.2.6 蜡样芽孢杆菌基因fla敲除株的构建 |
| 2.2.7 共聚焦显微镜观察蜡样芽孢杆菌粘附 |
| 2.2.8 蜡样芽孢杆菌天然鞭毛蛋白的提取 |
| 2.2.9 鞭毛蛋白抗血清的制备及抗体纯化 |
| 2.2.10 免疫印迹分析 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 鉴定与Galα1-4Gal结合的蜡样芽孢杆菌蛋白 |
| 2.3.2 重组表达载体构建和蛋白的表达纯化 |
| 2.3.3 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白与鸽卵类粘蛋白亲和常数的测定 |
| 2.3.4 流式细胞技术检测鞭毛蛋白与细胞表面的Gb3结合 |
| 2.3.5 蜡样芽孢杆菌天然鞭毛蛋白的提取 |
| 2.3.6 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白敲除株的构建 |
| 2.3.7 蜡样芽孢杆菌鞭毛蛋白有助于细菌粘附 |
| 2.3.8 鞭毛蛋白与细胞表面Gb3相互作用有助于细菌粘附 |
| 2.3.9 鞭毛蛋白与Gb3参与蜡样芽孢杆菌感染小鼠过程 |
| 2.3.10 抗蜡样芽孢杆菌鞭毛抗体的制备 |
| 2.3.11 抗鞭毛抗体对蜡样芽孢杆菌感染小鼠具有保护作用。 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶作用机制初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 细胞和动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶基因敲除株的构建 |
| 3.2.2 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶基因敲除株的鉴定 |
| 3.2.3 ELISA检测小鼠血清TNFα 水平 |
| 3.2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察神经酰胺的释放 |
| 3.2.5 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶基因敲除株的构建和鉴定 |
| 3.3.2 鞘磷脂酶基因的敲除降低了蜡样芽孢杆菌毒力 |
| 3.3.3 蜡样芽孢杆菌鞘磷脂酶可以促进宿主细胞神经酰胺的释放 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附件 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（6）禽源大肠杆菌主要毒力因子的分子流行病学分析及F1与P菌毛单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 禽源大肠杆菌的流行病学 |
| 2. 禽源大肠杆菌常见菌毛 |
| 2.1 菌毛的概述 |
| 2.2 菌毛的特点及其分类 |
| 2.3 菌毛的粘附机制与致病机制 |
| 2.4 菌毛的基因簇结构 |
| 2.5 菌毛的体外表达 |
| 2.6 鸡大肠杆菌菌毛的检测 |
| 3. 大肠杆菌的毒力岛 |
| 3.1 毒力岛的概述 |
| 3.2 毒力岛的特征 |
| 3.3 HPI毒力岛及其致病机制 |
| 3.4 ETT2毒力岛及其致病机制 |
| 3.5 LEE毒力岛及其致病机制 |
| 3.6 毒力岛的研究意义 |
| 4. 禽大肠杆菌病的防控 |
| 研究一 江苏部分地区不同毒力基因型鸡大肠杆菌感染的流行病学 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料采集与处理 |
| 2.2 病料的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 HPI毒力岛irp2、fyuA和intB基因的PCR检测 |
| 3.2 P菌毛PapC的PCR检测 |
| 3.3 ETT2的Ecs3703与Ecs3737的PCR检测 |
| 3.4 F1菌毛fimA的PCR检测 |
| 3.5 LEE毒力岛Intimin的PCR检测 |
| 3.6 临床病料中大肠杆菌不同毒力基因型感染的分子流行病学 |
| 3.7 细菌的分离鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 研究二 鸡大肠杆菌F1与P菌毛的主要结构蛋白的表达 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 工具酶与试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 PCR模板的制备 |
| 2.3 PilA菌毛的PCR扩增 |
| 2.4 PilA基因的克隆和筛选 |
| 2.5 PapA菌毛基因的扩增 |
| 2.6 PapA菌毛基因的克隆和筛选 |
| 2.7 重组质粒pGEX-PilA,pGEX-PapA的构建及筛选 |
| 2.8 融合蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.9 融合蛋白GST-papA和GST-PilA的Western-blot分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PilA基因的PCR扩增 |
| 3.2 重组质粒pMD18-T-PilA的鉴定 |
| 3.3 papA基因的PCR扩增 |
| 3.4 重组质粒pMD18-T-papA的鉴定 |
| 3.5 重组质粒pGEX-PilA和pGEX-Pap双酶切鉴定 |
| 3.6 重组质粒诱导表达的SDS-PAGE分析 |
| 4 讨论 |
| 研究三 鸡大肠杆菌F1与P菌毛的单克隆抗体制备 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株和蛋白 |
| 1.2 细胞和实验动物 |
| 1.3 细胞培养基及主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 饲养细胞的制备 |
| 2.3 骨髓瘤细胞SP2/0的制备 |
| 2.4 脾淋巴细胞的制备 |
| 2.5 细胞融合 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.7 杂交瘤细胞的克隆化及细胞株的建立 |
| 2.8 腹水的制备 |
| 2.9 腹水抗体效价的测定 |
| 2.10 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体的稳定性检测 |
| 2.12 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.13 McAb的初步应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定 |
| 3.2 杂交瘤细胞株的建立与稳定性的检测 |
| 3.3 腹水抗体效价 |
| 3.4 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.6 McAb对鸡大肠杆菌分离株的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛结构蛋白ApfA功能及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(ABBREVIATION) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的概述 |
| 1.1.1 病原学与流行病学 |
| 1.1.2 临床症状和病理变化 |
| 1.1.3 诊断与防治 |
| 1.2 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子 |
| 1.2.1 粘附定植 |
| 1.2.2 营养摄取 |
| 1.2.3 机体损伤 |
| 1.2.4 抵抗宿主免疫防御 |
| 1.2.5 持续感染 |
| 1.3 胸膜肺炎放线杆菌疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 亚单位疫苗 |
| 1.3.3 核酸疫苗 |
| 1.3.4 菌影疫苗 |
| 1.3.5 口服疫苗 |
| 1.3.6 弱毒活疫苗 |
| 1.4 细菌Ⅳ型菌毛研究进展 |
| 1.4.1 Ⅳ型菌毛结构与组装 |
| 1.4.2 Ⅳ型菌毛功能 |
| 2 胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白APFA功能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒、细胞及培养条件 |
| 2.2.2 主要试剂及药品 |
| 2.2.3 培养基及抗生素配制 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.2.5 引物 |
| 2.2.6 实验动物 |
| 2.2.7 apfA基因缺失突变株及互补菌株的构建和筛选 |
| 2.2.8 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.9 小鼠多克隆抗体制备 |
| 2.2.10 细胞粘附实验 |
| 2.2.11 共聚焦显微镜观察细胞粘附实验 |
| 2.2.12 RNA提取及荧光定量PCR |
| 2.2.13 Western Blot |
| 2.2.14 小鼠肺部定植实验 |
| 2.2.15 小鼠毒力实验 |
| 2.2.16 生物被膜检测 |
| 2.2.17 细胞毒性检测 |
| 2.2.18 溶血实验 |
| 2.2.19 CD46分子表达检测 |
| 2.2.20 酵母双杂交 |
| 2.2.21 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 APP apfA基因缺失突变株、及互补菌株的构建 |
| 2.3.2 ApfA重组蛋白表达纯化 |
| 2.3.3 APP Ⅳ型菌毛基因簇细胞接触表达检测 |
| 2.3.4 ApfA对APP细胞粘附能力的影响 |
| 2.3.5 ApfA对APP小鼠定植能力及毒力的影响 |
| 2.3.6 ApfA对APP生物被膜形成能力的影响 |
| 2.3.7 ApfA对APP溶血活性、细胞毒性的影响 |
| 2.3.8 CD46分子粘附受体验证 |
| 2.3.9 Ⅳ型菌毛宿主互作蛋白筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 Ⅳ型菌毛与粘附定植 |
| 2.4.2 Ⅳ型菌毛其他功能 |
| 2.4.3 Ⅳ型菌毛受体寻找 |
| 3 胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白APFA免疫原性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂及药品 |
| 3.2.2 主要溶液的配制 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.2.4 抗体效价检测 |
| 3.2.5 抗体分型 |
| 3.2.6 小鼠主动免疫实验 |
| 3.2.7 小鼠被动免疫试验 |
| 3.2.8 生物信息学及统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ApfA保守型分析 |
| 3.3.2 ApfA抗体效价检测 |
| 3.3.3 ApfA体内表达检测 |
| 3.3.4 ApfA多克隆抗体检测分型 |
| 3.3.5 ApfA小鼠免疫保护力分析 |
| 3.3.6 ApfA小鼠被动免疫保护力分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 APP Ⅳ型菌毛基因的分布与保守性 |
| 3.4.2 ApfA与保护性抗原 |
| 3.4.3 ApfA开发成亚单位疫苗的潜力 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）猪源肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛的研究进展 |
| 1.1 肺炎克雷伯菌流行现状 |
| 1.2 肺炎克雷伯菌致病相关因子的研究 |
| 1.3 肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛的研究 |
| 第2章 单克隆抗体技术的研究进展 |
| 2.1 单克隆抗体产生的历史 |
| 2.2 单克隆抗体产生的原理 |
| 2.3 杂交瘤技术的优、缺点 |
| 2.4 单克隆抗体的研究进展 |
| 2.5 基因工程单克隆抗体的发展 |
| 2.6 单克隆抗体技术的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 猪源肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛提取、纯化及完全抗原的制备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 猪源肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛单克隆抗体的制备与特性鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 双抗夹心ELISA 检测方法的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 双抗夹心ELISA 基本操作步骤 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
| Abstract |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（9）肠炎沙门氏菌SEF14菌毛功能探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 沙门氏菌菌毛研究进展 |
| 1 沙门氏菌菌毛 |
| 2 肠炎沙门氏菌SEF14菌毛 |
| 参考文献 |
| 综述二 沙门氏菌检测技术研究进展 |
| 1 传统常规检验技术 |
| 2 免疫学标记检测方法 |
| 3 分子生物学技术 |
| 4 肠炎沙门氏菌特异性检测方法研究概况 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 SEF14菌毛基因操纵子在肠炎沙门氏菌和D-群沙门氏菌的变异分析 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要亚单位sefA的克隆、表达以及免疫活性检测 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 肠炎沙门氏菌间接ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌SEF14菌毛突变株 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 肠炎沙门氏菌及SEF14突变株对Balb/c小鼠和中国地方品种鸡的感染 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 SEF14在肠炎沙门氏菌致病过程中作用初探 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）Ⅰ型菌毛介导鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力及对抗原递呈细胞侵袭力的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 沙门氏菌致病性的研究 |
| 1.2 沙门氏菌的菌毛 |
| 1.2.1 沙门氏菌菌毛分类 |
| 1.2.2 菌毛在沙门氏菌致病中的作用 |
| 1.2.3 菌毛抗原的应用 |
| 1.3 抗原递呈细胞介导的沙门氏菌感染与免疫 |
| 1.3.1 抗原递呈细胞 |
| 1.3.2 抗原递呈细胞在沙门氏菌感染中的作用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 鼠伤寒沙门氏菌突变株体外粘附的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和细胞 |
| 2.1.2 实验动物及相关试剂 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验所需质粒的制备 |
| 2.2.2 重组鼠伤寒沙门氏菌的培养 |
| 2.2.3 细菌的计数 |
| 2.2.4 细胞的培养 |
| 2.2.5 细菌粘附HEp-2细胞 |
| 2.2.6 细菌粘附BMDC |
| 2.2.7 粘附BMDC的LSCM观察 |
| 2.2.8 粘附BMDC的ESEM观察 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细菌玻片凝集实验 |
| 2.3.2 细菌黏附HEp-2细胞FACS |
| 2.3.3 细菌黏附BMDC的FACS |
| 2.3.4 LSCM观察结果 |
| 2.3.5 ESEM观察结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 细菌的培养及鉴定 |
| 2.4.2 细菌粘附细胞 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Ⅰ型菌毛在口服感染中对细菌毒力及侵袭力影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 实验动物及相关试剂 |
| 3.1.3 主要试剂及溶液的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细菌的培养 |
| 3.2.2 细菌的计数 |
| 3.2.3 细菌对小鼠的急性毒性实验 |
| 3.2.4 细菌在小鼠体内各器官的动态分布 |
| 3.2.5 小鼠脾脏细胞中APC感染率的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 细菌对小鼠急性毒性实验 |
| 3.3.2 细菌在小鼠体内各器官的动态分布 |
| 3.3.3 细菌对脾脏DC和M(?)的侵袭力 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 细菌在小鼠体内各器官的分布 |
| 3.4.2 细菌对脾脏DC和M(?)的侵袭力 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 Ⅰ型菌毛在静脉注射感染中对细菌毒及侵袭力影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 实验动物及相关试剂 |
| 4.1.3 主要试剂及溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细菌的培养 |
| 4.2.2 细菌的计数 |
| 4.2.3 细菌对小鼠的急性毒性实验 |
| 4.2.4 细菌在小鼠体内各器官的动态分布 |
| 4.2.5 小鼠脾脏细胞中APC感染率的检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 细菌对小鼠急性毒性试验 |
| 4.3.2 细菌在小鼠体内各器官的动态分布 |
| 4.3.3 细菌对脾脏APC的侵袭力 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 细菌在小鼠体内各器官的分布 |
| 4.4.2 细菌对脾脏APC的侵袭力 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 Ⅰ型菌毛对C57BL/6小鼠基因表达影响的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种和细胞 |
| 5.1.2 实验动物及相关试剂 |
| 5.1.3 主要试剂及溶液的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细菌与细胞的相互作用 |
| 5.2.2 细胞 RNA提取 |
| 5.2.3 小鼠基因芯片 |
| 5.3 结果和分析 |
| 5.3.1 细胞总RNA电泳 |
| 5.3.2 小鼠细胞差异表达基因 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、抗Ⅰ型菌毛单克隆抗体抗粘附作用机制的研究（论文参考文献）
- [1]抗沙门氏菌Peg菌毛单克隆抗体制备的一种简捷方法与初步应用[D]. 王思权. 扬州大学, 2021
- [2]APEC O1型E516摄铁基因c2515和c2516缺失株的生物学特性及C2515单克隆抗体的研制[D]. 李茜. 扬州大学, 2021
- [3]牛源致脑炎大肠杆菌多表位抗原的制备及免疫效果评价[D]. 海永慧. 石河子大学, 2021(02)
- [4]Gb3在蜡样芽孢杆菌感染过程中的作用与机制研究[D]. 高嵩. 军事科学院, 2020(02)
- [5]运用生物信息分析软件筛选鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白粘附作用功能表位[A]. 戴鼎震,崔生玲,程泽信,徐世永,茅慧华,陈玉华. 中国畜牧兽医学会信息技术分会第十二届学术研讨会论文集, 2017
- [6]禽源大肠杆菌主要毒力因子的分子流行病学分析及F1与P菌毛单克隆抗体的制备[D]. 李丽丽. 扬州大学, 2014(01)
- [7]胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛结构蛋白ApfA功能及免疫原性研究[D]. 周洋. 华中农业大学, 2013(01)
- [8]猪源肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立[D]. 石蕾. 吉林大学, 2010(09)
- [9]肠炎沙门氏菌SEF14菌毛功能探索[D]. 朱春红. 扬州大学, 2010(11)
- [10]Ⅰ型菌毛介导鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力及对抗原递呈细胞侵袭力的研究[D]. 张成栋. 华中农业大学, 2009(03)