一、食管癌组织中端粒酶mRNA的原位表达与临床相关性意义（论文文献综述）
高佳佳[1]（2021）在《功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究》文中研究说明食管癌（Esophageal cancer,ECA）是我国致死率排名第四位的恶性肿瘤,其中约90%的组织学类型为食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。食管癌早期诊断难,患者就诊时多为中晚期,预后差,探讨促进食管癌进展的分子机制对食管癌的诊断和治疗具有重要意义。富含嘌呤元件结合蛋白α（Purine-rich element binding protein alpha,PURα）是PUR蛋白家族成员之一,具有保守的核酸结合结构域,参与DNA复制、转录和修复以及RNA转运和翻译等多种生物学功能。PURα蛋白的异常表达除了参与神经系统疾病的发生外,近年发现PURα还参与一些恶性肿瘤的增殖调控,然而,PURα在食管癌中的表达和作用机制尚不清楚。本研究,首先探讨了 DNA结合蛋白PURα调控食管癌进展的分子机制。首先,分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中PURA基因在食管癌组织中mRNA表达水平,免疫组化分析评估PURα蛋白在食管癌中的表达水平,分析食管癌组织中PURα的表达水平与患者临床病理参数和预后的相关性,以及观察PURα对食管癌体外和体内肿瘤生物学表型的影响。通过构建稳定过表达和敲降PURα的食管鳞癌细胞系,利用CCK-8和平板克隆实验、划痕愈合和Transwell实验检测PURα对体外培养细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;建立裸鼠皮下移植瘤和尾静脉注射肝肺转移瘤模型,检测PURα对体内肿瘤增殖和肝肺等脏器转移能力的影响。进一步,探讨了 PURα影响食管癌进程的分子机理。对过表达和敲降PURA基因的食管鳞癌细胞的RNA-seq分析,发现受PURA调控的信号通路和差异表达基因。利用qPCR、Western blot和免疫荧光分析验证候选通路和基因,双荧光素酶报告基因和ChIP实验探究PURα对候选基因转录调控的影响,利用回复性实验验证候选基因影响PURα介导的食管癌表型改变中的作用。通过以上实验,我们发现,PURA mRNA和蛋白水平在食管癌组织中高表达,PURα高表达与食管癌患者的淋巴结转移和AJCC分期呈正相关（P<0.05）,且PURα高表达患者生存期更短（P<0.05）,提示PURα促进了食管鳞癌进展和不良预后。体内外功能实验发现,PURα促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进食管癌细胞的裸鼠致瘤和肝、肺等远处器官的转移能力。解析其机制,RNA-seq分析结果提示PURα参与细胞粘附分子和细胞外基质-受体相互作用等通路的调控,影响多个上皮和间质相关基因的表达;PURα下调E-钙黏蛋白（E-Cadherin,CDH1）、上调N-钙黏蛋白（N-Cadherin,CDH2）和波形蛋白（Vimentin,VIM）的表达,诱导食管癌细胞发生上皮-间叶转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。深入的机制分析表明,PURα可以与Snail家族锌指转录因子2（Snail family transcriptional repressor 2,SNAI2）基因启动子区-896至-431 bp的序列结合,促进SNAI2的转录活性,上调Snail2蛋白的表达。敲降SNAI2可抑制PURα诱导的EMT表型,降低食管癌细胞的运动、侵袭和转移的能力。总之,本研究发现PURα通过与SNAI2基因启动子区域结合,促进SNAI2转录活性,上调Snail2的表达,诱导食管鳞癌细胞发生EMT,进而促进食管鳞癌的增殖、侵袭和迁移,促进肿瘤进展。该研究为食管癌的诊断和治疗提供了新的分子靶标。肝癌（Liver cancer）是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在所有的恶性肿瘤中排名第四位,致死率高,预后差。RuvB-like 2（RUVBL2）蛋白属于与多种细胞活性相关的保守ATPase（AAA+）蛋白亚家族,其保守的WalkerA和B结构域可以参与ATP的结合和水解。有文献报道RUVBL2可能参与肝癌的发生,然而,RUVBL2的表达、调控和临床意义尚未系统性地在大规模肝癌临床样本中分析和验证。本实验室前期研究发现,RUVBL2蛋白在肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma.HCC）中表达上调,本研究探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能和表达调控机制。前期用免疫组化分析了 153例肝癌患者组织芯片的RUVBL2表达水平,在此工作基础上,我们对TCGA数据库中收录的371例肝癌患者的转录组测序数据、体细胞拷贝数改变数据和DNA甲基化数据进行整合分析,探究RUVBL2在肝癌中表达上调的原因和临床意义。进而在体外培养的肝癌细胞上探讨了 RUVBL2在肝癌中的生物学功能。在HepG2和Huh7肝癌细胞中瞬时敲降RUVBL2,利用CCK-8和平板克隆实验,以及Transwell实验检测RUVBL2对体外细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响:Western blot检测RUVBL2对热休克蛋白90（HSP90）、细胞分裂周期蛋白37（CDC37）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）和细胞外调解蛋白激酶（ERK）信号通路的影响。结果发现,RUVBL2基因启动子低甲基化、拷贝数增加,MYC基因扩增和CTNNB1基因突变可能参与调控RUVBL2在肝癌中表达水平增高。高水平的RUVBL2 mRNA与肝癌患者较短的无复发生存时间（Recurrence-free survival time.RFS）相关,但不影响总生存时间（Overall survival time,OS）。敲降RUVBL2肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低,并抑制HSP90-CDC37、AKT和ERK的磷酸化。以上结果提示,RUVBL2在肝细胞肝癌中的表达受到转录水平和表观遗传水平的调控。RUVBL2可能通过激活HSP90-CDC37、AKT和ERK通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,提示RUVBL2是肝癌的一个潜在预后预测标志和治疗靶标。本实验室前期采用全基因组关联分析（Genome-wide association analysis.GWAS）鉴定到位于2q33.1区域的5个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）位点与中国汉族人群食管鳞癌的发生显着相关。本研究还探讨了一个位于CASP8基因内含子中的主效位点调控食管癌易感性的机制。发现该位点通过影响剪接因子的结合而参与调控CASP8基因的选择性剪接,产生一个新的CASP8剪接亚型Caspase-8X。新剪接亚型编码C端催化结构域缺失的Caspase-8截短体蛋白Caspase-8X,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,与食管癌发生发展相关。该研究发现了一个参与调控食管鳞癌发生的新机制,为认识食管鳞癌癌变机理积累了科学数据。
张东红[2]（2014）在《高危型人乳头瘤病毒感染对食管癌不良预后的研究》文中提出研究背景：食管癌是世界范围内常见的,且具有明显地区聚集性的恶性肿瘤。在我国,食管癌预后较差,其死亡率一直居高不下,现位居所有肿瘤死亡原因的第四位,同样具有地域分布特征。广东汕头地区是我国唯一沿海食管癌高发区。我们前期研究表明该地区食管癌患者癌组织中人乳头瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）感染率在50-80%之间,并且以高危型HPV感染为主,但HPV感染对食管癌的致病机理和预后状况尚不清楚。端粒和端粒酶是染色体末端一种维持染色体完整和稳定的特殊结构,能防止染色体DNA降解、末端融合缺失和非正常重组。研究表明,端粒长度的进行性缩短和端粒酶的激活在肿瘤细胞的恶性转化和进展中起着重要作用。而端粒长度和端粒酶的表达均与端粒酶相关基因或亚端粒的DNA甲基化调控有关。因此,从端粒酶的表观遗传学修饰的角度探讨HPV感染与食管癌的相关性有助于食管癌病因学和食管癌患者预后的研究。研究目的与假说：目的：从端粒酶相关基因或亚端粒的DNA甲基化的角度分析HPV和端粒长度的相关性,以及对食管癌预后的影响,以期能为食管癌的病因学研究和预后分析提供一定的理论依据。假说：食管癌细胞中高危型HPV持续感染→HPV DNA断裂,E6/7癌基因整合入宿主基因组DNA的“脆性部位”→HPVE6/7癌蛋白稳定持续的表达→端粒酶相关基因（hTERT和TRF2）或亚端粒的DNA甲基化改变→食管癌中端粒长度的变化→增加癌细胞的恶性转化和永生化→影响食管癌患者预后。研究方法：通过构建分别含有HPV-16,-18和-58型E6/7和E2基因片段的质粒DNA,建立稳定且灵敏的绝对实时定量PCR技术（quantitative real time PCR, qPCR）,对70例食管癌患者中的癌组织及其配对的癌旁正常食管组织,以及60例正常人的食管粘膜组织中的高危型HPV-16,-18和-58型感染的病毒含量（E6/7基因拷贝数）和整合量（E2基因和E6/7基因拷贝数的比值）进行定量检测；采用免疫组化（immunohistochemistry, IHC）技术检测食管癌中HPV16E6蛋白的表达情况；以HEK293细胞DNA为标准品,采用实时定量PCR技术建立端粒长度的定量检测法方法,以检测食管癌和正常食管组织中的端粒长度；采用甲基化特异性PCR （methylation-specific PCR, MSP）技术检测食管癌中端粒酶相关基因人端粒酶催化亚单位(human reverse-transcriptase telomerase,端粒重复序列结合因子（Telomeric repeat-binding factor2, TRF2）和亚端粒DNA甲基化。采用SPSS16.0软件统计分析高危型HPV感染,端粒长度与DNA甲基化水平的三者之间相关性,以及对食管癌预后的影响。研究结果：（1）对构建的系列浓度HPV E6/7和E2基因标准品——含有HPV-16E6/7、HPV-16E2, HPV-18E6/7、HPV-18E2、HPV-58E6/7和HPV58E2基因片段质粒DNA,进行定量PCR扩增,其特异性较好。六种基因标准曲线的R2分别为0.9945、0.991、0.995、0.9976、0.9879和0.999,经相关性检验发现六个标准曲线均具有显着的相关性（P<0.05）。同时,E6/7和E2基因分别在三种型别HPV的扩增效率相一致。（2）食管癌组织中HPV-16,-18和-58病毒含量变异均较大,但三者之间无显着性差别。在食管癌组织中,三种型别HPV合并感染率和感染量均显着性高于正常食管组织（50.00%vs.33.33%, P=0.045;2.55±3.19vs.0.55±0.57copies/cell,P=0.021）。同时,HPV DNA的混合状态或整合状态在食管癌和正常食管中均较高（91.43%vs.85.00%）,但在食管癌中的整合状态比正常食管组织中显着性增高（F=17.832,P=0.001）。高危型HPV DNA的整合量与肿瘤分级呈正相关（r=3.753,P=0.033）,但与年龄、性别、吸烟、饮酒、家族史和淋巴结转移无关。HPV病毒含量与临床资料均无显着相关性。（3）免疫组化检测发现HPV16主要定位于食管癌细胞浆,HPV16蛋白在食管癌组织中的阳性率为59.26%,并随着肿瘤分级的增加而增加（r=0.301,P=0.027）。（4）从正常食管,到食管癌旁正常组织再到食管癌中,端粒长度依次缩短[4.77（4.28-5.33,）,4.37（3.89-5.09）和4.27（3.79-4.57）kb]（P趋势性检验<0.01）。（5）HPV或高危型HPV仅能延长食管癌组织中的端粒长度,而不影响正常食管和癌旁正常组织中的端粒长度。同时在食管癌组织中,端粒长度分别和高危型HPV基因的感染量和整合量呈正相关（r=0.410, P=0.037; r=0.492, P=0.01）。（6）食管癌组织中的端粒长度和癌/癌旁端粒长度比值分别在高危型HPV感染患者、食管癌细胞中HPV含量大于1的患者和HPV整合状态的患者中较长/大。同时,癌/癌旁端粒长度比值在吸烟患者、肿瘤分级为Ⅱ和Ⅲ的患者以及5年内死亡的患者中较大。（7）甲基化特异性PCR检测发现,食管癌中hTERT,7q,9q和XqYq均呈高甲基化状态,而TRF2、17q、18q和21q则呈低甲基化状态。7q基因甲基化水平分别与9q、18q呈正相关。而TRF2基因甲基化水平分别与hTERT、21q呈负相关。（8）相对与HPV阴性的食管癌患者,高危型HPV感染的患者中hTERT、18q和21q基因的甲基化水平较高,而TRF2较低。高危型HPV的整合量与hTERT甲基化水平呈正相关,与TRF2呈正相关。HPV病毒量和hTET、TRF2、7q、9q、17q、18q、21q、和XqYq基因甲基化水平无相关性。（9）相对于食管癌组织中端粒相对长度<0.7的患者,端粒相对长度≥0.7的患者中,hTERT和21q基因的甲基化水平增高,而TRF2则降低。食管癌组织中端粒长度分别与hTERT （r=0.318, P=0.007）和21q （r=0.297, P=0.013）基因甲基化水平呈正相关。（10）采用Kaplan-Meier分析和单因素Cox回归模型分析显示：肿瘤分级为Ⅲ级的食管癌患者,高危型HPV感染的患者以及癌/癌旁端粒长度比值≥0.8的患者预后较差,其生存的相对危险比（95%置信区间）值分别是对照组的3.13（1.26-7.50）、1.93（1.04-3.57）和2.30（1.19-4.46）。而食管癌患者的预后与年龄、性别、吸烟、家族史、淋巴结转移和HPV感染无关。采用多因素Cox回归模型分析显示：只有癌/癌旁端粒长度比值和高危型HPV感染分别是食管癌预后的独立指标,癌/癌旁端粒长度比值越大或高危型HPV感染的食管癌预后越差。研究小结：（1）采用实时定量PCR技术,我们构建了稳定且灵敏的HPV16,-18和-58型病毒绝对含量和整合量,以及相对端粒长度的检测方法；（2）食管癌患者中高危型HPV感染的拷贝数较低,但HPV DNA的高整合率可维持其蛋白的高表达状态；（3）端粒长度在食管癌变过程中进行性缩短,高危型HPV感染可逆转食管癌中端粒的缩短,使端粒长度维持在一定的长度；（4）高危型HPV感染维持端粒长度的过程与hTERT、TRF2和亚端粒21q的DNA甲基化水平有关；（5）高危型HPV感染、食管癌/癌旁端粒长度的比值分别是影响食管癌患者不良预后的独立危险因素。研究结论：食管癌患者肿瘤细胞中高危型HPV DNA的高感染率和整合率使其E6/7癌蛋白持续性高表达,进而可能通过端粒酶相关基因hTERT和TRF2的DNA甲基化水平的改变,影响了端粒酶活性,逆转食管癌中端粒的进行性缩短,增加细胞的恶性转化和永生化,与食管癌患者的不良预后密切相关。
陈艳[3]（2012）在《新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析》文中提出目的:尽管新疆哈萨克族居住环境及生活方式发生了变迁,但是哈萨克族食管癌的发病率和死亡率仍维持在较高水平。这是由于食管癌难以早期发现且预后较差,其5年生存率低于10%。目前,内镜下活检是食管癌早期发现及确诊的主要手段。活检组织主要是依靠病理作为定性诊断,但由于病理学诊断方法本身的局限性,对于一些癌前病变缺乏准确诊断。因此,识别各种病变的转化规律是关键。现有研究表明,癌基因和抑癌基因的表达异常,可能是导致细胞异常增生并进一步发生癌变的关键因素。所以,通过分析食管癌前病变基因的变化,筛选出特异的早期高相关基因,用于进行早期基因诊断,才是提高内镜诊断特异性和弥补病理形态学诊断不足的有效方法。而众多研究表明,食管癌癌旁组织的改变代表了早期食管癌的变化。因此,本研究以新疆哈萨克族食管鳞癌作为对象,采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学和相互作用的拓扑学方法,通过分析癌旁组织和远端无癌组织中癌基因和抑癌基因的表达改变,试图发现并确立食管鳞癌发生发展的早期高相关基因,并将哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因与国际上其他民族、地区食管癌早期相关基因进行拓扑学分析,比较二者的差异。这将为实施新疆哈萨克族食管鳞癌早期基因诊断提供实验依据和理论基础,建立的早期高相关基因将极大的提高内镜下活检诊断的特异度。同时也为食管鳞癌多基因发病机理研究奠定基础。方法:（1）应用半定量RT-PCR,分别在48例哈萨克族食管鳞癌组织和远端无癌组织,对42个候选基因进行mRNA水平的检测,依据mRNA表达比率的变化,筛选出高相关基因。高相关基因进一步在10例食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中运用半定量RT-PCR进行mRNA检测,依据结果,初步筛选出早期高相关基因,并应用Western blot检测部分早期高相关基因在10例鳞癌癌旁组织和远端无癌组织的蛋白表达。（2）扩大样本,在新的一组16例哈萨克族食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中运用半定量RT-PCR对筛选出的早期高相关基因进行检测。同时,以正常食管粘膜组织作为对照,将40例食管鳞癌癌旁组织样本,600张切片分成26组,每组18例,利用免疫组织化学方法对早期高相关基因蛋白进行检测。（3）对鉴定出的新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因,利用STRING9.0在线数据库和Pajek软件进行拓扑学分析,并与目前报道的其他地区和民族的早期食管鳞癌异常表达的蛋白质的相互作用,进行对比分析。结果:（1）通过比对42个候选基因在48例食管鳞癌组织和远端无癌组织中mRNA表达比率的差异,筛选出36个新疆哈萨克族食管癌高相关基因。（2）应用半定量RT-PCR、Western blot对36个高相关基因在10例食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中进行了分析,初步筛选了 26个新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因。（3）16例哈萨克族食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中半定量RT-PCR,以及18例食管鳞癌癌旁组织病理切片免疫组织化学的结果进一步验证了 26个早期高相关基因的表达改变。（4）对26个基因在早期个体标本中的表达分布进行分析,大约40%的个体都呈现的有 survivin、ETV5、MMP-7、TIMP-1、MMP-2、c-myc、c-fos、MTA1、CDK4、cyclinD1、MCM4、SKP2的基因表达组合。（5）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因26个蛋白和目前报道的在食管鳞癌早期异常表达20个蛋白质,两组数据构建的拓扑图截然不同,各组骨架结点图也不同。结论:（1）c-fos、Ki67、MCM4、ETV5、SKP2、TIMP-1、MMP-2、CDK4、MEMD、MTA1、MMP-7、c-myc、c-jun、Survivin、CyclinD1、BAG1、SP-17、c-erbB2、EphB4、CK-1、MGMT、periplakin、Snail、p33、Bax、E-cadherin 共 26 个基因为新疆哈萨克族食管鳞癌的早期高相关基因。（2）联合的多基因检测,可以有效提高特异性,不同基因的26种表达组合可作为早期诊断的实验依据。（3）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因相互作用拓扑图具有民族特异性,其网络中心结点蛋白,对于食管鳞癌分子机制的研究具有一定的提示作用。
陈小三[4]（2011）在《食管癌组织中Survivin和hTERT的表达及其相关性研究》文中认为目的探讨Survivin、hTERT两种凋亡调控基因在食管癌组织中的表达及其与临床病理因素的关系,并对两基因进行相关性分析。方法选择52例肺癌组织、30例癌旁肺组织及7例非食管癌组织,分别作为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测这三组中Survivin、hTERT基因表达的情况。结果1.在Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组中survivin阳性表达阳性率分别为88.5%（46/52）、83.3%（25/30）和28.6%（2/7）, hTERT分别为92.3%（48/52）、93.3%（28/30）和14.3%（1/7）。Survivin和hTERT在Ⅰ组和Ⅱ组中的表达阳性率明显高于Ⅲ组（P值分别为0.01和0.00）,而Ⅰ组与Ⅱ组之间无明显差异（P分别为0.52和1.00）。2. Survivin和hTERT在食管癌组织中表达与患者年龄、病理类型、分化程度、浸润程度、淋巴转移和临床分期无相关性（P均大于0.05）;3.在食管癌组织中Survivin和hTERT两基因的表达具有关联性（P=0.003）。结论Survivin和hTERT在食管癌的发生过程中起到重要作用。Survivin和hTERT在食管癌组织中的表达可能均是早期事件,联合检测这俩个基因可能对食管癌的早期诊断及相关治疗具有重要的意义。
王大虎[5]（2011）在《端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义》文中研究说明目的:食管癌（esophageal carcinoma, EC）是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一,我国的食管癌发病率较高,河北省磁县更是食管癌的高发区,严重影响着人们的生活质量和生命健康。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖和肿瘤的发生。端粒（telomere）作为分子钟控制着人类细胞的复制与衰老,与细胞的寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA长度会缩短55～200 bp,经历多次分裂后缩短至其下限时,细胞最终凋亡或死亡。端粒酶（telomerase）是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase , hTERT）是端粒酶发挥活化作用的重要途径,它的表达调控在端粒酶活性调节中起关键作用,是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。已有大量研究发现,在恶性肿瘤的发生中存在有端粒DNA长度的缩短,并且端粒酶的激活维持了大多数组织的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA消耗。说明端粒缩短在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有大量研究表明,人体正常细胞除少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞外,大多数细胞的端粒酶几乎都是无活性的,而与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化可能是恶性肿瘤发生发展的多种基因改变中起到了至关重要的作用,并且可以作为最具普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,将有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这种特性使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。本实验利用了多项实验方法检测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,探讨与食管癌发生及生物学行为的关系,试图为食管癌的早期诊断提供客观参考指标,并为揭示食管癌的发生、发展的机制提供理论依据。采用端粒重复序列扩增反应（TRAP）-ELISA和TRAP -银染法半定量技术,检测食管癌及异型增生组织中端粒酶活性的表达,探讨端粒酶活性与食管癌发生发展及其与临床病理因素的关系。PinX1基因作为端粒酶的内源性抑制基因,近年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达明显下降,端粒酶活性增强。但是也有研究显示PinX1在肝癌细胞中的表达与正常组织无显着差异,而与之相应的是此类肿瘤中大部分端粒酶活性也增强。目前PinX1基因在肿瘤细胞中的作用和对端粒酶活性的调控及在细胞癌变中的机制尚不十分清楚。有关PinX1基因在食管癌中的研究国内外也鲜有报道。PinX1基因的作用越来越引起人们的重视,但到目前为止,PinX1基因在食管癌中生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤等基因表达异常的有效手段,那么,通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞的增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验中利用多项技术,应用细胞模型研究PinX1在人食管癌、异型增生组织及正常食管组织中的表达,探讨PinX1与食管癌发生发展及与食管癌临床分期、病理分型及预后的相关性,并分析与端粒酶活性表达的相关性。研究转染PinX1基因前后细胞增殖凋亡等的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。同时我们应用TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。方法:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义收集采集自河北省磁县食管癌高发区现场的咬检组织1000例,所有患者未接受过化疗和放疗。从中选取130例,根据病情分为3组,第1组为正常食管组织36例,第2组为异型增生组织50例,第3组为食管鳞癌组织44例。经病理组织学诊断,50例异型增生食管粘膜组织中,22例为轻度增生组织,28例为重度增生组织;44例食管鳞状细胞癌中,20例为高分化鳞癌、11例为中分化鳞癌,13例为低分化鳞癌,25例侵及纤维膜及周围软组织,19例未侵及纤维膜;20例为淋巴结转移,24例为无淋巴结转移。采用流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）和免疫组织化学方法（immunohistochemistry, IHC）检测测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,分析与食管癌发生及与临床病理特征的关系。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义收集食管鳞状细胞癌手术切除标本130例,每例标本分别取癌组织、癌旁组织（距癌边缘2-5cm）及手术切缘正常食管粘膜（距癌边缘5cm以上）。从中选取50例食管鳞状细胞癌、异型增生及正常食管粘膜组织。经病理组织学诊断,50例食管鳞状细胞癌,39例为高中分化鳞癌,11例为低分化鳞癌,34例侵及纤维膜,16例未达到纤维膜,17例淋巴结转移,33例未转移。采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）、TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测食管癌组织、异型增生、正常粘膜组织中端粒酶活性和PinX1基因和蛋白的表达,分析端粒酶活性和PinX1表达与食管癌临床病理特征的关系。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响利用分子生物学技术构建pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒。采用脂质体转染方法将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒转染Eca109细胞,同时也设置空载体pCDNA3.1转染组。转染72小时后用G418进行稳定转染细胞的筛选,筛选出来的阳性细胞分别命名为Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTS方法检测过表达PinX1对Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞生长抑制作用。FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR、FCM、Western-blot方法检测Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞中PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测端粒酶活性在细胞中表达。结果:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义FCM检测端粒长度结果显示,端粒DNA长度在食管癌组织中表达量与正常食管组织相比明显缩短,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织的表达量呈现逐渐降低趋势（P<0.01）;端粒DNA长度在食管轻度增生、重度增生之间呈逐渐降低趋势,重度增生组与轻度增生组相比明显缩短（P<0.01）,轻度增生组与正常组比较无显着性差异（P>0.05）。随着细胞学分级增高,端粒DNA长度Q-FISH值逐渐降低,端粒DNA长度与细胞学分级呈负相关（r=-0.79, P <0.01）。FCM检测端粒酶hTERT基因蛋白含量,在癌、重度增生、轻度增生和正常食管的FI值分别为1.84±0.21、1.39±0.24、1.13±0.19和0.87±0.18,癌组hTERT含量高于重度增生组（P <0.01）、重度增生组高于轻度增生组（P<0.01）,轻度增生组与正常组相比无显着性差别。随着细胞学分级增高, hTERT的FI值随之升高, hTERT蛋白含量与细胞学分级呈正相关关系（r=0.83, P<0.01）。根据FI值>1.0为阳性表达的判断标准,轻度增生组、重度增生组和癌组hTERT蛋白阳性表达率分别为68.18%、92.86%和95.45%,重度增生组和癌组的表达率都高于轻度增生组（P<0.01）。FCM检测正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组细胞DNA含量,DI值分别为1.03±0.34、1.06±0.28、1.17±0.25和1.54±0.37,正常组、轻度增生组和重度增生组的DI值呈上升趋势（P>0.05）,癌组的DI值明显高于重度增生组。DI值与细胞学分级正相关（r=0.62, P<0.01）;正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组DNA异倍体率分别为11.11（4/36）、9.09（2/22）、28.57（8/28）和81.82（36/44）,癌组异倍体率高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）;从正常组到癌组PI值分别为10.98±4.11、14.15±4.76、18.97±5.27和28.79±5.47,随着细胞学分级的升高,PI值增大,癌组显着高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）。PI值与细胞学分级正相关（r=0.64, P<0.01）。130例食管样本的DI值与PI值高度正相关（r=0.76, P<0.01）;端粒长度Q-FISH值与端粒酶hTERT蛋白FI值负相关（r=-7.49, P<0.01）;端粒Q-FISH值与DI值负相关（r=-0.41, P<0.01）。IHC结果显示:端粒酶hTERT蛋白阳性颗粒呈棕黄色,阳性物质全部位于上皮细胞和癌细胞的核内。在异型增生组织,端粒酶hTERT蛋白的阳性表达部位主要集中在基底细胞层及其上方的细胞核内,随着食管黏膜上皮增生程度的加重,hTERT阳性细胞逐渐增多,阳性细胞带上移。正常食管粘膜组织中阳性表达率为11.1%（4/36）,异型增生组织和癌组织hTERT蛋白阳性表达率分别为44.0%（22/50）和86.37%（38/44）。三者阳性率比较,癌组织显着高于异型增生组织（P<0.01）,异型增生组织高于正常上皮组织（P<0.01）。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义端粒酶活性检查结果显示,在食管癌、异型增生和正常食管组织中,阳性表达率分别为84.0%、62.0%及6.0%,食管癌及异型增生组织与正常食管粘膜比较具有显着统计学差异（P<0.05）。端粒酶活性的平均A值分别为食管癌组织1.457±0.838、食管异型增生组织0.429±0.346和正常食管粘膜组织0.073±0.039。三组间两两比较端粒酶活性的平均A值均存在高度显着统计学差异（P<0.05）。按正常食管粘膜组织、食管异型增生组织和食管鳞癌组织的序列,端粒酶阳性表达率和平均A值依次明显增高。食管癌组织中端粒酶阳性表达率与组织学分级和淋巴结转移无关,而端粒酶活性的平均A值与组织学分级和淋巴结转移有关;食管癌组织中端粒酶阳性表达率及端粒酶活性的平均A值与其他临床病例因素如年龄、性别和浸润深度等无关。RT-PCR及FCM检测PinX1结果显示,PinX1 mRNA及蛋白在食管癌组织中表达均显着低于食管正常粘膜（P <0.01）,在食管正常粘膜、异型增生、癌组织之间呈现逐渐降低趋势（P <0.05）。食管癌组织中,PinX1 mRNA和蛋白与分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关（P <0.05）,与性别和年龄无明显相关（P >0.05）。食管癌组织中端粒酶活性表达与PinX1蛋白表达呈负相关性（rs =-0.883,P=0.000）。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒及空载体pCDNA3.1成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞,转染pCDNA3.1- PinX1重组质粒与空载体pCDNA3.1的阳性克隆细胞分别记为Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。MTS法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢（P<0.05）;而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异（P>0.05）。FCM测定细胞生长周期实验结果显示,转染PinX1基因的Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）为70.58±5.26,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）（分别为53.14±4.83及47.27±3.73）（P<0.05）。说明转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期（Fig. 3-9）。FCM测定细胞凋亡实验结果显示,流式细胞仪检测细胞凋亡表明:转染PinX1基因的Eca109细胞的凋亡率（%）为23.28±5.73,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的凋亡率（%）（分别为0.27±0.18及3.40±1.09）（P<0.05）。说明转染入PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、Western-blot和FCM检测结果显示,Eca109/ PinX1细胞中PinX1 mRNA和蛋白表达水平较Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞显着升高（P <0.05）。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低（P<0.05）。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数（PI）表达呈正相关性（rs=0.451,P=0.000）。结论:1端粒DNA长度在食管癌前细胞及癌细胞中明显缩短,并且随病变程度加重而递减。端粒酶hTERT、细胞内DNA含量和PI值在食管上皮癌变发生中明显递增,提示食管癌变与三者密切相关。端粒DNA长度、端粒酶hTERT在食管癌前病变早期即出现变化,可以做为监测食管癌发生发展的参考指标。端粒酶hTERT与食管癌的临床病理特征无关,不能做为食管癌病人预后的指标。端粒缩短、端粒酶hTERT高表达都与食管癌变密切相关,有望以上述二者为靶点指导抗肿瘤的基因治疗。2食管癌及异型增生组织中存在端粒酶活性表达,并存在量的差异。端粒酶活性在异型增生即呈现高表达,随着病变的加重,端粒酶活性依次显着增高,提示端粒酶参与了食管癌的发生与发展,端粒酶的激活是食管癌的早期事件。端粒酶可望成为食管癌的病情监测及早期诊断的生物学指标。端粒酶活性A值与食管癌的组织学分级和淋结转移有关,提示食管癌端粒酶活性A值可作为判断疗效和评价预后的指标。PinX1在食管癌组织中表达显着低于食管正常组织,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织之间呈现逐渐降低趋势。PinX1在食管癌中表达和病理分级呈负相关,分级越高,PinX1表达越低。浸润深度达到纤维膜者、有淋巴结转移者的PinX1表达要低于浸润深度未达到纤维膜者、无淋巴结转移者。认为PinX1是一种潜在的食管癌相关基因,检测PinX1的表达水平可能对评价食管癌恶性程度、转移潜能和预后评估有重要的临床价值。食管癌组织中端粒酶活性与PinX1表达呈显着负相关性,证实PinX1抑制端粒酶活性。3首次应用脂质体转染方法建立食管癌细胞株Eca109/PinX1,目前国内外文献尚未见相关报道。Eca109细胞转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期,细胞发生早期凋亡改变。Eca109细胞转染PinX1基因后,端粒酶活性明显降低,并且端粒活性与细胞增殖指数呈显着正相关,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。
贺红梅[6]（2007）在《食管上皮癌变过程中NF-κB、survivin、c-myc与hTERT的表达及意义》文中研究表明目的:食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一,其发生、发展是一个多基因、多步骤的复杂过程。在食管上皮的癌变过程中,端粒酶及其相关成分基因和蛋白的表达发挥着重要作用。人类端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶成分中的限速亚单位,而hTERT的表达是受多方面因素的共同调控的。本研究通过对食管癌变过程中核因子-кB（NF-кB）、存活素（survivin）、c-myc和人类端粒酶逆转录酶（hTERT）在组织中的表达及相关性的研究,阐述癌变的可能机制,从而为食管癌的早期诊断、预后判断以及针对hTERT为靶点的基因治疗提供理论依据。方法1应用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）方法检测了45例食管鳞状细胞癌组织,21例不典型增生组织和24例切缘正常组织中NF-кB、survivin、c-myc和hTERT蛋白的表达。2应用流式细胞技术（Flow Cytometry,FCM）对27例食管鳞状细胞癌组织、10例不典型增生组织和8例切缘正常组织中hTERT蛋白表达进行定量检测。3应用原位杂交技术（In Situ Hybridization,ISH）检测了45例食管鳞状细胞癌组织、21例不典型增生组织和24例切缘正常组织中hTERT mRNA的表达。结果1 hTERT在食管上皮不同病变中的表达采用ISH和IHC法分别检测hTERT mRNA和蛋白在45例食管鳞状细胞癌组织、21例不典型增生组织和24例切缘正常组织中的表达,其中原位杂交试验结果显示:hTERT mRNA在癌组织中的表达（84.4%）显着高于不典型增生组织（38.1 %）和切缘正常组织（4.2%）（P<0.05）;免疫组化结果显示,hTERT蛋白在癌组织中的表达（88.9%）显着高于不典型增生组织（57.1%）和切缘正常组织（12.5%）（P<0.05）。采用FCM法检测27例癌组织、10例不典型增生组织和8例切缘正常组织中hTERT蛋白表达量,其荧光指数（Fluorescence Index,FI）分别为1.59±0.14、1.25±0.17、1.00±0.19,三者之间差异有统计学意义（P<0.01）。综合IHC、ISH和FCM法检测结果,hTERT表达与患者年龄、性别、淋巴结转移及肿瘤的分化程度无关（P>0.05）;与食管癌的浸润深度有关（P<0.01）。食管癌组织中hTERT蛋白的表达与hTERT mRNA的表达有相关性（χ2=8.4586,P<0.01,c=0.3978）。2 c-myc在食管上皮不同病变中的表达采用IHC法检测45例食管鳞状细胞癌组织、21例不典型增生组织和24例切缘正常组织中的c-myc蛋白的表达发现,c-myc在癌组织中的表达（75.6%）明显高于不典型增生组织（52.4%）和切缘正常组织（16.7%）（P<0.05）。c-myc表达与患者年龄、性别及肿瘤的分化程度无关（P>0.05）;与食管癌的淋巴结转移、浸润深度有关（P<0.05）。3 survivin在食管上皮不同病变中的表达采用IHC法检测45例食管鳞状细胞癌组织、21例不典型增生组织和24例切缘正常组织中的survivin蛋白的表达发现,survivin在癌组织中的表达（82.2%）明显高于不典型增生组织（61.9%）和切缘正常组织（8.3%）（P<0.05）。IHC法检测结果显示,survivin表达与患者年龄、性别及肿瘤的分化程度无关（P>0.05）;与食管癌的淋巴结转移、浸润深度有关（P<0.05）。4 NF-кB在食管上皮不同病变中的表达采用IHC法检测45例食管鳞状细胞癌组织、21例不典型增生组织和24例切缘正常组织中的NF-кB蛋白的表达发现,NF-кB在癌组织中的表达（80.0%）明显高于不典型增生组织（57.1%）和切缘正常组织（20.8%）（P<0.05）。IHC法检测结果显示,NF-кB表达与患者年龄、性别、淋巴结转移及肿瘤的分化程度无关（P>0.05）;与食管癌的浸润深度有关（P<0.05）。5 hTERT mRNA与hTERT蛋白的关系在食管癌组织中hTERT mRNA的表达与hTERT蛋白的表达关系密切（χ2=8.4586,P<0.01,c=0.3978）。6 hTERT蛋白与NF-кB、survivin、c-myc蛋白的关系在食管癌组织中hTERT蛋白的表达分别与NF-кB蛋白（χ2=5.6250,P<0.05,c=0.3333）,survivin蛋白（χ2=6.8602,P<0.05,c=0.3646）,c-myc蛋白（χ2=17.3864,P<0.05,c=0.5279）的表达具有相关性。7 NF-кB蛋白与survivin、c-myc蛋白的关系在食管癌组织中NF-кB蛋白的表达分别与survivin蛋白（χ2=10.9840,P<0.05,c=0.4642）,c-myc蛋白（χ2=5.8957,P<0.05,c=0.3404）的表达有相关性。8 survivin蛋白与c-myc蛋白的关系在食管癌组织中survivin蛋白的表达与c-myc蛋白的表达有相关性（χ2=7.6294,P<0.05,c=0.3807）。结论1 hTERT mRNA和蛋白在食管癌组织中的表达明显高于不典型增生组织和正常食管粘膜组织,因而提示hTERT可能与食管癌的发生有关;hTERT与淋巴结转移及肿瘤分化程度无明显相关性;hTERT在有纤维膜浸润的原发性食管鳞癌中的表达明显高于无纤维膜浸润病例组,说明hTERT可能与食管癌的浸润有关;食管癌组织中hTERT蛋白的表达与hTERT mRNA的表达关系密切,提示hTERT蛋白的表达情况可以间接反映其mRNA表达水平,而且hTERT蛋白的高表达可能与hTERT基因转录水平的上调有关。2 c-myc蛋白在食管癌组织中的表达明显高于不典型增生组织和正常食管粘膜组织,因而提示c-myc可能与食管癌的发生有关;c-myc在有淋巴结转移的原发性食管鳞癌中的表达明显高于无转移病例组,提示c-myc可能与食管癌的转移有关;c-myc与肿瘤分化程度无明显相关性;c-myc在有纤维膜浸润的原发性食管鳞癌中的表达明显高于无纤维膜浸润病例组,说明c-myc可能与食管癌的浸润有关。3 survivin蛋白在食管癌组织中的表达明显高于不典型增生组织和正常食管粘膜组织,因而提示survivin可能与食管癌的发生有关;survivin在有淋巴结转移的原发性食管鳞癌中的表达明显高于无转移病例组,提示survivin可能与食管癌的转移有关;survivin与肿瘤分化程度无明显相关性;survivin在有纤维膜浸润的原发性食管鳞癌中的表达明显高于无纤维膜浸润病例组,说明survivin可能与食管癌的浸润有关。4 NF-кB蛋白在食管癌组织中的表达明显高于不典型增生组织和正常食管粘膜组织,因而提示NF-кB可能与食管癌的发生有关;NF-кB与淋巴结转移及肿瘤分化程度无明显相关性;NF-кB在有纤维膜浸润的原发性食管鳞癌中的表达明显高于无纤维膜浸润病例组,说明NF-кB可能与食管癌的浸润有关。5食管癌组织中hTERT蛋白的表达与NF-кB、survivin、c-myc蛋白的表达呈正相关,提示在食管癌的发生、发展过程中,NF-кB、survivin、c-myc可能上调hTERT的表达。6食管癌组织中NF-кB蛋白的表达与survivin、c-myc蛋白的表达呈正相关,提示在食管癌的发生、发展过程中,NF-кB与survivin、c-myc可能具有协同作用。7食管癌组织中survivin蛋白的表达与c-myc蛋白的表达呈正相关,提示在食管癌的发生、发展过程中,survivin与c-myc可能具有协同作用。
尹光文[7]（2006）在《尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶的表达及其与细胞凋亡、临床预后关系研究》文中研究指明尖锐湿疣（condyloma acuminatum,CA）是由人类乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染引起的一种常见的性传播疾病（sexually transmitted disease,STD），发病率居性传播疾病第二位，并呈逐年升高的趋势。CAI临床表现多为生殖器部位菜花状或乳头状增生物，少数可在短期内因疣体过度增生而形成巨大型CA（Buschke-loewenstein肿瘤）。CA虽多为良性增生物，但少数具有恶性转化的潜能。该病传染性大，对社会和家庭危害极大，严重影响患者身心健康。临床上CA治疗困难，存在治疗后高复发率的难题，这对控制该病的传播及流行造成很大困难，因而已受到人们的重视。 近年来，在肿瘤研究领域中细胞凋亡和端粒酶一直是医学界研究的热点问题。越来越多的资料表明，肿瘤不仅是增殖、分化异常性疾病，同时也与细胞凋亡异常密切相关。细胞凋亡受多种基因控制，survivin是近年来新发现的最强凋亡抑制因子，并与细胞增殖和血管生成有关；bax是bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡基因；caspase-3是细胞凋亡下游的关键执行者之一，处于凋亡途径的核心环节。端粒酶的激活与肿瘤凋亡、增殖平衡失调密切相关，端粒酶活性越强，抗凋亡作用也越强。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）的表达水平与端粒酶活性和细胞凋亡有关。 CA具有生长快、且易复发等特点，可能与凋亡相关基因的表达及端粒酶活性异常有关。目前虽有少数CA组织中细胞凋亡及端粒酶活性的相关研究，但有关凋亡相关基因survivin、bax及caspase-3在CA组织中表达研究；CA组织中hTERT蛋白
成静,李良菊,钱晓彬[8]（2003）在《食管癌组织中端粒酶mRNA的原位表达与临床相关性意义》文中指出目的:研究端粒酶活性在食管癌、癌旁组织、正常粘膜组织中的表达情况及与食管癌的临床病理联系,探讨食管癌组织中端粒酶活性在食管癌的发生、发展中的作用。方法:运用原位杂交技术检测端粒酶mRNA的表达。结果:在30例食管癌中,端粒酶mRNA的阳性表达率为93.3％,明显高于癌旁组织（阳性表达率为13.3％）和正常粘膜组织（阳性表达率为0％）（P<0.001）.端粒酶活性的表达强度与肿瘤的分化程度、浸润深度、临床分期及有无淋巴结转移有显着性相关（P<0.05）,与性别、年龄无相关性。结论:端粒酶的激活及表达强度对食管癌的诊断、治疗及预后判断有意义。
张蕾[9]（2002）在《食管鳞癌端粒酶活性的表达及反义寡核苷酸抑制端粒酶活性并诱导凋亡的研究》文中指出端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的特殊保护结构，它能防止染色体DNA的降解、末端融合、非正常重组和染色体丢失，端粒DNA的缩短与细胞的衰老、死亡密切相关。端粒酶（telomerase）是由RNA组分（human telomerase RNA component,hTR）、逆转录催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）和端粒酶相关蛋白（telomerase-associated protein 1 ／telomerase protein component 1，TP1／TLP1）组成的复合物，是一种能够延长端粒末端的反转录DNA合成酶。研究表明，人类大多数恶性肿瘤中具有端粒酶的高表达，而正常体细胞及良性病变中端粒酶无表达或低表达，且端粒酶活性与hTR和hTERT的表达密切相关。由于端粒酶具有以自身RNA为模板合成端粒DNA并维持端粒长度的功能，因此为肿瘤的靶向治疗提供了一条崭新思路：即通过以端粒酶RNA为靶点的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）抑制端粒酶活性，诱导肿瘤细胞凋亡，以达到治疗肿瘤的目的。随着对端粒及端粒酶研究的深入，以端粒酶RNA为靶点的ASODN在肿瘤治疗中的作用及其作用机制的研究已成为当今分子肿瘤病理学的研究热点。郑州大学Zop年博士研究生论文 食冒蹦鼾湍粒酶活仕的表达及反义寡快绑酚屹赋斜磷陌牲并诱导凋亡的研究 食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素。多步骤、复杂的渐进过程，而端粒酶的激活和端粒长度的稳定是细胞永生化和恶性转化的多步骤基因改变中重要的一环。迄今为止，有关食管鳞癌及不典型增生组织中端粒酶活性的定性和定量检测及其与临床病理因素关系的研究报道较少：食管鳞癌及不典型增生组织中端粒酶活性与hTR、hTERT表达的相关报道更为罕见；有关食管鳞癌和不典型增生组织中端粒长度及其与临床病理因素关系的研究，仅见国外一篇报道，且仅检测了食管癌组织的端粒长度，未对食管不典型增生组织进行检测：至于应用＊S＊＊N体内外抑制食管癌端粒酶活性、诱导凋亡及其作用机制的研究，国内外均未见报道。为了探讨食管鳞癌及不典型增生组织中端粒酶活性、hTR和 hTERT的表达及其相关关系；端粒长度及其与端粒酶的关系；以及阳离子脂质体介导的ASODN的体内外治疗的效果及作用机制，本文采用聚合酶链反应－酶联免疫吸附测定法门RAPELISA)定量及聚合酶链反应－银染法定性技术、原位杂交技术、免疫组化技术、Southern印迹杂交技术、化学发光检测技术及阳离子脂质体介导的ASODN体内外治疗等技术，对食管鳞癌。不典型增生组织及正常食管粘膜的端粒酶活性、hTR及hTERT表达。端粒长度进行了检测和分析；评价了封闭端粒酶RNA不同基因位点的ASODN，在体内外对食管癌细胞生长及端粒酶活性的抑制作用；在封闭端粒酶KNA功能区的反义寡核昔酸（ASODN叶3）连续7d体内外治疗食管癌的基础上，观察了ASODN－t3对细胞生长和端粒酶活性的抑制以及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。为探讨端粒酶在食管癌发生发展中的意义以及ASODN抑制端粒酶活性在食管癌靶向治疗中的作用提供理论依据。本实验分为以下三部分。郑州大学2＊2年博士研究生论文 食管鳞癌 性的表达及反义寡核昔酸抑＄惴湘酶活仕并诱导凋亡 院 第一部分 食管鳞癌及不典型增生组织中端粒酶活性、端粒长度及其相关研究 方法 l．应用T叫P上LISA定量、TW一染法定性法对38例食管鳞癌组织、15例不典型增生组织及12例正常食管粘膜组织标本进行了端粒酶阳性表达率及端粒酶活性A值的检测。 2．应用原位杂交及免疫组化技术对上述标本进行 hTR mRNA和hTERT蛋白表达的检测。 3．应用Southern印迹杂交和化学发光检测技术对上述标本进行端粒长度检测。 4．统计学处理：应用SPSS统计软件包，采用x‘检验、Fisher精确概率法、t检验、方差分析和直线回归分析，对所有资料进行统计学分析。检验标准以Pwto刀5为差异有显着性，P＜0刀1为差异有高度显着性。 结果 l．食管鳞癌端粒酶阳性表达率为84．ZIo（3门8），不典型增主为60．00o（门），正常食管粘膜为8．33OO门2卜食管鳞癌及不典型增生组织与正常食管粘膜比较具有显着性差异（P＜0刀5），食管鳞癌端粒酶阳性表达率高于不典型增生组织，但无显着性差异（P＞0刀5卜端粒酶活性的A值分别为食管鳞癌1．440L0．857、食管不典型增生0．486t0．302和正常食管粘膜0刀75L0刀49，三组间两两比较，端粒酶活性的A值均存在显着性差异（P＜0刀5卜 2．端粒酶活性的A值与食管鳞癌的组织学分级、淋巴结转移有关peo刀5，P1刀1），而与患者年龄／性别、肿瘤大小、大体类型、浸润深度等无关（P＞0“）。 3．食管鳞癌hTR的InRNA表达率为71．05oC7G8），不典型增生 3 郑付1大学2＊2年博士研究生论文 食管勘癌 旺的表达及反义嘉蹈招湖沛筛歧耕铂网舌性并诱导凋亡的研究为33．33o广八5卜正常食管粘膜为0．00o(八2卜三组间两两比较均具
李淳[10]（2001）在《人食管癌癌变过程端粒酶活性的研究》文中研究指明端粒酶是一种核糖核蛋白酶，它可合成端粒DNA，在正常体细胞中其活性受到抑制，但在肿瘤发生过程中，其活性被激活。本研究的目的是：（1）研究食管癌癌变过程端粒酶活性的情况；（2）了解癌组织中端粒酶活性与分化程度、浸润深度及与淋巴结转移的关系；（3）研究食管癌癌变过程hTERT、TP-1的mRNA表达情况及其与端粒酶活性的相关性；（4）研究食管癌癌变过程c-myc、bcl-X/L蛋白表达情况及其与端粒酶活性的相关性。 材料与方法：收集经病理确诊的手术切除新鲜食管癌标本45例，每例分别取癌灶、癌旁粘膜和远端切缘食管粘膜各一式二份。一份作连续冰冻切片，供检测端粒酶活性和hTERT、TP-1原位杂交用；另一份经10％福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，供c-myc、bcl-X/L免疫组织化学检测用。本文采用显微切割TRAP-银染法检测端粒酶活性；原位杂交法检测hTERT、TP-1的mRNA表达；免疫组织化学法检测c-myc、bcl-X/L的蛋白表达。 结果：45例全部为鳞癌，其中28例伴有区域淋巴结转移。1．显微切割TRAP-银染法检测端粒酶活性的结果： 端粒酶活性在癌旁非典型增生粘膜上皮及原位癌、浸润性癌中检出率明显高于正常上皮及单纯增生上皮，阳性率分别为79.3％、80.0％和82.2％。正常上皮及单纯增生上皮的阳性率分别为5.0％及9.0％。癌前病变组与非癌变组（包括正常上应及单纯增生上皮）比较差异有极显着性（P<0.01），而癌前病变组、原位癌、浸润性癌之间比较差异无显着性（P>0.05）。 端粒酶活性在同一癌组织不同浸润深度、不同分化程度的癌巢中差异无显着性（P>0.05）。 端粒酶活性在分化程度为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的不同癌组织中的阳性率分别为66.7％（8/12）、84.6％（22/26）及100.0％（7/7），其差异无显着性（P>0.05）。 端粒酶活性在有淋巴结转移者中阳性率（92.9％）高于无淋巴结转移者（64.7％），两者差异有显着性（P<0.05）。 2．原位杂交检测 i。TERTmRNA的结果： hTERTmRNA阳性物定位于胞浆内，呈棕黄色细颗粒状，正常粘膜上皮中无 表达，少数单纯增生上皮中开始出现表达，癌旁非典型增生上皮及原位癌、浸 润性癌中表达较高，阳性率分别为55二％、60％及64．4％。癌前病变组与非癌前 病变组阳性率比较有极显着差异p＜0对门。癌前病变组与原位癌、浸润性癌比 较则差异无显着性o功．0引。 h TETE RTmRTm RNRNA在癌组织中表达与端粒酶活性有相关性（P＜0对引。 3．原位杂交检测 TP－lmKNA的结果 TP mRNA阳性物定位于跑浆内，呈棕黄色细颗粒状，少部分正常粘膜上 皮及单纯增生上皮中有表达，癌旁非典型增生上皮及原位癌、浸润性癌中表达 较高，阳性率分别为 58，6O、50％及 62．2o。癌前病变组与非癌前病变组阳性率 比较有极显着差异（P＜0刀1）。癌前病变组与原位癌、浸润性癌比较则差异无显 着性（P＞O．05）。 ＊F1＞ RNRNA在癌组织中表达与端粒酶活性无相关性（P＞0刀5）。 4．免疫组织化学检测c－myc蛋白的结果 c－myc蛋白阳性物位于胞浆和／或胞核内，呈棕黄色细颗粒状，少部分正常粘 膜上皮及单纯增生上皮中有表达，癌旁非典型增生上皮及原位癌、浸润性癌中 表达较高，阳性率分别为 62．l％、90％及 82．2％。癌前病变组与非癌前病变组阳 性率比较有极显着差异（P＜0刀1）。癌前病变组与原位癌、浸润性癌比较则差异 无显着性（P＞0．oj）。 c－myc蛋白在癌组织中表达与端粒酶活性有相关性（P、0刀5人与hTERTmRNA 表达有极显着相关o＜0对门。 5．免疫组织化学检测bCI－X／L蛋白的结果 bCI－Xh蛋白阳性物在胞浆内呈棕黄色细颗粒状，少部分正常粘膜上皮及单 纯增生上皮中有表达，癌旁非典型增生上皮及原位癌、浸润癌中表达较高，阳 性率分别为62．l％、80％及对，l％。癌前病变组与非癌前病变组阳性率比较有极 显着差异 呼＜0刀1）。癌前病变组与原位癌、浸润癌比较则差异无显着性 o＞O仍）。非典型增生中，克 中、重各组的阳性率为36．＊％、肥＊％及100％， 呈逐渐升高，差异有显着性叩＜O‘0引。 ｝ bCIX／L 蛋白在癌组织中表达与端粒酶活性有极相关性（P＜0．01）。与h＊＊RTn N A表达也有极显着相关性（P＜0刀1）。 结论 1．食管癌癌前病变、癌组织
二、食管癌组织中端粒酶mRNA的原位表达与临床相关性意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、食管癌组织中端粒酶mRNA的原位表达与临床相关性意义（论文提纲范文）
（1）功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究（论文提纲范文）
| 基金支持 |
| 缩略语索引表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 PURα在食管鳞癌组织中的表达与临床病理特征分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 食管癌组织中PURA mRNA水平显着升高 |
| 2. 食管鳞癌组织中PURα蛋白水平显着升高 |
| 3. PURα高表达与AJCC分期和淋巴结转移正相关 |
| 4. PURα高表达的ESCC患者生存期更短 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 PURα影响食管癌生物学特性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 建立PURα稳定过表达和敲降的食管鳞癌细胞系 |
| 2. PURα促进体外食管癌细胞的增殖 |
| 3. PURα促进体外食管鳞癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4. PURα促进体内食管鳞癌的肿瘤增殖和转移能力 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 PURα促进食管癌进展的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. PURα调控食管鳞癌细胞转录组的RNA-seq分析 |
| 2. PURα调控食管鳞癌细胞EMT相关分子的转录 |
| 3. PURα上调EMT关键转录因子Snail2的表达 |
| 4. PURα通过促进Snail2的表达诱导食管鳞癌细胞发生EMT |
| 5. PURα通过调控Snail2促进食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 6. PURα通过Snail2在体内诱导食管鳞癌细胞EMT转变 |
| 7. PURα调控SNAI2的转录活性 |
| 8 PURα直接与SNAI2的启动子区域结合 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 RUVBL2在肝细胞肝癌中的调控机制和生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 在肝癌组织中RUVBL2的mRNA水平显着升高 |
| 2. RUVBL2 mRNA水平与患者临床病理参数相关性分析 |
| 3. RUVBL2 mRNA水平与患者生存的相关性 |
| 4. 肝癌组织中RUVBL2 mRNA的异常转录调控 |
| 5. RUVBL2促进体外肝癌细胞的增殖 |
| 6. RUVBL2促进体外肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 7. RUVBL2激活HSP90-CDC37、AKT和ERK通路 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 CASP8基因单核苷酸多态性调控食管鳞癌易感性的机理研究 |
| 文献综述 选择性剪接与细胞癌变研究进展 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文和获奖证书 |
（2）高危型人乳头瘤病毒感染对食管癌不良预后的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HPVE6/7和E2基因定量PCR扩增标准曲线的建立 |
| 2.2 食管癌组织中HPV病毒含量和整合情况分析 |
| 2.3 食管癌组织中HPV16表达情况分析 |
| 2.4 端粒相对长度定量PCR扩增标准曲线的建立 |
| 2.5 端粒长度在食管癌变中逐渐缩短 |
| 2.6 高危型HPV感染维持食管癌中端粒长度 |
| 2.7 端粒长度与食管癌患者临床资料的相关性 |
| 2.8 食管癌中端粒酶相关基因和亚端粒甲基化水平及其内在相关性 |
| 2.9 端粒酶相关基因和亚端粒甲基化水平与HPV感染的相关性 |
| 2.10 端粒酶相关基因和亚端粒甲基化水平与端粒长度的相关性 |
| 2.11 高危型HPV的感染、端粒长度和食管癌患者预后的相关性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 食管癌中HPV感染现状研究 |
| 3.2 食管癌中HPV感染对端粒长度的影响 |
| 3.3 食管癌中hTERT、TRF2和亚端粒的甲基化对端粒长度改变的影响 |
| 3.4 HPV感染、DNA的甲基化和端粒长度对食管癌患者预后的影响 |
| 3.5 研究中的创新与不足 |
| 4 研究结论 |
| 5 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间科研论文和基金资助情况 |
| 致谢 |
| 本人筒历 |
（3）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 候选基因在新疆哈萨克族食管鳞癌初步筛查的研究 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 确立新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的研究 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的相互作用 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）食管癌组织中Survivin和hTERT的表达及其相关性研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 凋亡调控基因 Survivin 和 hTERT 在食管癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 端粒DNA 长度及端粒酶hTERT 在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 食管癌中的端粒酶活性和PinX1 的表达及其生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基因转染PinX1 对食管癌Eca109 细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 端粒、端粒酶和PinX1 与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）食管上皮癌变过程中NF-κB、survivin、c-myc与hTERT的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 食管上皮癌变过程中 NF-кB、survivin、c-myc与hTERT 的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 NF-кB、hTERT 与肿瘤的生成 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶的表达及其与细胞凋亡、临床预后关系研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一部分 尖锐湿疣组织中凋亡相关基因survivin、bax和caspase-3蛋白及mRNA的表达研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 尖锐湿疣组织中端粒酶逆转录酶蛋白和mRNA的表达及其与survivin、bax、caspase-3和细胞凋亡关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶蛋白及mRNA表达与临床预后关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读博士期间发表论文情况 |
| 英文缩写词索引 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）食管鳞癌端粒酶活性的表达及反义寡核苷酸抑制端粒酶活性并诱导凋亡的研究（论文提纲范文）
| 论文 食管鳞癌端粒酶活性的表达及反义寡核苷酸抑制端粒酶活性并诱导凋亡的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 食管鳞癌及不典型增生组织中端粒酶活性、端粒长度及其相关研究 |
| 第一章 食管鳞癌及不典型增生组织中端粒酶活性及其基因组分的相关研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第二章 食管鳞癌及不典型增生组织中端粒长度及其与端粒酶活性的相关研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 封闭端粒酶RNA不同基因位点的反义寡核苷酸体内外抑制食管癌端粒酶活性的研究 |
| 第一章 封闭端粒酶RNA不同基因位点的反义寡核苷酸抑制食管癌细胞端粒酶活性及增殖的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第二章 封闭端粒酶RNA不同基因位点的反义寡核苷酸在裸鼠体内对食管癌移植瘤作用的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 封闭端粒酶RNA功能区的反义寡核苷酸体内外诱导食管癌细胞凋亡的研究 |
| 第一章 封闭端粒酶RNA功能区的反义寡核苷酸诱导食管癌细胞凋亡的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第二章 封闭端粒酶RNA功能区的反义寡核苷酸在裸鼠移植瘤动物模型体内抗食管癌作用的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附照片 |
| 参考文献 |
| 综述 端粒及端粒酶调控在肿瘤治疗方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间正式出版的论着及获奖情况 |
| 致谢 |
| 英文缩写词索引 |
（10）人食管癌癌变过程端粒酶活性的研究（论文提纲范文）
| 一 中文摘要 |
| 二 英文摘要 |
| 三 正文 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 四 综述 |
| 参考文献 |
四、食管癌组织中端粒酶mRNA的原位表达与临床相关性意义（论文参考文献）
- [1]功能基因PURA、RUVBL2和CASP8调控消化肿瘤进展的作用机制研究[D]. 高佳佳. 北京协和医学院, 2021
- [2]高危型人乳头瘤病毒感染对食管癌不良预后的研究[D]. 张东红. 北京协和医学院, 2014(11)
- [3]新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析[D]. 陈艳. 新疆医科大学, 2012(05)
- [4]食管癌组织中Survivin和hTERT的表达及其相关性研究[D]. 陈小三. 广西医科大学, 2011(08)
- [5]端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义[D]. 王大虎. 河北医科大学, 2011(10)
- [6]食管上皮癌变过程中NF-κB、survivin、c-myc与hTERT的表达及意义[D]. 贺红梅. 河北医科大学, 2007(06)
- [7]尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶的表达及其与细胞凋亡、临床预后关系研究[D]. 尹光文. 郑州大学, 2006(11)
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