一、人肺癌细胞LALU血管生成过程的形态学观察及意义（论文文献综述）
宋晓萍[1]（2021）在《七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究》文中研究说明本实验室前期从七鳃鳗组织中分离纯化一种选择性识别并杀伤肿瘤细胞的免疫蛋白LIP（Lamprey Immune Protein）,其具有凝集素结构域（Jacalin＿like）和气单胞菌溶素结构域（Aerolysin correlation）,LIP蛋白通过识别乳腺癌细胞（MCF-7）膜表面Neu5Gc唾液酸修饰的糖型结构靶向肿瘤细胞,在细胞膜表面沉积进而杀伤肿瘤细胞。由于正常细胞表面没有Neu5Gc修饰的糖型结构,因此LIP蛋白对正常组织细胞（MCF-10A）没有较强或者很少的识别、结合和杀伤效果。肺癌是我国以及国际范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,晚期肺癌主要依靠药物治疗,在治疗过程中对正常细胞也产生杀伤作用等一系列药物副作用。由于药物副作用的存在使得肺癌治疗药物的选择成为临床医生的关注点之一,所以探究LIP对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的识别和杀伤作用并揭示其作用机制至关重要。首先,使用LIP蛋白筛查23株不同组织来源的肿瘤细胞系,LIP对各组织来源的肿瘤细胞系有不同的识别能力和杀伤作用,说明LIP对肿瘤细胞杀伤具有特异性选择和一定的广谱性,而对正常组织细胞无结合和杀伤作用。通过高内涵成像分析系统和乳酸脱氢酶（LDH）方法检测LIP对人小细胞肺癌NCI-H446、人肺鳞癌细胞NCI-H520、人肺腺癌A549和正常肺上皮细胞L132的杀伤情况,细胞死亡率结果表明随着LIP浓度的增加,NCI-H446、NCI-H520、A549细胞的活力降低。A549细胞死亡率最低,为26.7%;NCI-H520细胞的死亡率最高,为61.3%。和临床常用的化疗药物顺铂,紫杉醇,5-Fu尿嘧啶比较,低剂量的LIP蛋白也可以达到高剂量化疗药物的杀伤效率,使细胞微团塌陷,破碎,不再聚集成团。同时发现LIP蛋白除单独应用对肿瘤细胞有作用外,与顺铂联合用药处理肿瘤细胞更能增加其对肺癌细胞的杀伤效果,随着浓度的增加,杀伤效率增加。细胞迁移实验结果显示,LIP显着抑制三种肺癌细胞的迁移,相反,它并没有抑制L132细胞的迁移。通过荧光探针、免疫荧光结合共聚焦显微镜对线粒体,内质网及细胞骨架进行观察,结果显示LIP促使肺癌细胞线粒体变短并皱缩成球形,线粒体数量明显减少,荧光消失;LIP引起内质网肿胀和损伤,导致空泡化,严重破坏细胞稳态,使细胞内容物外泄导致凋亡;LIP造成肺癌细胞骨架系统瓦解,微管解聚。采用Annexin V-FITC方法检测LIP对肺癌细胞凋亡的影响,结果显示LIP促使三种肺癌细胞磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻。流式细胞术实验结果显示,2μM和4μM LIP处理L132细胞24 h后,细胞处于相对稳定状态。相同剂量LIP处理NCI-H446、NCI-H520、A549细胞24 h后,细胞凋亡率明显增高。同时,LIP破坏线粒体,降低线粒体膜电位。从共聚焦显微镜图像可以看出,LIP处理的三种肺癌细胞的活性氧（ROS）水平高于未处理的对照组,说明LIP介导肿瘤细胞的破坏与活性氧有关。为了探究LIP诱导肺癌细胞凋亡的机制,LIP处理NCI-H446、NCI-H520和A549细胞后,通过免疫印迹检测PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达均显着上调且呈时间和剂量依赖性,明确内质网诱导的凋亡依赖于IRE-1、ATF-6和PERK通路,导致下游CHOP表达上调。在内质网应激抑制剂4-PBA作用48h后,PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达水平显着降低。总之,七鳃鳗免疫蛋白LIP通过内质网应激信号通路介导肺癌细胞凋亡。本文建立肺癌小鼠荷瘤模型并在细胞瘤处直接注射LIP蛋白,能显着延缓肿瘤生长速度,肿瘤组织明显缩小,但是对小鼠正常组织细胞没有明显的副作用。通过免疫组化实验检测发现,LIP可以选择性识别人肺癌组织样本,而对癌旁组织无识别效果。
申洁[2]（2021）在《中国黄芩属药用植物亲缘学研究》文中认为药用植物是世界各民族传统药物的主要来源,是现代药物开发利用的重要源泉。对重要药用植物类群的整理、挖掘和现代研究,一直以来是中医药传承和创新发展的重要组成部分。唇形科（Lamiaceae）黄芩属（Scutellaria）植物在世界范围内广泛分布,全球约有360-469种植物,其中约72个种或变种在世界各地作药用。我国约有126种或变种,其中约45个种或变种有传统药用记载。现代研究表明,该属植物具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、保肝和神经保护等多方面的显着活性,显示黄芩属蕴含丰富的药用植物,为一类重要的药用植物类群,值得深入挖掘和利用。然而,除了黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）和半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）等少数几个种得到较深入的研究外,大部分黄芩属植物的化学成分和药理活性研究较少或没有得到研究。同时由于物种数多且性状变异复杂,该属植物的分类和亲缘关系不清。因而需要从系统生物学的角度对该属进行综合研究,揭示不同来源物种的药用亲缘关系,以期发现新的药用资源和活性成分。为此,本论文基于药用植物亲缘学理论,采用叶绿体基因组技术揭示中国产黄芩属35种植物亲缘关系;采用植物代谢组学技术揭示该属植物主要成分的分布规律;采用体/内活性研究揭示该属植物的抗肿瘤活性特征;并从系统的角度分析了黄芩属植物亲缘关系-化学成分-活性之间的可能存在的内在联系。具体研究内容及结果如下:1.黄芩属植物物种数多且性状变异复杂,经典的形态分类分歧大,没有得到有效统一。本研究采用叶绿体基因组构建系统发生树,为合理探讨黄芩属药用亲缘关系提供参考背景。通过二代高通量测序技术首次报道了中国24种黄芩属植物叶绿体基因组.:长度在151574-152591 bp之间,平均GC含量为38.34%;共注释了 1 13个基因,包括80个蛋白编码基因、29个tRNA和4个rRNA。并与已发表的其它11种黄芩属植物的叶绿体基因组一起进行了比较分析和系统发育树的构建:发现了丰富的简单序列重复位点,其中单核苷酸重复位点所占比例最高,五核苷酸重复位点所占比例最低;发现16个高变区可作为潜在的DNA条形码。研究结果不仅初步揭示了中国黄芩属主要药用物种的亲缘关系,而且推动了黄芩属植物的分子系统构建。2.天然产物是药用植物活性物质基础和新药发现的重要来源。黄芩属为丰产药物类群,但大部分物种化学成分研究较浅或尚为空白。系统分析和比较该属化学成分分布规律是揭示黄芩属药用亲缘关系、发现潜在药用资源和活性成分的基础。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术首次对35种中国黄芩属植物进行了代谢组学分析:共在线鉴定出196个化合物,包括118个黄酮类化合物、30个二萜类化合物、5个吡喃酮苷类化合物、3个苯乙醇苷类化合物和其它类化合物39个。其中有85个化合物是首次在黄芩属植物注释到;基于特征数据矩阵的多元统计分析将35种植物基本归为两大组,与基于叶绿体基因组构建的分子系统发育树基本吻合;同时,还鉴定出不同组黄芩属植物的差异化学成分,发现不同组黄芩属植物主要差异化学成分与其传统功效存在一定的联系。研究结果为揭示黄芩属植物化学成分分布规律和黄芩属药用亲缘关系的阐明提供了基本数据,同时也为黄芩属潜在药用植物资源的开发利用奠定了基础。3.黄芩属植物中部分药用植物和化学成分抗肿瘤活性显着。但黄芩属植物抗肿瘤作用和分子机制的全局分析仍然有限。本研究首先运用网络药理学方法建立其抗肿瘤活性成分-靶点-通路-疾病的分子网络,分析结果显示:黄酮类及二萜类化合物是黄芩属植物抗肿瘤的主要活性成分,其中芹菜素、黄芩素、半枝莲碱G等为排名靠前的10个潜在关键活性成分;相关作用靶点86个,肿瘤相关通路203条,经拓扑筛选获得关键靶点为AKT1、EGFR、VEGFA和HSP90AA1等;GO功能与KEGG富集分析显示,黄芩属植物主要成分可能通过调节PI3K-Ak、Estrogen、HIF-1和FoxO等信号通路抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭,抑制肿瘤血管生成,减轻炎症反应等。分子对接结果显示潜在关键活性成分与核心靶点具有稳定的结合。为验证网络药理学分析结果,进一步采用肿瘤细胞体外生长抑制方法（蛋白染料磺酰罗丹明B染色法）,基于3种人源肿瘤细胞,测定了芹菜素、黄芩素和合金欢素等14种化合物以及35种黄芩属植物的甲醇提取物,并对活性较高的提取物进行了代谢组学和主要活性化合物含量测定分析。结果发现:黄酮苷元普遍对各肿瘤细胞有较好的抑制活性,特别是木犀草素和黄芩素对人肺癌A549细胞、人肝癌Bel7402细胞和人结直肠癌HCT116细胞均具有显着的抑制活性;京黄芩黑龙江变种的提取物表现出较突出的人肝癌细胞和人结直肠癌细胞抑制作用,京黄芩提取物表现出较好的人结直肠细胞癌抑制作用,量效关系分析显示其中化合物白杨素、木犀草素、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素可能是京黄芩及其黑龙江变种发挥抗肿瘤活性的主要活性化合物;滇黄芩根部对三种肿瘤细胞也有一定的抑制作用,滇黄芩根部中的黄芩素、白杨素、汉黄芩素以及高含量的黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷与千层纸素A可能是其抗肿瘤活性化合物。研究结果不仅部分验证了网络药理学的分析结果,为黄芩属植物进一步抗肿瘤活性研究提供了方向。同时本实验中超过一半以上的黄芩属提取物为首次进行抗肿瘤活性研究,可为黄芩属植物抗肿瘤活性资源的发现提供有益参考。4.黄芩茶主要由黄芩的地上部位制成,传统作为代茶饮,具有清热燥湿、降火解毒等功效。基于对黄芩属植物药用亲缘学的分析和前期研究,提示黄芩茶可能具有较好的防治肿瘤作用,为了验证这一假设,本研究对黄芩茶化学预防结直肠癌作用及其机制进行研究,结果发现:黄芩茶能够显着抑制氧化偶氮甲烷诱导的异常隐窝病灶形成;可显着降低IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α以及升高IFN-γ等炎症因子的水平;结合伪无菌大鼠模型,发现调节肠道菌群是黄芩茶预防结直肠癌作用的重要途径,16S rDNA测序分析表明,黄岑茶可通过增加有益菌群（Lachnoclostridium,Alistipes,Roseburia,Lactococcus）的丰度,降低 Bacteroides、Parasutterella 和unidentifiedClostridiales水平来调节肠道菌群结构;粪便代谢组学显示,黄岑茶可改善氧化偶氮甲烷诱导的代谢紊乱,这些发生改变的代谢物主要参与脂质代谢途径,且与肠道菌群变化之间有相关性。本研究表明黄芩茶可通过降低炎症、调节肠道菌群结构和改善代谢紊乱来抑制氧化偶氮甲烷诱导的异常隐窝灶形成,表明黄芩茶有潜力作为预防或治疗结直肠癌的药用资源和功能性饮料。5.为了揭示黄芩属植物的药用亲缘关系,本文基于上述研究结果,并结合相关文献报道,对中国黄芩属植物亲缘关系-化学成分-活性（传统疗效和药理活性）之间的联系进行了探讨。囊萼黄芩亚属植物、黄芩亚属的膜苞黄芩组和顶序黄芩组的狭叶黄芩亚组植物,亲缘关系近,聚为一个类群,都具有发达的根部。该类群植物常以根部入药,包含的高含量的黄酮类化合物可能与清热解毒、祛湿的传统疗效和抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝等的药理活性相关。此外,连钱黄芩亚属植物与黄芩亚属的其他类群可归为一大类。此大类植物通常根茎不发达,常以全草入药。黄酮类和/或二萜类化合物为该类群植物的主要化合物,可能与清热解毒、祛湿、消痈、消肿等传统功效和抗肿瘤、抗炎等药理活性相关。对我国黄芩属植物药用植物亲缘学的探讨可为黄芩属药用植物资源的深入开发提供科学的理论依据。综上所述,本论文从分子系统学、代谢组学和抗肿瘤药理活性等多个视角,整合了多层次研究数据,对中国黄芩属植物的药用亲缘关系进行了较为系统地研究和探讨。研究结果可为黄芩属植物活性天然产物和抗肿瘤活性植物资源的发现提供方向,为该属植物的进一步深入研究和开发利用奠定了良好基础。
王文平[3]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中指出研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
万令飞[4]（2020）在《Ⅰ.miR-194-5p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 Ⅱ.功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的增殖》文中认为近年来,肿瘤微环境的研究越来越引起人们的重视,人们将视线逐渐从主要关注肿瘤实质细胞本身,转向与肿瘤细胞相互作用的肿瘤微环境,这为深入理解肿瘤发生机制和治疗指出了新的方向与研究策略。肿瘤微环境中除了包含非细胞成分的细胞外基质（ECM）,细胞分泌的生长因子、趋化因子以及炎性因子外,还含有众多种类不同的细胞成分,如间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）、分化的成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和脂肪细胞等。其中间充质干细胞是一类成体干细胞,具有多向分化能力,还具有迁移到损伤组织和慢性炎症部位的能力,使得间充质干细胞在组织工程、细胞治疗方面有着广阔的应用前景。但近年来也有越来越多的证据表明间充质干细胞在肿瘤微环境中发挥着重要的调控作用。MSC在肿瘤细胞的刺激和诱导下,能够激活并分化产生癌相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblast,CAF）参与癌症发生发展。深入了解MSC与肿瘤细胞之间的相互作用,不仅能够寻找调控癌症的新靶点,还能够将肿瘤激活的MSC“黑暗面”转化为有利于人类健康的一面。肺癌是我国乃至世界范围内恶性程度较高的肿瘤之一,尽管治疗技术在进步,但是肺癌在癌症相关死亡人数中仍然占有非常高的比例。肺癌在发生发展的过程中伴随着丰富的血管化和纤维化,而MSC定位于血管周部位,提示肺癌组织中MSC的含量较丰富。本研究目的是为了探究肺癌组织来源的MSC与肿瘤细胞之间的相互作用并研究其调控机制,为肺癌的靶向治疗提供新的途径与理论支持。首先从人肺癌组织中分离MSC,并从形态学、细胞表面标记、多向分化能力等进行验证,实验结果显示所分离贴壁培养的间质细胞形态均一,形态类似于成纤维细胞,呈漩涡状生长,不表达内皮细胞和造血细胞标志,表达间质细胞的标记。免疫荧光结果进一步显示其表达间质细胞的标志物而不表达上皮细胞的标志物,并且通过特异性诱导脂肪分化和成骨分化,证明所分离的间质细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力,因此确定所分离的细胞符合MSC的鉴定特征。进一步通过裸鼠皮下共移植成瘤实验探究肺癌MSC对肺癌细胞的作用,实验结果表明肺癌MSC显着促进肺癌体内成瘤能力。随后通过miRNA芯片探究肺癌MSC与肺癌细胞共培养后肺癌细胞中miRNA的变化,发现多种抑制性miRNA下调,其中miR-194-5p引起了我们的研究兴趣,其在MSC与肿瘤细胞共培养后显着下调。通过慢病毒及mimics转染肺癌细胞,使得肺癌细胞过表达或抑制表达miR-194-5p进而进行功能性研究,结果显示miR-194-5p能够显着抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力。通过生物信息学技术,预测了miR-194-5p的下游靶基因为LIN28B,并且通过蛋白质免疫印迹技术进行了验证。进一步利用细胞因子芯片寻找肺癌MSC可能调控肺癌细胞miRNA改变的机制,结果显示肺癌MSC能够分泌b FGF下调肺癌细胞中miR-194-5p的表达来促进肺癌细胞的增殖。具体b FGF如何调控miR-194表达变化的分子机制仍在进行中。通过上述研究,本课题证明人肺癌组织中存在MSC,并且肺癌MSC显着促进肺癌增殖,进一步的研究表明,肺癌MSC能够通过分泌b FGF作用于肺癌细胞,调控miR-194-5p-LIN28B轴的表达,进而促进了肺癌的发生发展。该课题从肿瘤微环境的视角探讨肺癌MSC与肺癌细胞的相互作用及其初步机制,有望加深对肺癌微环境调控肺癌发生发展的认识。肝内胆管细胞癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是一种起源于肝内胆管上皮细胞的原发性肿瘤,其发病率是继肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）之后的第二大常见的原发性肝脏肿瘤。对于肝内胆管细胞癌病人,目前手术切除是唯一有效的治疗方案,但是术后病人复发率高。而对于晚期丧失手术切除可能的病人,目前缺乏可选择的治疗方案,病人预后非常差[39,40]。因此研发新型的低毒、高效、可以特异性靶向肿瘤的药物成为肝内胆管细胞癌研究领域的热点之一。石墨烯（graphene）是一种碳原子构成的单层片状结构的新型纳米材料。由于其独特的物理、化学性质近年来吸引了全世界各个领域科学家的广泛关注[41]。在生物、医学领域,石墨烯的衍生物氧化石墨烯（graphene oxide,GO）由于生物相容性好、比表面积大、表面易修饰等特点,在药物递送、生物成像、生物传感器、抗菌材料、癌症的诊断与治疗等方面都取得了较大的应用。氧化石墨烯制备方法简单,成本低,易于大规模生产。然而,经石墨氧化法直接制备的氧化石墨烯不能有效吸附双链DNA和RNA,这也在很大程度上限制了其在基因转染方面的应用。将具有正电荷的聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）接枝到氧化石墨烯上形成功能化的氧化石墨烯（GO-PEI）,从而使其表面可通过静电作用吸附带负电荷的核酸,此功能化的氧化石墨烯有望成为一种新型高效、低毒、低成本的基因递送载体（包括DNA及RNA）。近年来miRNA异常表达已被证明与肝内胆管细胞癌的发生和发展密不可分,发现和高效递送抑制性的miRNA对于肝内胆管细胞癌的治疗具有重要意义。到目前为止,合作者已利用GO-PEI可携带化疗药或者si RNA在体外抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。但利用GO-PEI作为药物载体携带抑制性的miRNA用于抑制肿瘤和肿瘤干细胞的增殖未见报道。通过高通量的miRNA芯片和TCGA公共数据库的交集寻找在肝内胆管细胞癌组织与癌旁相比下调的抑制性miRNA,包括miR-122-5p、miR-194-5p、let-7c-5p和miR-125b-5p等。进一步通过体内外功能实验发现,GO-PEI能够高效携带这些抑制miRNA进入肿瘤细胞内,抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞球的增殖,以及增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,显着下调与肿瘤细胞增殖相关的靶基因。并且通过裸鼠皮下荷瘤实验验证了GO-PEI能够高效携带miRNA抑制肿瘤细胞体内增殖。这部分课题探讨功能化的氧化石墨烯是否能够作为新型递送载体携带多个抑制性miRNA,进而抑制肝内胆管细胞癌的增殖能力,为肝内胆管细胞癌的药物递送治疗增加了可能性。
张曦文[5]（2020）在《肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究》文中研究说明肺癌是临床最常见的肿瘤,患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,能够有效激活T淋巴细胞免疫,是肿瘤免疫治疗中的调控关键。在肿瘤微环境中,肿瘤相关树突状细胞（Tumor-associated dendritic cells,TDCs）中脂质过氧化激活内质网应激,引起未折叠蛋白反（Unfolded Protein Response,UPR）,激活下游 IRE1α-XBP1 通路,产生的剪切型XBP1-s通过靶向多个脂质合成基因,诱导TDCs内脂质的异常积累,表现出未成熟表型和功能障碍,抑制了抗肿瘤免疫。有研究表明,PI3K-AKT-mTOR信号途径在脂质代谢中起重要调控作用,能够通过调节脂肪合成相关基因的表达来调控脂质合成,XBP1过表达会导致PI3K/mTOR表达的上调,敲除XBP1后,PI3K/mTOR表达下调,还有研究表明,抑制mTOR2可以下调脂质的生成。“脂浊”既为病理产物也是致病因素,多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方,具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效,可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明,肺瘤平膏（FLP）能够明显提高DCs功能,通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应,并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分,研究表明,桔梗皂苷D（PlatycodinD,PD）具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能,并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此,我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一,可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能,并希望对其效应机制进行初探。目的:（1）构建TDCs共培养体系,探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素（TG）诱导ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。（2）初探PD对TDCs的免疫调节功能,及探究TG激活ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。方法:（1）小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养,建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。（2）模拟肿瘤微环境,通过FLP含药血清干预TDCs模型后,流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应,CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化,Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。（3）毒胡萝卜素干预TDCs模型,观察TG激活ERS,对IRE1α-XBP1通路的影响,及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（4）FLP含药血清,作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（5）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 FLP 含药血清对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。（6）通过LDH、CCK8检测技术,观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。（7）模拟肿瘤微环境,通过PD干预TDCs模型后,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（8）通过构建TG激活ERS后的TDCs模型,观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（9）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 PD 对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。结果:（1）流式检测诱导后DCs表面分子CD1 1c+阳性表达比例为76.5%,并与肺癌细胞培养上清共培养,冻融抗原刺激,构建TDCs共培养模型。（2）在模拟的肿瘤微环境中,FLP含药血清干预后,降低TDCs胞内脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86的表达最为明显（P<0.05）,FLP刺激共培养淋巴细胞增殖（P<0.05）,明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）,降低Tregs细胞的表达（P<0.05）,提高细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（3）TG作用后,在TDCs培养模型中,BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA、蛋白表达增加（P<0.05）,脂质含量较模型组增加（P<0.05）,影响TDCs表面分子的表达,MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低（P<0.05）;抑制混合淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）,降低Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,提高Tregs亚群的表达（P<0.05）,同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌（P<0.05）。（4）FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs,脂质含量明显下降（P<0.05）,恢复TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显（P<0.05）,提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力（P<0.05）,提高Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）、降低Tregs细胞的亚群表达（P<0.05）,促进TG作用后 TDCs 细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（5）qPCR、Western blot 结果显示,对于 TG 激活 ERS 后,BiP-IRE1 α-XBP 1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加（P<0.05）;FLP含药血清干预TG作用后的TDCs,FLP+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,对重要脂质调节转录因子XBP1-s,具有降低其mRNA和蛋白表达的作用;同时,肺瘤平膏含药血清作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。（6）LDH结果显示,30uM以下的PD浓度,对DCs无明显损伤,或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示,PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞,其IC50值在13uM左右。（7）在TDCs共培养体系中,PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,提高CD80（PDH、PDM,P<0.05）、CD86（PDM、PDL,P<0.05）的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖（P<0.05）;PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率（P<0.05）,抑制 Tregs 亚群表达（PDH,P<0.05）;提高 IL-12p70（PDH、PDM,P<0.05）IFN-γ（PDH,P<0.05）细胞因子的分泌。（8）TG干预诱导RES后,PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量（P<0.01）;PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,各剂量组均能提高CD80及CD86的表达（P<0.05）,PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力（P<0.05）,PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达（P<0.05）,并能促进 TDCs 分泌 IL-12p70（PDH,P<0.05）、IFN-γ（PDH、PDM,P<0.05）细胞因子。（9）qPCR、Western blot结果显示,TG激活ERS后,PD+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA和蛋白的表达（P<0.01）,同时,PD+TG组作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达（P<0.05）水平作用较为明显。结论:基于本实验条件下,我们推测:（1）TG诱导ERS,激活IRE1α-XBP1通路,产生XBP1-s剪切形式,可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。（2）FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。（3）PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。（4）FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1 和 PI3K-AKT-mTOR 通路实现的。
谢学恒[6]（2020）在《复方苦参注射液联合顺铂对lewis肺癌小鼠抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理肺癌的发病率和死亡率在所有癌症中位居第一,严重危害人类生命健康。肺癌早期诊断困难,一旦确诊大多已为中晚期,预后极差。目前肺癌治疗手段有手术、化疗、放疗、靶向治疗等,但肺癌早期的手术治疗和肺癌晚期的化疗仍然是其主要治疗手段。顺铂具有抗肿瘤活性强、抗癌谱广等特点,在临床上广泛用于多种癌症的治疗。但其引发的不良反应如肾毒性、肝毒性、耳毒性等,限制了其临床应用。故临床上多采用联合用药从而达到增效减毒的目的。复方苦参注射液由苦参和白土苓两味中药加工制成,用于癌症治疗效果显着、无明显不良反应。大量临床研究表明,复方苦参注射液联合顺铂治疗肺癌,疗效确切且无明显毒副反应,但两药联合抗肿瘤作用机制仍未得到充分阐明。此外,关于复方苦参注射液对顺铂导致的肝肾损伤是否具有保护作用的研究鲜有报道。因此,本课题对复方苦参注射液和顺铂联合用药的抗肿瘤作用及机制进行了探索,并初步探究了复方苦参注射液对顺铂导致的肝肾损伤的保护作用;以期为临床用药提供科学依据和理论指导。本课题的主要研究内容如下:（1）将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（Control）、复方苦参注射液组（CKI）、顺铂组（DDP）及联合组（CKI+DDP）,每组10只。皮下注射lewis肺癌细胞建立lewis肺癌小鼠模型,并通过肿瘤重量、抑瘤率等指标检验联合用药的抑瘤效果。（2）采用ELISA法检测小鼠血清中细胞因子IL-4、IFN-γ的水平,以探究CKI对免疫功能的影响。（3）采用TUNEL染色检测小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况,并采用Western blot法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达。（4）用ELISA法检测小鼠肿瘤组织匀浆中糖酵解途径限速酶乳酸脱氢酶（LDH）及己糖激酶（HK）活性、能量代谢最终产物三磷酸腺苷（ATP）及糖酵解作用最终产物乳酸（Lactate）含量,并用Western blot法检测肿瘤组织中糖酵解相关蛋白丙酮酸激酶M2型（PKM2）、磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）的表达。（5）采用HE染色法观测小鼠肝、肾组织病理形态学变化,以探究CKI对DDP导致肝肾损伤的保护作用。通过上述研究发现:（1）小鼠一般情况:小鼠皮下接种lewis肺癌细胞7天后,右腋皮下可触及实体瘤块。小鼠进食情况、精神状态、反应灵敏度均不及接种前,皮毛出现光泽欠佳、脱落等现象。伴随小鼠生长,上述情况进一步变差;Control组小鼠情况最为严重,CKI组小鼠状态最佳,DDP组及CKI+DDP组小鼠状态相当,且介于CKI组与Control组之间。（2）对小鼠体重及有效体重的影响:与Control组相比,CKI组处死时小鼠体重及有效体重无显着性变化（P>0.05）;DDP、CKI+DDP组小鼠处死时体重及有效体重均显着下降（P<0.001）。与DDP组相比,CKI+DDP组处死时小鼠体重及有效体重无显着性变化（P>0.05）。（3）对瘤重及抑瘤率的影响:CKI、DDP及CKI+DDP组的平均瘤重分别是（5.93±1.43）g、（3.55±0.68）g、（1.92±0.67）g,且均显着低于Control组瘤重（P<0.01）。与DDP组相比,CKI+DDP组瘤重显着降低（P<0.05）。此外,CKI、DDP及CKI+DDP组抑瘤率分别为26.05%、55.68%、76.05%,据金氏公式计算得q值约为1.13,提示两药合用具有相加效应。（4）对小鼠血清细胞因子的影响:与Control组相比,CKI、DDP及CKI+DDP组小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平均无显着性差异（P>0.05）。（5）对肿瘤组织细胞凋亡的影响:Control、CKI、DDP及CKI+DDP组凋亡指数分别为24.43%、38.83%、53.73%、68.33%,CKI、DDP及CKI+DDP均可显着提升肿瘤组织细胞的凋亡指数（P<0.001）;与DDP组相比,CKI+DDP组凋亡指数显着升高（P<0.01）,差异具有统计学意义。（6）对凋亡相关蛋白表达的影响:CKI、DDP单用对凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达均无显着影响（P>0.05）,但CKI+DDP却可以显着上调cleaved caspase-3表达（P<0.001）。（7）对糖酵解相关酶活性的影响:与Control组相比,CKI组HK、LDH活性无显着性变化（P>0.05）;DDP及CKI+DDP组HK、LDH活性显着降低（P<0.01）。与DDP组相比,CKI+DDP组HK、LDH活性均无显着性变化（P>0.05）。（8）对糖酵解相关产物的影响:与Control组相比,CKI、DDP及CKI+DDP组均可以显着下调小鼠肿瘤组织中ATP含量（P<0.001）;与DDP组比,CKI+DDP对肿瘤组织中ATP含量无明显抑制作用（P>0.05）。与Control组相比,各给药组乳酸含量均未发生显着变化（P>0.05）。与DDP组相比,CKI+DDP组ATP含量未发生显着变化（P>0.05）。（9）对糖酵解相关蛋白表达的影响:与Control组相比,CKI、DDP、CKI+DDP组PKM2蛋白表达量显着降低,差异具有统计学意义（P<0.001）;与DDP组相比,CKI+DDP组PKM2蛋白表达量无显着性变化（P>0.05）)。与Control组相比,CKI、DDP、CKI+DDP组PFKFB3蛋白表达量显着降低,差异具有统计学意义（P<0.001）;与DDP组相比,CKI+DDP组PFKFB3蛋白表达量升高,差异具有统计学意义（P<0.001）。（10）对小鼠肝组织病理形态学的影响:与Control组比,DDP组小鼠肝小叶内肝细胞有大量变性,出现大量坏死灶及嗜酸性小体,肝索排列非常不整齐,肝小叶内有大量炎症,重度坏死;CKI+DDP组肝细胞数量、肝索排列相对CKI组差,可见少量脂肪滴,小叶内肝细胞可见变性和点灶状坏死,有少量嗜酸性小体形成,肝周围部分可见少量炎性细胞。但CKI+DDP组整体病理损伤程度优于DDP组。（11）对小鼠肾组织病理形态学的影响:与Control组比,DDP组肾小球体积大小不一,小管上皮细胞排列不整齐,肾小管及肾小管-间质间可见大量炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞较多颗粒、空泡样变性,小管上皮细胞可见较多脱落,可见较多管型。而CKI+DDP肾小球体积大致正常,大小相对一致,小球内细胞较Control组增多,细胞外基质Control组增多,肾小球基底膜大致完整,小管上皮细胞排列大致整齐,肾小管及肾小管-间质间结构尚可,可见少量炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞轻度颗粒、空泡样变性,小管上皮细胞可见轻度脱落。管型少见。CKI+DDP组整体病理损伤情况优于DDP组。综上所述,可得出以下结论:（1）复方苦参注射液可以显着增强顺铂的抗肿瘤作用,两药联用具有相加效应;复方苦参注射液还对顺铂导致的肝、肾损伤有保护作用。两药联用可以达到增效减毒的效果。（2）复方苦参注射液、顺铂及两药联合均可通过降低肿瘤组织中PKM2、PFKFB3蛋白的表达,HK、LDH活性及ATP含量进而抑制肿瘤的糖酵解作用;但两药联用与两药单用相比,在抑制肿瘤细胞糖酵解作用上无增效作用。（3）复方苦参注射液、顺铂及两药联合均可显着提高肿瘤细胞的凋亡指数,且两药联用与两药单用比具有增效作用。此外,复方苦参注射液、顺铂单用对肿瘤组织中cleaved caspase-3蛋白的表达无影响,但两药联用可显着上调肿瘤组织中cleaved caspase-3蛋白的表达。综上所述,复方苦参注射液联合顺铂可以显着促进肿瘤细胞凋亡,其机制可能与肿瘤组织中cleaved caspase-3蛋白表达的升高有关;两药联用在促进肿瘤细胞凋亡作用上具有增效作用。
邓俊刚[7]（2019）在《席夫碱—过渡金属配合物的合成及抗肿瘤活性和机制研究》文中提出本文通过设计和改造合成了一系列酰腙类席夫碱和缩氨基硫脲配体,并与过渡金属配位合成了一系列新的配合物,使用红外光谱、核磁共振、质谱、元素分析及X-射线单晶衍射技术对其进行表征。MTT法研究了配体及配合物对肿瘤细胞的抑制率,流式细胞仪研究了配合物对肿瘤细胞周期的影响及诱导肿瘤细胞凋亡的情况;ICP-MS、荧光倒置显微镜、紫外-可见光谱、荧光光谱、蛋白印迹法、琼脂糖凝胶电泳、TRAP分析和分子对接模拟分别用于研究了配合物在肿瘤细胞的分布、配合物与DNA的相互作用、配合物对周期和凋亡相关蛋白及对端粒酶活性的影响,并使用3D细胞球模拟体外肿瘤体来研究配合物对肿瘤体的影响,获得了多个活性较好的席夫碱金属配合物。一、为筛选具有较高抗肿瘤活性的席夫碱过渡金属配合物,本论文基于吡啶苯甲酰腙进行结构优化,合成了吡啶醛苯甲酰腙（L1）、喹啉醛苯甲酰腙（L2）、萘甲醛苯甲酰腙（L8-12）和水杨醛苯甲酰腙（L13-17）,并通过巯基替代席夫碱中羰基合成了吡啶醛缩氨基硫脲配体（L8-12）,使用溶液法将以上配体与过渡金属离子鳌合配位合成了配合物C1-C21;X-单晶衍射结果显示所有配合物均为单核分子,铜金属配合物C1和C4中的中心铜（Ⅱ）离子通过与配体L1和L2上的N原子、杂环N原子和羰基O原子进行三齿鳌合配位;铜（Ⅱ）-缩氨基硫脲配合物C7-C11的中心铜（Ⅱ）离子与氨基硫脲配体L3-7中的N原子、杂环N原子和巯基S原子进行三齿鳌合,而配合物C10和C11的中心铜（Ⅱ）离子还与一个甲醇分子鳌合形成五配位模式;Pt配合物C2和C5的中心Pt（Ⅱ）离子通过与配体L1和L2上的两个N原子进行双齿鳌合;Ru配合物C3和C6的中心Ru（Ⅱ）离子与通过配体L1和L2上的N原子和羰基O原子形成双齿配位;Pt配合物C12和C13的中心Pt（Ⅱ）离子通过与配体L8和L9上的N原子和羰基O原子进行双齿鳌合,另外与一个氯离子和一个二甲基亚砜分子鳌合,形成平面四边形;Pt配合物C14、C15和C16的中心Pt（Ⅱ）离子通过与配体L10、L11和L12上的N原子和苯环上的去氢O原子进行双齿鳌合,另外与一个氯离子和一个二甲基亚砜分子鳌合,形成平面四边形;配合物C17、C18、C19和C20的中心Pt（Ⅱ）离子通过与配体L13-L16上的N原子和羰基O原子进行双齿鳌合,另外与一个氯离子和一个二甲基亚砜分子鳌合,形成平面四边形;Pt配合物C21的中心Pt（Ⅱ）离子通过与配体L17上的N原子和苯环上的去氢O原子形成双齿鳌合,另外与一个氯离子和一个二甲基亚砜分子鳌合,形成平面四边形。这些配合物在配位模式和分子结构上有一定差异,可能会导致其生物活性的差异。二、使用MTT法检测了配体及配合物对肿瘤细胞的抑制率。结果显示,除缩氨基硫脲配体L4-7对肿瘤细胞有较高的抑制率（52.27%-76.49%）外,其他配体对肿瘤细胞的抑制率都较低（<40%）,对缩氨基硫脲配体L3的N-4进行结构修饰后的配体L4-7对肿瘤细胞的抑制率大大增强;通过配体L1和L2分别与三种不同的金属离子形成配位得到配合物C1-C6,其对肿瘤细胞的抑制率存在明显差异,其中Cu（Ⅱ）配合物C1和C4表现出相对较高的活性,对MGC80-3细胞的活性最好,IC50值分别为（22.02±1.83）μM和（15.68±1.29）μM,而Pt（Ⅱ）配合物C2和C5对MGC80-3细胞的IC50值>40μM,Ru（Ⅱ）配位合物对人胃癌细胞系MGC80-3细胞的IC50值>50μM;ICP-MS检测配合物C1-C6作用于1×106的MGC80-3细胞后细胞中三种金属的总量,结果显示细胞中铜的总量分别为（3.87±0.22nmol Cu/106cells）（C1）和（7.32±0.22 nmol Cu/106cells）（C4）,检测到细胞中Pt的总量分别为（2.98±0.32 nmol Pt/106cells）（C2）和（4.68±0.42 nmol Pt/106cells）（C5）,检测到细胞中Ru的总量分别为（0.042±0.012 nmol Ru/106cells）（C3）和（0.044±0.003 nmol Ru/106cells）（C6）,Ru配合物相对Cu和Pt配合物被吸收进入细胞的量较少,可能是导致配合物C3和C6活性低原因;2-吡啶缩氨基硫脲配体及其铜配合物对MGC80-3细胞和SK-OV-3细胞具有较高的抑制能力,其中配体L3及其配合物C7对MGC80-3细胞的IC50值分别为（19.04±0.43）μM和（12.11±0.82）μM,通过在N-4位引入苯环（C8）、或使N-4形成哌啶环（C9）或吡咯烷环（C11）,配合物吸收进入肿瘤细胞的的量明显增高,配合物对MGC80-3细胞的活性提高几倍。而在N-4处引入两个甲基后的配合物C10对MGC80-3细胞的细胞毒性比C7增加14倍多,结果说明对N-4位的修饰能很好的改变配体及其配合物的活性;选用羟基、烃基或卤素取代苯甲酰腙苯环上的氢前后得到的Pt（Ⅱ）配合C12-C16对MGC80-3细胞的抑制率高于其他肿瘤细胞,其IC50分别为（7.18±0.58）μM、（10.64±0.87）μM、（5.22±0.70）μM、（4.38±0.38）μM和（13.07±0.31）μM,低于顺铂的IC50（17.87±0.35）μM,以异丙基对位取代的配合物C15活性最好;以卤素或甲基取代水杨醛苯环上的氢原子后合成得到酰腙配合物C18-C21,配合物显示出对肿瘤细胞有良好的活性,IC50值在5.67-18.64μM范围内,比未修饰前的配合物C17的细胞毒性提高了(IC50值在15.41-27.76μM范围),配合物C17-C21对A549细胞和A549cisR细胞显示出相同的活性,其中以溴离子取代的C19对这两株细胞的活性最好,IC50值分别为（8.03±0.26）μM和（8.07±0.28）μM,优于顺铂对A549细胞和A549cisR细胞的活性,IC50值分别为（20.25±0.74）μM和（49.24±0.57）μM,表明配合物C19与顺铂无交叉耐药性。实验表明,通过结构修饰和改造后,可增加肿瘤细胞对配合物吸收,增强活性。三、流式细胞术检测配合物诱导肿瘤细胞凋亡的情况的结果显示:配合物C7和C10能诱导MGC80-3细胞发生晚期凋亡,凋亡百分比为22.76%和32.75%;配合物C12-C16明显诱导MGC80-3细胞发生早期凋亡,凋亡百分比为36.66%、30.90%、42.85%、71.45%和22.79%;配合物C17和C19能诱导A549cisR细胞发生早期凋亡,凋亡百分比为38.97%和45.07%;另外流式细胞术检测到配合物C7能将MGC80-3细胞周期阻滞在G1期,而配合物C10、C12-C16将MGC80-3细胞周期阻滞在S期,配合物C17和C19将A549cisR细胞周期阻滞在S期,配合物都引起了细胞内线粒体膜电位（Δψm）的降低,继而导致肿瘤细胞的凋亡;显微镜下观察到以上配合物都能引起细胞内活性氧（ROS）的产生,配合物C17和C19能导致A549cisR细胞形态的改变并抑制细胞迁移,此外在体外还能抑制3D肿瘤细胞球的生长。四、通过模拟分子对接、紫外-可见光谱、荧光光谱、琼脂糖凝胶电泳、蛋白印迹实验（Western Blot）、流式细胞术和TRAP分析研究配合物的抗肿瘤细胞作用机制,结果显示配合物可通过多个途径诱导细胞凋亡。1、紫外-可见光谱实验显示配合物C10、C15、C17和C19溶液中加入CT-DNA导致配合物的吸收峰都发生了不同程度的减色效应,证实配合物通过插入与CT-DNA螺旋结合;荧光光谱实验显示配合物C10、C15、C17和C19可竞争取代EB-DNA中EB引起溶液荧光强度的减弱;琼脂糖凝胶电泳结果显示Cu（Ⅱ）配合物C7和C10对DNA的作用比Pt（Ⅱ）配合物C12、C15、C17和C19弱,只有配合物C10高剂量（250μM）时显示对DNA的作用比较明显,而Pt（Ⅱ）配合物C12、C15、C17和C19在较低的剂量（10μM）下对DNA有明显的作用;分子对接模拟结果显示配合物能嵌入DNA分子中,以氢键与DNA发生相互作用,从而导致DNA损伤,DNA损伤的可导致细胞周期的阻滞,这与流式细胞术检测到的配合物对细胞周期影响的结果相符;Western Bolt法检测配合物对周期相关蛋白影响的结果显示:配合物C7和C10能明显抑制细胞周期蛋白CyclinA、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK2和周期调控因子Cdc25A的表达,并能显着上调抑癌基因p21和p27的表达;配合物C12-C16可不同程度地抑制CyclinA和CDK2的表达,并上调p27的表达,配合物C13-C16能显着上调抑癌基因p21的表达;配合物C17和C19抑制CyclinA和CDK2存在剂量相关性,高剂量时显着抑制CyclinA和CDK2的表达,并能显着上调p21的表达。实验证实合成的金属配合可作用于DNA,并通过调节周期相关蛋白的表达对细胞周期产生影响。2、线粒体是多数金属配合物作用的靶点之一,流式细胞术检测结果显示线粒体膜电位能被明显下调;Western Bolt实验检测配合物对凋亡相关蛋白的影响,结果显示配合物C10能明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促凋亡蛋白Bad和Bax的表达被上调,细胞色素C和凋亡酶激活因子Apaf-1的表达也明显上调;配合物C12-C16对Bcl-2和Bax表达的影响不一致,其中配合物C12-C15能明显抑制Bcl-2的表达,配合物C14-C16显着上调促凋亡蛋白Bax的表达,并导致细胞色素C的释放;配合物C17和C19在高剂量时明显抑制Bcl-2和Bcl-xL的表达并上调Bax的表达,细胞色素C在高剂量时表达量明显增加;使用流式细胞仪检测Caspase-3/9的表达,结果显示配合物C7、C10、C12-C16、C17和C19能不同程度的激活Caspase-9的表达,并引起Caspase-3被激活。该实验证实配合物可作用于线粒体相关蛋白,诱导线粒体膜电位的降低,激活凋亡执行因子导致细胞凋亡。3、Western Blot实验显示配合物C7、C10、C12-C16、C17和C19对原癌基因c-myc和端粒酶逆转录hTERT表达的抑制很显着,并导致细胞中端粒酶活性的降低;端粒酶活性检测显示配合物C7、C10、C12-C16、C17和C19不同程度地抑制肿瘤细胞中端粒酶的活性。抑制肿瘤细胞端粒酶的活性也是诱导其凋亡的路径之一。
刘锐[8]（2019）在《miRNA-99b-5p在肺癌中的功能及化合物GA13315抑制肺癌细胞的靶点筛选和机制研究》文中研究说明[目的]miRNA在调控肿瘤细胞生物行为中起着重要作用,本课题的目的是考察miRNA-99b-5p（miR-99b-5p）与肺癌患者生存期间的相关性,同时研究其对肺癌增殖,侵袭和转移能力的影响并探索其作用靶点及机制。[方法]1.TCGA数据库（starBase v3.0 project）分析miR-99b-5p在肺癌组织和正常组织间转录差异,及其转录水平与肺癌患者生存间的相关性;2.在肺癌细胞株中验证miR-99b-5p的功能机制:借助细胞转染的方法,过表达miR-99b-5p后,分别用CCK-8法,细胞划痕实验和细胞迁移侵袭实验（Transwell）技术研究miR-99b-5p对肺癌细胞增殖率,侵袭能力和迁移能力的影响;3.双荧光素酶报告基因检测和蛋白质印迹法Western blot研究和验证miR-99b-5p的作用靶点及功能机制。[结果]对比肺正常组织,miR-99b-5p在肺癌组织标本中低表达;miR-99b-5p高转录肺癌患者较miR-99b-5p低转录患者具有较高的生存率,p=0.02;miR-99b-5p在非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H292中的转录水平显着低于人支气管上皮细胞株16-HBE（p<0.001）;miR-99b-5p在小细胞肺癌株NCI-H69的转录水平低于人支气管上皮细胞株16-HBE（p<0.05）;miR-99b-5p在人胚肾细胞株HEK293T的转录水平较人支气管上皮细胞株16-HBE无显着差异（p=ns）;上调miR-99b-5p转录水平可抑制肺癌细胞的增殖,侵袭和转移能力,p<0.01;FZD8是miR-99b-5p的结合靶点;过表达FZD8可部分逆转miR-99b-5p对肺癌细胞增殖,侵袭和转移行为的抑制作用,p<0.01。[结论]miR-99b-5p通过靶向FZD8抑制肺癌细胞的增殖,侵袭和转移,与肺癌患者的生存显着相关,这种新鉴定的miR-99b-5p/FZD8轴提供了对肺癌进展机制的新见解。[目的]1、筛选化合物GA13315抑制肺癌细胞的相关作用靶点,挖掘相关信号转导通路,了解关键分子靶标间的互作关系,诠释化合物的潜在抑瘤途径,验证关键靶点的正确性,给进一步深入研究化合物作用机制提供方向;2、验证化合物GA13315对肺癌细胞的部分作用机制,为研究有效,低毒,经济的新型抗癌药物奠定基础。[方法]1、梯度浓度化合物GA13315作用于肺癌细胞株A549和H460 48小时,CCK-8法检测肺癌细胞增殖率;转录组测序技术检测化合物作用于肺癌细胞前后的差异表达基因谱,行基因本体（Gene Ontology）功能聚集分析,KEGG通路分析,基因互作网络分析。基于Foldchange和P值,结合生物信息结果,筛选10个目的基因,用qPCR方法验证其准确性,挖掘化合物GA13315对肺癌细胞细胞的潜在作用机制。2、过表达和沉默目的基因,验证化合物GA13315促肺癌细胞凋亡的相关信号转导通路及靶点,染色质免疫共沉淀方法检验与目的基因结合的转录因子。使用SPSS 19.0软件（SPSS Inc.）分析数据,并表示为平均值±标准差的形式。通过Student’s t-tests评估两组之间的差异显着性。通过方差分析分析多组之间的差异,而后用 Tukey’s honestly signifcant difference post-hoc test 评估各组间的差异。p<0.05被认为统计学上有显着差异。[结果]1、化合物GA13315对肺癌细胞有显着抑制增殖和促进凋亡作用,IC50=11.37±2.23μM。化合物GA13315作用肺癌细胞后共有250个差异表达基因（FC≥1.5;P<0.05）,其中94个基因表达上调,156个基因表达下调,qPCR和western blot方式验证发现,TRIM67,NF-κB2,FAS在化合物作用后均出现上调。2、沉默TRIM67的表达后,化合物GA13315促肺癌细胞的凋亡作用下降。3、TRIM67促进NF-κB2由前体蛋白转化为活性蛋白p52,激活NF-κB2信号转导通路,上调FAS蛋白表达,促进肺癌细胞的凋亡。[结论]化合物GA13315对肺癌细胞有显着的抑制增殖作用和促凋亡作用;化合物GA13315作用于肺癌细胞后出现众多显着差异基因;其中TRIM67在化合物GA13315促肺癌细胞凋亡作用中起着关键作用,TRIM67促进NF-κB2由前体蛋白转化为活体形式p52,激活NF-κB2信号转导通路,上调FAS蛋白表达,促进肺癌细胞的凋亡。
刘意[9]（2019）在《VEGF在铬诱导肺支气管上皮细胞Beas-2B恶性转化中的作用及机制研究》文中研究表明目的:肺癌是全球范围内发生率和死亡率均最高的恶性肿瘤,并且其发病率呈逐年递增趋势,正成为临床最常见的恶性肿瘤。大部分肺癌的发生发展都与环境因素有关,特别是暴露于环境中的重金属与肺癌密切相关,许多研究表明,六价铬[Hexavalent chromium,Cr（VI）]化合物在环境中的暴露与肺癌发生有一定相关性,可能是诱发肺癌的重要因素。虽然研究人员对六价铬的致癌作用进行了广泛深入研究,但其分子机制尚不完全明朗。因此,本实验通过构建六价铬诱导的人支气管上皮细胞（Human bronchial epithelial cells,Beas-2B）恶性转化模型Cr（VI）-Beas-2B,旨在探究:1.在六价铬诱导的人支气管上皮细胞恶性转化过程中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在迁移、侵袭及血管生成等方面的生物学作用;2.从蛋白、分子水平探究VEGF是否通过影响迁移、侵袭相关蛋白的表达从而调控迁移、侵袭;3.天然黄酮类化合物刺槐素对VEGF及其下游迁移、侵袭相关蛋白表达的影响;4.刺槐素对VEGF及其相关信号通路介导的迁移、侵袭及血管生成的影响。通过以上研究揭示VEGF与六价铬诱导的人支气管上皮细胞恶性转化之间的关联,为深入研究环境重金属致癌机理提供参考靶点和思路,同时刺槐素对六价铬恶性转化细胞的逆转作用也为深入研究环境重金属所致癌症的发生、临床预防、治疗以及预后提供依据和思路。方法:1.挑选软琼脂中不同形态的细胞克隆进行二次培养,选取其中能稳定培养的8株细胞（A、B、C、D、E、F、G、H）,用蛋白免疫印迹（Western blot）对其VEGF蛋白的表达进行鉴定,并利用灰度值分析蛋白条带筛选VEGF高表达的恶性转化细胞株;2.观察正常Beas-2B细胞与VEGF高表达的恶性转化细胞形态学差异;用Western blot检测正常Beas-2B细胞与VEGF高表达的恶性转化细胞关于迁移、侵袭相关蛋白p-FAK、p-Src、MMP-9、E-cadherin等表达差异;用划痕实验、Transwell实验及免疫荧光实验检测正常Beas-2B细胞与VEGF高表达的恶性转化细胞的迁移、侵袭等运动能力差异;小管生成（Tube Formation）实验鉴定正常Beas-2B细胞与VEGF高表达的恶性转化细胞之间血管生成能力的差异;3.分别利用重组质粒过表达VEGF、重组人VEGF细胞因子刺激、siRNA干扰、VEGF特异性抑制剂氯化血根碱（Sanguinarine chloride,SAN）处理,通过内、外源途径上调和下调VEGF的表达;再分别检测VEGF表达及迁移侵袭相关蛋白表达情况,检测细胞迁移、侵袭等运动能力及血管生成能力是否受到影响,确定VEGF与Cr（VI）诱导的细胞恶性转化的关联性;4.以不同浓度的刺槐素（Acacetin,Aca）溶液（0、1、2.5、5、10、20、30、40、50μM）处理VEGF高表达的恶性转化细胞,MTT实验筛选刺槐素作用时间及作用浓度;5.Western blot检测不同浓度刺槐素对恶性转化细胞关于VEGF以及迁移、侵袭相关蛋白表达的影响;划痕实验、Transwell及免疫荧光检测不同浓度刺槐素对恶性转化细胞的迁移侵袭等运动能力的影响;Tube Formation鉴定不同浓度刺槐素对恶性转化细胞血管生成能力的影响,从而探讨VEGF作为刺槐素预防重金属致癌作用的靶点的可能性。结果:1.8株Cr（VI）-Beas-2B细胞中VEGF高表达（与正常Beas-2B细胞中VEGF表达量相比）有4株并且E细胞株的VEGF蛋白表达量最高;2.VEGF高表达的恶性转化细胞在形态上相较之于正常Beas-2B细胞已呈现出明显的异形性,细胞接触性抑制消失,具有类似肿瘤细胞的形态特征;3.在VEGF高表达的恶性转化细胞中E-cadherin、MMP-9表达分别低于、高于正常Beas-2B细胞,FAK和Src的磷酸化激活态p-FAK和p-Src表达也高于正常Beas-2B细胞中相应蛋白的表达;VEGF高表达的恶性转化细胞迁移、侵袭及血管生成能力均高于正常Beas-2B细胞;4.用重组VEGF生长因子刺激VEGF高表达的恶性转化细胞,可以上调MMP-9、p-FAK和p-Src、抑制E-cadherin的表达,促进细胞迁移、侵袭等运动能力及血管生成能力,而用VEGF特异性抑制剂氯化血根碱处理后结果相反,并且都表现为浓度依赖性;以VEGF重组质粒转染VEGF高表达的恶性转化细胞,上调了MMP-9、p-FAK和p-Src表达,降低了E-cadherin的表达,并且促进了细胞迁移、侵袭等运动能力及血管生成能力,si-RNA干扰VEGF高表达的恶性转化细胞后结果与过表达相反;5.天然黄酮类化合物刺槐素对正常Beas-2B细胞活性抑制不明显,而当浓度在50μM时对VEGF高表达的恶性转化细胞抑制率达到50%,为避免细胞过高的增殖抑制带来的影响,因此选择40μM为刺槐素的作用浓度,为了体现药物剂量与实验效应的关系,最终选择0、10、20、40μM的浓度梯度;6.刺槐素下调了VEGF、MMP-9、p-FAK和p-Src表达,上调了E-cadherin表达,抑制了细胞迁移、侵袭等运动能力及血管生成能力,且该抑制作用与刺槐素浓度成正相关性。结论:1.六价铬诱导的VEGF高表达的恶性转化细胞具有类似肿瘤细胞的形态特征,迁移、侵袭及血管生成能力比正常Beas-2B细胞更强;2.VEGF通过影响迁移、侵袭相关蛋白的表达从而调控细胞迁移、侵袭以及血管生成,参与六价铬致癌过程;3.天然黄酮类化合物刺槐素通过调控VEGF及其下游迁移、侵袭相关蛋白的表达,从而影响细胞迁移、侵袭及血管生成等恶性肿瘤的指标,对重金属的致癌起到预防作用。
罗颖懿[10]（2019）在《新西兰牡荆苷Ⅱ促肝癌凋亡与抑制肺癌EMT的机制研究》文中认为肺癌是目前世界上恶性肿瘤发病率和死亡率最高的癌症,肝癌则是全球死亡率第三高的癌症。诱导癌细胞凋亡是目前抗癌的重要研究方向之一,通过利用药物诱导肿瘤细胞发生程序性死亡,达到逐渐消除肿瘤的目的。恶性肿瘤发生转移是癌症患者死亡的最主要原因,上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）与肿瘤的侵袭与转移密切相关,转化生长因子（Transforming Growth Factor-[β1,TGF-β1）能有效诱导细胞发生EMT。新西兰牡荆苷Ⅱ（ViceninⅡ）是课题组前期从铁皮石斛中提取分离得到的共性特征黄酮碳苷成分,其诱导肿瘤凋亡的研究较少,抗肿瘤转移及EMT的作用机制的研究尚无报道。因此本研究从诱导肝癌HepG2细胞凋亡及抑制TGF-β1诱导的肺癌A549与H1299细胞EMT、迁移和侵袭的分子机制两个方面探讨新西兰牡荆苷Ⅱ的抗肿瘤活性,为新西兰牡荆苷Ⅱ及铁皮石斛黄酮类成分的抗肿瘤活性提供重要的实验基础及补充依据。目的:研究新西兰牡荆苷Ⅱ诱导肝癌HepG2细胞凋亡及抑制TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞EMT、迁移和侵袭的分子机制。方法:1.新西兰牡荆苷Ⅱ诱导人肝癌HepG2细胞凋亡研究（1）MTT法检测新西兰牡荆苷Ⅱ对不同肿瘤细胞细胞增殖的影响,筛选出效果最好的细胞模型与合适的给药浓度开展后续凋亡实验;（2）Hoechst33258染色观察HepG2细胞凋亡形态学改变;（3）Annexin V-PI双染法,流式细胞术检测HepG2细胞的凋亡率;（4）实时逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）测定凋亡及MAPK通路相关基因的表达。2.新西兰牡荆苷Ⅱ抑制TGF-p1诱导的肺癌A549及H1299细胞EMT的机制研究（1）MTT法检测新西兰牡荆苷Ⅱ与TGF-β1对肺癌A549及H1299细胞毒作用,筛选出合适的TGF-[β1造模浓度与新西兰牡荆苷Ⅱ给药浓度;（2）倒置显微镜观察新西兰牡荆苷Ⅱ与TGF-β1对肺癌细胞的形态学变化;（3）克隆形成实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞增殖能力影响;（4）划痕实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞迁移能力影响;（5）Transwell小室实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞的侵袭作用;（6）免疫荧光实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞EMT上皮标志物E-cadherin及间质标志物Vimentin表达的影响;（7）蛋白免疫印迹法（Western boltting）实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ及路通抑制剂LY294002和SB431542对TGF-β1诱导的肺癌细胞EMT标志物及PI3K/Akt/mTOR和TGF-β/Smad通路蛋白表达影响;结果:1.新西兰牡荆苷Ⅱ诱导人肝癌HepG2细胞发生凋亡（1）12.5-100μM新西兰牡荆苷Ⅱ处理不同肿瘤细胞后,MTT实验结果显示新西兰牡荆苷Ⅱ对肝癌HepG2细胞增殖抑制里最强,其次是肺腺癌A549细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC7901细胞、结肠癌HT-29细胞、和黑色素瘤B16细胞,故选择细胞模型为肝癌细胞;新西兰牡荆苷Ⅱ具有时间依赖性,48h细胞存活率显着低于于24h,当新西兰牡荆苷Ⅱ浓度小于75μM,HepG2细胞存活率呈浓度依赖性地下降,高于75μM存活率基本不变,故选用给药浓度为75 μM,给药时间为48h开展后续凋亡实验。新西兰牡荆苷Ⅱ的IC 50为50.35μM。（2）倒置显微镜下观察,新西兰牡荆苷Ⅱ组HepG2细胞表现出数量减少,体积缩小,细胞质缩合,膜起泡等调亡特征。用Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察,正常细胞细胞核较大,无颗粒块状荧光,给药组细胞可以观察到细胞核固缩,染色质缩合,核内出现凋亡小体,可见浓染致密的颗粒块状荧光且荧光较强的凋亡典型特征。（3）流式细胞仪测定75μM新西兰牡荆苷Ⅱ作用HepG2细胞48 h后细胞的总凋亡率为14.57±0.91%（p<0.01）,与空白对照组相比有显着性差异,表明新西兰牡荆苷Ⅱ能显着促进HepG2细胞凋亡。（4）RT-qPCR检测相关基因的表达量。75μM新西兰牡荆苷Ⅱ作用于HepG2细胞48 h后能显着提高促凋亡基因Bax的表达,降低抗凋亡基因Bcl-2的表达,提高Bax/Bcl-2比值（P<0.01）,提高直接参与细胞凋亡caspase 8的mRNA表达（P<0.01）,而TNF-α的水平无显着变化;另外MAPK信号通路中关键基因ERK、JNK、P38和NFκB的表达水平显着升高（P<0.01）,而ERK、JNK、P38和NFκB表达上调能促进细胞凋亡的发生;表明新西兰牡荆苷Ⅱ可能通过MAPK通路和Bax/Bcl-2、caspase途径诱导HepG2细胞发生凋亡效应。2.新西兰牡荆苷Ⅱ通通过抑制TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信号通路TGF-β1诱导的人肺癌A549及H1299细胞的EMT、迁移与侵袭（1）MTT结果显示小于10 μM的新西兰牡荆苷Ⅱ对肺癌A549及H1299细胞无显着的杀伤作用,当浓度大于10μM,药物浓度及时间依赖性地显着抑制细胞增殖。小于5ng/mL的TGF-β1能促进A549细胞增殖,对H1299细胞无毒作用,当浓度大于5ng/mL,TGF-β1浓度及时间依赖性地显着抑制A549及H1299细胞增殖。故最终选用新西兰牡荆苷Ⅱ的浓度为无细胞毒性的低浓度（2.5、5、10μM）,TGF-β1的造模浓度为5 ng/mL进行后续EMT相关实验;（2）倒置显微镜观察5 ng/mL TGF-β1可诱导A549及H1299细胞外形变瘦长,形态变为细长纺锤状,细胞间连接消失,成功地诱导了 EMT的发生,而2.5、5、1OμM新西兰牡荆苷Ⅱ浓度依赖性地使这些EMT的典型特征逐渐消失,从细胞形态学上新西兰牡荆苷Ⅱ能抑制TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞的EMT;（3）克隆形成实验结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ能浓度依赖性地抑制TGF-β1诱导增加的A549及H1299细胞克隆能力;（4）划痕和Transwell小室实验结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ能浓度依赖性地抑制TGF-β1诱导增强的肺癌A549及H1299细胞迁移与侵袭能力;（5）免疫荧光实验结果表明10μM新西兰牡荆苷Ⅱ显着增强A549及H1299细胞中TGF-β1诱导减弱的上皮标志物E-cadherin绿色荧光表达,减弱TGF-β1诱导增强的间质标志物Vimentin绿色荧光表达。（6）Western boltting实验结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ浓度依赖性地增强TGF-β1诱导减弱的A549及H1299细胞的上皮标志物蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白ZO-1及Claudin-1的蛋白表达量,减弱TGF-β1诱导增强的间质标志物蛋白N-cadherin及vimentin、基质金属蛋白酶蛋白MMP-2、转录因子Snail及Slug的蛋白表达;（7）Westernboltting研究EMT作用机制的结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ能浓度依赖性地降低TGF-β1诱导的A549及H1299细胞PI3K/Akt/mTOR通路蛋白p-mTOR、p-Akt、p-p70S6K 以及 TGF-β/Smad 通路蛋白 p-Smad2 和 p-Smad3 的蛋白表达;PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组和TGF-β/Smad路通抑制剂SB431542组能显着减少TGF-β1诱导上调的N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和MMP-2的蛋白表达,显着增加TGF-β1诱导下调的E-cadherin和ZO-1的蛋白表达水平,新西兰牡荆苷Ⅱ组与抑制剂组具有相同的效应,进一步证明了新西兰牡荆苷Ⅱ能通过抑制PI3K/Akt/mTOR及TGF-β/Smad信号通路逆转TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞的EMT。结论:本研究证明了新西兰牡荆苷Ⅱ可能通过MAPK通路抑制人肝癌HepG2细胞增殖并诱导其凋亡;此外,新西兰牡荆苷Ⅱ还能通过抑制TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信号通路逆转TGF-β1诱导的人肺癌A549及H1299细胞的上皮间质转化、迁移与侵袭。本研究初步证实低浓度的新西兰牡荆苷Ⅱ具有抗肿瘤转移作用,高浓度新西兰牡荆苷Ⅱ具有诱导肿瘤凋亡的作用,为铁皮石斛黄酮类成分及新西兰牡荆苷Ⅱ的抗肿瘤活性提供重要的研究基础与补充依据。
二、人肺癌细胞LALU血管生成过程的形态学观察及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人肺癌细胞LALU血管生成过程的形态学观察及意义（论文提纲范文）
（1）七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的发病机制及临床表现 |
| 1.1.1 肺癌的发生 |
| 1.1.2 罹患肺癌的危险因素 |
| 1.1.3 肺癌的临床表现 |
| 1.2 肺癌的诊断 |
| 1.2.1 肺癌的辅助影像学检查 |
| 1.2.2 获取肺癌组织学或细胞学检查技术 |
| 1.2.3 肺癌的实验室血清学检查 |
| 1.2.4 肺癌的病理学评估 |
| 1.3 肺癌的治疗 |
| 1.4 肺癌的靶向治疗 |
| 1.4.1 非小细胞肺癌靶向药物 |
| 1.4.1.1 以表皮生长因子受体为靶点的药物 |
| 1.4.1.2 间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制药 |
| 1.4.1.3 ROS1 重排抑制药 |
| 1.4.1.4 血管内皮生长因子为靶点的药物 |
| 1.4.1.5 其他 |
| 1.4.2 非小细胞肺癌免疫治疗药物 |
| 1.4.3 SCLC靶向药物的现状 |
| 1.5 七鳃鳗LIP的发现及细胞毒作用 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 七鳃鳗LIP蛋白对23 种肿瘤细胞杀伤活性比较分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组LIP蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.2 重组LIP蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 重组LIP蛋白活性鉴定 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 重组LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.2.6 流式细胞仪对LIP蛋白杀伤肿瘤细胞定量分析 |
| 2.2.7 Western blot检测LIP蛋白在细胞膜表面的沉积 |
| 2.2.8 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组LIP蛋白的纯化 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测LIP蛋白对肿瘤和正常细胞的识别 |
| 2.3.3 Western Blot检测LIP蛋白在细胞表面的沉积 |
| 2.3.4 LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 LIP蛋白对三种肺癌细胞的生物学活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP蛋白对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.2 荧光显微镜检测LIP对三种肺癌细胞微团杀伤活性 |
| 3.2.3 LDH检测LIP对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.4 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP联合顺铂对三种肺癌细胞的杀伤作用 |
| 3.2.5 细胞划痕实验检测LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.6 免疫荧光检测LIP蛋白对细胞骨架的影响 |
| 3.2.7 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞杀伤活性探究 |
| 3.3.2 LIP蛋白与多种化疗药物对三种肺癌细胞杀伤活性比较探究 |
| 3.3.3 LIP蛋白与顺铂联合作用三种肺癌细胞探究 |
| 3.3.4 LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力探究 |
| 3.3.5 LIP蛋白对三种肺癌细胞骨架的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对线粒体的影响 |
| 4.2.2 Annexin V-FITC检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.4 流式细胞术检测LIP蛋白作用后肺癌细胞线粒体膜电位变化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体损伤探究 |
| 4.3.2 LIP蛋白诱导三种肺癌细胞凋亡检测 |
| 4.3.3 LIP蛋白通过影响线粒体膜电位变化抑制线粒体功能 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 LIP蛋白通过引起内质网应激激活细胞凋亡通路 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的影响 |
| 5.2.2 共聚焦监测LIP蛋白对三种肺癌细胞内ROS的影响 |
| 5.2.3 细胞蛋白提取及蛋白浓度定量 |
| 5.2.4 WesternBlot检测内质网应激及加入抑制剂后凋亡通路相关蛋白的表达 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的损伤 |
| 5.3.2 LIP蛋白作用三种肺癌细胞后ROS含量变化情况 |
| 5.3.3 三种肺癌细胞中内质网应激诱导的凋亡通路相关蛋白表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 LIP蛋白在荷瘤小鼠及人源肿瘤组织水平对瘤体的识别和抑瘤作用 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 注射LIP蛋白对小鼠肺癌细胞瘤的影响 |
| 6.2.2 透射电镜观察鼠肺癌肿瘤组织 |
| 6.2.3 人肺癌肿瘤组织的保存处理 |
| 6.2.4 肿瘤组织包埋及冰冻切片的制备 |
| 6.2.5 人肺癌肿瘤组织的HE染色 |
| 6.2.6 人肺癌肿瘤组织的免疫组织化学染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 小鼠肺癌细胞瘤注射LIP蛋白后的变化 |
| 6.3.2 LIP蛋白促小鼠A549-Luc-C8 细胞瘤的细胞凋亡 |
| 6.3.3 LIP蛋白对荷瘤小鼠正常组织形态的影响 |
| 6.3.4 人肺癌组织的HE染色 |
| 6.3.5 LIP蛋白特异性识别人肺癌组织 |
| 6.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 读博期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（2）中国黄芩属药用植物亲缘学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语及术语简表 |
| 前言 |
| 第一章 黄芩属植物研究概况 |
| 第一节 黄芩属植物分类概况 |
| 第二节 黄芩属植物的传统应用 |
| 第三节 黄芩属植物的化学成分研究进展 |
| 第四节 黄芩属植物的药理活性研究进展 |
| 第五节 小结 |
| 第二章 黄芩属植物叶绿体基因组的比较及系统发育分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 基于代谢组学的中国黄芩属植物化学成分研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 黄芩属植物抗肿瘤活性研究 |
| 第一节 基于网络药理学的黄芩属植物抗肿瘤作用机制研究 |
| 1. 方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 黄芩属植物提取物及主要化合物的体外抗肿瘤活性测定 |
| 1. 实验材料、试剂及仪器 |
| 2. 试剂配制与提取方法 |
| 3. 方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 第五章 黄芩茶干预结直肠癌癌前病变药效作用和机制探索研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 数据处理 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第六章 中国黄芩属植物的药用亲缘关系探讨 |
| 1. 黄芩属植物属下分类系统的选择 |
| 2. 中国黄芩属植物的分类、化学成分与传统功效和药理活性的联系 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本文的创新点 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（3）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）Ⅰ.miR-194-5p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 Ⅱ.功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的增殖（论文提纲范文）
| Ⅰ. miR1945p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1. 肺癌研究现状 |
| 1.1.1. 肺癌流行病学特征 |
| 1.1.2. 肺癌致病因素 |
| 1.2. 间充质干细胞微环境与肺癌 |
| 1.2.1. 间充质干细胞的定义 |
| 1.2.2. 间充质干细胞与肿瘤微环境 |
| 1.2.3. 间充质干细胞与肺癌 |
| 1.3. miRNA与肺癌研究进展 |
| 1.3.1. miRNA的生物学特性 |
| 1.3.2. miRNA在肺癌中的作用 |
| 1.4. 本文研究内容与意义 |
| 第2章 人肺癌组织来源的MSC促进肿瘤增殖 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2. 实验材料 |
| 2.2.1. 肺癌病人标本和实验细胞 |
| 2.2.2. 仪器设备 |
| 2.2.3. 试剂及耗材 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.3.1. 肺癌MSC的分离 |
| 2.3.2. 细胞复苏 |
| 2.3.3. 细胞传代与冻存 |
| 2.3.4. 流式细胞术检测MSC表面标记 |
| 2.3.5. 免疫荧光染色 |
| 2.3.6. MSC成骨分化诱导 |
| 2.3.7. MSC成脂分化诱导 |
| 2.3.8. 小鼠皮下荷瘤实验 |
| 2.4. 实验结果 |
| 2.4.1. 人肺癌组织MSC的分离与鉴定 |
| 2.4.2. 肺癌MSC促进肺癌细胞体内增殖 |
| 2.5. 本章小结 |
| 第3章 肺癌组织MSC下调肺癌细胞中miR1945p促进肺癌增殖与迁移 |
| 3.1. 引言 |
| 3.2. 实验材料 |
| 3.2.1. 肺癌病人标本和肺癌细胞系 |
| 3.2.2. 仪器设备 |
| 3.2.3. 试剂及耗材 |
| 3.3. 实验方法 |
| 3.3.1. 质粒转化 |
| 3.3.2. 质粒提取与扩增 |
| 3.3.3. 慢病毒包装及感染 |
| 3.3.4. RNA的提取 |
| 3.3.5. 实时荧光定量PCR |
| 3.3.6. 肿瘤干细胞球形成实验 |
| 3.3.7. Transwell迁移实验 |
| 3.3.8. 小鼠皮下荷瘤实验 |
| 3.3.9. 蛋白质免疫印迹 |
| 3.4. 实验结果 |
| 3.4.1. 肺癌 MSC 下调肺癌细胞中 mi R-194-5p 的表达 |
| 3.4.2. miR-194-5p 下调促进肺癌细胞增殖 |
| 3.4.3. 预测 miR-194-5p 下游靶基因为 LIN28B |
| 3.4.4. 肺癌 MSC 通过分泌 bFGF 下调肺癌中的 miR-194-5p 表达 |
| 3.5. 小结 |
| 3.6. 讨论 |
| 结论 |
| Ⅱ. 功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1. 肝内胆管细胞癌研究状况 |
| 1.1.1. 肝内胆管细胞癌简介 |
| 1.1.2. 诱发肝内胆管细胞癌的因素 |
| 1.1.3. GO-PEI作为递送载体的相关研究 |
| 1.1.4. Micro RNA(miRNA)的作用机制及肿瘤治疗 |
| 第2章 功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的研究 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2. 实验材料 |
| 2.2.1. 纳米材料和实验细胞 |
| 2.2.2. 仪器设备 |
| 2.2.3. 试剂及耗材 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.3.1. 细胞的复苏 |
| 2.3.2. 细胞传代与冻存 |
| 2.3.3. 制备及纯化GO-PEI实验 |
| 2.3.4. 凝胶阻滞实验 |
| 2.3.5. 凋亡流式检测 |
| 2.3.6. CCK8增殖实验 |
| 2.3.7. 肿瘤克隆形成实验 |
| 2.3.8. TCGA和miRNA芯片分析 |
| 2.3.9. miRNA实时荧光定量PCR |
| 2.3.10. 流式细胞术检测 |
| 2.3.11. 激光共聚焦显微镜观察 |
| 2.3.12. 肿瘤干细胞球形成实验 |
| 2.3.13. 体内荷瘤实验 |
| 2.4. 实验结果 |
| 2.4.1. GO-PEI的构建及表征 |
| 2.4.2. GO-PEI-miRNA复合物的凝胶阻滞实验 |
| 2.4.3. GO-PEI对细胞的凋亡和毒性研究 |
| 2.4.4. TCGA及miRNA芯片寻找ICC中下调的抑制性miRNA |
| 2.4.5. GO-PEI能够携带miRNA进入肿瘤细胞内 |
| 2.4.6. GO-PEI携带4种抑制性miRNA对肿瘤干细胞特性的影响 |
| 2.4.7. GO-PEI携带4种抑制性miRNA可增强肿瘤细胞对Sorafenib的敏感性 |
| 2.4.8. GO-PEI携带4种抑制性miRNA在体内显着抑制肿瘤增殖 |
| 2.5. 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| Ⅰ. miR1945p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 |
| Ⅱ. 功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的研究 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分: 文献综述 |
| 综述一: 中医药调节肿瘤免疫应答防治肿瘤的研究进展 |
| 1 先天性免疫调节 |
| 2 适应性免疫调节 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 树突状细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的作用 |
| 1 树突状细胞亚群分类 |
| 2 肿瘤免疫中树突状细胞功能 |
| 3 肿瘤对树突状细胞功能的调节作用 |
| 4 肿瘤治疗中的树突状细胞功能 |
| 5 基于树突状细胞的肿瘤免疫疗法 |
| 6 抗肿瘤树突状细胞疫苗 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三: 桔梗皂苷D的抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 1 调控肿瘤细胞凋亡途径 |
| 2 调控肿瘤细胞自噬 |
| 3 调控肿瘤细胞增殖 |
| 4 抑制血管生成 |
| 5 抑制肿瘤的侵袭和转移 |
| 6 体内抗肿瘤调控 |
| 7 免疫调节及降脂活性 |
| 8 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一: 肿瘤相关树突状细胞的诱导培养 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状脂质及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 毒胡萝卜素激活内质网应激对肿瘤相关树突状细胞中脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四: 肺瘤平膏含药血清逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质及功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六: 桔梗皂苷D对树突状细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞脂质含量及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八: 桔梗皂苷D逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验九: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（6）复方苦参注射液联合顺铂对lewis肺癌小鼠抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 复方苦参注射液抗肿瘤作用及机制研究进展文献综述 |
| 1.2.1 诱导细胞凋亡 |
| 1.2.2 调控细胞自噬 |
| 1.2.3 阻滞细胞周期 |
| 1.2.4 调节ROS水平 |
| 1.2.5 调节免疫功能 |
| 1.2.6 调节能量代谢 |
| 1.2.7 抑制DNA修复 |
| 1.2.8 抑制肿瘤干细胞 |
| 1.2.9 抑制肿瘤血管生成 |
| 1.2.10 抑制肿瘤侵袭、转移 |
| 1.3 顺铂抗肿瘤作用及机制研究进展文献综述 |
| 1.3.1 诱导细胞凋亡 |
| 1.3.2 抑制肿瘤血管生成 |
| 1.3.3 抑制肿瘤侵袭、转移 |
| 1.3.4 抑制肿瘤细胞糖酵解作用 |
| 1.4 课题来源及研究意义 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 课题研究意义 |
| 1.5 论文主要研究内容 |
| 2 复方苦参注射液联合顺铂对lewis肺癌小鼠抑瘤作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器、试剂及材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 动物一般情况观察 |
| 2.3.2 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠体重、有效体重及其变化的影响 |
| 2.3.3 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠瘤重及抑瘤率的影响 |
| 2.3.4 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠肿瘤组织病理病理形态学的影响 |
| 2.3.5 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-4水平的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 复方苦参注射液联合顺铂对lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡作用的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器、试剂及材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 CKI+DDP对肿瘤组织细胞凋亡的影响 |
| 3.3.2 CKI+DDP对肿瘤组织中cleaved caspase-3蛋白表达的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 复方苦参注射液联合顺铂对lewis肺癌小鼠肿瘤细胞糖酵解作用的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器、试剂及材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠肿瘤组织匀浆中糖酵解相关产物含量的影响 |
| 4.3.2 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠肿瘤组织匀浆中糖酵解相关酶活性的影响 |
| 4.3.3 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠肿瘤组织中糖酵解相关蛋白表达的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 复方苦参注射液联合顺铂对lewis肺癌小鼠肝肾损伤的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验仪器、试剂及材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠肝组织病理形态学的影响 |
| 5.3.2 CKI+DDP对lewis肺癌小鼠肾组织病理形态学的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）席夫碱—过渡金属配合物的合成及抗肿瘤活性和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 癌症疾病简介 |
| 2 癌细胞凋亡途径 |
| 3 抗癌药物特异性靶点 |
| 4 Pt类抗癌药物研究及应用 |
| 5 席夫碱及其金属配合物抗癌研究 |
| 5.1 席夫碱及其金属配合物的类型 |
| 5.2 席夫碱及其过渡金属配合物的抗癌活性 |
| 6 本论文的研究目的、选题依据和研究思路 |
| 6.1 研究目的 |
| 6.2 选题依据 |
| 6.3 研究思路 |
| 参考文献 |
| 第二章 席夫碱及其金属配合物的合成及结构表征 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 6-甲基-2-吡啶甲醛苯甲酰腙及其过渡金属配合物的合成及表征 |
| 2.4 2-喹啉甲醛苯甲酰腙及其过渡金属配合物的合成及表征 |
| 2.5 2-吡啶缩氨基硫脲及其铜(Ⅱ)配合物合成表征 |
| 2.6 2-羟基-1-萘甲醛苯甲酰腙及其Pt(Ⅱ)配合物的合成及表征 |
| 2.7 2-羟基-1-水杨醛苯甲酰腙-Pt(Ⅱ)配合物的合成及表征 |
| 3 配合物(C1-C21)在溶液中的稳定性实验 |
| 3.1 配合物C1-C3的稳定性 |
| 3.2 配合物C4-C6的稳定性 |
| 3.3 配合物C7-C11的稳定性 |
| 3.4 配合物C12-C16的稳定性 |
| 3.5 配合物C17-C21的稳定性 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 席夫碱配体及其金属配合物的体外抗肿瘤活性研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 储备液及实验中溶液的配制 |
| 2.3 细胞复苏及培养 |
| 2.4 配体及配合物的细胞毒性测定 |
| 2.5 细胞对配合物的摄取实验 |
| 2.6 细胞周期分析 |
| 2.7 细胞内ROS的观察 |
| 2.8 线粒体膜电位(Δψm)的检测 |
| 2.9 细胞凋亡检测 |
| 2.10 细胞形态分析 |
| 2.11 细胞迁移试验 |
| 2.12 抑制肿瘤球体生长 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 配体及配合物体外对肿瘤细胞的抑制率 |
| 3.2 肿瘤细胞吸收配合物及分布研究 |
| 3.3 配合物对肿瘤细胞周期的影响 |
| 3.4 配合物对细胞内活性氧的影响 |
| 3.5 配合物对细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.6 配合物诱导细胞凋亡 |
| 3.7 配合物C17和C19对A549cisR细胞形态的影响 |
| 3.8 配合物C17和C19对A549cisR细胞迁移的影响 |
| 3.9 配合物C17和C19对A549cisR细胞球的影响 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 席夫碱金属配合物体外抗肿瘤机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 模拟分子对接 |
| 2.3 紫外-可见光谱研究配合物与CT-DNA作用研究 |
| 2.4 荧光光谱研究配合物与CT-DNA作用研究 |
| 2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.6 蛋白印迹法研究相关蛋白的表达 |
| 2.7 Caspase-3/9表达的测定 |
| 2.8 TRAP银染实验 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 DNA对接结果 |
| 3.2 紫外-可见光谱研究配合物与DNA作用实验结果 |
| 3.3 荧光光谱研究配合物与CT-DNA相互作用实验结果 |
| 3.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.5 配合物对周期相关蛋白的影响 |
| 3.6 配合物对凋亡相关蛋白的影响 |
| 3.7 配合物对Caspase-3/9的影响 |
| 3.8 配合物调控c-myc和hTERT蛋白的表达 |
| 3.9 配合物对端粒酶活性的影响 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的相关论文 |
| 致谢 |
（8）miRNA-99b-5p在肺癌中的功能及化合物GA13315抑制肺癌细胞的靶点筛选和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 第一部分 miRNA-99b-5p在肺癌中的功能及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 化合物GA13315抑制肺癌细胞的靶点筛选及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 肺癌辅助和新辅助药物治疗现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）VEGF在铬诱导肺支气管上皮细胞Beas-2B恶性转化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肺癌 |
| 1.1.1 肺癌的概述 |
| 1.1.2 肺癌的研究现状 |
| 1.2 重金属铬 |
| 1.2.1 铬的概述 |
| 1.2.2 铬与肺癌 |
| 1.3 Beas-2B细胞 |
| 1.4 肿瘤迁移、侵袭 |
| 1.5 肿瘤血管生成 |
| 1.6 血管内皮生长因子(VEGF) |
| 1.6.1 VEGF的概述 |
| 1.6.2 VEGF与肺癌 |
| 1.7 刺槐素对肿瘤的预防作用 |
| 1.8 研究内容 |
| 1.8.1 研究目的和意义 |
| 1.8.2 实验设计思路 |
| 第二章 实验细胞株的筛选及其恶性程度确定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.3 伤痕愈合实验 |
| 2.2.4 Transwell迁移实验 |
| 2.2.5 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.6 免疫荧光实验 |
| 2.2.7 小管生成实验 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 VEGF蛋白高表达细胞株的确定 |
| 2.4.2 VEGF蛋白高表达细胞株的形态学变化 |
| 2.4.3 VEGF蛋白高表达细胞株的蛋白表达变化 |
| 2.4.4 VEGF蛋白高表达细胞株的细胞迁移、侵袭等运动能力变化 |
| 2.4.5 VEGF蛋白高表达细胞株的细胞血管生成能力变化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 VEGF对六价铬恶性转化Beas-2B细胞迁移、侵袭及血管生成的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.1.5 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 MTT |
| 3.2.3 转化菌培养 |
| 3.2.4 质粒抽提 |
| 3.2.5 瞬时转染 |
| 3.2.6 蛋白免疫印迹实验 |
| 3.2.7 伤痕愈合实验 |
| 3.2.8 Transwell迁移实验 |
| 3.2.9 Transwell侵袭实验 |
| 3.2.10 免疫荧光实验 |
| 3.2.11 小管生成实验 |
| 3.3 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 外源性重组VEGF生长因子刺激恶性转化细胞后迁移、侵袭相关蛋白表达情况 |
| 3.4.2 外源性重组VEGF生长因子刺激恶性转化细胞后迁移、侵袭等运动能力变化 |
| 3.4.3 外源性重组VEGF生长因子刺激恶性转化细胞后血管生成能力变化 |
| 3.4.4 VEGF特异性抑制剂氯化血根碱处理恶性转化细胞后迁移、侵袭相关蛋白表达情况 |
| 3.4.5 VEGF特异性抑制剂氯化血根碱处理恶性转化细胞后迁移、侵袭等运动能力变化 |
| 3.4.6 VEGF特异性抑制剂氯化血根碱处理恶性转化细胞后血管生成能力变化 |
| 3.4.7 过表达VEGF后恶性转化细胞中迁移、侵袭相关蛋白表达情况 |
| 3.4.8 过表达VEGF后恶性转化细胞中迁移、侵袭等运动能力变化 |
| 3.4.9 过表达VEGF后恶性转化细胞中血管生成能力变化 |
| 3.4.10 VEGF siRNA干扰后恶性转化细胞中迁移、侵袭相关蛋白表达情况 |
| 3.4.11 VEGF siRNA干扰后恶性转化细胞中迁移、侵袭等运动能力变化 |
| 3.4.12 VEGF siRNA干扰后恶性转化细胞中血管生成能力变化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 刺槐素对六价铬恶性转化Beas-2B细胞的预防作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要试剂配制 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 MTT |
| 4.2.3 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.2.4 伤痕愈合实验 |
| 4.2.5 Transwell迁移实验 |
| 4.2.6 Transwell侵袭实验 |
| 4.2.7 免疫荧光实验 |
| 4.2.8 小管生成实验 |
| 4.3 数据分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 刺槐素对正常Beas-2B及Cr(Ⅵ)-Beas-2B恶性转化细胞活性的影响 |
| 4.4.2 刺槐素刺激恶性转化细胞后VEGF及迁移侵袭相关蛋白表达情况 |
| 4.4.3 刺槐素刺激恶性转化细胞后迁移、侵袭等运动能力变化 |
| 4.4.4 刺槐素刺激恶性转化细胞后血管生成能力变化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间学术研究成果 |
（10）新西兰牡荆苷Ⅱ促肝癌凋亡与抑制肺癌EMT的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 癌症概述 |
| 1.2 铁皮石斛概述 |
| 1.3 新西兰牡荆苷Ⅱ概述 |
| 1.4 细胞凋亡 |
| 1.5 上皮间质转化(EMT) |
| 1.5.1 EMT的概述 |
| 1.5.2 EMT与癌症转移的关系 |
| 1.5.3 EMT的标志物 |
| 1.6 转化生长因子( Transforming Growth Factor-β, TGF-β) |
| 1.6.1 TGF-β/Smad信号通路与EMT |
| 1.6.2 非Smad信号通路(PI3K/Akt/mTOR信号通路) |
| 第二章 新西兰牡荆苷Ⅱ诱导人肝癌HepG2细胞凋亡研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验试药 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法检测新西兰牡荆苷Ⅱ对不同肿瘤细胞生长的影响 |
| 2.2.3 Hoechst33258染色观察HepG2细胞凋亡形态学改变 |
| 2.2.4 流式细胞仪检测新西兰牡荆苷Ⅱ对肝癌HepG2细胞的凋亡率 |
| 2.2.5 荧光定量PCR法测定凋亡相关基因的表达 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 MTT筛选新西兰牡荆苷Ⅱ对不同肿瘤细胞生长的影响 |
| 2.3.2 肝癌HepG2细胞凋亡形态学改变 |
| 2.3.3 Annexin V-PI双染法检测HepG2细胞的凋亡率 |
| 2.3.4 荧光定量PCR法测定HepG2细胞凋亡相关基因的mRNA表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 新西兰牡荆苷Ⅱ抑制TGF-β1诱导的肺癌上皮间质转化的机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂与耗材 |
| 3.1.3 实验试药 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞所需溶液的配置 |
| 3.2.3 MTT法检测新西兰牡荆苷Ⅱ与TGF-β1对A549及H1299细胞毒作用 |
| 3.2.4 荧光显微镜观察细胞的形态学变化 |
| 3.2.5 平板克隆形成实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞增殖能力影响 |
| 3.2.6 划痕实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞迁移能力影响 |
| 3.2.7 Transwell小室实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞侵袭能力影响 |
| 3.2.8 免疫荧光实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞EMT标志物E-cadherin及Vimentin表达的影响 |
| 3.2.9 Western boltting实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞EMT标志物及TGF-β/S mad和PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达影响 |
| 3.2.10 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 新西兰牡荆苷Ⅱ及TGF-β1对肺癌细胞生长的影响 |
| 3.3.2 TGF-β1及新西兰牡荆苷Ⅱ对A549及H1299细胞形态学的改变 |
| 3.3.3 新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.3.4 新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.3.5 免疫荧光检测新西兰牡荆苷Ⅱ对E-cadherin及Vimentin蛋白表达的影响 |
| 3.3.6 Western blot验证新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导肺癌EMT蛋白标志物的影响 |
| 3.3.7 新西兰牡荆苷Ⅱ抑制TGF-β1诱导的肺癌EMT的机制 |
| 3.3.8 进一步验证新西兰牡荆苷Ⅱ通过PI3 K/Akt/mTOR及TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的肺癌EMT |
| 3.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间论文发表与课题参与情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、人肺癌细胞LALU血管生成过程的形态学观察及意义（论文参考文献）
- [1]七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究[D]. 宋晓萍. 辽宁师范大学, 2021(09)
- [2]中国黄芩属药用植物亲缘学研究[D]. 申洁. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [4]Ⅰ.miR-194-5p在间充质干细胞微环境调控肺癌增殖的作用及机制研究 Ⅱ.功能化的氧化石墨烯作为新型miRNA递送载体抑制肝内胆管细胞癌的增殖[D]. 万令飞. 北京工业大学, 2020(06)
- [5]肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究[D]. 张曦文. 中国中医科学院, 2020(01)
- [6]复方苦参注射液联合顺铂对lewis肺癌小鼠抗肿瘤作用研究[D]. 谢学恒. 哈尔滨商业大学, 2020
- [7]席夫碱—过渡金属配合物的合成及抗肿瘤活性和机制研究[D]. 邓俊刚. 广西师范大学, 2019(04)
- [8]miRNA-99b-5p在肺癌中的功能及化合物GA13315抑制肺癌细胞的靶点筛选和机制研究[D]. 刘锐. 昆明医科大学, 2019(02)
- [9]VEGF在铬诱导肺支气管上皮细胞Beas-2B恶性转化中的作用及机制研究[D]. 刘意. 江苏大学, 2019(03)
- [10]新西兰牡荆苷Ⅱ促肝癌凋亡与抑制肺癌EMT的机制研究[D]. 罗颖懿. 广州中医药大学, 2019(04)