一、人类成纤维细胞作为人胚胎干细胞饲养层细胞的初步研究（论文文献综述）
刘峰,彭宇环,罗良平,吴本清[1]（2022）在《植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化》文中研究指明背景:碱性成纤维细胞生长因子是维持人胚胎干细胞长期培养的重要生长因子,提供来源可靠、无动物源性以及低成本的碱性成纤维细胞生长因子产品对维持人胚胎干细胞生长以及规模化制备至关重要。目的:为了排除动物源性或者其他细菌类的潜在干扰,该研究评估植物源性碱性成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞生长与分化的影响。方法:以人胚胎干细胞系（H9）作为研究材料,采用免疫荧光染色、流式细胞仪检测、碱性磷酸酶染色、RT-PCR方法比较不同质量浓度植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持干细胞特性的能力以及其向外、中、内三胚层分化和胰腺细胞分化的潜能。结果与结论:植物源性碱性成纤维细胞生长因子（4μg/L和0.4μg/L）和常规碱性成纤维细胞生长因子（4μg/L）都能很好地维持人胚胎干细胞的生长和分化能力,提示植物源性碱性成纤维细胞生长因子可以作为有效支持人胚胎干细胞生长和分化的备选产品。
葛文燕[2]（2021）在《人多能干细胞向肝脏样细胞定向分化体系的优化》文中认为近年来,多种肝脏疾病的发病率逐渐升高,严重影响着人们的健康。目前,治疗终末期肝病的有效方法是供体肝移植和肝细胞移植,但肝供体的缺乏使这两种方法的开展都面临着巨大的挑战。因此,开发可再生的肝细胞来源是一个亟待解决的问题。人多能干细胞具有自我更新以及分化为多种细胞类型的潜能,成为了产生肝脏样细胞的理想细胞来源之一。近年来,将多能干细胞分化为肝脏样细胞的研究有了诸多进展,但该领域仍存在一些问题,例如:得到的肝脏样细胞异质性高;培养系统中存在异种动物产品及昂贵的生长因子,难以满足临床和大规模生产的要求;肝脏细胞的功能和成熟度都有待提高。在本课题中,我们将人胚胎干细胞到肝细胞过程中的中间阶段——定型内胚层细胞在体外扩增和纯化,形成内胚层祖细胞系,并将其继续分化为肝脏样细胞。利用这种方法可以降低分化细胞的异质性,减少移植后的致瘤风险,也有利于分化机制的研究。此外,结合化学小分子筛选,我们建立了内胚层祖细胞扩增和高效分化的新体系,去除了对生长因子的依赖。结果显示,利用新体系分化获得的肝细胞,与基于生长因子分化体系获得的肝细胞形态相似,可以表达高水平的肝脏特异性标志物,并具有糖原合成和脂质代谢等生物学功能。综上所述,这项研究优化并建立了内胚层祖细胞系培养的新体系,为体外大规模的肝细胞生产提供了基础,为肝脏发育过程及机制研究提供了平台,并且有助于促进肝脏样细胞在临床上的应用。
李金珊[3]（2021）在《小鼠胚胎干细胞在2iL与PKCi体系下Polycomb复合体表达差异的研究》文中进行了进一步梳理
高新悦[4]（2021）在《人诱导性多能干细胞系的建立及向外胚层定向分化的研究》文中研究说明2006年,Shinya Yamanaka通过逆转录病毒将四种转录因子转入小鼠成纤维细胞,从而获得了一种类似于胚胎干细胞的多能细胞,称之为诱导性多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cell,iPSC）,之后又相继报道了人iPSC的产生。iPSC的产生和发展,使人们对多能性的调控机制有了新的认识,同时也让人们看到了iPSC在疾病建模方面的巨大潜力。在威胁人类健康的众多疾病中,有一种疾病叫急性脊髓炎,它是一组导致脊髓神经损伤的炎症性疾病,但其确切病因尚不明确。因此,对急性脊髓炎患者来源的iPSC进行研究,在明确急性脊髓炎的致病机制上有重要意义。本研究将来源于人胎儿成纤维细胞和急性脊髓炎患者的皮肤成纤维细胞利用电转染的方法转入8个外源因子,即OCT4,SOX2,c-Myc,KLF4,NANOG,LIN28,RARG和LRH1,使其重编程为iPSC,然后探讨两种来源的iPSC在多能性,转录组特征和向外胚层方向分化等方面的生物学特性,试图寻找正常人和疾病患者之间的差异,以期为急性脊髓炎致病机制的研究提供一定的理论基础。具体实验结果如下:1.人胎儿成纤维细胞（HEF）和急性脊髓炎患者成纤维细胞（P-HAF）来源的iPSC细胞系的建立及生物学特性检测本实验利用电转染8因子的方式成功建立了人胎儿成纤维细胞来源iPSC（iPS）细胞系和急性脊髓炎患者成纤维细胞来源的iPSC（P-iPS）细胞系。两种细胞的克隆形态没有明显差异,碱性磷酸酶活性均为阳性且核型正常,同时内源多能基因也都被成功激活。2.iPS和P-iPS的分子生物学特性分析转录组数据的分析结果再次验证了两种成纤维细胞被成功重编程为iPSCs,并且数据显示正常人与疾病患者之间存在差异。与人胎儿成纤维细胞相比,急性脊髓炎患者成纤维细胞差异基因主要富集在炎症相关信号通路上,并且在诱导为P-iPS之后,这种差异继续存在。3.iPS和P-iPS向外胚层方向的分化首先利用人胚胎干细胞系（h ESC）向神经嵴细胞（Neural crest,NC）和颅基板细胞（Cranial placode,CP）方向进行定向诱导,对诱导体系进行检验。实时荧光定量PCR（q PCR）和免疫荧光染色（IF）结果显示,分化细胞表达NC和CP的标记物。然后,将iPS和P-iPS向NC和CP方向进行诱导分化,q PCR和IF结果显示诱导细胞表达NC和CP的标记物。从细胞的形态和AP染色结果来看,iPS和P-iPS来源的NC和CP均没有明显差别。q PCR结果显示,无论NC还是CP,在iPS与P-iPS来源的分化细胞中,FOXG1,OTX2和SOX2的表达均下调,同时IF结果显示两种来源的分化细胞均表达NESTIN,因此,在标记基因的表达方面,iPS与P-iPS同样没有十分明显的差异。
武彩霞[5]（2021）在《骡子诱导多能干细胞生物学特性分析及体外分化的研究》文中研究说明骡是马和驴种间杂交所生的杂种后代,大部分没有生殖能力。目前关于骡不育的原因还没有相关实验证明性结论。2011年,Saitou等人将小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）定向诱导为原始生殖样细胞（Primordial germ cell-like cells,PGCLCs）,成功得到了存活后代,并且在小鼠iPSCs上也得到了相同结果。在之后的研究中,利用不同方法也可将人和马iPSCs定向诱导为PGCLCs。本研究尝试利用干细胞具有多能性、可以长期稳定传代等优势将本实验室建立的可育母骡iPSCs（Fertile mule fibroblasts induced pluripotent stem cells）定向诱导为PGCLCs,为研究骡不育的生殖生物学机制提供科学依据。具体实验结果如下:1.克隆形态与碱性磷酸酶染色结果显示,骡FMF-iPSCs细胞核质比大,细胞之间连接紧密,克隆形态呈不规则扁平状,界限清晰且碱性磷酸酶染色呈阳性。2.核型分析结果显示,骡FMF-iPSCs染色体数目正常2N=63/XX,基因组稳定。3.实时荧光定量PCR及免疫荧光染色结果显示,骡FMF-iPSCs在RNA、蛋白水平均表达多能性标记基因OCT4、SOX2、NANOG。4.体外EBs分化结果显示:骡FMF-iPSCs具有体外分化为三个胚层的潜能,分化产物在RNA水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因HNF4A、HAND1、NESTIN,蛋白水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因GATA6、T、NESTIN。5.骡FMF-iPSCs注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48 h后,组织切片荧光染色结果显示,该细胞系增殖、移动,有贡献到三个胚层与早期PGCs的潜能。6.PGCLCs定向诱导分化结果显示,三种不同诱导方法均可使FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs,RNA水平、蛋白水平分别表达PGCs标记基因NANOS3、BLIMP1、SOX17;VASA、BLIMP1。综上所述:本研究得到了在血清Li F培养体系中长期稳定传代的可育母骡FMF-iPSCs,该细胞系具有自我更新能力和多能性,并维持稳定的基因组特征;这类干细胞体外拟胚体分化具有贡献到三个胚层的潜能,注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48h后干细胞能够增殖、移动,并贡献到三个胚层与PGCs。另一方面,通过三种不同诱导方法均可将FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs。上述研究探讨了骡FMF-iPSCs的干细胞特性及PGCLCs定向分化能力,为杂交动物细胞的干细胞诱导及相关研究提供重要科学依据。
刘默凝[6]（2021）在《乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立》文中认为多能干细胞（Pluripotent stem cells,PSCs）在成年个体中具有向所有细胞类型分化的潜力,具有无限的自我更新能力。哺乳动物多能干细胞通常被分为三种类型:胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）、诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）和成体多能干细胞。诱导并建立乌骨绵羊iPSCs可为摸索绵羊ESCs体外培养条件奠定科学基础。在家畜中,只有猪获得了不依赖外源基因的iPSCs,牛、山羊、绵羊暂未见相关报道,对于家畜iPSCs的诱导还需进一步深入探索。本实验首先建立乌骨绵羊体细胞耳成纤维细胞系,使用不同转录因子体系对乌骨绵羊体细胞进行重编程,尝试获得具有强发育潜能或者定向发育潜能的绵羊iPSCs。随后对获得的乌骨绵羊iPSCs从细胞形态、核型、内源性多能基因表达、体内外三胚层分化能力以及发育潜能等方面进行研究,结果如下:（1）本实验通过组织块培养法从出生后15日龄的乌骨绵羊耳部皮肤成功分离雌、雄性两个乌骨绵羊成纤维细胞系,获得的细胞系核型正常（2n=54）、生长曲线符合正常细胞生长规律（S型）、无支原体污染,可作为诱导乌骨绵羊iPSCs的起始细胞系。（2）以piggyBac+Tet-on载体为基础设计并构建PB-TRE-sLargeT（SV40 Large T）、PB-TRE-hTERT和PB-TRE-sLhT（sLargeT和hTERT）三个表达载体,并通过电转染的方法整合至乌骨绵羊成纤维细胞基因组,在添加1.0μg/m L Doxycycline的条件下成功表达相应外源基因,证明三个载体可用于后续乌骨绵羊iPSCs的诱导。（3）X8（b OSMK+pNhL+sLhT）诱导体系、B9-LT（b OSMK+pNhL+hRL+sLargeT）诱导体系和10a（b OSMK+pNhL+hRL+sLhT）诱导体系均可诱导雄性乌骨绵羊成体细胞重编程,并且SV40 Large T可提高piggyBac+TET-on载体诱导的乌骨绵羊iPSCs重编程效率;本实验共建立了344个细胞克隆形态类似小鼠或人PSCs的乌骨绵羊iPSCs细胞系,其中X8诱导体系121个、B9-LT诱导体系134个、10a诱导体系89个;由X8诱导体系获得内源性OCT4激活程度最高的细胞系:X8-4,命名为:siPSC-4。（4）本实验建立的乌骨绵羊诱导多能干细胞系siPSC-4可稳定传代49代,核型正常（2n=54,31/40,77.5%）,内源性OCT4表达稳定,免疫荧光检测表达多能性基因OCT4、SOX2、NANOG和REX1,具有体外三胚层的分化能力并可在体内形成具有中、内胚层分化的畸胎瘤;此外,实验结果表明,STO饲养层细胞有助于siPSC-4内源基因OCT4的持续表达,在Feeder Free培养条件下,siPSC-4内源OCT4的表达量下降;另外小鼠和人类na（?）vePSCs的干细胞培养液2i、t2i、4i、5i以及小鼠拓展多功能干细胞（Expanded potential pluripotent stem cells,EPSCs）培养液不能维持siPSC-4的正常生长,最终细胞全部凋亡;（5）本实验建立的siPSC-4可参与小鼠和绵羊早期胚胎的发育,在15%（3/20）小鼠囊胚内细胞团（Inner cell mass,ICM）、26%（6/24）绵羊囊胚ICM中可检测到td-tomato标记的siPSC-4细胞;本研究首次使用piggyBac+TET-on转座系统表达外源转录因子（bovine OCT4、SOX2、KLF4、c MYC,porcine NANOG,human LIN28,SV40 Large T和human TERT）将雄性乌骨绵羊成体细胞重编程为诱导多能干细胞。获得表达多能基因、具备体外三胚层分化能力的乌骨绵羊iPSCs,为进一步研究绵羊全能胚胎干细胞的建系提供了优良的实验材料。
才文道力玛[7]（2021）在《蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立》文中提出蒙古马是世界上最古老的马品种之一,是我国优秀的马种资源。具有耐寒耐旱、耐粗饲、适应能力强等特征。此外,马匹关节和肌腱的解剖学、生理学以及损伤性质与人类高度相似,因此马是用于研究软骨损伤或退化细胞疗法的传统动物模型之一。诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）是将特定的转录因子导入体细胞重编程而获得的类似胚胎干细胞的一类细胞。iPSCs可以来源于任意体细胞,能够自我更新并分化为所有类型体细胞,因此在生物医学上可以用于建立疾病模型,以研究疾病的发生、药物检测以及疾病治疗,而在农业方面,它还可以用于研发转基因动物或者保护优秀遗传资源。但迄今为止,尽管有许多团队尝试建立马的iPSCs,但仍没有真正的马iPSCs的报道,在国内外均没有关于蒙古马iPS细胞的研究。因此,为了建立蒙古马诱导多能干细胞系,在本研究中,我们采用多顺反子慢病毒载体,将OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个外源基因导入至蒙古马胚胎成纤维细胞中进行重编程。为后续进一步建立蒙古马生物学及医学细胞模型奠定基础。我们的实验结果如下:1.通过消化法分离培养了蒙古马34天胚胎成纤维细胞和小鼠13.5天胚胎成纤维细胞。两种细胞形态都符合成纤维细胞形态特征,能够正常消化传代,并且经过冻存、复苏后能够正常增殖且形态无异常。可以为后续研究提供重编程供体细胞及马iPSCs的饲养层。2.为了优化多顺反子慢病毒包装体系,我们使用脂质体3000和脂质体LTX两种转染试剂转染293T细胞,并比较了编码绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒的转染效率及包装病毒感染细胞的能力。最终显示,脂质体3000在病毒质粒的转染效率和包装病毒颗粒对细胞的感染能力方面都显示出较好的效果,分别为79.4±6.3%和74±3.6%。3.通过感染编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的多顺反子慢病毒,我们成功获得了蒙古马iPS样细胞（E-iPS）:⑴蒙古马iPS样细胞显示出清晰的边缘、呈细胞集落生长;⑵对蒙古马iPS样细胞进行碱性磷酸酶染色,结果呈阳性,表明其具有多能性;⑶提取蒙古马iPS样细胞RNA,实时荧光定量PCR方法检测蒙古马iPS样细胞多能性相关基因的m RNA表达水平,结果显示,蒙古马iPS样细胞高表达Oct4、Sox2、Nanog、Bmp4、Rex1等5个多能性相关基因;⑷对获得的蒙古马iPS样细胞进行免疫荧光染色实验,结果显示蒙古马iPS样细胞表达多能性标记Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、SSEA-1以及SSEA-4;⑸将蒙古马iPS细胞培养液中成分2i、LIF及BFGF撤去后观察其形态变化。结果显示,培养液撤去2i和BFGF时,E-iPS失去克隆形态,表明蒙古马iPS细胞可能通过BFGF途径来维持多能性。
张筱芫[8]（2021）在《NANOS2维持水牛精原干细胞干性特征机制的初步研究》文中提出水牛是我国华南地区重要家畜,具有较高的奶用和肉用价值。但我国水牛为沼泽型水牛,产肉、产奶等生产性能较低,急需通过集成多种生物繁殖技术对其进行改良。精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是雄性体内唯一能够进行遗传物质传递的成体细胞,是进行水牛遗传改良或雄性种质资源保存的理想种子细胞。但目前水牛SSCs自我更新和分化机制尚不明晰,体外培养系统还不完善。已有研究证实Nanos2是小鼠雄性生殖细胞发育重要调控因子,在促进小鼠原始生殖细胞向雄性分化及维持SSCs动态平衡过程中起了重要作用。我们前期研究证实水牛NANOS2的表达模式与小鼠既存在一致性,也存在差异性,水牛NANOS2不但能在幼年水牛和成年水牛的SSCs中表达,也能在成年水牛曲精细管的延长精子细胞中表达,其功能是否与小鼠一致有待证实。本研究在优化水牛SSCs体外培养体系基础上,将构建的NANOS2过表达SSC-like细胞进行体外培养,通过对水牛NANOS2过表达SSCs的转录组测序及生物信息学分析解析了水牛SSC-like细胞转录组相关变化,揭示NANOS2维持水牛SSC-like细胞干性特征相关机制。主要研究结论如下:（1）构建了NANOS2过表达载体。以XP61质粒为骨架构建XP61-NANOS2过表达载体,利用hy PBase转座酶将其转入水牛睾丸Sertoli细胞以验证NANOS2是否能在细胞中表达。结果显示XP61-NANOS2过表达载体构建成功。（2）筛选和优化了水牛SSCs体外培养系统。根据先前研究,我们选择无血清培养模式,并设置三种培养方式:饲养层加Insert（F+I）、Laminin加Insert（L+I）及Laminin无Insert（L）以探索对水牛THY1+细胞的最佳体外培养方式。同时对所培养的细胞进行细胞免疫荧光鉴定及RT-PCR对比。结果显示,F+I、L+I培养方式下培养的细胞都能被NANOS2、DDX4和PGP9.5一抗着色,但F+I条件更能维持水牛SSC-like细胞的干性。（3）通过对水牛NANOS2过表达SSCs的转录组测序及生物信息学分析解析了水牛SSC-like细胞转录组相关变化。对培养的SSC-like细胞进行NANOS2过表达后,将进行过表达的SSC-like细胞（X-N SSC-like细胞）和未进行过表达的SSC-like细胞进行转录组测序,检测到表达的基因共有16675个,其中,X-N SSC-like细胞与SSC-like细胞共同表达的细胞有11912个,X-N SSC-like细胞相对于SSC-like细胞具有表达量显着性差异的基因共有2659个（差异倍数>2;P<0.05）。KEGG富集分析显示这些具有显着性差异的基因多数参与了MAPK信号通路、MAPK1/MAPK3信号通路、m TOR信号通路、PI3K-Akt信号通路;GO富集分析显示,在这些具有显着性差异基因中的上调基因主要参与了经典Wnt信号通路、正向调节生长发育、Wnt信号通路、甲基化、r RNA甲基化、细胞有丝分裂的调节和细胞生长的调节,而这些具有显着性差异基因中的下调基因主要参与了正向调节凋亡过程、凋亡信号通路及外部凋亡信号通路。在检测出的基因中,我们发现FZD9、SOX17、WNT5B基因上调;SOX4基因下调。说明在水牛SSC-like细胞体外培养中,NANOS2可以通过抑制其分化来维持其干性,且NANOS2可以促进其自我更新及增殖能力。综上,本研究初步解析了NANOS2基因维持水牛SSC干性特征的机制,为今后深入探索水牛SSCs自我更新和分化机制的研究提供参考。
张云峰[9]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中研究指明绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
袁霞[10]（2021）在《CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究》文中研究说明在哺乳动物中,可以通过体细胞核移植、体外受精和胚胎移植等胚胎工程技术以及超低温冷冻技术实现种质资源的保护和物种复原。然而由于禽类为卵生动物,其胚胎发育方式与哺乳动物相比有很大差异,导致这些胚胎工程技术和冷冻保存技术无法在禽类上广泛应用,极大地阻碍了禽类胚胎工程的研究和珍稀物种保护工作。而禽类原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）具有迁移的特性,体外培养的鸡PGCs注入正常孵化的鸡胚血管后可在受体胚胎性腺中增殖并产生了嵌合体鸡,且鸡PGCs移植到鸭早期胚胎中也能够获得嵌合体鸭,表明PGCs的异体/种间移植或许能解决禽类种质资源保存的问题。然而由于分离原代PGCs细胞数量少,且需以牺牲早期胚胎为代价,导致PGCs异种间移植应用并不广泛,禽类种质资源保护仍面临巨大难题。2006年,诱导干细胞技术问世,体细胞经过诱导重编程能够形成与胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）类似的诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPS）,诱导体细胞重编程技术的出现给为珍稀禽类的保种、转基因禽类的生产等研究开辟了新思路,诱导体细胞重编程技术能够为禽类的胚胎工程和转基因工程研究提供新的干细胞来源,诱导重编程所需的禽类体细胞的分离和冷冻技术相对简单,能够短时间获取大量的细胞,并且对个体不会造成较大伤害,因此,若能通过诱导重编程技术将禽类体细胞重编程为iPS并进一步诱导成PGCs,便能极大地解决PGCs分离困难且无法大量获得的难题。目前,诱导体细胞重编程技术已在小鼠、人、大鼠、猪、猴、牛、羊、鸡等多个物种上成功应用。本课题组前期建立了原代PGCs迁移归巢模型并成功产生了后代,同时建立了 CEF诱导鸡iPS并进一步诱导分化为iPGCs的转分化体系,但这一转分化体系的诱导效率较低,且CEF转分化形成的iPGCs细胞是否具有原代PGCs同样的产生后代的能力仍不清楚。因此,本研究利用OCT4、SOX2、NANOG、LIN28（OSNL）因子体系诱导黑羽狼山鸡CEF重编程为iPS,对该体系进行优化,通过BMP4/BMP8b/EGF体系将其诱导分化为iPGCs,进一步通过转录组测序对不同体系诱导获得的iPS细胞及iPGCs进行分析,分别比较其与原代ESCs和PGCs之间的异同,最后通过鸡胚血管移植的技术将黑羽狼山鸡iPGCs移植到受体隐性白羽鸡中,孵化出壳后饲养至性成熟,通过公母鸡自交产生后代,借助微卫星检测以及基因组重测序分析后代鸡是否来源于黑羽狼山鸡iPGCs,为实现PGCs在禽类种质资源保护过程中的广泛应用奠定基础。研究结果如下:（1）鸡iPS诱导体系的优化本研究利用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28A（OSNL）重编程体系对鸡成纤维细胞CEF进行诱导重编程,获得了与ESCs有相似特性的狼山鸡iPS,为碱性磷酸酶染色阳性,表达SSEA-1蛋白,体外能够分化形成类胚体且表达三胚层标记基因。荧光定量结果显示,从诱导重编程的第6天开始,内源性多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等的表达逐渐被激活,而成纤维细胞标记基因Thy-1的表达逐渐被沉默。对重编程过程中不同天数的糖酵解相关基因表达、酶活性、葡萄糖摄取量及乳酸产生量的变化进行检测,结果显示,从诱导的第6天开始,重编程过程中糖酵解相关基因Hk1,Ldha,Glut1,Pfkp表达逐渐上调,并且糖酵解关键限速酶己糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）及果糖-6-磷酸激酶（PFK）活性在诱导第9天均显着增强（P<0.05）。同时,葡萄糖摄取量逐渐增加,乳酸产生量出现极显着堆积（P<0.01）,表明鸡CEF诱导重编程为iPS的过程中糖酵解被激活。此外,随着重编程的进行,氧化磷酸化相关基因Ndufa10及Cox4i1的表达极显着下调（P<0.01）,且鸡iPS细胞的线粒体膜电位与CEF相比出现明显下降,表明氧化磷酸化被抑制。进一步通过添加糖酵解抑制剂和激活剂发现糖酵解能够激活内源多能性基因表达从而促进鸡iPS形成。通过生物信息学分析发现Oct4、Sox2和Nanog三个转录因子在糖酵解关键基因Hk1、Pfkp和Ldha的启动子区有共同的结合位点,双荧光素酶报告实验检测显示过表达Oct4,Sox2,Nanog极显着上调了Hk1、Pfkp和Ldha等基因的转录活性（P<0.01）,且过表达Oct4,Sox2,Nanog能够上调Hk1、Pfkp和Ldha的表达并提高糖酵解水平。因此本研究OSNL体系的基础上筛选了糖酵解激活剂2i-SP来优化iPS诱导体系,结果显示,添加2i-SP后糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Glut1的mRNA表达均上调,葡萄糖摄取量和乳酸产生量也有不同程度的提高。同时添加2i-SP后,诱导产生的iPS克隆数从24.33±2.08极显着增加至47.00±3.61（P<0.01）,流式分析检测SSEA-1阳性细胞比例也从1.59%±0.08极显着升高到11.47%±1.93（P<0.01）,表明2i-SP通过激活糖酵解来促进鸡iPS形成。以上结果表明糖酵解能够协同核心多能性因子促进鸡体细胞诱导重编程,小分子化合物2i-SP能够提高鸡iPS的形成效率。（2）不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究为了比较分析体外诱导重编程形成的鸡iPS细胞与ESCs的转录水平的异同以及添加不同小分子化合物对鸡iPS形成的影响,分析干细胞形成和糖代谢相关因子在不同诱导条件下的表达变化,本研究对不同体系诱导的鸡iPS、CEF及鸡ESCs进行RNA-seq,首先对不同样本的log10（FPKM）进行聚类热图分析,结果显示,重编程后的iPS基因表达模式与ESCs相似。对糖酵解及氧化磷酸化相关基因FPKM值进行聚类热图分析,结果显示iPS（OSNL）中糖酵解相关基因Hk1、Ldha、Pdk3、Pdk4、Pfkp、Slc2al、Hif1a等基因表达水平均高于iPS（OSNL）,而氧化磷酸化相关基因Mdufs1-6,Ndufa1-12等的表达水平均低于CEF,表明CEF诱导重编程为iPS后其代谢方式从氧化磷酸化转变为糖酵解。在iPS（OSNL）组和CEF组中,存在8376个基因差异表达,所有差异表达基因主要富集到细胞代谢相关的条目以及许多与糖代谢、脂代谢、蛋白合成相关的通路。与iPS（OSNL）vs CEF组相比,iPS（OSNL2i-SP）vs CEF组中有1 751个特异上调表达基因,主要富集到细胞生长调节、细胞周期正调控、胚胎骨骼系统形态发生等细胞生长发育调控的相关条目,并且还富集到自噬体、糖:质子转运体活动及碳水化合物代谢过程。（3）鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究本研究通过BMP4/BMP8b/EGF将黑羽狼山鸡iPS诱导分化,获得了 PAS染色阳性且表达Cvh、c-KIT、Blimp1等PGCs标记基因的iPGCs。对鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化进行检测发现在iPS诱导分化为iPGCs的过程中,糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Ldha的表达逐渐下降,并伴随着氧化磷酸化相关基因Ndufa10和Cox4i1表达的逐渐增加,同时葡萄糖摄取量逐渐减少,乳酸产生量也逐渐降低,表明鸡iPS诱导分化为iPGCs的过程中糖酵解被抑制。为了全面解析iPGCs中基因的表达情况;鉴定iPS来源的iPGCs是否具有正常的PGC相似的特性,以及研究iPGCs体外诱导形成过程中的机制,本研究对iPS诱导的iPGCs进行了转录组测序。层次聚类结果显示iPS来源的iPGCs的表达模式接近于原代PGCs。根据筛选出的PGCs标记基因表达情况制作小提琴图,结果显示iPS体外诱导的iPGCs细胞的PGCs标记基因表达模式与原代PGCs相近。在鸡iPGCs（iPS derived）组与PGCs组中,6555个基因存在差异表达,所有差异表达基因主要富集到了一些与糖类、脂类及蛋白质代谢相关的条目以及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸代谢、自噬和PPAR等信号通路,表明这些信号通路在体外诱导iPGCs的过程中可能发挥了重要的调控作用。（4）鸡iPGCs介导类克隆体系的建立本研究将黑羽狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs注射至孵化2.5天的隐形白羽鸡F1的血管中,建立鸡iPGCs介导的类克隆体系,利用F1代公母鸡自交获得了类克隆鸡后代F2,并对F2代类克隆鸡进行了微卫星鉴定。狼山鸡iPGCs经PKH26红色荧光细胞膜表面标记后在显微镜下呈红色荧光,分离移植了 PKH26标记的黑羽狼山鸡iPGCs细胞后的白羽鸡种蛋的生殖嵴,在显微镜下观察到受体鸡胚生殖嵴中PKH26标记的红色荧光。移植了黑羽狼山鸡CEF诱导重编程获得的iPGCs的F1代受体隐性白羽鸡胚共100枚,继续孵化至出壳并存活的F1代受体隐性白羽鸡共45只,饲养至性成熟后进行公母鸡自交,收集所产受精蛋孵化至出壳,记为F2代,共获得517只F2代后代鸡,其中F2代阳性类克隆鸡个数为193只类克隆鸡阳性率为37.33%。F2代继续饲养,至性成熟时进行测交,收集受精种蛋孵化至出壳,鸡为F3代,共获得140只F3代后代鸡,其中阳性类克隆鸡个数为64只,类克隆鸡阳性率为45.71%,接近50%。本研究选择MCW004及MCW104微卫星位点作为黑羽狼山鸡的特异分子标记,对F2代阳性类克隆鸡进行了 MCW004及MCW104位点的微卫星测序检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点的长度均不一,但阳性后代中仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明类克隆鸡为狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs来源的后代。本研究对F2代类克隆鸡自交产生的F3代类克隆鸡同样进行了微卫星检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点长度仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明本研究的CEF转分化为iPGCs介导的类克隆技术能够稳定遗传原供体的遗传特性。
二、人类成纤维细胞作为人胚胎干细胞饲养层细胞的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类成纤维细胞作为人胚胎干细胞饲养层细胞的初步研究（论文提纲范文）
（1）植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 干细胞培养和分组 |
| 1.4.2 三胚层分化和胰腺分化 |
| 1.4.3 免疫荧光染色 |
| 1.4.5 碱性磷酸酶染色 |
| 1.4.6 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 1.5 主要观察指标 |
| 2 结果Results |
| 2.1 植物源bFGF可以维持人胚胎干细胞未分化特性 |
| 2.2植物源性bFGF培养条件下的人胚胎干细胞具备向三胚层分化能力和胰腺分化能力 |
| 2.3 无饲养层细胞培养体系下不同浓度bFGF不能单独支撑人胚胎干细胞的长期培养 |
| 2.4 生物相容性 |
| 3 讨论Discussion |
（2）人多能干细胞向肝脏样细胞定向分化体系的优化（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 肝脏发育过程和调控因素 |
| 1.1.1 肝脏的功能和结构 |
| 1.1.2 肝脏发育过程 |
| 1.1.3 调节肝脏发育的信号通路介绍 |
| 1.1.4 肝脏发育过程中的遗传控制 |
| 1.2 体外获得人肝细胞的方法 |
| 1.2.1 分离原代肝细胞及肝脏干细胞 |
| 1.2.2 分化人多能干细胞 |
| 1.2.3 分化人成体干细胞 |
| 1.2.4 转分化人成纤维细胞 |
| 1.3 分化人多能干细胞到肝脏样细胞的方法和应用 |
| 1.3.1 分化方法和进展介绍 |
| 1.3.2 肝脏样细胞的鉴定方法 |
| 1.3.3 肝脏样细胞在疾病模型和药物筛选中的应用 |
| 1.3.4 肝脏样细胞临床应用的局限性和发展方向 |
| 1.4 内胚层祖细胞/肝祖细胞的获得和应用 |
| 1.4.1 体外获得可扩增的内胚层祖细胞 |
| 1.4.2 体外获得可扩增的肝祖细胞 |
| 1.5 化学小分子诱导体系的介绍 |
| 1.6 本课题的研究内容 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器及设备 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 检测试剂盒 |
| 2.1.4 抗体及小分子 |
| 2.1.5 主要细胞系 |
| 2.1.6 小鼠品系 |
| 2.1.7 常用试剂配方 |
| 2.2 分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 2.2.1 细胞内总RNA的提取和反转录 |
| 2.2.2 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.4 FACS流式分析实验 |
| 2.2.5 过碘酸雪夫(PAS)染色 |
| 2.2.6 油红O染色 |
| 2.3 细胞实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、传代与冻存 |
| 2.3.2 细胞计数 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 干细胞向定型内胚层的分化 |
| 2.3.5 内胚层祖细胞向肝脏样细胞的分化 |
| 2.3.6 Foxa3慢病毒包装及转染 |
| 2.3.7 Foxa3介导的转分化 |
| 2.3.8 化学小分子筛选 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 带有报告基因的人胚胎干细胞系的鉴定 |
| 3.2 诱导人胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化 |
| 3.3 内胚层祖细胞的获得和鉴定 |
| 3.4 内胚层祖细胞扩增过程的优化 |
| 3.4.1 去除生长因子严重影响了内胚层祖细胞的增殖 |
| 3.4.2 PKC激活剂恢复了内胚层祖细胞的增殖能力 |
| 3.4.3 PKC激活剂不能恢复SOX17的表达 |
| 3.4.4 CHIR99021对内胚层祖细胞有浓度依赖性作用 |
| 3.4.5 OEM培养的内胚层祖细胞可以维持长期自我更新能力 |
| 3.4.6 OEM-EPCs在Matrigel基质上可维持正常生长 |
| 3.4.7 OEM扩增体系具有可重复性 |
| 3.5 OEM-EPCs具有分化为肝脏样细胞的能力 |
| 3.6 内胚层祖细胞向肝细胞分化过程的优化 |
| 3.6.1 RA显着促进内胚层祖细胞向肝脏样细胞分化的效率 |
| 3.6.2 VX-11e显着促进内胚层祖细胞向肝脏样细胞分化的效率 |
| 3.6.3 RA和VX-11e叠加可将肝脏分化的效率进一步提高 |
| 3.6.4 VX-11e促进早期的肝脏命运决定 |
| 3.6.5 VX-11e在肝脏转分化过程中也有一定促进效果 |
| 3.7 优化后的肝脏分化体系的鉴定 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（4）人诱导性多能干细胞系的建立及向外胚层定向分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 人多能干细胞研究进展 |
| 1.1.1 人诱导多能干细胞疾病建模的研究 |
| 1.1.2 人多能干细胞定向分化外胚层的研究 |
| 1.2 急性脊髓炎研究进展 |
| 1.2.1 急性脊髓炎的临床特征 |
| 1.2.2 急性脊髓炎的致病原因 |
| 1.2.3 急性脊髓炎的临床治疗 |
| 第二章 iPS和 P-iPS细胞系的建立及生物学特性检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与耗材 |
| 2.1.2 实验试剂及抗体 |
| 2.1.3 细胞系 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要试剂的配制 |
| 2.2.2 iPS和 P-iPS细胞系的建立 |
| 2.2.3 碱性磷酸酶染色 |
| 2.2.4 核型分析 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 形态学鉴定与碱性磷酸酶染色结果(AP) |
| 2.3.2 核型分析鉴定 |
| 2.3.3 内源性多能基因m RNA水平检测结果 |
| 2.3.4 内源性多能基因蛋白水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 iPS和 P-iPS的分子生物学特性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验设备与器材 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 细胞系 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 培养液的配制 |
| 3.2.2 人胚胎干细胞的解冻与培养 |
| 3.2.3 RNA-seq测序样本的收样 |
| 3.2.4 RNA-seq文库的制备 |
| 3.2.5 差异基因和富集分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 主成分分析结果 |
| 3.3.2 差异表达基因分析结果 |
| 3.3.3 HEF和 P-HAF富集分析 |
| 3.3.4 iPS和 P-iPS富集分析 |
| 3.3.5 多种标志基因在五种细胞中的表达趋势分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 iPS和 P-iPS向外胚层方向的分化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备与器材 |
| 4.1.2 实验试剂及抗体 |
| 4.1.3 细胞系 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 主要试剂的配制 |
| 4.2.2 外胚层方向的定向分化 |
| 4.2.3 碱性磷酸酶染色 |
| 4.2.4 实时荧光定量PCR |
| 4.2.5 免疫荧光染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 h ESC向外胚层方向的分化 |
| 4.3.2 iPS和 P-iPS向外胚层方向的分化 |
| 4.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（5）骡子诱导多能干细胞生物学特性分析及体外分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 骡子部分可育研究进展 |
| 1.1.1 骡子部分可育原因假说 |
| 1.1.2 骡子部分可育实验进展 |
| 1.2 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 1.3 哺乳动物生殖细胞的发生及体外诱导概况 |
| 1.3.1 配子发生 |
| 1.3.2 PGCLCs研究进展 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 骡子iPSCs的培养及生物学特性检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验设备与器材 |
| 2.1.2 实验试剂及抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要试剂配制 |
| 2.2.2 饲养层细胞的制备 |
| 2.2.3 FMF-iPSCs的培养、冻存与复苏 |
| 2.2.4 FMF-iPSCs碱性磷酸酶染色 |
| 2.2.5 FMF-iPSCs核型分析 |
| 2.2.6 FMF-iPSCs实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.7 FMF-iPSCs免疫荧光染色 |
| 2.2.8 FMF-iPSCs中转染红色荧光蛋白 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 feeder生物学特性 |
| 2.3.2 FMF-iPSCs形态学鉴定与碱性磷酸酶染色鉴定 |
| 2.3.3 FMF-iPSCs核型分析鉴定 |
| 2.3.4 FMF-iPSCs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 2.3.5 FMF-iPSCs免疫荧光染色鉴定 |
| 2.3.6 FMF-iPSCs荧光蛋白质粒转染 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 骡子iPSCs体外拟胚体分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验设备与器材 |
| 3.1.2 实验试剂及抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 培养液的配制 |
| 3.2.2 FMF-iPSCs体外拟胚体分化 |
| 3.2.3 EBs实时荧光定量PCR检测 |
| 3.2.4 EBs免疫荧光染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 EBs分化形态学鉴定 |
| 3.3.2 EBs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 3.3.3 EBs免疫荧光染色鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 骡子iPSCs嵌合体制备及定向诱导分化PGCLCs |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备与器材 |
| 4.1.2 实验试剂及抗体 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 主要试剂的配制 |
| 4.2.2 嵌合体制备 |
| 4.2.3 FMF-iPSCs经 AF重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.4 FMF-iPSCs经4i重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.5 FMF-iPSCs经 FTW重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.6 PGCLCs实时荧光定量PCR检测 |
| 4.2.7 PGCLCs免疫荧光染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FMF-iPSCs在 E6.5 天小鼠胚胎中分化能力鉴定 |
| 4.3.2 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs形态学鉴定 |
| 4.3.3 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 4.3.4 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs免疫荧光染色鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（6）乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 乌骨羊 |
| 1.2 多能干细胞的概述 |
| 1.2.1 多能干细胞的起源 |
| 1.2.2 在体外获取不同多能状态的干细胞 |
| 1.3 家畜胚胎干细胞的研究进展 |
| 1.3.1 牛、猪、绵羊胚胎干细胞的研究进展 |
| 1.3.2 Wnt信号通路是维持家畜多能干细胞的关键信号 |
| 1.4 家畜诱导多能干细胞的研究进展 |
| 1.4.1 家畜PSCs重编程的方法 |
| 1.4.2 牛诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.4.3 山羊及绵羊诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.5 多能干细胞在家畜物种中的应用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 乌骨绵羊成纤维细胞的分离及饲养层细胞的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 细胞培养液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乌骨绵羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.2.2 STO feeder的制备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 乌骨绵羊耳成纤维细胞的原代培养 |
| 2.3.2 乌骨绵羊耳成纤维细胞的传代 |
| 2.3.3 乌骨绵羊耳成纤维细胞的生长曲线 |
| 2.3.4 乌骨绵羊成纤维细胞支原体检测结果 |
| 2.3.5 乌骨绵羊成纤维细胞染色体分析结果 |
| 2.3.6 乌骨绵羊耳成纤维细胞的复苏效果 |
| 2.3.7 STO细胞解冻后的状态 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器及耗材 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒PB-TRE-hRL、pBABE-hygro-hTERT、pSG5 LargeT simian virus的转化与提取 |
| 3.2.2 线性载体的制备 |
| 3.2.3 目的基因的获得 |
| 3.2.4 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体质粒图谱 |
| 3.3.2 质粒PB-TRE-hRL酶切结果 |
| 3.3.3 sLargeT和 hTERT基因RT-PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.3.4 PB-TRE-sLhT载体构建中间基因RT-PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.3.5 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT测序结果 |
| 3.3.6 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT电转染成纤维细胞结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器及耗材 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 质粒 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 电转染 |
| 4.2.2 乌骨绵羊iPSCs的传代及冻存 |
| 4.2.3 乌骨绵羊iPSCs内源基因表达情况的检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 不同诱导体系的iPSCs细胞系建系率 |
| 4.3.2 不同诱导体系获得的iPSCs克隆形态的比较 |
| 4.3.3 不同诱导体系诱导初期iPSCs细胞克隆的形态变化 |
| 4.3.4 不同诱导体系获得的iPSCs细胞系内源基因激活情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 乌骨绵羊iPSCs发育潜能的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验仪器及耗材 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.1.5 质粒 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 siPSC-4和siPSC-6 外源转基因检测 |
| 5.2.2 碱性磷酸酶染色 |
| 5.2.3 免疫组织化学检测 |
| 5.2.4 拟胚体体外分化 |
| 5.2.5 畸胎瘤体内分化 |
| 5.2.6 siPSC-4减DOX培养测试 |
| 5.2.7 siPSC-4 异种嵌合能力检测 |
| 5.2.8 siPSC-4 同种嵌合能力检测 |
| 5.2.9 转录组文库构建、测序及分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 siPSC-4和siPSC-6 细胞干细胞特性分析 |
| 5.3.2 经典培养液中siPSC-4 细胞形态及内源基因的表达 |
| 5.3.3 无饲养层细胞条件下培养siPSC-4 内源基因表达检测 |
| 5.3.4 siPSC-4 细胞嵌合体发育潜能分析 |
| 5.3.5 RNA测序结果分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 多能干细胞 |
| 1.1.1 胚胎干细胞 |
| 1.1.2 核移植ESCs |
| 1.1.3 诱导多能干细胞 |
| 1.2 多能干细胞的诱导方法 |
| 1.2.1 整合方法 |
| 1.2.2 非整合方法 |
| 1.3 诱导多能干细胞的研究意义 |
| 1.3.1 iPSCs与疾病建模及治疗 |
| 1.3.2 iPSCs与再生医学 |
| 1.3.3 iPSCs与农业经济 |
| 1.4 马多能干细胞研究历程 |
| 1.4.1 马胚胎干细胞 |
| 1.4.2 马诱导多能干细胞 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 实验一蒙古马胚胎成纤维细胞的培养及小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备 |
| 2.1 试验耗材与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂药品 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 蒙古马胚胎成纤维细胞原代培养 |
| 2.2.2 蒙古马胚胎成纤维细胞传代培养 |
| 2.2.3 蒙古马胚胎成纤维细胞冻存 |
| 2.2.4 蒙古马胚胎成纤维细胞复苏 |
| 2.2.5 蒙古马胚胎成纤维细胞生长曲线绘制 |
| 2.2.6 小鼠成纤维细胞原代培养 |
| 2.2.7 饲养层细胞制备 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蒙古马胚胎成纤维细胞的形态学观察 |
| 2.3.2 蒙古马胚胎成纤维细胞生长曲线 |
| 2.3.3 小鼠胚胎成纤维细胞形态学观察 |
| 2.3.4 蒙古马胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞的对比 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二多顺反子慢病毒包装体系的优化 |
| 3.1 试验耗材与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 慢病毒质粒的转化及提取 |
| 3.2.2 293T细胞培养 |
| 3.2.3 慢病毒包装 |
| 3.2.4 慢病毒感染 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 慢病毒质粒转染效率的比较 |
| 3.3.2 慢病毒感染效率的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 实验三蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的建立及鉴定 |
| 4.1 试验耗材与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要培养液及试剂配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 蒙古马胚胎成纤维细胞培养 |
| 4.2.2 慢病毒质粒的转化及提取 |
| 4.2.3 慢病毒颗粒包装及EEF测滴度 |
| 4.2.4 慢病毒感染蒙古马胚胎成纤维细胞 |
| 4.2.5 iPS克隆的分离与培养 |
| 4.2.6 蒙古马iPS样细胞的传代、冻存与复苏 |
| 4.2.7 蒙古马iPS样细胞生物学特性检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 EEF测慢病毒滴度 |
| 4.3.2 EEF细胞诱导后碱性磷酸酶及多能性标记物的检测 |
| 4.3.3 多顺反子体系诱导获得蒙古马iPS样细胞及其鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）NANOS2维持水牛精原干细胞干性特征机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.精原干细胞及其微环境 |
| 1.1 精原干细胞的概念及其发育特征 |
| 1.1.1 精原干细胞的概念 |
| 1.1.2 精原干细胞的发育特征 |
| 1.2 精原干细胞的Niche |
| 1.3 Niche的作用机制 |
| 2.精原干细胞的鉴定及体外培养 |
| 2.1 精原干细胞的分离与鉴定 |
| 2.2 精原干细胞体外培养体系 |
| 3.NANOS2基因的研究 |
| 3.1 NANOS2基因的表达特征 |
| 3.2 NANOS2基因在精原干细胞中的功能 |
| 4.课题研究内容 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 第一章 精原干细胞体外培养体系优化 |
| 1.材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二章 水牛源NANOS2基因克隆及NANOS2真核过表达载体的构建 |
| 1.材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 NANOS2过表达对SSC-like细胞干性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第四章 总结论与创新点 |
| 1.总结论 |
| 2.创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文 |
（9）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（10）CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 原始生殖细胞(PGCs) |
| 1.1.1 鸡PGCs的起源和迁移 |
| 1.1.2 鸡PGCs的分离和培养 |
| 1.1.3 PGCs细胞的体外诱导 |
| 1.1.4 PGCs的应用 |
| 1.2 细胞重编程 |
| 1.2.1 细胞重编程的研究进展 |
| 1.2.2 体细胞诱导重编程的分子机制 |
| 1.2.3 体细胞诱导重编程体系的优化 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞的应用 |
| 1.3 本课题前期研究发现 |
| 1.4 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 鸡CEF诱导重编程为iPS |
| 2.1.5 鸡iPS的鉴定 |
| 2.1.6 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.1.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.1.8 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用 |
| 2.1.9 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 鸡CEF诱导重编程为iPS及鉴定 |
| 2.2.2 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.2.3 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.2.4 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用研究 |
| 2.2.5 小分子化合物2i-SP优化鸡iPS诱导体系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第3章 不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 细胞分离纯化 |
| 3.1.5 RNA抽提和质量检测 |
| 3.1.6 cDNA文库构建及测序 |
| 3.1.7 RNA-seq数据分析步骤 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 RNA样品检测结果 |
| 3.2.2 测序数据产出统计 |
| 3.2.3 参考序列比对分析 |
| 3.2.4 RNA-seq整体质量评估 |
| 3.2.5 不同体系诱导的iPS细胞相关性分析 |
| 3.2.6 不同体系诱导的iPS细胞差异表达基因筛选 |
| 3.2.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中差异表达基因功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 鸡iPS/ESCs诱导分化为iPGCs |
| 4.1.5 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化研究 |
| 4.1.6 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组测序 |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鸡iPS诱导分化为iPGCs |
| 4.2.2 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化 |
| 4.2.3 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组学研究 |
| 4.2.4 鸡iPGCs (iPS-derived)与PGCs差异表达基因功能分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 鸡iPGCs介导类克隆体系的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器和设备 |
| 5.1.4 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.1.5 类克隆鸡微卫星检测 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.2.2 微卫星检测类克隆鸡品种关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 全文结论与创新点 |
| 论文有待进一步深入研究的问题 |
| 附录 |
| 原始数据表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、人类成纤维细胞作为人胚胎干细胞饲养层细胞的初步研究（论文参考文献）
- [1]植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 刘峰,彭宇环,罗良平,吴本清. 中国组织工程研究, 2022(07)
- [2]人多能干细胞向肝脏样细胞定向分化体系的优化[D]. 葛文燕. 浙江大学, 2021(01)
- [3]小鼠胚胎干细胞在2iL与PKCi体系下Polycomb复合体表达差异的研究[D]. 李金珊. 南京师范大学, 2021
- [4]人诱导性多能干细胞系的建立及向外胚层定向分化的研究[D]. 高新悦. 内蒙古大学, 2021(12)
- [5]骡子诱导多能干细胞生物学特性分析及体外分化的研究[D]. 武彩霞. 内蒙古大学, 2021(12)
- [6]乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立[D]. 刘默凝. 内蒙古农业大学, 2021
- [7]蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立[D]. 才文道力玛. 内蒙古农业大学, 2021
- [8]NANOS2维持水牛精原干细胞干性特征机制的初步研究[D]. 张筱芫. 广西大学, 2021(12)
- [9]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [10]CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究[D]. 袁霞. 扬州大学, 2021